CN112294793B - 氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。所述氯生太尔能够与新型冠状病毒在内的冠状病毒蛋白靶点主蛋白酶Mpro结合，能够抑制Mpro蛋白酶活性。本发明所述氯生太尔或其药学上可接受的盐可制备用于预防或治疗冠状病毒感染中的药物，在使用时，所述氯生太尔或其药学上可接受的盐能够单独使用，或者与药学上可接受的化合物、载体或辅料相配合制成胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂使用。本发明为冠状病毒的预防或治疗提供了新的化合物以及新的思路。

Description

氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗 冠状病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药学技术领域，更具体地涉及氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎目前尚无特效治疗药物，临床上多采取各种氧疗、对症治疗和免疫调节治疗。然而部分重症患者在经过抗病毒治疗以及抗炎治疗后仍无法有明显疗效，容易合并感染，造成多发性，弥漫性病变。目前的药物以及治疗方法尚无法满足临床需要，亟需开展针对新型冠状病毒的靶向药物研究。

SARS-Cov-2属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种包膜的非分段正向RNA病毒，其进入宿主细胞是由S蛋白介导的，S蛋白分为受体结合S1区和膜融合S2区。S1通过其受体结合域 (RBD) 与细胞表面血管紧张素转换酶2 (ACE2) 受体结合；S2融合宿主细胞和病毒膜，使病毒基因组能够进入宿主细胞进行复制而引发疾病。SARS-CoV-2基因组大小约29.8kb，含有14个ORFs，可编码27个蛋白，其中包括4种较为保守结构蛋白：刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M和核衣壳蛋白N；8种辅助蛋白3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14等。SARS-Cov-2病毒基因组在5’端有2个开放阅读框orf1a和orf1b，可编码2个多聚蛋白pp1a和pp1b；该病毒内还包含两种半胱氨酸蛋白酶-主蛋白酶（Mpro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro），由这两个蛋白酶水解多聚蛋白可得到15种非结构蛋白NSP (NSP1-NSP10和NSP12-NSP16) ，进而参与到病毒的转录和复制过程中。

SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）也称3C类蛋白酶（3C-like proteinase，3CL-pro）是由病毒非结构基因nsp5编码的一种蛋白酶，存在于细胞质。Mpro对病毒存活不可或缺，尤其是在处理从病毒RNA翻译过来的多蛋白过程中起至关重要的作用。Mpro可以识别多蛋白1ab（复制酶1ab，~790 kDa）的分裂位点至少有11个，在绝大多数的裂解发生的序列特征为Leu-Gln--(Ser, Ala, Gly)(--表示裂解位点)，因此抑制Mpro的活性可阻断病毒复制，并且人体没有与Mpro相似的蛋白酶。可见，Mpro蛋白酶是抗新型冠状病毒的重要靶标，并且Mpro抑制剂具有更高的安全性。因此，研究针对Mpro蛋白酶的药物具有重要意义。

氯生太尔（Closantel），又名氯氰碘柳胺，是一种杀虫剂，对肝片吸虫、胃肠道线虫及节肢动物的幼虫阶段均有驱杀活性。氯生太尔的半衰期很长，长达15d，驱杀效果显著。氯生太尔可扰乱寄生虫细胞膜中的液体和离子传输机制，干扰ATP的产生，进而损害寄生虫的能动性。氯生太尔还具有抗犬细小病毒的作用，但目前未曾有氯生太尔作用于（新型）冠状病毒Mpro蛋白酶，抑制其活性并应用于抗（新型）冠状病毒的相关报道。

发明内容

本发明针对目前新型冠状病毒肺炎缺乏有效防治药物的问题，提供了氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。所述氯生太尔与冠状病毒肺炎靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，其可抑制Mpro蛋白酶活性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。

进一步的，所述氯生太尔的结构式为

。

进一步的，所述氯生太尔与冠状病毒Mpro蛋白酶之间具有较强的结合。

进一步的，所述氯生太尔能够抑制冠状病毒Mpro蛋白酶的活性。

进一步的，所述氯生太尔对Mpro的ki值为0.58±0.03 μmol/L。

进一步的，所述氯生太尔的抑制浓度IC₅₀ 为1.46±0.20 µmol/L。

进一步的，所述冠状病毒感染包括新型冠状病毒SARS-Cov-2感染。

进一步的，所述氯生太尔或其药学上可接受的盐能够单独使用，或者与药学上可接受的化合物、载体或辅料相配合制成药物使用。

进一步的，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明利用分子对接、结合自由能计算等方法验证了氯生太尔与冠状病毒靶点主蛋白酶Mpro的结合模式，计算了氯生太尔与Mpro的结合自由能，证明了氯生太尔与Mpro之间具有较强的结合；并利用酶活性测试，验证了氯生太尔对Mpro蛋白酶具有很好的抑制作用，其抑制浓度IC₅₀ 为1.46±0.20 µmol/L，说明所述氯生太尔可以成为预防和/或治疗冠状病毒感染的潜在药物。另外，氯生太尔或其药学上可接受的盐可以单独作为一种原料药使用，或与药学上可接受的化合物、载体或辅料相配合制成胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂等各种形式的药剂来预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎。本发明为治疗冠状病毒感染，尤其是新型冠状病毒感染提供了新的化合物以及新的思路。

附图说明

图1为氯生太尔与新型冠状病毒靶点Mpro蛋白的结合模式。

图2为氯生太尔对新型冠状病毒靶点Mpro蛋白的ki。

图3为氯生太尔抑制新型冠状病毒靶点Mpro的IC₅₀结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，对本发明进行进一步阐述。显然，本发明所述实施例仅用于解释本发明，而不对本发明范围进行限定。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：氯生太尔对新型冠状病毒靶点主蛋白酶 (Mpro) 结合模式

采用分子对接方法和结合自由能计算相结合的方法：选用主蛋白酶Mpro与小分子抑制剂复合物的晶体结构（PDB ID: 6LU7）为起始结构，晶体结构中主蛋白酶与小分子抑制剂是通过共价连接的，因此，通过AutoDock Tools依次删除蛋白与抑制剂间的共价键，删除除蛋白以外的所有组分，对蛋白进行加氢、加电荷、质子化状态确认和能量优化，处理后的结构用于后续的基于分子对接的虚拟筛选研究。对接过程的格点是以小分子抑制剂的中心为中心，边长为20Å的立方体盒子，每个格点的长度为0.375 Å。将约5万个化合物以及Drugbank数据库经加氢、加电荷、确保其质子化状态合理和能量优化等方式预处理后，将其三维结构对接到上述生成的网格化的Mpro蛋白结构中。对接过程中，选用拉马克遗传算法，每个化合物只保留1个构象。在此过程中，AutoGrid4用于获取并规范化对接过程中的所有原子坐标，Autodock4用于将小分子化合物对接到结合口袋中，并进行打分排序。选取对接打分低于域值的化合物，重新对接到Mpro结合口袋，第二轮的分子对接每个化合物保留3个最佳结合构象，以便结合模式和构效关系的分析。通过肉眼观察对接打分前500的化合物的结合模式，分析分子内能，对结合好的化合物进行Mpro抑制活性测试。

在抑制活性测试的化合物中确定了氯生太尔，氯生太尔与新型冠状病毒肺炎靶点Mpro蛋白酶的对接打分为-7.0，结合自由能为 -45 kcal/mol。氯生太尔与Mpro的结合模式如图1所示，氯生太尔的氰基N与Cys145和Gly143的主链NH形成氢键作用，氯生太尔中间芳香环上的Cl原子与ASN142的主链NH形成偶极-偶极作用，酰氨基的NH和-C=O分别与主蛋白GLN189的侧链和GLU166的主链形成氢键作用。氯生太尔的酚羟基在中性状态下去质子，与酰氨的NH形成分子内氢键，锁定了分子构象，并使亲水的酚羟基指向蛋白外部，减少了分子的去溶剂化作用，同时使其相连的芳香环与Gln189侧链的酰氨形成π-σ键作用。这些有利的相互作用使氯生太尔与新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶有较强的结合，因此，氯生太尔可抑制Mpro蛋白酶活性，从而抑制病毒的复制，其对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。

氯生太尔的结构式如下：

。

实施例2：氯生太尔对新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶抑制活性测试

1、重组Mpro蛋白酶的表达与纯化

将包含SARS-CoV-2来源的Mpro重组质粒（pGEX4T1，武汉普健生物公司合成）转化入大肠杆菌菌株BL21（codonplus），再将菌株在LB或2×YT培养基中生长至OD₆₀₀为 0.6-0.8，然后加入0.1 mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），在15℃继续生长24小时进行低温诱导表达，通常1 L培养基可收获约8-15g湿菌。按1：5 的比例加入裂解液将菌重悬，经超声、高压破碎等方式破碎菌体后，离心取上清经GST Beads进行亲和层析纯化，通过牛-凝血酶切除GST-Tag纯化标签后，用SDS-PAGE的方法对蛋白纯度进行验证。

经Ni Beads亲和层析获得了大量的Mpro蛋白酶，经SDS-PAGE鉴定其纯度达95%以上。

2、氯生太尔对Mpro蛋白酶抑制活性测试

向含1mg Mpro蛋白酶的管内加入230 μL DMSO，使Mpro终浓度为1 mM，室温避光震荡10分钟后，分装30 μL /每管备用，剩余冻存于-20℃。从冰箱取出Mpro并置于室温避光解冻5分钟后，开始活性测试。每孔加入48 μL反应缓冲液（pH 7.3的50 mM Tris-HCl和1 mMEDTA）和1 μL终浓度为100 nM的Mpro，然后加入1 μL不同浓度的氯生太尔(15 μM, 10 μM,7.5 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 0.31 μM)，充分混匀后室温静置30分钟，然后使用多孔道移液器加入49 μL 反应缓冲液和1 μL终浓度为1 μM的荧光底物或终浓度为2μM的荧光底物的混合物；立即使用多功能酶标仪SpectraMax i3测量，激发波长320nm，发射波长405 nm，每30秒读数1次，连续记录15分钟，取线性区间内斜率作为V₀并计算抑制剂IC₅₀。

试验结果如图2和图3所示，氯生太尔抑制Mpro蛋白酶ki为0.58±0.03 μmol/L；而氯生太尔的抑制浓度IC₅₀为1.46±0.20 μM。

综上，氯生太尔可与新型冠状病毒Mpro蛋白酶具有较强的结合，氯生太尔具有很好抑制Mpro蛋白酶活性的作用，说明氯生太尔或其药学上可接受的盐具有预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的作用，进而能够成为可以预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎潜在药物或化合物。氯生太尔或其药学上可接受的盐可以单独作为一种原料药使用，或与药学上可接受的化合物、载体或辅料相配合制成胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂等各种形式的药剂来预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.氯生太尔或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述氯生太尔能够抑制冠状病毒Mpro蛋白酶的活性；所述氯生太尔的抑制浓度IC₅₀为1.46±0.20 µmol/L；所述氯生太尔抑制Mpro蛋白酶ki为0.58±0.03 μmol/L；所述氯生太尔与冠状病毒Mpro蛋白酶之间具有较强的结合；所述氯生太尔的结构式为

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒感染包括新型冠状病毒SARS-Cov-2感染。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯生太尔或其药学上可接受的盐能够单独使用，或者与药学上可接受的化合物或辅料相配合制成药物使用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。

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