KR101977622B1 - 판람근 뿌리 발효 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
판람근 뿌리 발효 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 판람근 뿌리 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 판람근 뿌리 추출물을 발효시킨 발효액에 인간 감염성 질환을 일으키는 바이러스로 생식기질환이나 구순염을 일으키는 헤르페스바이러스, 대상포진을 일으키는 헤르페스조스터바이러스, 호흡기 질환을 일으키는 코로나바이러스, 심근염, 피부발진 등을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 판람근 뿌리 추출물을 발효시킨 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
바이러스 질환은 매우 다양한 질병을 유발하며 바이러스의 종류에 따라 그 증상도 각기 다르다. 호흡기 질환을 일으키는 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 라이노바이러스 등이 있으며 설사 등 장염을 유발하는 바이러스는 로타바이러스, 엔테로바이러스이며, 면역질환은 레트로바이러스, 암을 유발하는 바이러스는 아데노바이러스, 파필로마바이러스 B형 및 C형 간염 바이러스 등이다. 또한, 헤르페스심플렉스바이러스는 얼굴 이나 생식기 피부에 포진을 일으키기도 하며, 헤르페스조스터바이러스는 대상포진의 원인이 된다.
엔테로바이러스에는 폴리오바이러스 그룹, 코사키바이러스 그룹, 엔테로바이러스 그룹으로 나뉘어지는데 엔테로바이러스 감염 환자는 전 세계적으로 5천만 명의 환자가 있을 것으로 추산된다[Morens DM 과 Pallansch MA1995. In; Human enterovirus infections. Robalt HA (ed) Washington, DC, ASM Press, pp3-23]. 폴리오바이러스는 감기나 소아마비를 일으키고[Pallansch MA 2003. In :infectious diseases. Gorbach SL, Barlett JG, Blacklow NR (eds). Philadelphia:Lippincott, Williams and Wilkins, pp 2347-2057], 코사키바이러스는 무균척수염이나 뇌염 [Chonmaitree T. 등, 1981. Pediatrics. 489-493], 급성 근육마비, 심근염[Fujioka S, 등. 2001. Biodrugs. 15(12):791-799], 타입 I형 당뇨[Green J 등. 2004. Diabet Med. 21(6):507-514], 피부발진[Moreira RC 등, 1995. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 37(3):235-238], 엔테로바이러스는 수족구 병[Chang LY 등, 1998. Lancet 352: 367-368]의 원인이다.
인플루엔자바이러스는 인플루엔자 A, B, C 형 바이러스가 있는데, 이 중 발병 빈도수가 높은 것은 인플루엔자 A형 바이러스와 인플루엔자 B형 바이러스이다. 따라서, 매년 독감 예방 백신은 2종의 A형 바이러스와 1종의 B형 바이러스가 혼합된 형태로 제조된다. 인플루엔자는 매년 10억 명의 환자가 발생하며 심한 호흡기질환을 유발하며 사망하는 예도 발생한다. 특히, 유행성 인플루엔자의 경우는 사망률이 더 높아지는데 1918년 대유행 때에는 15~50백만 명의 사망자가 속출했으며, 1957년에는 2백만 명이 사망했고 1968년에는 1백만 명이 사망하였다. H5N1형의 조류 인플루엔자바이러스가 사람에게 감염된 사례가 보고되면서 최근 조류 인플루엔자바이러스에 감염되어 사망하는 사례가 증가되고 있어 조류 인플루엔자바이러스의 대유행 가능성이 점차 높아지고 있다[G Juckett. 2006. American Family Physician 74(5) 785-790].
코로나바이러스는 숙주동물에 따라 각기 발병되는 증상이 다른데 사람에게는 호흡기질환(HCoV-229E), 생쥐에게는 간염증상(MHV-A59)을, 돼지에게는 심한 설사증상(TGE-Purdue 115, PED-CV777), 소에게는 호흡기질환(BCoVENT)을 유발하고 있으며 2003년에 나타난 사스바이러스는 중증 호흡기질환을 사람에게 유발한다.
판람근은 배추과 식물인 대청[숭람(藍)] Isatistinctoria L..의 뿌리를 말린 것이다. 대청은 각지에서 심는다. 일반적으로 한의학재로 사용되어 왔으며 가을에 뿌리를 캐 햇볕에 말려서 쓰며, 맛은 쓰고 성질은 차다. 주로 열을 내리고 해독하며 혈열(血熱)을 없애는 효과가 알려져 있으며, 약리 실험에서 항균 작용이 밝혀져 있다.
다만, 판람근의 추출액을 그대로 쓰는 방법에 대해서는 알려져 있으나 이를 발효하였을 때 바이러스 감염 및 치료 효과가 증가되어 바이러스 질병을 직접적으로 억제할 수 있는 효능이 있음은 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구 노력한 결과, 판람근 뿌리 추출물을 발효시킨 발효액에 인간 감염성 질환을 일으키는 바이러스로 생식기질환이나 구순염을 일으키는 헤르페스바이러스, 대상포진을 일으키는 헤르페스조스터바이러스, 호흡기 질환을 일으키는 코로나바이러스, 심근염, 피부발진 등을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 직접적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 판람근 뿌리 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 판람근 뿌리 추출물을 발효 효모를 이용하여 발효시킨 발효액을 이용하여 일반적인 제품 제형과 혼합하여 바이러스 감염 및 치료제를 발명하였으며, 상기 혼합물은 바이러스로 생식기질환이나 구순염을 일으키는 헤르페스바이러스, 대상포진을 일으키는 헤르페스조스터바이러스, 호흡기 질환을 일으키는 코로나바이러스, 심근염, 피부발진 등을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면, 본 발명은 판람근 뿌리 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 바이러스성 생식기질환이나 구순염을 일으키는 헤르페스바이러스, 대상포진을 일으키는 헤르페스조스터바이러스, 호흡기 질환을 일으키는 코로나바이러스, 심근염, 피부발진 등을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 판람근 뿌리 추출물의 발효액을 이용하여 바이러스가 포유동물 세포에 세포막에 부착되는 것을 억제하는 것을 관찰한 컨포컬 레이저 현미경 사진을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 목적상 바이러스는 헤르페스심플렉스바이러스(Herpes simplex virus), 헤르페스조스터바이러스(Herpes zoster virus), 코사키바이러스(Coxsackie virus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 인플루엔자바이러스(Influenza), 코로나바이러스(Coronavirus)이다. 엔테로바이러스에는 폴리오바이러스, 코사키바이러스, 엔테로바이러스 등이 포함되어 있으며 인플루엔자바이러스에는 인플루엔자 A형, B형, C형 바이러스가 포함되어 있으며 코로나바이러스에는 사람코로나바이러스(HCoV-229E), 돼지 코로나바이러스, 소코로나바이러스, 사스코로나바이러스(SARS-CoV) 등이 포함되어 있으며, 헤르페스바이러스는 헤르페스심플렉스 타입 1 및 타입 2 및 헤르페스조스터바이러스 등을 포함하고 있다.
본 발명에서 용어, "항바이러스[anti-virus] 활성"이란 상기 엔테로바이러스, 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스이며 보다 구체적으로 엔테로바이러스에 속하는 폴리오바이러스, 코사키바이러스, 엔테로바이러스의 다양한 아형과 변이형, 인플루엔자바이러스에 인플루엔자 A형, B형, C형 바이러스의 다양한 아형과 변이형, 코로나바이러스에 속하는 사람코로나바이러스, 돼지코로나바이러스, 사스코로나바이러스의 다양한 아형과 변이형 및 헤르페스바이러스는 헤르페스심플렉스 타입 1 및 타입 2 및 헤르페스조스터바이러스 등을 포함하며 바이러스입자가 숙주세포에 감염되는 것을 억제하는 능력, 즉 숙주세포의 세포막에 바이러스 입자가 달라 붙어 세포 내로 유입되는 것을 억제하는 능력을 의미한다. 이러한 결과로 바이러스는 숙주세포를 이용하여 바이러스입자를 복제 또는 증식 하는 것에 필요한 기작을 방해하게 되며 이를 통해 항바이러스활성을 가진다.
본 발명의 도면 1에 의하면, 본 발명의 항바이러스 활성은 바이러스를 처리한 포유 동물 세포에 바이러스의 감염 여부를 시간에 따라 확인하여 본 결과 바이러스가 세포막에 붙는 것을 억제하여 일어나는 것으로 분석되었다.
본 발명은 판람근 뿌리 추출물에 발효 효모를 접종하여 발효시킨 발효액의 필터액을 유효성분으로하는 항바이러스 감염 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 특징이 있다.
본 발명의 조성물은 상기 판람근 뿌리 추출액을 발효한 발효액을 필터액 또는 원액 외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 판람근 뿌리 추출물에 발효 효모를 접종하여 발효시킨 발효액의 필터액을 유효성분으로하는 항바이러스 화장품 및 피부외용제를 제공하는데 또 다른 특징이 있다.
또한, 본 발명은 판람근 뿌리 추출물에 발효 효모를 접종하여 발효시킨 발효액의 필터액을 유효성분으로하는 항바이러스 건강식품을 제공하는데 또 다른 특징이 있다.
본 발명의 식품은 상기 판람근 뿌리추출액 발효액의 필터액 외에 적절한 담체 및 부형제 또는 보조 유효성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 드링크제의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 제형에 사용되기에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유 등이 포함된다. 본 발명의 식품을 제품화하기 위하여, 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 발효는 판람근 뿌리 추출물을 기질로 하여 유산균, 구체적으로 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum) 및 비피도박테리움 비피디움(Bifidobacterium bifidum) 중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 첨가하거나, 효모, 구체적으로 Galactomyces, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces ellipsoids, Saccharomyces boulardii , Bifidobacterium longum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc sp, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaseus 중 선택된 1종 이상의 효모를 첨가하여 이를 기질에 접종하는 단계; 35 ~ 45 ℃에서 1 ~ 3 일간 1차 발효시키는 단계: 다시 2 ~ 6 ℃에 서 12 ~ 36 시간 동안 2차 발효시켜서 발효액을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
참조예 1 : 판람근 뿌리 추출물의 제조
환류냉각관을 부착시킨 둥근 플라스크에 판람근 뿌리 100 g의 시료에 증류수 1 L를 넣고 80℃의 수욕조 상에서 3 시간씩, 3회 반복 추출하여 얻은 추출물을 여과지로 여과하여 제조 하였고, 하기 발효 원료 및 실험예의 시료로 사용하였다.
참조예 2 : 판람근 뿌리 추출액의 발효
Saccharomyces cerevisiae 균을 YM 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도 에서 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 YM 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도 배양기에서 24시간 진탕배양시켜 종균으로 사용한다.
판람근 뿌리 추출액이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양된 Saccharomyces cerevisiae 균을 107~108 CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 35 ~ 45 ℃에서 1 ~ 3 일간 1차 발효시킨 후, 다시 2 ~ 6 ℃에 서 12 ~ 36 시간 동안 2차 발효시켜 발효물을 제조하였다.
발효를 종료하기 위해 100℃에서 40분간 열을 가하여 균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.
제조된 발효액은 동물세포 배양용 배지인 MEM과 동량으로 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과하여균을 제거한 액(발효액 필터액)을 항바이러스능 측정에 사용하였다.
참조예 3 : 바이러스의 배양
항바이러스 활성 분석에 사용된 인플루엔자 A 형 바이러스[A/WS/33]와 인플루엔자 B형 바이러스[B/Lee/40], 엔테로바이러스로서는 코사키 A16 바이러스, 코사키 B3 바이러스, 코사키 B4 바이러스, 엔테로바이러스 71(EV71), 헤르페스 바이러스로서 헤르페스 심플렉스 타입 1 및 2(Human Herpesvirus 1/2, VR-734, 1383) , 헤르페스 조스터는 ATCC로부터 구입하였다. 인플루엔자 A형 바이러스와 인플루엔자 B형 바이러스는 MDCK 세포에서 증식배양하였으며, 엔테로바이러스로서는 코사키 A16 바이러스, 코사키 B3 바이러스, 코사키 B4 바이러스, 엔테로바이러스 71는 Vero 세포, 헤르페스 바이러스는 NIH3T3-E1 세포에서 증식 배양하고 각각의 바이러스 역가를 측정하여 TCID50에 해당하는 바이러스 용액을 산출하였다.
실시예 1 : 코사키바이러스에 대한 발효액 필터액의 항바이러스능 시험
발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, Vero 세포 2 × 104 개를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고, TCID 50이 되도록 희석한 1종의 코사키 A 바이러스(A16)와, 2 종의 코사키 B 바이러스(B3, B4) 바이러스 용액 90 ㎕을 각 웰에 넣은 다음, 상기 참고예 2에서 제조한 발효액 필터액 배지 혼합액 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다(발효액 필터액의 최종 농도 5%).
한편, 각 균주를 배지에서 배양한 배양액을 동량의 MEM 배지와 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜서 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다( 배양액의 최종 농도 5%).
각 발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능 측정은 권두한 등이 발명한 등록 특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 감염시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1 시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 발효액 필터액만을 처리한 군[B], 바이러스만을 처리한 군[C], 바이러스와 발효액 필터액을 같이 처리한 군[D]으로 표기하였고 각각 발효액의 세포생존율(%) [수학식 1]과 발효액 필터액의 바이러스에 대한 증식억제능(%) [수학식 2]로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
각 필터액 또는 배양액 5% 농도에서의 세포생존율(%) 및 바이러스 증식 억제능(%)을 구하여 다음 표 1(세포생존율)과 표 2 (바이러스 증식 억제능)에 나타내었다.
| 구분(%) | 세포 생존률 | ||
| 비처리군 | 발효액 필터액 | MDR 배양액 | |
| Vero 세포 | 104.00 ± 7.21 | 100.13 ± 2.12 | 97.05 ± 0.99 |
| NIH3T3 세포 | 104.00 ± 8.23 | 99.09 ± 2.04 | 104.34 ± 8.23 |
| MDCK 세포 | 99.50 ± 2.15 | 104.14 ± 3.07 | 99.50 ± 2.15 |
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 바이러스에 감염 실험에 사용될 세포들에 대해 발효액 필터액이나 배양액은 5%의 농도조건에서 대조군에 비하여 95 ~ 109%의 세포생존율을 보임으로써 세포 성장에 영향을 거의 미치지 않음을 알 수 있다.
| 구분(%) | 비감염군 | 감염군 | |||
| 비처리군 | 코자키 A16 | 코자키 B3 | 코자키 B4 | ||
| 배양액 | 99.72 ± 1.87 | 0.00 ± 12.60 | 0.60 ± 2.34 | 2.44 ±4.46 | 9.14 ± 2.55 |
| 판람근 추출액 | 100.56 ± 2.52 | 0.00 ± 12.60 | 18.32 ± 0.50 | 32.75 ± 3.51 | 9.90 ± 1.28 |
| 추출액 발효액 | 104.34 ± 8.23 | 0.00 ± 12.60 | 58.49 ± 4.76 | 87.98 ± 3.53 | 80.27 ± 6.58 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 판람근 뿌리 추출액의 발효액 필터액은 1/20(5%)의 농도에서 코사키바이러스 A16 형에서는 58.4% 이상의 억제능을, 코사키바이러스 B3 형에서는 87.9% 이상의 억제능을 보였으며, 코사키바이러스 B4 형에서는 80.3% 이상의 억제능을 보였으며, 배양액은 코사키바이러스 A16 형에서 0.60% 의 억제능을, 코사키바이러스 B3 형에서 2.44% 이상의 억제능을, 코사키바이러스 B4 형에서 9.14% 이상의 억제능을 보여 발효액 필터액이 배양액 보다 20 ~ 50배 이상의 항바이러스능을 나타내었다. 판람근 뿌리 추출액만을 처리하였을 때 코사키바이러스 A16 형에서는 18.32% 이상의 억제능을, 코사키바이러스 B3 형에서는 32.75% 이상의 억제능을 보였으며, 코사키바이러스 B4 형에서는 9.9% 이상의 억제능을 보여 발효유 필터액은 발효시키지 않은 단순 추출액보다 2 ~ 9배 이상 항바이러스능이 뛰어났다.
실시예 2 : 엔테로바이러스에 대한 발효액 필터액의 항바이러스능 시험
발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, Vero 세포 2 × 104 개를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고, TCID 50이 되도록 희석한 EV71 바이러스 용액 90 ㎕을 각 웰에 넣은 다음, 상기 참고예 2에서 제조한 발효액 필터액 배지 혼합액 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다(발효액 필터액의 최종 농도 5%).
한편, 각 균주를 배지에서 배양한 배양액을 동량의 MEM 배지와 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜서 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다( 배양액의 최종 농도 5%).
각 발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능 측정은 권두한 등이 발명한 등록 특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 감염시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1 시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 발효액 필터액만을 처리한 군[B], 바이러스만을 처리한 군[C], 바이러스와 발효액 필터액을 같이 처리한 군[D]으로 표기하였고 각각 발효액의 세포생존율(%) [수학식 1]과 발효액 필터액의 바이러스에 대한 증식억제능(%) [수학식 2]로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
| 구분(%) | 비감염군 | 감염군 | |
| 비처리군 | EV71 | ||
| 배양액 | 99.72 ± 1.87 | 0.00 ± 12.60 | 11.47 ± 1.25 |
| 판람근 추출액 | 100.56 ± 2.52 | 0.00 ± 12.60 | 21.85 ± 1.71 |
| 추출액 발효액 | 104.34 ± 8.23 | 0.00 ± 12.60 | 92.74 ± 1.63 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 판람근 뿌리 추출액의 발효액 필터액은 1/20(5%)의 농도에서 엔테로바이러스 EV71에 92.74% 이상의 억제능을 보였으며, 배양액은 엔테로바이러스 EV71에서 11.47% 의 억제능을 보여 발효액 필터액이 배양액 보다 8배 이상의 항바이러스능을 나타내었다. 판람근 뿌리 추출액만을 처리하였을 때 엔테로바이러스 EV71에서 21.85% 이상의 억제능을 보여 발효액 필터액은 발효시키지 않은 단순 추출액보다 4배 이상 항바이러스능이 뛰어났다.
실시예 3 : 인플루엔자바이러스에 대한 발효액 필터액의 항바이러스능 시험
발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포 2 × 104 개를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고, TCID 50이 되도록 희석한 2종의 인플루엔자A 바이러스(A/WS/33, A/PR/8/34)와 1종의 인플루엔자B 바이러스(B/lee/40) 용액 90 ㎕을 각 웰에 넣은 다음, 상기 참고예 2에서 제조한 발효액 필터액 배지 혼합액 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다(발효액 필터액의 최종 농도 5%).
한편, 각 균주를 배지에서 배양한 배양액을 동량의 MEM 배지와 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜서 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다( 배양액의 최종 농도 5%).
각 발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능 측정은 권두한 등이 발명한 등록 특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 감염시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1 시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 발효액 필터액만을 처리한 군[B], 바이러스만을 처리한 군[C], 바이러스와 발효액 필터액을 같이 처리한 군[D]으로 표기하였고 각각 발효액의 세포생존율(%) [수학식 1]과 발효액 필터액의 바이러스에 대한 증식억제능(%) [수학식 2]로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
| 구분(%) | 비감염군 | 감염군 | |||
| 비처리군 | A/PR/8/34 | A/WS/33 | B/Lee/40 | ||
| 배양액 | 113.77 ±8.15 | 0.00 ± 11.80 | 0.60 ± 2.34 | 2.44 ±4.46 | 9.14 ± 2.55 |
| 판람근 추출액 | 114.30 ± 3.77 | 0.00 ± 12.60 | 18.32 ± 0.50 | 32.75 ± 3.51 | 9.90 ± 1.28 |
| 추출액 발효액 | 99.17 ± 5.919 | 0.00 ± 13.0 | 58.49 ± 4.76 | 87.98 ± 3.53 | 80.27 ± 6.58 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 판람근 뿌리 추출액의 발효액 필터액은 1/20(5%)의 농도에서 인플루엔자 바이러스에 58 ~ 88% 이상의 억제능을 보였으며, 배양액은 엔테로바이러스 EV71에서 0.6 ~ 9.14% 의 억제능을 보여 발효액 필터액이 배양액 보다 7 ~ 90배 이상의 항바이러스능을 나타내었다. 판람근 뿌리 추출액만을 처리하였을 때 9.9 ~ 32.75% 이상의 억제능을 보여 발효액 필터액은 발효시키지 않은 단순 추출액보다 1.7 ~ 8배 이상 항바이러스능이 뛰어났다.
실시예 4 : 코로나바이러스에 대한 발효액 필터액의 항바이러스능 시험
발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, Vero 세포 2 × 104 개를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고, TCID 50이 되도록 희석한 PEDV 바이러스 용액 90 ㎕을 각 웰에 넣은 다음, 상기 참고예 2에서 제조한 발효액 필터액 배지 혼합액 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다(발효액 필터액의 최종 농도 5%).
한편, 각 균주를 배지에서 배양한 배양액을 동량의 MEM 배지와 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜서 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다( 배양액의 최종 농도 5%).
각 발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능 측정은 권두한 등이 발명한 등록 특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 감염시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1 시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 발효액 필터액만을 처리한 군[B], 바이러스만을 처리한 군[C], 바이러스와 발효액 필터액을 같이 처리한 군[D]으로 표기하였고 각각 발효액의 세포생존율(%) [수학식 1]과 발효액 필터액의 바이러스에 대한 증식억제능(%) [수학식 2]로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
| 구분(%) | 비감염군 | 감염군 | |
| 비처리군 | PEDV | ||
| 배양액 | 99.72 ± 1.87 | 0.00 ± 12.60 | 0.00 ± 21.50 |
| 판람근 추출액 | 97.05 ± 0.99 | 0.00 ± 21.50 | 11.80 ± 12.00 |
| 추출액 발효액 | 99.50 ± 2.15 | 0.00 ± 12.60 | 97.05 ± 0.99 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 판람근 뿌리 추출액의 발효액 필터액은 1/20(5%)의 농도에서 97.05% 이상의 억제능을 보였으며, 배양액은 11.47% 의 억제능을 보여 발효액 필터액이 배양액 보다 8배 이상의 항바이러스능을 나타내었다. 판람근 뿌리 추출액만을 처리하였을 때 11.80 억제능을 보여 발효액 필터액은 발효시키지 않은 단순 추출액보다 7배 이상 항바이러스능이 뛰어났다.
실시예 5 : 헤르페스바이러스에 대한 발효액 필터액의 항바이러스능 시험
발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, NIH3T3-E1(musculus fibroblast) 세포 2 × 104 개를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고, TCID 50이 되도록 희석한 2종의 헤르페스심플렉스(HPV1, HPV2)와 1종의 헤르페스조스터(Zoster) 용액 90 ㎕을 각 웰에 넣은 다음, 상기 참고예 2에서 제조한 발효액 필터액 배지 혼합액 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다(발효액 필터액의 최종 농도 5%).
한편, 각 균주를 배지에서 배양한 배양액을 동량의 MEM 배지와 섞은 후에 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜서 10 ㎕를 각 웰에 투여하였다( 배양액의 최종 농도 5%).
각 발효액 필터액의 바이러스 증식 억제능 측정은 권두한 등이 발명한 등록 특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 감염시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1 시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 발효액 필터액만을 처리한 군[B], 바이러스만을 처리한 군[C], 바이러스와 발효액 필터액을 같이 처리한 군[D]으로 표기하였고 각각 발효액의 세포생존율(%) [수학식 1]과 발효액 필터액의 바이러스에 대한 증식억제능(%) [수학식 2]로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.
| 구분(%) | 비감염군 | 감염군 | |||
| 비처리군 | HPV1 | HPV2 | Zoster | ||
| 배양액 | 113.77 ±8.15 | 0.00 ± 11.80 | 0.60 ± 2.34 | 2.44 ±4.46 | 9.14 ± 2.55 |
| 판람근 추출액 | 114.30 ± 3.77 | 0.00 ± 12.60 | 18.32 ± 0.50 | 32.75 ± 3.51 | 9.90 ± 1.28 |
| 추출액 발효액 | 99.17 ± 5.919 | 0.00 ± 13.0 | 58.49 ± 4.76 | 87.98 ± 3.53 | 80.27 ± 6.58 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 판람근 뿌리 추출액의 발효액 필터액은 1/20(5%)의 농도에서 헤르페스바이러스에 58 ~ 88% 이상의 억제능을 보였으며, 배양액은 0.6 ~ 9.14% 의 억제능을 보여 발효액 필터액이 배양액 보다 7 ~ 90배 이상의 항바이러스능을 나타내었다. 판람근 뿌리 추출액만을 처리하였을 때 9.9 ~ 32.75% 이상의 억제능을 보여 발효액 필터액은 발효시키지 않은 단순 추출액보다 1.7 ~ 8배 이상 항바이러스능이 뛰어났다.
제제예 1 : 화장품의 제조
| 번호 | 원료명 | 처방예 1 |
| 1 | 정제수 | 잔량 |
| 2 | 1,3-부틸렌글리콜 | 4.0 |
| 3 | 디소듐 이디티에이 | 0.1 |
| 4 | 피이지-피피지 18/4 코폴리머 | 1.0 |
| 5 | 디-판테놀 | 0.1 |
| 6 | 메틸파라벤 | 0.2 |
| 7 | 에탄올 | 8 |
| 8 | 피피지-26-부테스-26/피이지-40 경화피 마자유 |
0.5 |
| 9 | 향 | 적량 |
| 10 | 판람근 뿌리 추출액 발효액 | 25 |
<제조방법>
1) 번호 2, 3, 4의 원료를 칭량한 후 번호 1의 정제수를 첨가하여 실온에서 교반하여 용해하였다.
2) 번호 5, 6, 7, 8, 9의 원료를 칭량한 후 교반용해하고 상기 1)에 첨가하였다.
3) 번호 10의 판람근 뿌리 추출액 발효액의 필터액을 첨가하여 용해한 후 상기 1)에 넣고 적절하게 교반하고 여과하여 화장품을 제조하였다.
Claims (7)
- 판람근 뿌리 추출물을 발효시킨 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염 예방 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 발효는 효모를 이용하여 판람근 뿌리 추출물을 발효한 발효액을 함유하는 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염 예방 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 헤르페스심플렉스바이러스, 헤르페스조스터바이러스, 코로나바이러스, 코사키바이러스, 엔테로바이러스 또는 인플루엔자바이러스 중 1종 이상의 바이러스 인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염 예방 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이러스 감염 및 치료는 바이러스가 포유류 세포의 세포막에 부착하지 못하게 하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염 예방 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 화장품
- 제 5 항에 있어서, 상기 발효액은 전체 중량의 25 중량% 이상 인 것을 특징으로 하는 항바이러스 화장품.
- 제 1항에 있어서, 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강보조식품.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020170121525A KR101977622B1 (ko) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | 판람근 뿌리 발효 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170121525A KR101977622B1 (ko) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | 판람근 뿌리 발효 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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|---|---|
| KR20190033129A KR20190033129A (ko) | 2019-03-29 |
| KR101977622B1 true KR101977622B1 (ko) | 2019-05-13 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170121525A KR101977622B1 (ko) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | 판람근 뿌리 발효 추출물을 함유하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11236402A (ja) * | 1998-02-24 | 1999-08-31 | Kitasato Inst:The | 新規多糖体及び、該多糖体の抗ウイルス剤並びにアジュバント剤 |
| KR101951010B1 (ko) * | 2015-03-27 | 2019-02-22 | 한국 한의학 연구원 | 대청엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 선천면역 증진 및 항바이러스용 조성물 |
-
2017
- 2017-09-21 KR KR1020170121525A patent/KR101977622B1/ko active IP Right Grant
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