CN111803494B - 褪黑素在制备抗肠道病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了药物制备技术领域中的褪黑素在制备抗肠道病毒药物中的应用，尤其是在制备防治肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)的药物组合物中的应用。通过体外EV71感染细胞模型实验进行研究，结果显示褪黑素能在基因水平抑制EV71的复制。证明所述的褪黑素有明显的抗EV71的作用，可用于制备EV71的药物。

Description

褪黑素在制备抗肠道病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，涉及褪黑素在制备抗肠道病毒药物中的应用。
背景技术
手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性肠道传染病，好发于学龄前尤其是3岁以下儿童，其主要传播途径为消化道、呼吸道以及密切接触。肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是HFMD的主要病原体，是一种高度噬神经病毒，可引起严重的神经系统损害。所以，从根源上治疗及预防刻不容缓。目前，临床上多用干扰素、利巴韦林和甲泼尼龙等进行联合给药治疗HFDM，但对EV71引起的重症HFMD效果差强人意，寻求新的、特异的抗EV71药物对HFMD的预防及治疗显得尤为重要。
1959年，国外学者从牛松果体中分离出一种激素，因这种激素能使蛙背部皮肤褪色，故命名褪黑素(Melatonin，MT)，化学成分是N-乙酰-5-甲氧基色胺。MT是一种广泛分布于植物、单细胞生物、藻类、细菌、无脊椎动物和脊椎动物中的内源性吲哚胺，在人体内具有重要生理作用，如调节生物钟节律、调节代谢、抗氧化、调节生殖功能等。
目前没有褪黑素用在肠道病毒上的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供褪黑素在制备肠道病毒药物中的应用。
本发明的目的之一是提供褪黑素或它药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂作为活性成分在制备抗肠道病毒药物中的应用。
其中，所述的肠道病毒为肠道病毒71型。
所述肠道病毒71型感染所致的疾病包括手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经系统感染中的一种或者多种。
本发明的目的之二是提供一种药物，褪黑素为活性成分制备的防治肠道病毒感染的药物。
具体的，褪黑素为活性成分制备的抗肠道病毒71型感染的药物。
本发明所述的褪黑素的分子式为：C13H16N2O2(可市购)。
本发明对上述分子式为C13H16N2O2的褪黑素进行了下述实验：
由于EV71能引起严重中枢神经系统并发症，故本发明以EV71感染的SK-N-SH(人神经母细胞瘤细胞)细胞为研究模型，检测褪黑素对EV71感染后细胞病变效应(Cellcytopathic effect，CPE)的影响；对上清中病毒滴度的影响；对EV71 VP1 mRNA的影响。检测结果显示，褪黑素能够抑制EV71引起的CPE，降低病毒滴度，抑制EV71 VP1 mRNA的转录水平。
实验结果证明，褪黑素具有明显的抗EV71作用，可用于制备抗EV71感染的药物。
附图说明
图1是用CCK8法检测褪黑素对SK-N-SH细胞生长的影响示意图；
图2是在光镜下观察褪黑素对EV71引起CPE的影响示意图；
图3是用Reed-Muench公式计算褪黑素作用于EV71感染的SK-N-SH细胞后，病毒滴度的变化示意图；
图4是用荧光定量PCR法检测褪黑素作用于EV71感染的SK-N-SH细胞后，对EV71VP1mRNA转录水平的影响示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1、CCK8筛选褪黑素作用SK-N-SH细胞最大无毒浓度
取处于对数生长期的SK-N-SH细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于96孔板中，1×104个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，将不同浓度的褪黑素(1mM、3mM、5mM、7mM和9mM)加入96孔板中，每个稀释度接种5个孔为实验组，设5个孔只加培养基、细胞为实验对照组，另设5个孔只加培养基作空白对照，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，于培养72h后采用CCK8法测定OD值，计算细胞存活率。
Figure BDA0002638666690000021
如图1所示，结果显示浓度大于5mM的褪黑素对SK-N-SH细胞生长有明显的影响(p<0.05)。
2、光镜下观察褪黑素对EV71引起CPE的影响
取处于对数生长期的SK-N-SH细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于6孔板中，5.5×105个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，PBS清洗2-3次，以MOI＝1的EV71感染SK-N-SH细胞，2h后，吸出病毒液，替换为完全培养基配置的含不同浓度MT的培养基，同时设褪黑素单独给药组，EV71感染组，阴性培养基对照组。72h后在光学显微镜下观察CPE。如图2所示，褪黑素单独给药组对细胞无毒性作用，和EV71感染组相比，MT 1、3、5mM能有效抑制EV71引起的CPE。
3、褪黑素对EV71病毒滴度的影响
种板，接毒以及加药方式同2，加药24h后，收集细胞上清，4℃，12000rpm，离心10min，再次收集细胞上清，备用。
取对数生长期的Vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，按照1×104个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞长满单层，弃去培养液，用PBS清洗两遍，将收集的上清病毒液用DMEM/F-12培养基依次10倍稀释(10-1～10-10)，每个稀释度接种8个孔，另设8孔作空白对照，只加无血清的DMEM/F-12培养基，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每日观察并记录CPE情况，连续72h，用Reed-Muench公式计算病毒液的50％细胞感染剂量(50％tissue culture infective dose，TCID50)。
Figure BDA0002638666690000031
如图3所示，和病毒感染组相比褪黑素1、3、5mM均能降低细胞上清中由EV71感染引起的滴度。
4、褪黑素对VP1基因转录水平的影响
种板，接毒以及加药方式同2，加药24h后，收集细胞提取总RNA,流程如下：①取出6孔板，置于冰上，PBS清洗2次，加入1mL Trizol裂解5-10min，转移裂解液至EP管中；②加入0.2mL氯仿，涡旋震荡仪震荡30s，室温静置15min。12000rpm，4℃离心15min；③取上层无色水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min,12000rpm，4℃离心10min；④弃上清，取1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，上下颠倒洗涤，12000rpm，4℃离心8min；⑤弃上清，待沉淀RNA残留的乙醇挥发后，取30μL RNase-free water溶解RNA沉淀，冻于-80℃冰箱。
根据所得RNA浓度值，定量为1μg，计算所需RNA样本的量。将提取的RNA在20μL体系中进行反转录为cDNA，反应程序为：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保存，反应体系如下：
表1实时荧光定量PCR反转录体系
Figure BDA0002638666690000041
表2实时荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0002638666690000042
将获得的cDNA为模板，每个样品三个重复，以β-actin为内参，在荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序为：95℃，30s；(95℃，3s→60℃，30s)×40次循环，溶解曲线仪器默认，反应体系如表：
表3实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002638666690000043
实验重复三次，利用Graphpad prism5软件进行数据分析作图，用β-actin做内参、
Figure BDA0002638666690000044
计算结果，计算各组之间的相对水平。
如图4所示，褪黑素1、3、5mM能有效降低EV71 VP1 mRNA的转录水平。
实验结果证明，褪黑素有明显的EV71作用，可用于制备防治由EV71引起的手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经系统感染的药物。

Claims (3)

1.褪黑素或它药学上可接受的盐作为活性成分在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。
3.褪黑素或它药学上可接受的盐作为活性成分在制备防治由肠道病毒71型感染所致疾病中的应用，其特征在于：肠道病毒71型感染所致的疾病包括手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿和中枢神经系统感染中的一种或者多种。
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