CN115025092B - 石蒜碱在防治gcrv感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了石蒜碱在防治草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染中的应用。细胞感染模型的建立显示，石蒜碱能够对感染GCRV的细胞系起到显著的保护作用，结合qPCR实验结果发现，石蒜碱处理后GCRV病毒相关基因转录水平被显著抑制，被病毒诱导的免疫相关基因转录水平恢复正常。因此，石蒜碱能够作为防治鱼类GCRV感染的药物或添加剂，具有使用剂量小，保护效果佳的优点。

Description

石蒜碱在防治GCRV感染中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及石蒜碱的用途，具体涉及石蒜碱用于制备预防和治疗GCRV感染的药物或添加剂。
背景技术
石蒜碱(Lycorine hydrochloride)，一种存在于石蒜鳞茎内的环形生物碱，在石蒜提取物中是主要活性物质。石蒜碱性辛而温，在临床上常被用作祛痰剂，也被用于治疗黄疸，痢疾。石蒜碱氢化后的产物二氢石蒜碱有较强的抗阿米巴痢的作用，且毒较小，是良好的临床药物；石蒜碱制成的内胺盐在动物上也表现出较好的抗肿瘤作用。目前，尚未有将石蒜碱应用于水生病毒感染的防治过程中的实例，石蒜碱对于水生病毒感染的影响尚不清楚。
GCRV，即草鱼呼肠孤病毒，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属，是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒。GCRV引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。GCRV能够在多种草鱼细胞系中进行体外培养，如草鱼肾细胞(CIK)、草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼卵巢细胞(GCO)和草鱼囊胚细胞(GCB)等，并使其产生显著的细胞病变效应。
目前，针对GCRV的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。目前各类疫苗主要通过注射、口服或浸浴的方式来使用。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易于变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗GCRV药物在给药方式，对于不同毒株维持抗病毒效果等方面相比于疫苗防治具有显著的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供石蒜碱在防治GCRV感染中的应用，石蒜碱能够显著抑制鱼类离体培养细胞中病毒相关基因(GCRV相关基因，包括S6、S9)的转录，TCID50实验证实石蒜碱对于GCRV感染起到保护作用，石蒜碱能够用于制备防治GCRV感染的药物或添加剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
石蒜碱在防治GCRV感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染GCRV的CIK细胞系在加入20μM石蒜碱处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，石蒜碱处理之后，CIK细胞中病毒相关基因(GCRV相关基因，包括S6、S9)的表达量被显著抑制，同时细胞系中抗病毒免疫相关基因(包括gcvig1、gcifn)表达量基本恢复正常水平。
本发明实施例中选取的鱼类细胞系是来源于GCRV病毒重要宿主草鱼的细胞系，因此通过建立细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知石蒜碱适用于GCRV的病毒防治。
石蒜碱作为预防或治疗GCRV感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，没有药物残留的风险的优点。
附图说明
图1为石蒜碱对GCRV 873感染细胞的影响。
图2为石蒜碱对细胞中GCRV 873病毒基因转录水平的影响。
图3为石蒜碱对感染GCRV 873的细胞中抗病毒免疫相关因子转录水平的影响。
具体实施方式
实施例1：石蒜碱对GCRV 873感染细胞的影响
抗病毒实验用于检测GRCV 873(实验室保存)在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。CIK细胞用于检测GCRV 873病毒滴度。取生长状态良好的CIK细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种MOI＝1的GCRV 873于CIK细胞，同时加入20μM石蒜碱处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。固定细胞前收集上清，保存于4℃备测病毒滴度。使用TCID50方法检测病毒滴度：取生长状态良好的CIK细胞传代接入96孔板，28℃培养过夜；接种收集的上清后，根据细胞空斑计算石蒜碱未处理组和处理组病毒滴度。结果如图1所示，20μM石蒜碱处理后细胞病变效应明显被抑制，感染病毒细胞中GCRV 873病毒滴度明显降低。
实施例2：石蒜碱对GCRV 873病毒基因转录的影响
检测感染GCRV 873之后的CIK细胞用20μM石蒜碱处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的CIK细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用TRIzol(Invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。通过qPCR检测病毒相关基因的转录水平，相关方法参照文献[1]。结果表明：如图2所示，20μM石蒜碱处理后，细胞中GCRV 873病毒相关基因(包括S6，S9)的转录水平显著下降。
实施例3：石蒜碱对宿主抗病毒免疫相关基因表达水平的影响
检测感染GCRV 873之后的CIK细胞用20μM石蒜碱处理后，细胞中抗病毒免疫相关基因的表达情况。取生长状态良好的CIK细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，用TRIzol(Invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。使用qPCR检测抗病毒免疫相关基因的转录水平(包括gcvig1，gcifn)，相关方法参照文献[2]。实验结果表明，如图3所示，细胞中抗病毒免疫相关基因(包括gcvig1,gcifn)的转录水平被GCRV 873病毒刺激后表达上调，石蒜碱处理后转录水平显著恢复。
参考文献
[1]ZHOU X Y,LU L F,LI Z C,et al.Temperature effects on SVCVpropagation and the related IFN response in zebrafish[J].Aquaculture,2021,533.
[2]ZHOU Y,LU L F,ZHANG C,et al.Grass carp cGASL negatively regulatesinterferon activation through autophagic degradation of MAVS[J].Dev CompImmunol,2021,115:103876.

Claims (2)

1.石蒜碱在制备防治草鱼呼肠孤病毒感染的药物中的应用。
2.石蒜碱在制备防治草鱼呼肠孤病毒感染的添加剂中的应用。
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Lycorine;Xiao-Yu Bai等;《Natural Small Molecule Drugs from Plants》;第589–594页 *

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