CN106574251A - 新颖噬菌体和包括其的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)以及包含其作为活性成分的组合物。另外，本发明涉及一种使用噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或所述组合物来预防和/或治疗鸟类的由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。

Description

新颖噬菌体和包括其的组合物

技术领域

本发明涉及一种具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力的新颖噬菌体、一种包括其的组合物、以及一种使用所述新颖噬菌体或所述组合物预防或治疗鸟类的感染性疾病的方法。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli，在下文中也称为‘E.coli’)是一种肠杆菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)革兰氏阴性短杆菌，且是存在于包括哺乳动物在内的各种动物的肠道内的正常菌落的一种。大多数大肠杆菌菌株无致病性并且可能引起机会性感染，但是一些高致病性菌株会在包括人类在内的动物中引起各种肠道疾病和败血症。

在这些大肠杆菌菌株中，禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli，APEC)通过例如鸡、鹅、火鸡等鸟类的呼吸道引起感染，且已知通过呼吸道粘膜进入禽类体内。就鸟类的呼吸道疾病而言，禽致病性大肠杆菌主要在家禽中引起疾病，这给家禽业带来巨大的经济损失。

同时，噬菌体(bacteriophage)指一种细菌特异性病毒，其预防和抑制感染有特异性噬菌体的细菌的生长。由于噬菌体具有比抗生素强的宿主特异性，并且近来出现抗生素抗性细菌以及动物体内抗生素残留的问题日益严重，因此噬菌体的应用已引起巨大关注。

已在多个国家对噬菌体积极进行研究，并且除关于噬菌体的专利申请以外，使用噬菌体的组合物获得食品及药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的趋势正逐渐增加。

然而，与噬菌体相关的用于预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的技术仍不充分，且由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病是在包含家禽饲养在内的鸟类饲养业中的重要问题，因此需要这类噬菌体和开发相关的技术。

发明内容

技术问题

由于针对克服抗生素抗性细菌的出现以及动物体内抗生素残留以及针对有效预防和治疗鸟类的感染性疾病的认真调查，因此本发明人从自然资源分离出一种新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)，其具有杀死引起家禽呼吸道疾病的禽致病性大肠杆菌的特异性能力。

此外，本发明人辨明了所述新颖噬菌体的形态学、生物化学和遗传特性，证实了所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并且使用所述噬菌体开发出抗生素、消毒剂、饲料添加剂和其它组合物、一种用于预防或治疗鸟类中的感染性疾病的组合物、以及一种使用其预防或治疗疾病的方法。

本发明的一个目的是提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)。

本发明的另一目的是提供一种用于预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，所述组合物包含噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

本发明的又一目的是提供包含噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或清洁剂。

本发明的再一目的是提供一种使用噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或包含其作为活性成分的组合物来预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。

技术解决方案

本发明的一个方面提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli)的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)。

本发明的另一个方面提供一种用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，所述组合物包含噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

本发明的又一个方面提供包含噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或清洁剂。

本发明的再一个方面提供一种预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，所述方法包括：向鸟类投予噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或包含其作为活性成分的组合物。

有利效果

根据本发明的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)有效果，其具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力。

此外，根据本发明的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)具有极好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，因此不仅可以在各种温度、pH和干燥条件的范围下用作预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的试剂，而且可以用作包含噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性组分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂、清洁剂等。

此外，本发明提供噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或包含其作为活性成分的抗生素，且所述抗生素由于下列而有效果：与之前的抗生素相比，所述抗生素具有针对禽致病性大肠杆菌的特异性，且因此选择性地杀死特异性致病菌而不杀死有益细菌，并且所述抗生素不引发抗药性，从而使得与之前的抗生素相比产品寿命延长。

此外，通过向鸟类投予噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或包含噬菌体其作为活性成分的组合物，本发明具有预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的效果。

附图说明

图1是新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)(在下文中称为‘ΦCJ25’)的电子显微图像。

图2示出了新颖噬菌体ΦCJ25的PFGE的结果。

图3示出了新颖噬菌体ΦCJ25的SDS-PAGE的结果。

图4是示出新颖噬菌体ΦCJ25的耐酸性实验结果的图形。

图5是示出新颖噬菌体ΦCJ25的耐热性实验结果的图形。

图6是示出新颖噬菌体ΦCJ25的耐干燥性实验结果的图形。

具体实施方式

在下文中，将更详细阐述本发明的实施例。这里将不再赘述所属领域的普通技术人员所显而易见的细节。

本发明的一个实施例提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli，APEC)的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)(在下文中称为‘ΦCJ25’)。

禽致病性大肠杆菌指通过例如鸡、鹅、火鸡等鸟类的呼吸道传播且能够引起鸟类的感染性疾病、特别是禽大肠杆菌病的大肠杆菌。具体来说，禽致病性大肠杆菌通过呼吸道粘膜进入鸟类体内，并引起各种疾病，例如败血症、肉芽肿、气囊炎、输卵管炎、关节炎等。正如普通的大肠杆菌一样，禽致病性大肠杆菌是革兰氏阴性菌，具有周生鞭毛进行移动，并且是好氧或兼性厌氧菌，从而分解乳糖(Lactose)和果糖(Fructose)而产生酸和气体。

禽致病性大肠杆菌在常见培养基中生长良好，且能够在约7℃至约48℃的温度下生长，理想生长温度介于约35℃至约37℃。具体来说，在接近鸟类体温的约42℃下，致病性因子有效地得到表达。此外，禽致病性大肠杆菌能够在介于pH 4.5至pH 9.0下生长。

噬菌体(bacteriophage)是能够感染特定细菌并抑制所述细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单股或双股DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)作为遗传物质的病毒。

具体来说，根据本发明实施例的噬菌体ΦCJ25是具有选择性地感染禽致病性大肠杆菌的物种特异性的噬菌体，且在形态学上属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，具有二十面体衣壳(isometric capsid)和可收缩尾部(contractile tail)(图1)。对噬菌体ΦCJ25的核苷酸序列与其它噬菌体的解码核苷酸序列的同源性进行了比较，且结果在[表1]中示出。噬菌体ΦCJ25在pH 3.5到pH 11.0下显示稳定的耐酸性，并未丧失活性(图4)，且在耐热性方面，即使当暴露在50℃或更高温度(例如，53℃)下2小时时仍不显示出活性降低(图5)。在耐干燥性方面，噬菌体ΦCJ25在干燥后显示出约2对数的活性降低(图6)。噬菌体ΦCJ25的DNA核苷酸序列在序列表的序列编号1中列出。

噬菌体ΦCJ25是由本发明人分离的新颖噬菌体，且在2013年10月25日以保藏编号KCCM11463P保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，韩国首尔西大门区弘济1洞361-221)。

本发明的另一个实施例提供一种包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物。

因为噬菌体ΦCJ25展现出能够特异性地杀死禽致病性大肠杆菌的抗细菌活性，所以可以用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌感染引起的疾病。由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的实例包括禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)，但并不仅限于此。

本文中的术语“禽大肠杆菌病”指发生于鸟类的呼吸道中的由致病性大肠杆菌感染引起的疾病，且其症状包括气囊炎(airsacculitis)、肝周炎(perihepatitis)、腹膜炎(peritonitis)、心包炎(pericarditis)、输卵管炎(salpingitis)、脐炎(omphalitis)、骨髓炎(osteomyelitis)或败血症(septicemia)，由此造成被感染鸟类的生长迟缓和死亡。

本文中的术语“预防”是指通过向动物投予噬菌体ΦCJ25和/或包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的组合物以抑止或减缓对应疾病，或延迟对应疾病发生的全部举措。

本文中的术语“治疗”是指通过向动物投予噬菌体ΦCJ25和/或包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的组合物来使感染性疾病的症状好转或减轻的全部举措。

根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物可以5×10²到5×10¹²pfu/ml包含噬菌体ΦCJ25、具体来说1×10⁶pfu/ml到1×10¹⁰pfu/ml的量包含噬菌体ΦCJ25。

根据此实施例用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物还可包含医药学上可接受的载剂，并且可与所述载剂一起配制，以提供食物、药物、饲料添加剂或饮用水添加剂等。

本文中的术语“医药学上可接受的载剂”指既不刺激有机体也不抑制所投予化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。

适用于此实施例的载剂的类型并无特别限制，而是可以利用在所属领域中常用的任何医药学上可接受的载剂。载剂的实例可包括盐水、蒸馏水、林葛尔氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇，但并不仅限于此。这些可以单独使用或以其2种以上的组合形式使用。

此外，必要时，可以向根据本发明的组合物中添加其它常用添加剂，如抗氧化剂、缓冲溶液和/或细胞抑制剂，并且还可向根据本发明的组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂而配制成可注射配制品，例如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、颗粒和片剂。

投予根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的方法并无特别限制，而是可以使用相关领域中常用的任何方法。投药方法的一个实例可包括口服或非经肠投药。

口服的剂型的实例可以包括含锭、糖锭剂(troches)、片剂(lozenge)、水溶性悬浮液、油性悬浮液、配制的散剂、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆及酏剂(elixirs)。

为了将根据此实施例的组合物配制成例如片剂或胶囊等的剂型，还可包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖(Saccharose)、山梨糖醇(Sorbitol)、甘露糖醇(Mannitol)、淀粉、支链淀粉(Amylopectin)、纤维素(Cellulose)和明胶(Gelatin)；赋形剂，例如磷酸氢钙(dicalcium phosphate)；崩解剂，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁(magnesium stearate)、硬脂酸钙(calcium stearate)、硬脂基反丁烯二酸钠(sodiumstearyl fumarate)和聚乙二醇蜡(polyethylene glycol wax)，而对于胶囊配制品，除上述物质外，还可包含液体载剂，如脂肪油。

非经肠投予此实施例的组合物的方法可以包括例如静脉注射、腹膜内投药、肌肉内投药、皮下投药和局部投药，以及将根据本发明的组合物施用或喷雾到患部的方法，但并不仅限于此。

为了调配非经肠剂型，举例来说，此实施例的组合物可以调配成用于注射的剂型，例如皮下注射、静脉内注射和肌肉内注射；栓剂；或用于喷雾的剂型，例如气雾剂以便能够通过吸入器吸入，但并不仅限于此。为了调配用于注射的剂型，可以将此实施例的组合物与稳定剂或缓冲剂一起于水中混合，以制备溶液或悬浮液，将制备的溶液或悬浮液配制成以单位投药的剂型，例如安瓿(ampoule)或小瓶(vial)。在将组合物配制成例如气雾剂等用于喷雾的剂型时，可以将组合物与推进剂等以及添加剂配制在一起，以便在其中分散水分散性缩合物或湿粉。

根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的适宜施用、喷雾或投药剂量可以根据以下因素而不同：例如动物的年龄、体重和性别、疾病症状程度、摄取的实物、排泄率等以及配制组合物的方法、投药方法、投药时间和/或投药途径，并且具有普通技术的兽医可以易于确定用于所需治疗的有效剂量并对此开出处方。

本发明的另一个实施例提供包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的抗生素。

本文中的术语“抗生素”意指以药物形式投给包含人类的动物、展现出杀死细菌的功效的制剂，并且用作防腐剂、杀菌剂以及抗细菌剂的统称。

此实施例的包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的抗生素具有以下效果：与典型抗生素相比，所述抗生素具有针对禽致病性大肠杆菌的特异性，且因此不杀死有益细菌，而是杀死特异性致病菌；并且所述抗生素不引发抗生素抗性，与典型抗生素相比使产品的寿命延长。

本发明的再一个实施例提供一种用于禽饲料或禽饮用水的添加剂，所述添加剂包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分。

作为施用所述禽饲料添加剂或禽饮用水添加剂的对象的鸟类并无特别限制，但是此实施例中的“鸟类”特别指家禽。

在本文中，“家禽”是家畜中属于鸟类的动物的通称。家禽并无特别限制，且可以包括选自鸡、鹅、火鸡等组成的群组的至少一种。

所述禽饲料添加剂或禽饮用水添加剂可通过使用噬菌体ΦCJ25或包含其的组合物单独制备饲料添加剂或禽饮用水添加剂并且将添加剂与饲料或饮用水混合的方式使用、或通过在制备饲料或饮用水的过程中直接添加噬菌体ΦCJ25或包含其的组合物的方式使用。

根据此实施例的以饲料添加剂或饮用水添加剂形式使用的噬菌体ΦCJ25或包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的组合物可以呈液态或干燥状态，例如呈干燥粉末形式。

举例来说，以饲料添加剂的重量计，根据本发明的噬菌体ΦCJ25以0.05至10重量％、具体来说0.1至2重量％的量以粉末形式混合。

用于干燥根据此实施例的饲料添加剂或饮用水添加剂以产生干燥粉末的方法并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何方法。干燥方法的实例可包含风干法、自然干燥法、喷雾干燥法和冰冻干燥法，但并不仅限于此。这些方法可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。

根据此实施例的饲料添加剂或饮用水添加剂还可包含其它非致病性微生物。所述微生物可以从由以下组成的群组中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；在例如牛胃的厌氧条件下具有生理活性和有机物质降解能力的乳酸菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；具有增加动物重量、增加产奶量以及增加饲料消化吸收率的效果的霉菌，例如米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；以及酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。这些微生物可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。

根据此实施例的包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂还可视需要包含其它添加剂。可用的添加剂的实例可包含粘合剂、乳化剂和防腐剂，其是为了防止饲料或饮用水的质量劣化而添加；氨基酸、维生素、酶、有益细菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂或寡醣，其是为了增加饲料或饮用水的效用而添加；以及其它饲料补充剂等。这些添加剂可以单独使用或以其组合形式使用。

以饲料的100重量份计，根据本发明的饲料添加剂可以0.05重量份到10重量份、具体来说0.1重量份到2重量份的量存在。以饮用水的100重量份计，根据本发明的饮用水添加剂可以0.0001重量份到0.01重量份、具体来说0.001重量份到0.005重量份的量存在。在这些范围内，所述添加剂使得针对禽致病性大肠杆菌的噬菌体ΦCJ25的活性得以充分展现。

本发明的又一个实施例提供通过向饲料或饮用水中添加包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或向其中直接添加噬菌体ΦCJ25所制备的饲料或饮用水。

此实施例中使用的饲料并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何饲料。饲料的实例可包括植物饲料，例如谷物、根用蔬菜、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、油脂、淀粉、谷物残渣或副产品等；以及动物饲料，例如蛋白质、无机物质、油脂、矿物质、单细胞蛋白、以及浮游动物或动物性食物。这些饲料可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。

用于此实施例的饮用水并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何饮用水。

本发明的又一个实施例提供包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的剂型并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何剂型。

为了去除禽致病性大肠杆菌，可以将消毒剂喷雾于鸟类的栖息地、屠宰场、死亡区域、厨房和烹饪设备等，但并不仅限于此。

清洁剂可以用于清洗暴露或可能暴露于禽致病性大肠杆菌的鸟类的皮肤或身体部位的表面，但并不限于此。

本发明的另一个实施例提供一种使用噬菌体ΦCJ25或包含其作为活性成分的组合物来预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。

具体来说，此实施例的预防方法或治疗方法包括向暴露或可能暴露于禽致病性大肠杆菌的鸟类投予医药学上有效量的噬菌体ΦCJ25或包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的组合物。对所属领域的技术人员显而易见的是，噬菌体ΦCJ25或包含其作为活性成分的组合物的适宜一日总剂量可由医师在合理医学判断的范围内确定。

对于某些鸟类来说，噬菌体ΦCJ25或包含噬菌体ΦCJ25作为活性成分的组合物的具体医药学有效剂量可通过考虑到要实现的反应的种类和程度、对应个体的年龄、体重、一般健康状况、性别或饮食、噬菌体ΦCJ25或包含其的组合物的投药时间和投药途径、组合物的分泌速率、治疗周期等来确定，且可根据医学领域中现有的各种因素以及类似因素而不同，包括同时或在不同时间使用的药物的组分。

噬菌体ΦCJ25或包含其作为活性成分的组合物可通过鼻喷雾以医药制剂形式投予鸟类，或直接添加到禽饲料或饮用水中以便被吸收，且可以饲料添加剂或饮用水添加剂形式与饲料或饮用水混合并且随后投予。

噬菌体ΦCJ25或包含其作为活性成分的组合物的投药途径和投药方法并无特别限制，而是可以通过任何途径和方法实现，只要投药使噬菌体ΦCJ25或包含其的组合物能够到达预期组织即可。即，噬菌体ΦCJ25或包含其作为活性成分的组合物可以通过各种口服或非经肠途径投予，且投药的实例可以包括经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻内、吸入等，但并不仅限于此。

在下文中，将参照优选实例更详细阐述本发明。应理解，这些实例不应被理解为以任何方式限制本发明。

[实例1]-分离感染禽致病性大肠杆菌的噬菌体

<实例1-1>

噬菌体的筛选和单一噬菌体的分离

将从一家位于忠清道洪城郡广川的三和远宗农场附近收集的鸡粪便获得的50ml样品在4,000rpm下离心10分钟，且通过0.45μm过滤器过滤所得的上清液以制备样品液，随后使用所制备的样品液进行软琼脂覆盖法(soft agar overlay)。软琼脂覆盖法指使用在顶部琼脂(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)中生长的宿主细胞来观察噬菌体溶解的方法。

具体来说，将150μl从韩国建国大学兽医系获得的禽致病性大肠杆菌(E09-19)的振荡培养溶液(OD₆₀₀＝2)和2ml 10×LB培养基(10g/l的色氨酸(tryptone)；5g/l的酵母提取液；10g/l的NaCl)与18ml经过滤的样品液混合，随后在30℃下培养18小时，并将所得的培养液在4,000rpm下离心10分钟，且通过0.45μm过滤器过滤所得的上清液。随后，将由3ml0.7％(w/v)琼脂和150μl禽致病性大肠杆菌(E09-19)的振荡培养溶液(OD₆₀₀＝2)组成的混合溶液倾倒于LB培养基平板中并固化，将10μl样品液滴在上面，接着在30℃下培养18小时，由此证实噬菌斑形成。

由于已知每一噬菌斑中存在一种噬菌体，所以本发明人尝试从所形成的噬菌斑中分离单一噬菌体。具体来说，向噬菌斑中添加400μl SM溶液(NaCl5.8g/l；MgSO₄7H₂O2g/l；1MTris-HCl(pH7.5)50ml)并且在室温下放置4小时，由此获得噬菌体溶液。

随后，将100μl噬菌体溶液与12ml0.7％(w/v)琼脂和500μl禽致病性大肠杆菌(E09-19)的振荡培养溶液(OD₆₀₀＝2)混合，将其用于使用直径为150mm的LB培养基平板实施软琼脂覆盖法，进行培养，直到噬菌体完全溶解。培养完成后，向LB培养基平板中添加15mlSM溶液并在室温下放置4小时，由此获得噬菌体溶液。

向所获得的溶液中，添加1％(v/v)的氯仿并混合10分钟，接着在4,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液，将上清液通过0.45μm过滤器过滤，由此获得最终样品。

<实例1-2>

噬菌体的大规模培养和纯化

使用禽致病性大肠杆菌(E09-19)大规模培养在实例1-1中获得的噬菌体，并且随后从其中纯化噬菌体。

具体来说，将禽致病性大肠杆菌(E09-19)振荡培养，并以1.5×10¹⁰cfu接种，随后于4,000rpm下离心10分钟，并重悬浮于4ml SM溶液中。为此，以MOI(感染复数)＝0.0001以1.5×10⁶pfu向其中添加噬菌体，接着在室温下放置20分钟。

此后，用其对150ml LB培养基进行接种，并在30℃下培养6小时。培养完成后，向最终体积的1％(v/v)的体积添加氯仿，随后搅拌20分钟，向其中分别以1μg/ml的最终浓度添加作为限制酶的DNase I和RNase A，并在30℃下放置30分钟。随后，添加氯化钠和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，分别至1M和10％(w/v)的最终浓度，且在4℃下放置3小时，随后在4℃和12,000rpm下离心20分钟，由此获得沉淀物。

将获得的沉淀物悬浮于5ml SM溶液中，且随后在室温下放置20分钟，边搅拌边向其中添加4ml氯仿，随后于4℃和4,000rpm下离心20分钟，由此获得上清液。通过0.45μm过滤器过滤上清液，随后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)进行超速离心(35,000rpm，1小时，4℃)，由此纯化噬菌体。

本发明人从农场鸡粪便收集的样品中分离出具有杀死禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenic E.coli，APEC)的特异性能力的噬菌体，所述噬菌体被称为“噬菌体ΦCJ25”并且在2013年10月25日以保藏编号KCCM11463P保藏在韩国微生物培养中心(Korean CultureCenter of Microorganisms，韩国首尔西大门区弘济1洞361-221)。

<实例2>

ΦCJ25的形态学观察

将实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ25稀释在0.01％明胶溶液中并且随后用2.5％戊二醛(glutaraldehyde)溶液固定。将所得的噬菌体滴加在经碳涂覆的云母板(carbon-coated mica plate)(约2.5mm×2.5mm)上，使其适应10分钟，然后用蒸馏水洗涤。

随后，将碳膜(carbon film)安放在铜网(copper grid)上，用4％乙酸双氧铀(uranyl acetate)染色60秒、干燥并使用透射电子显微镜(JEM-1011，80kV，放大倍率为×200,000)进行检查(图1)。

图1是噬菌体ΦCJ25的透射电子显微图像，其中形态学特征为尺寸为约83nm的具有可收缩尾部(contractile tail)的二十面体衣壳，表明所述噬菌体属于A1形态型(morphotype A1)肌尾噬菌体科(myobiridae)。

<实例3>

ΦCJ25的总基因组DNA尺寸分析

从实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ25提取基因组DNA。

具体来说，向纯化的噬菌体ΦCJ25的培养液中添加20mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50μg/ml蛋白酶(proteinase)K和0.5％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)，并在50℃下放置1小时，边搅拌边向其中添加等量的苯酚(pH8.0)，接着在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。

将上清液与相等量的PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合，随后在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。将上清液与等量的氯仿混合，随后在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。将上清液与以总体积计10％(v/v)的3M乙酸钠(sodium acetate)混合，随后添加2体积的95％冷乙醇，混合，并在-20℃下放置1小时。

随后，将所得的物质在0℃和12,000rpm下离心10分钟，去除上清液而获得沉淀物，将沉淀物溶解于50μl TE缓冲液(Tris-EDTA，pH8.0)中。将所提取的DNA稀释10倍，然后通过测量在OD₂₆₀下的吸光度来确定的浓度。

接着，将1μg DNA装载于1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并且使用伯瑞(BIORAD)PFGE系统程序7(尺寸范围25kb至100kb；切换时间斜坡(switch time ramp)0.4秒至2.0秒，线性形状(linear shape)；正向电压(forward voltage)180V；反向电压(reversevoltage)120V)在室温下进行电泳20小时(图2)。

图2是噬菌体ΦCJ25的基因组DNA的电泳凝胶照片，且可以看出噬菌体ΦCJ25的基因组DNA的尺寸约为39kbp。

<实例4>

ΦCJ25的蛋白质图谱分析

将15μl经纯化的10¹¹pfu/ml效价(titer)的噬菌体ΦCJ25溶液与3μl5×SDS样品溶液混合，然后沸腾5分钟以进行12％SDS-PAGE(图3)。

图3是对噬菌体ΦCJ25进行SDS-PAGE的结果的电泳照片，且可以看出主要蛋白质的尺寸为约约43kDa、约49.3kDa、约60.4kDa以及约94.9kDa。

<实例5>

ΦCJ25的遗传特性分析

为了确认实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ25的遗传特性，使用FLX钛测序器(titanium sequencer)(罗氏公司)作为基因分析装置来分析噬菌体ΦCJ25的DNA。基因由(株)千年基因公司(Macrogen Inc.)使用GS和从头组装软件(de novo assemblersoftware)(罗氏公司)重组。使用GeneMArk.hmm，Glimmer3.02版和FGENESB软件识别开放阅读框(open reading frame)。使用BLASTP和蛋白质扫描(InterProScan)程序注释(annotation)开放阅读框。

核苷酸序列与先前报导的噬菌体(大肠杆菌噬菌体EcoDS1)的核苷酸序列具有相似性，但是可以看出并不存在所有片段100％一致的噬菌体。因此，可以看出所述噬菌体是新分离的噬菌体。

下表1示出噬菌体ΦCJ25的核苷酸序列与所述领域中先前报导的噬菌体的解码核苷酸序列之间的比较结果。

表1

[表1]

使用测序器分析所制备的噬菌体ΦCJ25的DNA，且所分析的全部核苷酸序列在序列编号1中列出。

<实例6>

ΦCJ25的pH稳定性

为了确认噬菌体ΦCJ25是否能够在像胃部条件的低pH下维持稳定性，在各种pH(pH 2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0)下检测稳定性。

关于所述实验，制备0.2M浓度的各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 4.0、pH 4.5、pH5.0、pH 5.5)、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0和pH 3.5)、磷酸钠缓冲剂(pH 6.5和pH7.0)以及Tris-HCl溶液(pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0以及pH 11.0)。

将180μl的每一种pH溶液与20μl的具有1.0×10¹⁰PFU/ml效价的噬菌体溶液混合，使得每一pH溶液的浓度为1M，然后将所得的溶液在室温下放置2小时。对于控制组，通过相同的方法将20μl的具有1.0×10¹⁰PFU/ml效价的噬菌体溶液与180μl SM溶液混合，并将所得的溶液在室温下放置2小时。之后，连续稀释溶液，并将10μl每一稀释步骤中的每一溶液通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，以基于噬菌体是否溶解来确定噬菌体效价(图4)。

图4示出了噬菌体ΦCJ25的耐酸性的实验结果。在图4中，可以看出与控制组相比，噬菌体ΦCJ25在pH 3.5到pH 11.0下并未丧失其活性并且保持稳定性。

<实例7>

噬菌体ΦCJ25的热稳定性

如果将噬菌体配制成各种噬菌体剂型的饲料添加剂，在配制过程中可能产生热，且因此，进行以下实验来确认噬菌体的热稳定性。

具体来说，将100μl 1.25×10¹⁰PFU/ml的噬菌体ΦCJ25溶液分别在37℃、45℃、53℃和60℃下放置10分钟、30分钟、60分钟以及120分钟。接着，连续稀释所得到的实验培养溶液，将10μl每一稀释步骤中的每一溶液通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，以基于噬菌体是否溶解来确定噬菌体效价(图5)。

图5示出了噬菌体ΦCJ25的耐热性的实验结果。如图5中所示，可以看出噬菌体ΦCJ25在53℃下达120分钟时未显示出活性丧失，并且在60℃下达120分钟时显示出约1对数(log)的活性降低。

<实例8>

噬菌体的耐干燥稳定性

如果将噬菌体ΦCJ25配制成各种噬菌体剂型的饲料添加剂，在配制过程中可对噬菌体进行干燥，因此进行以下试验来确认噬菌体抵抗干燥条件的稳定性。

基于来自耐热实验的结果，干燥实验使用浓缩器(SpeedVac concentrator)进行。将200μl1.2×10¹⁰PFU/ml的噬菌体ΦCJ25溶液在60℃和真空下干燥2小时，并将所获得的丸粒(pellet)置于200μl SM溶液中，随后在4℃下完全重悬浮一天，由此测量效价(图6)。

图6示出噬菌体ΦCJ25的抗干燥性的实验结果。如图6中所示，可以看出在干燥后，与初始效价和相对稳定性相比，噬菌体在60℃下干燥2小时后显示出约2对数(log)的活性丧失。

<实例9>

检测噬菌体ΦCJ25对禽致病性大肠杆菌野生型分离菌株的感染范围

除本实验中使用的禽致病性大肠杆菌(E09-19)外，对由韩国建国大学的兽医学院分离的46株野生型禽致病性大肠杆菌、由韩国动植物检验局分离的10株禽致病性大肠杆菌、由韩国全北国立大学的兽医学院分离的7株禽致病性大肠杆菌以及由科微范分离的26株经疾病诊断的禽致病性大肠杆菌进行噬菌体ΦCJ25溶解活性测试。

具体来说，将150μl每一菌株的振荡培养溶液(OD₆₀₀＝2)混合，向其中滴加10μl具有10⁹pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ25溶液，并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，接着检测噬菌斑的形成(表2)。

结果在表2中示出。

表2

[表2]

如表2中所示，噬菌体ΦCJ25展现出对禽致病性大肠杆菌(O-1、0-125)的感染能力，所述禽致病性大肠杆菌是普通家禽农场中禽大肠杆菌病的主要致病菌。同时，已知O-78血清型一般来说是从家禽农场中分离的禽致病性大肠杆菌中最主要的菌株。

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附上序列表提交。

关于所保藏微生物或其它生物材料的说明

(PCT规则13之2)

表格PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月再版)

<110> CJ 第一制糖株式会社

<120> 新颖噬菌体和包括其的组合物

<130> P14-5114

<150> KR 10-2014-0044997

<151> 2014-04-15

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 39618

<212> DNA

<213> 新颖噬菌体CJ25

<400> 1

tcttcaatct taatcaggaa ccgtgagaac ttgtaggaca tcagataaga ccttccgatg 60

aacactgtac gtcctgacca atctccattg agtgtaacca cagttgagat ttcggtcaat 120

tcaccaaggt ccacgtaagc accctgactg tcaataagat agtagcgacc gggagacgga 180

gtgtttccac cataagcaga accaatgtca accgtagtct tataggtgtc agcgttgtat 240

gagtcaattg gtattatcat agacaccttg gagtcaacgt ggagtctata cggctctaat 300

ggaaagtcag ttgcctcctt gatgaactta aggtgctcaa ggtccacgcc gacttggtgc 360

tgacgaacaa tgaacatggt agagccaatc gacgcagacg ccagaatctt atcagcttta 420

gggaactccc agtgcgacca agaggcttga agctgtacgc cgtccttaaa caagaacttg 480

tagatgtaga ttcggttgta tgcacctgta gagttgacgc agatgtagtt ctcggtccct 540

gtaccttgaa tgtcaaacac cccgttaggg atataagaca gtacgtggcc agtggtatca 600

tcggcatcct tcacgtcaga cacatctgct acagcgaagt atcgcttaat gctggtgaat 660

gacccacgag gcgctgagaa gaagactgag cgtcctacag cgaacggtct ggcattatcg 720

cctacggcaa actctgagcc tacatcaagc tggatagact tcgaggtaag gacccctgag 780

cttgtcatca cgaactgcac ctcatctgac caaagtagta gctgctcact aaacggaacg 840

gcatacttaa ggattgagat tctagggtga cttacagcta cgtcaatagg atcgtcatca 900

ctcagtgtcg ccacactctt agggaagaac gcaaagtagc tggctgaacg gctcatgatt 960

acgttctcgc ctgacaagaa ccccagccta ttcctgtaga agaacacatc gttaatcgta 1020

gcatccacga agctaggcat agggtttgtg tcatcattac cagcaccacg cttagaccag 1080

tccagagtct tgaactcaaa ggagccgtca gattgtctca ccagagcatg tggcattgtg 1140

gtgttgtcga acccagtgac cactcccggc tctactgtct ccttccacgt cttagtgttg 1200

gagtcataca tcacgtaata ttcatcggcg ctactgttgg tctcaccttg aatcttaatg 1260

atgtacccat ttggagcagc aagaggcaac ttagagattg tctgcaccgt gtcgaggact 1320

gggctgatta gctggttagc gtagccatcc tccgtctcca ctgagttaat gtcagtccct 1380

gaaggggcag tgattaacag gaatccaggc ccaaggtcga acgtgaaggt agggtaagca 1440

gcaacaagaa ggtctctcag agcttcaccg atgacctgag catccacctt atgagggtcc 1500

ttctcggcat cagtacctgc tggcaactta tgcctaacct taactcctcc gttgattcct 1560

accctaaggg cgcgaccata ctgtccgcca cgcaggttaa ttaaagcacg agctttacaa 1620

ttataaccag agtgtgcctt ctcgctcccc cctttaacga caaccttacg gttcacgatg 1680

aacgtatagt ctgcaacggt aacgacacgg atatcatctc gcgggttgga cgacttaacg 1740

tagtctacct caccggaaac tgagtactga ttaccactca agtcaactac ctgaatgttg 1800

gacccgttga acacgatgta atactgctcc tgctcatcac ggttaatcag gtggaactta 1860

gggttgctcc caacgtcgat gttaagacgt cgcttgaaga ctgtaggtgg acgcttctgg 1920

agtccatcac tttcggatga ccagcagtta acttgctcct cgccttggtc cgagaacctc 1980

aggatgtcgg gctgctggct aatgccacct ttaaggttct tgattgattg agtaattagt 2040

ggcataggcc ctccttaaat catactcatt aggacgtatc cctcagcgat gtcaccaacg 2100

tcagcaatgt ggacaacctt acgtgctacc tgttgtccag tatacccgtt gtcccactca 2160

ttcaggataa gccagtcgcc aaccttaaag tcccggtcgt taagtctaag ctctgctgtc 2220

tttagaccta gctgtaccgg accaaagtgc tggcggtgaa tcttcaggtt gtgactagcc 2280

attagtccct cccgatgtcg gacatcatgt tgtagcgacc agtgtccatc tcgtattcca 2340

tgacctgctg atagagctct gcttcctgct cacgaaggta cagttcagac tctgggctac 2400

cgaagaactt agcgttgaac tcacggctag ctttagtgac gatgtagtcc ctgaagacca 2460

caggcatctc ggagaatggc ttcatctcca caagctctac cgtgataggg tcggtgaaag 2520

tggttgactg agtggacagg tcgtacaggt atccacccat gttgctgtag tagctggtgg 2580

ccccagtggt cattacacga aggtatgacg gcaagaatcg aatcctattg tcttggacat 2640

caggtgtcag gacagcagct tcgttgatgt taaagttcca gcctttagct tggacctgac 2700

gattgacacg atgcagtata cgttgagcgt tcgagacgtc agcgttcccc tcgtcaagct 2760

gtaggactgc tggttcaccg atagcagcta acatatcgtt gatggcgtct aagtcatcgt 2820

tagtattcag tggaatgtat tgagccataa gtctcctctc gctttaagca aaaaaaaccc 2880

ctcaagcacc cgaaggcacc caaggggttt caattagttg ttggactcag ccagtttagc 2940

ggccctgttc gcagcacgag tacgcgcagc tttctgttga ggagttaggg tctcctcttc 3000

aggtgcagcc gctactgtag cgacgttagg ttggctaaag gtgcttacgc cgctgcgctg 3060

aaaaccagtg cgccagccgc ttcagggcgc agaccaccgt gacccatagc gtacttacca 3120

acaatcaggt cgccctgagc atcgacgtca cggtcacgtt ccagcgccaa gtcacgcagc 3180

ttaacggtac ccacagcaga acggtgagag aacagaccca caacgttgtc catagcaact 3240

ttaacgtcgc cagtagcagt tgccgggaat gcgtgtttct gaccggaagt gatagagata 3300

ccatcgtcac cacgggtctc accagcgcca ccctgtacaa gatgcggaac ttcaacaaca 3360

acgaagccca tcacgttacg gatgttacca gtctctgggt caatcagcgc agcatagtta 3420

gcagcgttag gcatcagagc ggcgaggatt gcagagtagt tgtccggcgt ggtgtagaag 3480

taacggtcgc cagcaggaac gtagttggag gtcagcttcg cacgagcaat ggtcagttga 3540

ccaatgattg cttcacccag tttagccggg gtgtcgaggt cagctttctt accaacttcc 3600

agtacggacg cagtacccag accagcgatg ttctcgttgg atgcagctgg gaggttacac 3660

aggatagcca tttcagccag aacagcacca tcggcagcga tagccagagc ctcacccaac 3720

tggttggaat actcgccagc cacgtcatag tggttcatag cgtcttcaat gtcgaaaatc 3780

atcacatcgg cagtcagcag accatcaatg gtaatcactt tctcggtatg tttgatacct 3840

ttacgcttat ctgacagtcg ctcacctgga gccagataca caccagaggt gcggcccatg 3900

accgggaact gagcagactt accgttctga atggtacgga caatatgctt gtcagccgtt 3960

acagagcggc gagtgaatgc ggtcaggact tcaccagcaa agaccttcag gaacaacgcc 4020

agagcgtcgg aactggatgt acctttacct tggtctgtac caattttctg acccgtaacc 4080

tttgccatat gataattctc ctattcaatt gaaagataaa gtttattact tactgtatgc 4140

ccaatccgta tggactgaag taatagggaa accttgagtc tgtctcttgg tctccctata 4200

gtgatagttt agtcctacag gcttgaggcg gctaccttag cgcgaacttc catcgtgtac 4260

ttagcgtcac gcaggtatcg cgggtcactc atagccttaa tcatgtcagc cttggagctg 4320

aatgcttcgg tctgaggagc cttaggtgcg accacaggtt tagcctgagt ggtgatggta 4380

cgctgaggtt taacacctac agctttaccc agagtcttgc cagccagatt cagaagagct 4440

ttggtagtag caatgtcctt acgaacgata gcagcttcca gtgcttcacg agttgatggg 4500

tcgttggatt caaggtgtga caggattcga ttaaaatgtt cagcaccacc agcgtatcga 4560

accacaccag cagcgtactg ttcagccaga gcttcctgac cacgtacaaa cgaatctacg 4620

aaacgcttgg tgtaacctgc ttcctgcaac ttagcgtagg atgcgtcaga cagcttaccg 4680

tccttggcgt attcagcctt gatagcggta atctcatcag cagtgacctt gccagcttct 4740

acagcagaag acaccatgtc gtcgaatgca gcttcgtttt catccagagc ggtgacactt 4800

tcggtcagct ctttaggtgc atcaccaagt tcgacgaact caggttgctc accatcgttc 4860

tcagactctt cgtcatctga ctcgtggtct tcttcacctt cagtctcttc gacgttctcg 4920

tcttcttcgg tcgcctcttc gttttcgact tccagttgct tgaaggtaat agcgtcgtcg 4980

ccatcacgaa cagctacgtc ctgttcaagc atagacttct ggtattcgtt caggtcctca 5040

acggaaccag tgattgcatt agagctaacg ccaaactcgg cataaactga ttgagacatt 5100

gagtcattct cctttaagtc gttaataggt aaacacctac ttgcagtgtg ggactaacgg 5160

ctaccatatg gtcgacttag tagctcttac tttcggtgtt cctatagtga tagtttaggc 5220

ttgagccatg tcctcaccag ctccctgacc tacagcagca cccatgttag caccagcagc 5280

agacgcaccg ttgaccacag ctccttgagc ggattgttca gcaatacgtt gcatcttctc 5340

gtcctgagtc agaagcagac cagcggtgtc aattcctaag gcattcagta gtcgcagctt 5400

cagggtcggc aagttaatgt ccgggtcctg ttgcagaggc tgtagcccgg tcatcatgtt 5460

aaccgcctga gtcagcttct ccaagtcctg accacgacct aacgcttcca gaccagtgga 5520

gaccgtaggc tctaccgctt ctttcggaag gtcaggaatc atgccagcag actgaagttg 5580

gttcatcagc acacggacga taggtaactg aagctcttgt gactgtaccg agtacacgcc 5640

ccctaaggtc gcctccagtt cgccagcaac ataacgaatc tcttcagcag tcactcgctc 5700

agcattacgc tgaacagcac tattaagaag gaaggcccag cctaaacgtt gctcgatagc 5760

gtcagccacc gacttggcaa tcgtaaagtc ctgacctttc gtcagttgca ggaagttgat 5820

gtcctcgacg cgaccagcca cgaactcacc tgtagccgcc ttgttcagac gacgaggttg 5880

cgtgataccg ttcgggttaa cgaggcccac caccttggag gctaccttag ccattttggt 5940

gatagcttct gtaatcgtct ccagcgagtt caggtctcca agatactcct cgcagtaaga 6000

acgaccatag tcttcaccat ccagtcgaac cattcgtacc gggatgtatg gacatgcagt 6060

cagtgggtag gaaccctcgg tccctgctac ctcaatgcct tccacttctt catagcgcaa 6120

atactcgtcg tcctgacggt agatgtgagt atatacttcc agctctgtgt caggctcata 6180

gtcgtctgcg ttgagttgtg acttcacgtc ttccggtaga gcactaaacg ctaccttgtc 6240

gagagtcaca atctgcaaga tattaccgaa agcatcacgt tgaacaacgt aggacactaa 6300

gcggtacatt cgcataggac tgtaagtacc ttgttcaggc tctggaatgt agagcagaca 6360

gttaccggag acgataagct gcttcagagc ttcgaacaat gggacacgga aactgttagt 6420

ctccatgtag gccatcaaca cacgctcgac catagccagc ccttcgtcaa cacgagccgc 6480

agcctctgag tcctgactca aggtcttggc ctcatattcg gagactgtaa gtcgcatcca 6540

cggtgactga gggaataatg ccaacatcag ctttgcagcc aagttgttca agcagcgagc 6600

acctacagct tgccacggag ttgtgtactc agtagacgag ttgtcggact ccttaggaaa 6660

tagtgacggg atagtgacag cagcacagtt ctgagcgcgt gtctcatatg gctgtctacc 6720

gttctttagt ctgtcataga ccgctttagc tccttcagca gcgaaccctt cacgttcagc 6780

cattcgtcac ctccttaaat agaaataccg ccaccagagg tgcgagagac ctgaaggcta 6840

cgcttaccgg aacgcttcac tttcttctcg tcagatgtgg ttgtttcagt atccacatcc 6900

tccactttgg cgttcggtac ttccactggt gctgctgggg cctgagcctc aacaacctta 6960

ggtgcatctt cagctccaag accaacggtc cctagcgtac ttttcaccac tttcttgaaa 7020

gccttactga ttgatttacc cacggttaat ctccttagtt gttacgatgt ctaccgaccc 7080

agaaacatgc ttgacacgag aataccagcc aagaccccaa cgcttgcact cttcgtttac 7140

gatgtgcctg acagtctcaa gaaccttgcg ggaggactgc gagtcacgac gaatagcgac 7200

gattgaaagg tcaagaccgg gagtcggtcg gtgccaagat gcggtagcta gcatgtagag 7260

atacgctact ggttgacctg agacatcgta gattgtgtac tcttcaccat cgaactcgtc 7320

agcaatacgg taagtatgag ccttgaagtc ctcgaatgac ttgaagttag actgcccgtc 7380

ttcccagagg cgacaagcgc acatgtggcg accttcgcgt gagttgagat atggtagcat 7440

tgtcttaccc catgttgacg ccagaggctc gcatagcgcg acttactgac gatttatctt 7500

taggtgcaga ctccttcttg accttcaggt ctttgatacc tttggtctcg ttggtgtcca 7560

catccgattc agccccgatg tcaactgacg caacttcctc actcagaggt gctggttcag 7620

gtgcttggac cgaaggcttc ggagtgctaa tctttggact gaaacacata gtccctccta 7680

cagttaatca aactgaacgg tatctttcag ctcacgacgc atagcaatcg cagagtcgag 7740

agtgtcagag caatactgga gacccttgat aaaccctgca atgaacgcat cgctgtagcc 7800

ctgctgcttt aggagactga tagctcccat cttctcagcg tagcttgcgt tgaacagtac 7860

gtgcagaaac tggatggcag actgggagat gttcgggaca tcaagtcttt cttcctgtaa 7920

ctgcttaaca acgttttcaa tagcattaat tgccatcttg aatctcctct ttaagttaag 7980

actaaagtct atcttatagt catatcctag gtcctaaagt ccctatagtg atagtttagt 8040

gtttcaccta tggatgactg ttggattgat aggatatgac tatcggttag actcagtgtt 8100

tagggcggtt gttcgacccg aaccacttgt acatgcagta aagggccaga agtccggccc 8160

agtagattac atggatggtg tccacaggat gacctccttg gacttagggt catagtcgga 8220

ggctcgacaa atacgagcga cctgagcttg gaccagaagc tcctcctcgg tcatcccagc 8280

tttagcagcc agtgtaacca tgcagtccca cagcgtcatg tcttcacgct tcggatactt 8340

cttccactca gtcttaatct ggcctttgtt cttaccagtc ttaagctcac ggctctcctg 8400

cacgaagtag tacggctcgt caaggaacgc acgagtggtg tcctcaccca ttcccggaat 8460

gccaccgtag ccatctgtag tatcaccctt gatggtctgc tccatgtgcc agtagtctgc 8520

ctcggcagtc gtatgactca ggatttcacc agtggttaac cagaagaact cacagttcgg 8580

gatggtcttg aagtccttat cgcaggacac cagcaccgca tggtcacatc caacaatctg 8640

aggtcgggtc ccgatgatac ccatacagtc atcaccctca agcgtaggac gcaggaagct 8700

gttgaaccgt gggtcagcca tcacttctgc tacgaacttc ttgtaaccta caggcttgcg 8760

agaaccttta cgattggact tataggtagg cagaacctcc ttacgccagt tgttatcgtc 8820

agtaaagcac atcacaatct tagcgtcttt ccacgccttg cgcttcttga cgatttcaga 8880

gatggtgttc tcaaggatac gacgagcctt ctcatggtcg cagataatgg tccagatgtc 8940

atcaccccag tctgtctcgt cctcggcagc agccatagaa gagaagacca gatagtcacc 9000

atccagaacc agagctatct tcttctcaga acccatcgtc cagacctcca gtagccatag 9060

cgaccatagc tggcatcaaa gaaactttcg gctccttaat acgttcgaga gtcacctcag 9120

gctgaagcca tttgttggcg aactcgtggg ccatgtcgtt gtcctctgag tttaggtggg 9180

acatcaggtt ccagaagttt gaagacatct cagtctcatt ctcaaccggg cgatatactc 9240

cccagtcatt tacctctgaa ccatagctgt cactccacat accactggct acgatggtca 9300

gcccgatgaa cgggcgccac tcataggcct cagcgggaga ctctgtatat gactcaacgt 9360

ccttctcggt caaggtgtat gaccaagatg cgtagaactc agcgtacttg cggtgctcct 9420

tctcgcactc acccatttca aggaccagct ctttaagact ttcaggtatc ttcatagaca 9480

gcctccatgt tggttcagga acttaacgcc ttcagcggta atctcccacg caccattgtt 9540

acgcccatcc gtagacaggc agctcagatg tccacgactc gcagcctcag ccacaagtgc 9600

agcgttgttg cgcacatagt tggactggaa ggtcttcggg caggacttaa gggccgctag 9660

gacccgtaag tattcactca ttgcttgacc tcgaatcgca ggttggacac accgaactgg 9720

ccagcaccaa aggcgtctac cagctctttc ttgatgttct tcttggcgac aatttcaagg 9780

gcagactcag ggcctaactc gattgctgct ttgaccagag ccaactgaaa cccatccagc 9840

ttcttaccct cagcgtaggc tttagtcgtc tcagccagtt ggcgacacac ggtctcttct 9900

tcctttgagt tgataaccat cttcaggtcg aaacttacac gaatacgttt agtaatagcc 9960

attggtaaca ctcctttccg ttaatgacat tctttccacg tgggtccaat cttaccctca 10020

gtatcaagaa cacatttaaa gttatagaac tcacccacct tacgcatagc aagctgagca 10080

atcttgacga cttcttcggc aatctcctga gtacgacaag ctacttgaat ctcatccttt 10140

ctgtattctc ctattgctag gagtgtcgga ctatatcatc agcctttgag ttgactgtct 10200

ggcgcttcgg gtaacgaggg aatctcaccc tcggccctac tcctttcgga tagtctctac 10260

gccttccact ctctaatcca cttacacgcg gcagagaacg taacaccaaa cttctcacct 10320

aagtgtgttc ctgtacatcc agtctccagc cagtattcct tcgctgactc tttatggtca 10380

gcgtagcgtt ccctgtttgt cttgactgta tgctcagacc cttctagtaa ctggagatgc 10440

tctgcgttac agcatgccct gttcctacac ttgtggtcta cttcataccc ttctggtata 10500

tctccgtgct gttccttcca gactgtcctg tgatacatct ctaggacacc gttagtcctc 10560

tttcggaaat aaccatcagc attaagtttg tgtgacgtag ggatgataca accactctct 10620

gtggtcgcaa ggattaactt cttgcctctc atatatcctc cctatggctt ggctcggtat 10680

tgccctagaa gggtttcacc gagttcacca gatttaatgt gcacaatgag atagtttatg 10740

cacccatgcc atatatgcaa agtctccttc ccagccgtga acatacccgg cctcttctag 10800

catacgttca gtctcgacaa tccagtgctt acagactacc gcaccatcgc cttgaagtag 10860

ggcgttaagt gctgagtgtg gagaccggat gtgaatgcgg cgaccatcaa gtccacgcaa 10920

ccaacggcgt ttccacttga cgatgttctc accatctacc cacttagagt ctgagattaa 10980

cgtattactc acagcttccc tgaggtcctt gatggctggt gtgccctcaa tgaatttctt 11040

catgagagct gaaccttcct tcttaccacc gccgactatc agtccaatct tcgctgcgcc 11100

tgcaccatac aggaacgcat agatgaacgt cttggcgttg ttgcggaaag cctcatggtc 11160

gtggctcgac ttatcgcgtg ggacgttagg tgctaaccca gcgtttactg cgttggccca 11220

gtggatgtca ccttcgacca cagtcttcgc ataggcacca ccatcaaacg gagccgctcg 11280

gttccccaga caacgaagct caagacctga ggcatcaaca cccacttgaa tccaagggtc 11340

tggcttaccg tccttcttat tccacgctgc accgaaggca ccacggcaag tctcaccata 11400

cggagcaccg ttagcaggga cctgagccat gtttggtgaa ctatgggtcg cacgtccggt 11460

tactgccccg catgggttga ttgaaccgtg catacgtccg tctggaccta caagtttcaa 11520

ccatgcgttc ttaccttcag ccacctgacc tatgcgcttc tggactacaa gatactcacg 11580

gaccagctct acgcaagcct gagcctctgc gtctggtaac ttaacgtgtt ctaacgtctc 11640

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gaatggtgct ccctccatcg tgtctcgtga gtcgaactcg caaggctcca gtcctaggcg 11820

ttgagctttg ttcttcggct tcttgaatac tgacccgacc ttaggataca cgactcgagg 11880

atacttcgga aggtccttgc ctgtacgtgg gtgcttgaag aactccttgc ctcccttcgg 11940

tgcataccag ctaccgaaag tcgaacgcag cttgtccagt agctctgcac gtttgacagt 12000

gagttcacga tataagcctt cgaccatctc ggtgttcatc ggatagccgt tacgttccat 12060

cttcgcacag gtccacgcag catcatgttc cagacgcaac gcataaatct ggtcgaaagc 12120

gaactgttca gactggaagt aatacttgtc agtcagaaac ttcttgaaca acgccagcgt 12180

gaccacaacg tcttgaacgt tatagtccag catctcctga gacgggaaca accattcgtc 12240

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caagcgagct agcaccaagg tatcaacaat tcgaccctta ttcacattta ggttcttacc 12480

gaagtatttc ttcttcagta ttttcaaggc tggtatatca tagttcacac cattgtgcag 12540

aaccagcata ccgtcagtgg atgccataat agattctatg cggtctatat attctttgaa 12600

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tctaatcata aaggccactc gatgtgaatg gccttgagtc tagacctaga agtctgtacg 13260

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gtctcccaga atgttggaca ggcaggtcgc ttcgtcactc caccatttgt acatgaaccg 13380

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gactcggcga atgaatcgta caggtggaac ttatcgtctc cgaacagctt gtcataccat 13980

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ttagagttta ttaaccgcgg tctgaagtga ccagttcgtt ggtagacatc cagcgttgta 15480

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tggagcaatt tatggttgaa gacgtgagag ttactaatct tcacgtacac ttcacccggc 16020

ttaccgtgga tgataaacga atagcctacc gggattttat caatggtcag acgcttacga 16080

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gtcgtaatca ccaccagagc cagagtcgtc accaccttcg gaaccatcgt caccgaagtc 16620

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ctctgacttc ttaccagctc ggagtcgata cttcaggacg ttacccaagc agaatccacg 17700

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ttaaatcttg accgtagggt cgtcctcagt tccacgccac tggtcgaacg agggatgccg 18720

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ttaccgtcgt cggtgattgg ttgttcacca tacgccagac acatcagctc agacttatgg 23460

ccctctgccc ggagtcgtgc ctgtagcaca cggtcacgct cctcctgttg acgtgcggag 23520

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tcatctcgta gcacccatcg tagaacgcct gttcactgct ataagttatc tggtacatgt 24540

tacttatcct catcgtgtag actatcgtga atacgtttgc ggccctcata gaccgctttc 24600

aggtgacgca tagtcgcatc gtggtttaac tgcccggtct tgaccataat ccgggcgttg 24660

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tgttggtcgt caccgttgtt tcgatgtggt acagcttaca tcttatcgtt actgcttgtc 25260

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tttgggcacg agtgttcata ctaatatcca gcttaggagc attatataaa tctatgcgct 29940

cccctacagc cccagagcga tcggcaatgt taacagcaat agaaaaagtg gtattgtttc 30000

cttcaatttt gatggtggag cgtttatctg cattaattga aatggcaggg gatgcctcag 30060

ctgttgacat tcctgtaatc tccaatgctt gcacatactt agtgatgtat atctttgcct 30120

cttcactata gttacctgcc aaacacgttg cctggctgtc accaattctt atctcacctg 30180

tttcaattgt acttgaaatt actgacgtcc caacaatggg aacttcaacc ttagtcccta 30240

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tacggcgtgt ttctacccca ccagtagagt tggtgaatgc aatttcaaac cagatatcga 30360

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tcgtgctcat tccttcaata gaaaccgtac actgcctggt actcccgccg atatagccca 30480

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caattaagtt ggcattaaaa ccaccagcta tggggatgga gtatgttgta ttatcttgtg 31080

ttgttgatat taaccaatct gattcagatt ttattccatg tttgttttta tatgttttta 31140

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gagctacttt aggtttagcc ttgaggcctt ccgtgagtgc gtcaaatacg ttagcgctta 35460

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gtcgatgatg tctcgaccaa ccttccaaga ctcagggtta tccccgacca taagttgatg 36300

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aatattacta gccattagtc ctcctcttag ctatgacctg taggtgtgcc tttagcagca 38220

ctaatcggtg cagcaccacc agagcttgat gccccagaga ttgacttacc agcagcgtac 38280

ccctgcatcc cggcgcttgc aacattaagt gcatgagcca gtgggctggt cttgatgatt 38340

ttaccctgac cacggatagc agacttggtg ttctcaatgt tggcgatacg gttcccgaag 38400

atagccgcat agtcgcggtt gtaactttcg gtaatccctg ctcgctcctt gactgtatct 38460

ccttcgacct gacgttcaat cctgtccata gagttacctt ccagaccgga ctcagccacc 38520

gcagctcgga ccataccctg attgcgtata ccgttgagcg tggtctctgt cagttcagcc 38580

atctgctgct ccttcaggtc tcgctcctgc atcctcaggt tggcgtcaga atagttcatc 38640

tgcttaacca tttcctgagc ctgtcggttc tgagcgtcaa ttgctgcacc ttcggccttg 38700

gcctgctggg atgcggacat agtggccccg gctacagcca tgatgcccat ggcgatactt 38760

acgggttcac acatacgtcc tccttagaga tagtgaataa ttgaaaacgc tcaccagtta 38820

ccgggctgat agtccaatca tcatggaact tagccccaag caacttcaag aatttaatgt 38880

gagacttatt gcctgaccac acgtagttcc agatggtccc gtattggtct aacattaagt 38940

ccctgtactc agagatacgc tttacgaact ctcgcttctc tttaggtctc agcttataga 39000

caagaccgga agtcaagaac catacgttat ccccttggtt tccaccatag gcaaacactt 39060

cgcctacacc gttcgttaaa accacagatg acggggataa atgcttaagc agtctttcag 39120

atagacccac ggttgaccca tagtttgctt tgcattcatt aacatcatct gctgaaagat 39180

gccacagaaa gtagtggaca tctggttccg tagccttgcg aatatacata aagtctcctt 39240

ataaccttaa gggcctatag tccctatagt gatagttaag gtaaatctat aggccattca 39300

ataagttaaa cggaacgagc tttcttagcg tatgacgcct cccagccaca cccaacgatt 39360

gacactgggg taggatagtc ggactctaag gttagactcg tggttaatgc gttaccattc 39420

atagcgaagc gatactgacc atccccaatg ttggtagtcc cgatggtttg ctgaccaagg 39480

gtgtacccat taaaggtgtt cacgaactcc cgctcaccgt ttctgacaat gagtctaaga 39540

gcaccagtgt ccttgtagtt gacccaagcc cgacgaagtt gtaggcgtcc agtgtcttca 39600

gactgagtgc cactttcg 39618

Claims (12)

1.一种噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)，具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli)的特异性能力。

2.一种组合物，用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病，所述组合物包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述感染性疾病是禽大肠杆菌病。

4.一种抗生素，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

5.一种禽饲料添加剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

6.一种禽饲料，包含根据权利要求5所述的禽饲料添加剂。

7.一种禽饮用水添加剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

8.一种禽饮用水，包含根据权利要求7所述的禽饮用水添加剂。

9.一种消毒剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

10.一种清洗剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)作为活性成分。

11.一种预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，包括：

向鸟类投予根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ25(KCCM11463P)或根据权利要求2所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，其中所述感染性疾病是禽大肠杆菌病。