CN118078790A - 乳酸根离子在鱼类抗病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖及水产病毒防治技术领域，具体涉及乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。本发明发现乳酸脱氢酶(ldha)缺失会导致斑马鱼对SVCV感染的抵御能力下降，进而得出乳酸根离子的补充可以达到防治鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染的作用。具体的乳酸根离子可以有效增强鱼体抵御SVCV感染，抑制SVCV复制与增殖，提高感染鱼体的存活率，可有效应用于鲤科鱼类养殖中的SVCV防治。且提供乳酸根离子的乳酸钠价格低廉，经济性高。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖及水产病毒防治技术领域，具体涉及乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。
背景技术
鱼类病原性疾病包括细菌性、真菌性、病毒性和寄生虫性疾病等类型，其中病毒性疾病潜伏期长,不易发现，一旦发病,速度较快,不易控制。鲤春病毒血症病毒(SVCV)是鲤春病毒血症(SVC)的病原体，属于弹状病毒科水泡性病毒属。鲤春病毒血症病毒流行范围较广，在欧洲、美洲和亚洲国家造成了水产养殖鱼类的高发病率和死亡率。鲤春病毒血症病毒宿主范围广泛，我国的主要经济鱼类青鱼、草鱼、鲢、鳙和鲤，模式生物斑马鱼，观赏鱼类锦鲤等均可感染SVCV。SVCV通常在春季流行，水温处于10℃～17℃时，最利于SVCV增殖和传播。感染SVCV的鱼类表现出复杂的症状，如肝脏、血管坏死，出现炎症反应以及脾脏充血、鱼鳃以及皮肤出血、鳃板退化等。
研究发现，SVCV感染细胞能够抑制p53的泛素化修饰，进而现有技术中多通过增加p53的K63位的泛素化修饰来达到抑制SVCV的作用，如通过Ca2+来调控p53发挥抑制SVCV的效果，进而达到预防鲤春病毒血症的作用。
在动物体内代谢过程中，在有氧条件下，细胞质中己糖分解成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体发生三羧酸循环。而在缺氧条件下，通过乳酸发酵，在乳酸脱氢酶LDHA的作用下将丙酮酸转化为乳酸。病原体感染可造成局部组织或细胞缺氧增强乳酸的产生。以往，乳酸一直被认为是葡萄糖的代谢废物。但近几年的研究发现，乳酸在调节多种生物过程中发挥关键作用，如巨噬细胞极化、辅助性T细胞分化以及肿瘤免疫监测等，但是乳酸或乳酸根在鱼类抗病毒中的作用仍不明确。
发明内容
本发明的目的在于提供乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用，乳酸根离子可以抑制鲤春病毒血症病毒的复制与增殖，提高感染鱼体存活率，有效防治鲤科鱼类养殖过程中的鲤春病毒血症。
乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。
优选的，所述防治鲤春病毒血症的产品包括增强鱼体抵御鲤春病毒血症病毒感染、抑制鲤春病毒血症病毒感染复制和抑制鲤春病毒血症病毒感染增殖中一项或多项的产品。
优选的，所述乳酸根离子的使用浓度为1～15mM。
优选的，提供所述乳酸根离子的物质包括乳酸钠。
优选的，所述产品包括药物或饲料。
优选的，所述药物的剂型包括液体剂或固体剂。
优选的，所述液体剂包括注射剂或浸泡剂。
优选的，所述饲料包括水产饲料和乳酸根离子组分。
本发明还提供了一种防治鲤春病毒血症的产品，所述产品包括乳酸根离子组分和辅料；当所述产品为药物时，所述辅料为药物学上接受的辅料；当所述产品为饲料时，所述辅料为水产饲料。
有益效果：
本发明提供了乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。本发明发现乳酸脱氢酶(ldha)缺失会导致斑马鱼对SVCV感染的抵御能力下降，进而得出乳酸根离子的补充可以达到防治SVCV感染的作用。具体的乳酸根离子可以有效增强鱼体抵御鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染，抑制SVCV复制与增殖，提高感染鱼体的存活率，可有效应用于鲤科鱼类养殖中的SVCV防治。且提供乳酸根离子的乳酸钠价格低廉，经济性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中不同浓度乳酸钠对斑马鱼幼鱼的生长发育的影响图；
图2为实施例2中不同试验组中斑马鱼幼鱼生长发育情况；
图3为实施例3中鲤春病毒血症病毒病毒相关基因的荧光定量表达结果；
图4为实施例4中乳酸脱氢酶缺失的斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒病毒后的生长发育和相关基因表达情况。
具体实施方式
本发明提供了乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。
本发明所述产品优选包括增强鱼体抵御鲤春病毒血症病毒感染、抑制鲤春病毒血症病毒感染复制和抑制鲤春病毒血症病毒感染增殖中一项或多项的产品，更优选为增强鱼体抵御鲤春病毒血症病毒感染、抑制鲤春病毒血症病毒感染复制和抑制鲤春病毒血症病毒感染增殖的产品。
本发明所述乳酸根离子的使用浓度优选为1～15mM，进一步优选为5～10mM，更优选为5mM。本发明所述使用浓度范围内的乳酸根离子防治鲤春病毒血症的作用，但是5mM浓度可以既保证防治鲤春病毒血症的作用，又对鱼体无其他严重损害。
本发明所述药物优选包括药物或饲料；所述药物的剂型优选包括液体剂或固体剂；所述液体剂优选包括注射剂或浸泡剂；所述饲料优选包括水产饲料和乳酸根离子组分。
具体的，本发明优选采用浸泡法将感染SVCV的幼鱼和/或仔稚鱼浸泡在含有乳酸根离子的溶液中，用于治疗感染幼体。本发明所述的浸泡时间优选为12～24h，更优选为12h。或者，本发明优选采用腹腔注射法，将含乳酸根离子的溶液注射入成鱼腹腔，用于治疗感染成鱼。或者，本发明优选将含有乳酸根离子鱼水产饲料制备成混合饲料，对鱼体进行投喂以预防和/或治疗SVCV感染。本发明所述混合饲料中乳酸根离子的用量优选为2.4％。在本发明中，所述乳酸根离子的应用对象优选包括鲤科鱼。
本发明还提供了一种防治鲤春病毒血症的产品，所述产品包括乳酸根离子组分和辅料；当所述产品为药物时，所述辅料为药物学上接受的辅料；当所述产品为饲料时，所述辅料为水产饲料。本发明对所述辅料的类型和用量没有特殊限定，依据需要常规设置即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
不同浓度乳酸钠处理对斑马鱼生长发育无显著影响，步骤如下：
在35cm×23.5cm×36cm的水族箱中进行，每天换水并保持水温在28℃左右。饲养到3月龄的AB型斑马鱼成鱼交配产卵，获得的鱼卵于10cm培养皿中并加入10mL 0.1％亚甲基蓝溶液于28℃恒温孵化箱中孵育，每隔12h挑除死卵，孵育3天的斑马鱼幼鱼各挑取30条于6cm培养皿中即为一个处理组，共设置四个处理组。
称取560.15mg乳酸钠加入1mL水，配制成终浓度为5M的乳酸钠储液。将配置好的乳酸钠储液以0μL、1μL、2μL和10μL的量加入不同处理组，并用0.2％的海盐溶液补充至总体积为5mL，各组乳酸钠终浓度分别为0mM、1mM、2mM和10mM。将各处理组放回28℃恒温孵化箱中继续孵育72h，在显微镜下观察斑马鱼幼鱼的生长发育情况，结果如图1所示。
如图1所示，在显微镜下观察发现，与对照组0mM乳酸钠相同，1mM、2mM、10mM的乳酸钠均未对斑马鱼幼鱼的生长发育产生明显影响。
实施例2
乳酸钠增强感染SVCV斑马鱼存活率，步骤如下：
以实施例1所述方法饲养AB型斑马鱼并使成鱼交配产卵，获得的鱼卵于10cm培养皿中并加入10mL 0.1％亚甲基蓝溶液于28℃恒温孵化箱中孵育，每隔12h挑除死卵，孵育3天的斑马鱼幼鱼各挑取30条于6cm培养皿中即为一个处理组，共设置三个实验组。
A组为对照组，添加5mL 0.2％的海盐溶液；B组加入2mL SVCV(滴度为～2.50×107TCID50/mL)感染并补充3mL 0.2％的海盐溶液；C组加入2mL SVCV(滴度为～2.50×107TCID50/mL)感染并补充3mL 0.2％的海盐溶液然后加入5μL浓度为5M的乳酸钠储液，保证乳酸钠终浓度为5mM。将各处理组放回28℃恒温孵化箱中继续孵育12h，在显微镜下观察斑马鱼幼鱼的生长发育情况，结果如图2所示，其中图2中B组中的红色箭头表示受SVCV感染后死亡蜷曲的斑马鱼幼鱼。
如图2所示，在显微镜下观察发现，B组斑马鱼幼鱼死亡率为30％，而C组添加乳酸钠后，斑马鱼死亡率为0。说明乳酸钠对斑马鱼感染SVCV有明显防护作用。
实施例3
乳酸钠抑制斑马鱼感染SVCV后鱼体中病毒相关基因表达，步骤如下：
按照实施例2所述方法分别处理对照组和实验组，处理12h后，将每组30条斑马鱼幼鱼收集至研磨管中，并用0.2％的海盐溶液清洗一次。使用TRIzol(Invitrogen)提取组织总RNA，由EasyScript逆转录试剂盒(TRANS)逆转录得到cDNA。通过RT-PCR检测病毒相关基因的表达情况，用到的病毒相关引物为：SVCV-G-protein-RT的正向引物和反向引物分别为：5'-CGACCTGGATTAGACT TG-3'(SEQ ID NO.1)，5'-AATGTTCCGTTTCTCACT-3'(SEQ IDNO.2)；
SVCV-N-protein-RT的正向引物和反向引物分别为：5'-TGAGGTGAGTGCT GAGGATG-3'(SEQ ID NO.3)，5'-CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3'(SEQ ID NO.4)；
SVCV-P-protein-RT的正向引物和反向引物分别为：5'-TTGGACCTGGGAT AGTGA-3'(SEQ ID NO.5)，5'-CTTGCTTGGTTTGTGGG-3'(SEQ ID NO.6)；
SVCV-L-protein-RT的正向引物和反向引物分别为：5'-GCCCACTTTGCATC CAGTCC-3'(SEQ ID NO.7)，5'-GAGATGCCACAGACTCCTCC-3'(SEQ ID NO.8)；
SVCV-M-protein-RT的正向引物和反向引物分别为：5'-TACTCCTCCCACT TACGA-3'(SEQ ID NO.9)，5'-CAAGAGTCCGAGAAGGTC-3'(SEQ ID NO.10)。
RT-PCR反应体系为：28μL无酶水正向引物和反向引物共3.3μL 33μL RT mix 2μLcDNA，每孔20μL混合液设置三个重复，运行以下程序：95℃5min；95℃3s 60℃15s共55个循环；65℃5s；95℃5s。
检测结果如图3所示。如图3所示结果表明：5mM乳酸钠处理之后，斑马鱼幼鱼体内病毒相关基因SVCV-N、SVCV-M、SVCV-P、SVCV-G、SVCV-L(依次对应核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L))的表达显著下降。说明乳酸钠对SVCV在斑马鱼体内的增殖有明显的抑制作用。
实施例4
本实施例利用CRISPR/Cas9技术获得了乳酸脱氢酶(ldha)缺失的斑马鱼并用SVCV处理ldha缺失斑马鱼和野生型斑马鱼，具体过程如下：
使用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼中的ldha：
首先，利用CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)设计sgRNA，核苷酸序列具体为：5'-GGAAGCTGAGCGGTTTGCCC-3'(SEQ ID NO.11)。用Xba I酶切得到优化后的斑马鱼密码子Cas9质粒，具体序列为5'-GTAATACGACTCACT ATAGGAAGCTGAGCGGTTTGCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'(SEQ ID NO.12)，然后进行纯化和转录。使用PpUC19-gRNA载体扩增ldhasgRNA模板。sgRNA采用Transcript Aid T7高产转录试剂盒((Fermentas)合成。注射单细胞期的斑马鱼胚胎每个胚胎各1ng Cas9RNA和0.15ng sgRNA。突变最初是使用异源双链迁移率分析实验(HMA)检测的。如果HMA结果为阳性，则将剩余的胚胎培养至成年作为F0代，然后与WT斑马鱼(AB株)回交，产生F1代。F1代用HMA进行基因分型。基因型通过靶点测序确定。杂合F1代与WT斑马鱼(AB株)回交，产生F2代。携带目标突变的杂合子F2代成年个体进行杂交，产生F3代。F3代野生型、杂合子、纯合子的比例应该符合孟德尔遗传定律(1:2:1)。
以实施例1所述方法饲养上述办法中获得的ldha缺失斑马鱼(记为ldha-/-)及野生型斑马鱼(记为ldha+/+)并使成鱼交配产卵，获得的鱼卵于10cm培养皿中并加入10mL 0.1％亚甲基蓝溶液于28℃恒温孵化箱中孵育，每隔12h挑除死卵。挑取孵育3天的ldha缺失斑马鱼及野生型斑马鱼幼鱼若干于6cm培养皿。
ldha+/+斑马鱼幼鱼分为两组，第一组添加5mL 0.2％的海盐溶液；第二组加入2mLSVCV(滴度为～2.50×107TCID50/mL)感染并补充3mL 0.2％的海盐溶液；ldha-/-斑马鱼幼鱼同样分为两组，与ldha+/+斑马鱼幼鱼做相同处理。将各处理组放回28℃恒温孵化箱中继续孵育12h，在显微镜下观察斑马鱼幼鱼的生长发育情况，结果如图4所示，其中图4中红色箭头表示受SVCV感染后死亡蜷曲的斑马鱼幼鱼。
ldha+/+与ldha-/-斑马鱼幼鱼各96条，共准备两组。第一组，将每条斑马鱼幼鱼小心吸至96孔培养皿中，补充至每孔100μL 0.2％的海盐溶液。第二组，将每条斑马鱼幼鱼小心吸至96孔培养皿中，随后加入20μL SVCV(滴度为～2.50×107TCID50/mL)并补充80μL 0.2％的海盐溶液。将各处理组放回28℃恒温孵化箱中继续孵育，每小时在显微镜下统计一次斑马鱼幼鱼的死亡情况，结果如图4所示。
按照实施例3中方法处理ldha+/+与ldha-/-斑马鱼幼鱼后提取RNA通过RT-PCR检测病毒相关基因的表达情况，结果如图4所示。
如图4所示结果表明：ldha缺失斑马鱼感染SVCV后死亡率明显升高。用RT-PCR方式检测斑马鱼幼鱼体内病毒基因复制情况(方法和引物同实施例3)，发现ldha缺失斑马鱼体内SVCV-N、SVCV-P、SVCV-G的表达量明显升高。
由以上实施例可以得出：乳酸根离子可以抑制鲤春病毒血症病毒的复制与增殖，提高感染鱼体存活率，有效防治鲤科鱼类养殖过程中的鲤春病毒血症。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.乳酸根离子在制备防治鲤春病毒血症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治鲤春病毒血症的产品包括增强鱼体抵御鲤春病毒血症病毒的感染、抑制鲤春病毒血症病毒感染复制和抑制鲤春病毒血症病毒感染增殖中一项或多项的产品。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳酸根离子的使用浓度为1～15mM。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，提供所述乳酸根离子的物质包括乳酸钠。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物或饲料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括液体剂或固体剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述液体剂包括注射剂或浸泡剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述饲料包括水产饲料和乳酸根离子组分。
9.一种防治鲤春病毒血症的产品，其特征在于，所述产品包括乳酸根离子组分和辅料；当所述产品为药物时，所述辅料为药物学上接受的辅料；当所述产品为饲料时，所述辅料为水产饲料。
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| JPH04108360A (ja) * | 1990-08-28 | 1992-04-09 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | カルシウム吸収促進栄養剤、食品及び飼料 |
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