JP5944187B2

JP5944187B2 - ハナサナギタケ由来抽出物と、これを含有するアストロサイト増殖促進剤およびアストロサイト増殖促進剤の製造方法

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Publication number: JP5944187B2
Application number: JP2012051004A
Authority: JP
Inventors: 鈴木　幸一; 幸一鈴木; 圭一郎山本; 拓斗福田; 猛宏加藤; 貴志平賀; 正秋対馬; 鈴木　文夫; 文夫鈴木; 英之安田
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Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2016-07-05
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Description

本発明は、ハナサナギタケ由来抽出物と、これを含有するアストロサイト増殖促進剤およびアストロサイト増殖促進剤の製造方法に関するものである。

グリア細胞の一種であるアストロサイト（星状膠細胞）は、脳の全細胞の約半数を占める。従来は、情報処理機能は神経細胞が担うという観点から、神経細胞の周囲に存在するアストロサイトの機能は、神経細胞の支持・保護・栄養供給などが考えられてきた。

一方、近年、アストロサイトは、神経回路形成機能（非特許文献１−４）、伝達物質濃度調節機能(非特許文献５、６）という間接的な神経回路形成補助機構だけでなく、神経細胞からの入力とそれに続くアストロサイト間におけるカルシウム伝播（非特許文献７−９）、シナプス小胞様小胞を含み神経細胞へ出力できること（非特許文献１０、１１）などが報告され始め、アストロサイト自身が情報処理細胞の一翼を担うことが示唆されている。

さらに、記憶の形成に対するアストロサイトの役割に関する研究も行われ始めており、記憶などの脳の高次機能は、ニューロンとアストロサイトとの間の相互作用を介して制御されていることが示唆されている。例えば、記憶形成ののちに海馬においてアストロサイト数が増加することや（非特許文献１２）、アストロサイトの機能を抑制すると記憶形成が阻害されること（非特許文献１３）などが報告されている。

また、統合失調症や双極性障害、うつ病などの精神疾患において脳神経解剖学的に共通に見られる異常として、マクロなレベルでは脳質肥大、海馬、大脳皮質サイズの縮小がみられ、ミクロなレベルでは神経細胞体サイズの縮小、樹状突起spine密度の減少、樹状突起長の短縮、シナプス関連タンパク質量の減少などが知られていた。これらは神経細胞の直接的な異常と考えられてきたが、最近では、アストロサイト数の減少も共通して見られることが報告されており、アストロサイト数の減少に基づく間接的な神経細胞状態の異常の可能性も検討されている（非特許文献１４）。

一方、これまで、本発明者らは、冬虫夏草の薬理効果などに関する研究を進めてきた。

冬虫夏草は、昆虫にとりつく昆虫病原菌類の一つであり、狭義の解釈では、昆虫網（Insecta）、チョウ目（Lepidoptera）、コウモリガ上科（Hepialoidea）、コウモリガ科（Hepialidiae）に属するコウモリガを宿主とした中国のチベット自治区、青海省、四川省、貴州省、甘粛省、雲南省をはじめ、ネパールやブータンの標高3,000から4,000メートルの高山地帯に棲息するCordyceps Sinennsisをいう。宿主昆虫の種類も多種多様で，カメムシ目（Hemiptera），チョウ目（Lepidoptera），コウチュウ目（Coleoptera），ハチ目（Hymenoptera），バッタ目（Orthoptera），トンボ目（Odonata），ハエ目（Diptera）など多岐にわたる．
一方、広義の解釈では、このような昆虫の成虫や幼虫に寄生する菌全体を冬虫夏草と呼ばれてもいる。

そして、冬虫夏草について、漢方薬の材料や健康補助食品素材としての科学的知見はまだ少ない段階であるが、これまでの冬虫夏草の生理活性に関する研究例として、Cordycepsとその生産物が糖尿病、心血管疾患や癌や代謝病を防ぎ、または、それらの疾病の進行を遅延させるのに有効な栄養剤として広く利用されている（非特許文献１５）。このほかにも、サナギタケCordyceps militarisの水抽出物による抗酸化作用（非特許文献１６）、免疫調節作用（非特許文献１７）、in vivoでのインシュリン抵抗性の減少とインシュリン分泌物の増加作用(非特許文献１８)、チベット産の冬虫夏草であるCordyceps Sinensis（以下C. sinensis）の熱水抽出による抗高脂血症効果（非特許文献１９），抗腫瘍活性(非特許文献２０)、抗炎症作用（非特許文献２１）のほか，メシマコブ（Phellinus linteus）のプロテオグリカン複合物による抗腫瘍活性（非特許文献２２）などが報告されている。そして、このような冬虫夏草の知名度の高まりによる急激な需要増加による乱獲などによって、チベット産の冬虫夏草であるC. sinensisは高価で入手が困難になっている。

また、広義の解釈としての冬虫夏草の１種であるハナサナギタケ（Paecilomyces tenuipes,以下、P.tenuipesと記載する）は、子嚢菌類のバッカク菌科のCordyceps属に属し、カイコの幼虫に寄生する菌であることから、カイコ蛹との組み合わせによる冬虫夏草の人工栽培が近年日本で商業化されている。しかしながら、市販されているCordyceps属やPaecilomyces属の冬虫夏草の多くの商品は無性種の菌糸培養から調製されたものが多く、さらには、P. tenuipesの薬理効果に関する研究報告はCordycepsに比べ圧倒的に少ない。

これまで、P. tenuipesの生理活性成分としては、宿主（カイコ蛹）と子実体の混合粉末の酢酸エチル抽出物中から単離された環状ヘキサデプシペプチドBeauvericinがラット肝癌細胞増殖抑制効果を有すること（非特許文献２３）や、宿主（カイコ蛹）から分離した子実体を材料とし、60%エタノール抽出、5%メタノール抽出、熱水抽出の過程を経て得られたハナサナギン（3,4-ジグアニジノブタノイル-DOPA）が、フリーラジカル（DPPH）消去活性やスーパーオキシドアニオン消去能を有すること（非特許文献２４、２５）などが知られている。

また、これらの冬虫夏草の人工栽培方法も提案されている（特許文献１、２）。

特許第２６７６５０２号特許第３８６５７３５号

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そして、本発明者らは、C. sinensisに比べて入手が容易であり、コスト面、安定供給の面で優れているハナサナギタケ（P.tenuipes）に関する研究を進める中で、ハナサナギタケ（P.tenuipes）粉末に由来する抽出画分に、顕著なアストロサイト増殖促進活性があることを見出し、本発明に至った。

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、ハナサナギタケ（P.tenuipes）に由来するアストロサイト増殖促進剤を提供することを課題としている。

上記の課題を解決するため、本発明は、以下の抽出物、アストロサイト増殖促進剤およびアストロサイト増殖促進剤の製造方法を提供する。
＜１＞以下の工程：
（１）ハナサナギタケ（P.tenuipes）をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程；および
（３）前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程（２）における有機溶媒は、ｎ−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程（３）における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が２０〜８０％である抽出方法によって得られた抽出物。
＜２＞前記＜１＞の抽出物を含有するアストロサイト増殖促進剤。
＜３＞（１）ハナサナギタケ（P.tenuipes）をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程；および
（３）前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程（２）における有機溶媒は、ｎ−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程（３）における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が２０〜８０％である
ことを特徴とするアストロサイト増殖促進剤の製造方法。
＜４＞前記工程（３）において、水と有機溶媒の混合液による固相抽出の前に、前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージされた担体と水とによる固相抽出を行う工程を含むことを特徴とする＜３＞のアストロサイト増殖促進剤の製造方法。

本発明によれば、ハナサナギタケ（P.tenuipes）に由来するアストロサイト増殖促進剤が提供される。入手しやすいハナサナギタケ（P.tenuipes）を原料としており、優れたアストロサイト増殖促進効果を発揮することから、コスト面、安定供給の面でも優れている。

各サンプル添加後48h経過した神経細胞の様子を位相差顕微鏡で観察した顕微鏡写真である。サンプル添加前である播種後72 hにおける神経細胞の合計突起長の数値と、各サンプル添加後48h経過した神経細胞の合計突起長の数値を示した図である。各サンプル添加後48h後のアストロサイトの様子を位相差顕微鏡で観察した顕微鏡写真である。各サンプル添加後48h後のアストロサイトの増殖率を示した図である。Ｆ５における時間ごとのアストロサイトの増殖率を示した図である。

本発明のアストロサイト増殖促進剤は、ハナサナギタケ（P.tenuipes）に由来する抽出物を含有する。そして、本発明のアストロサイト増殖促進剤の製造方法は、以下の工程：
（１）ハナサナギタケ（P.tenuipes）の熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程；および
（３）前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージ（添加）した後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程、を含む。

以下、各工程について説明する。

工程（１）では、ハナサナギタケ（P.tenuipes）の熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る。

ハナサナギタケ（P.tenuipes）は、日本、台湾、中国、ネパール等に広く分布し、ガの蛹、幼虫、カイコ蛹、幼虫などに寄生して、養分を摂取して増殖して、虫の死骸より淡黄色の子実体を発生する。本発明のアストロサイト増殖促進剤の材料として使用されるハナサナギタケ（P.tenuipes）は、自生するものであってもよいが、好ましくは、宿主をカイコとして人工栽培されたものである。ハナサナギタケは、C. sinensisと比較して入手が容易であるため、コストを抑えることができるとともに、安定に供給することができる。

冬虫夏草の人工栽培方法は種々の方法が提案されているが、例えば、特許文献２の方法、すなわち、繭を形成する前のカイコの幼虫を煮沸してから乾燥させ、このカイコ乾燥粉末５０〜９０重量パーセント、残部が豆類、穀類、海藻類またはキノコ類の乾燥粉末の１種または２種以上からなる食物乾燥粉末を混合して、これに培養液を加えて混練し、これを育成箱の底部に敷き詰めて培地を作成し、この培地を、植菌袋に封入して加熱滅菌処理した後、培地に冬虫夏草の菌を接種して、育成する方法を例示することができる。

そして、本発明では、例えば、上記の方法で栽培されたハナサナギタケ（P.tenuipes）を凍結乾燥させた後、粉砕して得たハナサナギタケ粉末を使用することが好ましい。ここで、本発明に使用されるハナサナギタケ粉末は、ハナサナギタケの子実体のみを粉末化したものであってもよいが、好ましくは、子実体および宿主（例えば、カイコ）を粉末化したものである。

さらに、このハナサナギタケ粉末の熱水抽出方法は特に限定されないが、例えば、このハナサナギタケ粉末に水を加え、オートクレーブなどで加熱する固液抽出によって、熱水抽出液を得ることができる。加熱条件は、適宜設計することができるが、例えば、80〜120℃で、およそ60分程度加熱することで、ハナサナギタケ（P.tenuipes）粉末の熱水抽出液を得ることができる。さらに、この熱水抽出液を、遠心分離し、上清を濾過し回収し、前記の抽出工程を繰り返し行うことで、より高い収量でハナサナギタケ（P.tenuipes）粉末からの熱水抽出液を得ることができる。そして、このハナサナギタケ粉末の熱水抽出液の上清を回収し、凍結乾燥することでハナサナギタケ粉末の熱水抽出物(ＰＴＥ)を得ることができる。

工程（２）では、前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る。

この工程では、水と有機溶媒を用いた二層分配（液液抽出）を行うことでハナサナギタケ粉末の熱水抽出物を水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させることができる。具体的には、例えば、ハナサナギタケ粉末の熱水抽出物(ＰＴＥ)を水に溶解し、この溶液と有機溶媒とを分液漏斗に入れて振盪させることで、２つの液の界面において物質交換を生じさせ、水層に含まれる有機物などを取り除くことができる。この場合、有機溶媒としては、例えば、ｎ-ヘキサン、酢酸エチル、アセトンなどの有機溶媒を例示することができ、なかでも、酢酸エチルを使用することが好ましい。

そして、このような方法で得られた水抽出画分を、例えば、窒素風乾処理や、凍結乾燥処理など行うことによって、水抽出画分の乾燥体を得ることができる。

工程（３）では、前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージ（添加）した後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る。

この工程では、従来公知の精製方法を採用することができる。例えば、カラム（シリカゲル）クロマトグラフィーを例示することができ、なかでも、逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーを好ましく例示することができる。逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーは、目の細かいカラム（シリカゲル）を用い、カラム内部に圧力をかけて展開を行うため精製能に優れている。

好ましい形態としては、例えば、前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージ（添加）された担体に、水（超純水）を流して固相抽出して抽出液を得て、その後、水と有機溶媒の混合液の濃度を順次上げながら、複数回抽出する逐次抽出を行う方法を例示することができる。前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージ（添加）された担体に、水（超純水）を流して固相抽出することで、水抽出画分中に含まれる糖を溶出させることでき、その後の水と有機溶媒の混合液による固相抽出による有効成分の抽出をより確実に行うことができる。

混合液中の有機溶媒の濃度は、２０％〜８０％であることが好ましく、より好ましくは４０％〜７０％、特に好ましくは６０％程度である。混合溶液中の有機溶媒の濃度がこのような範囲であることで、アストロサイト増殖活性を有する成分を確実に精製することができる。また、逐次抽出を行う場合には、水（超純水）を流して固相抽出した後、例えば、混合液中の有機溶媒の濃度を、１０％、２０％、４０％、６０％・・・・と順次上げながら抽出を行うことで確実に有効成分を抽出することができる。この場合、混合液中の有機溶媒の濃度が、４０％〜７０％、特に６０％程度の抽出液にアストロサイト増殖活性を有する成分が含まれる。

また、この工程で使用する有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールなどを例示することができ、なかでも、メタノール、エタノールを好ましく使用することができる。メタノール、エタノールを使用することで、確実に有効成分を抽出することができる。

また、この工程を経て得られた抽出液は、適宜、凍結、乾燥などの処理を行って濃縮乾燥させ、固形の抽出物とすることが可能である。

この工程を経て得られた抽出物は、アストロサイト増殖促進活性を有するため、これを有効成分とすることで、アストロサイト増殖促進剤として使用することができる。

本発明のアストロサイト増殖促進剤は、上記の方法で得られた抽出物を有効成分として含有することができる。すなわち、抽出物は、ハナサナギタケ（P.tenuipes）粉末の熱水抽出液を乾燥させて得た熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒との二層分配によって分離された水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージされた担体と、水と有機溶媒の混合液との固相抽出によって得られる。

in vivoまたはin vitroにおいて、本発明のアストロサイト増殖促進剤を脳細胞に作用させることで、アストロサイトを増殖させることができる。したがって、本発明のアストロサイト増殖促進剤は、各種の疾患や障害の治療、予防などに利用することができる。

例えば、アストロサイトは、ヒトの脳の全細胞の約半数を占めることから、本発明のアストロサイト増殖促進剤は、脳挫傷などの治療薬として利用することができる。また、アストロサイトは神経回路形成機能などを有することから、認知機能障害を引き起こす脳疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病などの治療薬として利用することができる。さらに、アストロサイトは記憶形成に関与していることから、空間パターンや情報の補充などの記憶能力や学習能力の向上のために利用することができる。そして、アストロサイト増殖促進剤は、統合失調症や双極性障害、うつ病などの精神疾患の治療薬としても利用することができる。

本発明のアストロサイト増殖促進剤は、経口または非経口投与が可能である。

経口投与の場合、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、分包包装、オブラート剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル剤、および無菌包装粉剤などの形をとることができる。この場合、添加剤として、慣用の賦形剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味剤、芳香剤なども適宜加えることができる。例えば、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースなどが例示される。経口投与する場合、投与量は、製剤化方法、投与方式、投与対象者の年齢、体重などを考慮して適宜決定することができる。さらに、本発明のアストロサイト増殖促進剤は、医薬品のみならず健康補助食品などに利用することもできる。

また、非経口投与の場合は、静脈内投与、皮下投与、経皮吸収等の他、脳内への直接投与が可能である。脳内への直接投与の場合、治療、改善すべき症状等に応じて、脳内の領域を適宜選択することができる。

さらに、本発明のアストロサイト増殖促進剤は、ヒトのみならず各種の哺乳動物などにも投与することができる。

本発明のアストロサイト増殖促進剤は、優れたアストロサイト増殖効果を有し、上記の通りの各種の用途に有効利用することができる。また、C. sinensisに比べて入手が容易なハナサナギタケ（P.tenuipes）を材料としているため、コスト面、安定供給の面で優れている。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜実施例１＞カイコ冬虫夏草抽出物の部分精製
１．供試試料
供試試料である冬虫夏草として、ハナサナギタケ P. tenuipes粉末を実験に用いた。ハナサナギタケP. tenuipesは、福島県や茨城県にまたがる八溝山で採取したものを、特許文献１（特許第2676502号）に記載の方法と同様の方法により培養した。なお、この菌株は、微生物識別表示名Paecilomyces tenuipes, IU070255、受託番号ＦＥＲＭＰ−２２０１１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

これを、乾繭の工程で得られる乾燥したカイコ実用品種（錦秋×鐘和）の蛹に感染させ、65 days、25℃の暗室で培養した。得られた子実体ならびに宿主の蛹を乾燥後、粉砕した。

２．P. tenuipes 熱水抽出物（PTE）の調製
P. tenuipes粉末（80 g）に8倍量（W/V）（640 ml）の超純水（以下、MQと記載する）を加え、105℃、60 minオートクレーブ（BS-245，トミー精工）で加熱することで熱水抽出物を得た。抽出液を10,000 x g 4℃，10 min遠心分離し、上清を定性濾紙（No.2 ADVANTEC）で濾過し回収した。残渣に再び8倍量のMQを添加し、同条件で二回目の抽出をおこなった。上清を回収し、1回目の抽出で得られた上清と混合し、吸引濾過でろ液を回収した。これを凍結乾燥器（EYELA FDU-2100，東京理化器械）で凍結乾燥することで得られた粉末をP. tenuipes 熱水抽出物（以下、PTEと記載する）とし、使用するまで-80℃の超低温槽で保存した）。

PTEの乾燥重量と収率を表１に示す。

３．PTE二層分配抽出物の調製
ビーカー中でPTE（10.1273 g）にMQを加え溶解し、溶液を200 ml容の分液漏斗に移した。分液漏斗を振とうすることでPTEの濃度勾配を均一にし、そこに酢酸エチル100 mlを加えた。その後、振とうとガス抜きを5 min繰り返した後、分液漏斗を15 min静置し、完全に透明な二液層に分離させた。下層のMQ層（MQ-1）を回収し、分液漏斗に新たにMQを100 ml加え、同様の操作を繰り返した。

下層のMQ層（MQ-2）と上層の酢酸エチル層（EA-1）を回収し、分液漏斗に一度目に回収したMQ層（MQ-1）と酢酸エチルを100 ml入れ、再び同様の操作を繰り返した。下層のMQ層（MQ-1）と上層の酢酸エチル層（EA-2）を回収した。EA-1とEA-2を混合し酢酸エチル画分とし、MQ-1とMQ-2を混合しMQ画分とした。それぞれの画分をロータリーエバポレーター一式（CCA-1100、DPE-1220、SB-1000、N-1000、EYELA；DTU-20、ULVAC）、窒素風乾並びに凍結乾燥機（EYEZA，FDU-2100）を用いて濃縮乾燥後、収量と収率を計算し、-80℃低温槽で保存した。

酢酸エチル層（Ethyl acetate-Phase）と、MQ層(MQ-Phase)の収量と収率を表２に示す。

４. 逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製
上記３．で得られた二層分配抽出物MQ層をさらに精製するため、逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーをおこなった。カラムは乾式充填法により作製した。担体であるシリカゲル（Wakosil 40C18、和光純薬工業）を、カラム体積が100 cm³になるようクロマト管に10 cmの高さまで入れ、メタノールにより膨潤させた後、最初の展開溶媒であるMQをクロマト管上部まで入れ、ポンプ（HIBLOW AIR POMP、型式 SPP-6EBS、テクノ高規株式会社）加圧により溶媒と担体内の気泡を押し出して置換した。

その後、上記３．で得られた二層分配抽出物MQ層4.0 mgをMQに溶解して1,000× g 1 minで遠心分離をおこない、その上清のみを担体表面にチャージした。ポンプ加圧しながらMQを500 ml、10％メタノール（メタノール／MQ水（1/9、v/v））、20％メタノール（メタノール／MQ水（1/4、 v/v））、40％メタノール（メタノール／MQ水（2/3、 v/v）、60％メタノール（メタノール／MQ水（3/2、 v/v））、80％メタノール（メタノール／MQ水（4/1、 v/v））、100％メタノールをカラム体積の３倍量（300 ml）を順次流した。溶出したそれぞれの画分は三角フラスコに分取した。

分取したそれぞれの画分は、ロータリーエバポレーターやアスピレーター、凍結乾燥機を用いて濃縮乾燥し、収量と収率を算出した後、以下の生物活性試験に供した。

以下、各画分を、Ｆ１：MQ抽出画分、Ｆ２：10％メタノール抽出画分、Ｆ３：20％メタノール抽出画分、Ｆ４：40％メタノール抽出画分、Ｆ５：60％メタノール抽出画分、Ｆ６：80％メタノール抽出画分、Ｆ７：100％メタノール抽出画分とする。

各画分（Ｆ１〜Ｆ７）の乾重量と収率を表３に示す。

＜実施例２＞マウス胎児大脳神経細胞初代培養
１. 実験動物
妊娠ICR♀マウスを日本SLCより購入し、妊娠16 daysの段階におけるマウス胎児を以下の実験に使用した。

２. マウス大脳神経初代培養
（1）大脳神経細胞の調製
妊娠16 daysのICR♀マウスをジエチルエーテルによる麻酔後、頸椎脱臼により安楽死させた。マウスを開腹し子宮ごと胎児を摘出し、70%エタノールで十分に消毒した後、細胞培養用シャーレ（直径100 mm、Orange Scientific）内のPBS（-）30 mlに浸し、クリーンベンチ内に運び込んだ。以後の操作は、すべてクリーンベンチ内でおこなった。

子宮から胎児を摘出し、PBS（-）20 mlをあらかじめ分注したシャーレに移した後、胎児を開頭し脳全体を摘出した。得られた脳を高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（HG-D-MEM, 和光純薬）10 ml中に移し、ピンセットを用いて培地中で嗅球、正中隆起、髄膜を取り除き、海馬を含む大脳のみとした後、ハサミで1 mm四方以下になるように細かく刻んだ。刻んだ大脳を培地ごと50 mlコニカルチューブ（TPP）に移し、2 min静置した後、電動ピペットを用いて上清を取り除いた。刻んだ脳にHG-D-MEM 4 mlを加え、更に2.5%トリプシン（SIGMA）400 μl、1% DNase I（SIGMA）40 μlを加えた後、37℃の恒温槽にて、時々撹拌しながら10 minインキュベートした。インキュベート後、コニカルチューブにHG-D-MEM（10% FBS）を10 ml加え、トリプシンの反応を停止させた後、遠心分離機（TOMY、 LC-220）で1,000 × gで3 min遠心分離した。上清を電動ピペットで吸い取り、HG-D-MEM（10% FBS）を10 ml加え、滅菌ガラスピペットで細胞塊が見えなくなるまで、数回ピペッティングした。余分な細胞塊を取り除くため、細胞液をセルストレイナー（孔径100μm，BD Falcon^TM）に通した。

（2）大脳神経突起長の観察
（1）で調製した細胞液中の細胞数を細胞計数板を用いて計数し、 5.0 × 10⁵ cells/mlになるようにHG-D-MEM（10% FBS）で濃度を調整した。24 well Poly-D-Lysine Coated Plate （BD Falcon^TM）に1 well当たり500 μlずつ播種した。5%CO₂、37℃湿潤条件下で72 h培養し、培地交換と同時に、サンプルとして実施例１で得たＦ１〜Ｆ７をそれぞれ0.5 μlずつ添加した後、更に48 h同条件下で培養した。また、コントロールとしてサンプル溶解に用いたPBS（-）とDMSOを使用し、ポジティブコントロールとして、神経細胞増殖効果があることが知られているレスベラトロール（Res. 終濃度10μM）を使用した。1サンプルにつき4 wellずつ添加した。

24 well Plate の各well について、位相差顕微鏡（ECLIPSE Ti-S，Nikon）を用いて観察をおこない、50μm四方の視野を無作為に抽出し、細胞播種後72 hおよびサンプル添加後48 h（細胞播種後120 h）が経過した時点における、大脳神経細胞の合計突起長を観察・計測した。神経突起伸長の計測は画像解析用ソフトウェアであるNIS-Elements Ar 3.0（Nikon）を用いておこなった。

３．統計解析
統計解析用ソフトウェアとして、JMP 8（登録商標）（SAS Institue Inc.）を用いた。上記２.（2）で計測した大脳神経細胞の合計突起長について分散分析（ANOVA）をおこなった。その結果、有意差が認められた場合のみ、Tukey-Kramerの方法を用いて事後検定（Past-hoc test）をおこなった。P <0.05の場合、統計的に有意であるとした。

４．結果
神経細胞の免疫染色により把握した形態的特徴を基にして位相差顕微鏡での観察・計測をおこなった。サンプル添加前である播種後72 hにおける大脳神経細胞の合計突起長の数値はすべての群において横並びであったが、サンプル添加後48 hにおいてはＦ１〜Ｆ７を添加した群において、いずれも播種後72 hと比較して数値が有意に増大していた（図１）。

サンプル添加後48 hにおいて、コントロールであるPBSおよびDMSOの数値はそれぞれ374.89μm、374.38μmであり、ポジティブコントロールであるレスベラトロールでは608.59μmとより数値が大きく増大したが、サンプル添加群では、特にＦ１で535.07μm、Ｆ２で530.73μm、Ｆ６で502.37μmと、ポジティブコントロールには及ばないものの数値が大きく増大する傾向が見られた（図２）。しかし、すべてのサンプル添加群（Ｆ１〜Ｆ７）においてコントロール群との統計上の有意な差は認められなかった。

＜実施例３＞アストロサイト増殖促進活性実験
（1）新生児マウス大脳神経細胞初代培養
ICRマウス新生児（生後0日目）を70%エタノールで十分に消毒した後、細胞培養用100 mm dish（直径100 mm、Orange Scientific）内のPBS（-） 30 mlに浸し、クリーンベンチ内に運び、仔マウスに頸椎脱臼をおこない、安楽死させた。仔マウスを開頭し脳全体を摘出し、それらを高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（HG-D-MEM、和光純薬） 15 mlが入った細胞培養用100 mm dishに移し、ピンセットを用いて培地中で嗅球、正中隆起、髄膜を取り除き海馬を含む大脳のみとした後、さらにHG-D-MEM 10 mlが入った細胞培養用100 mm dishに移し、メスを用いて1 mm四方ほどの大きさに細かくカットした。カットした大脳を培地ごと50 mlコニカルチューブ（TPP）に移し、2 min静置した後、上清を取り除いた。新しくHG-D-MEM 4 mlを加え、さらに2.5%トリプシン（SIGMA）400μl，1% DNase I（SIGMA）40μlを加えた後37℃ウォーターバスにて、時々撹拌しながら10 min インキュベートをおこなった。インキュベート後、コニカルチューブにHG-D-MEM（10%FBS）を10 ml 加え、トリプシンの反応を停止させた後、遠心分離機（H-9R、コクサン）で1,000 × gで3 min 遠心分離した。電動ピペッターで上清を吸い取り、HG-D-MEM（10%FBS）を10 ml 加え、滅菌ピペットで細胞塊が見えなくなるまで、数回ピペッティングした。余分な細胞塊を取り除くため、細胞液をセルストレイナー（孔径100 μm ，BD Falcon^TM）に通した後、細胞計数板で細胞数を計数し、6.0 × 10⁵ cells/mlになるようにHG-D-MEM（10% FBS）で調整した。細胞数を調整後、Poly-D-Lysine Cellware 100 mm Dish（PDL 100 mm dish，BD Falcon^TM）に7 mlずつ細胞液を播いた。また、播種後96 h後にアスピレーターで培地を一度除去し、PBS（-）10 mlでPDL 100 mm dish内を軽く洗浄し、HG-D-MEM 7 mlを新しく加えて培地の交換をおこなった。

（2）アストロサイトの調製
培地交換から72 h後に細胞液を播種したPDL 100 mm dishをインキュベーター内から取り出し、パラフィルムを用いて蓋を密閉し、3〜4 dishを重ねて固定した。これを、37℃、100 rpm、20 hの条件でバイオシェイカー（BR-40LF、TAITEC）で振盪培養し、神経細胞や細胞片、死細胞等を遊離させた。振盪後、PDL 100 mm dishをクリーンベンチ内に移し、アスピレーターで上清を取り除き、PBS（-）10mlで洗浄し、パスツールピペットで2.5％トリプシン（SIGMA）を適量加え、インキュベーター内で10 min静置した。PDL 100 mm dishを再びクリーンベンチ内に戻し、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM、和光純薬）（10% FBS）を10 ml加え、トリプシンの反応を止め、細胞液を50 mlコニカルチューブに集めた。その後、細胞計数板で細胞数を計数し、6.0 × 10⁵ cells/mlになるようにD-MEM（10% FBS）で調整した。これをアストロサイト細胞液とする。

そして、このアストロサイト細胞液をPDL 100 mm dishに7 mlずつ播種した。この時PDL 100 mm dish内には、ニューロン以外の中枢神経系における神経細胞である、アストロサイトのみが着生している。（以下、培養アストロサイトと記載する）
（3）培養アストロサイトの継代
上記（2）で調整した培養アストロサイトは、播種後96 hで培地交換をおこない、さらに72 h後でも培地交換をおこなった。操作は上記（1）の実験での培地交換と同様だが、2回の培地交換のいずれも、培地としてD-MEM（10% FBS）を使用した。また、PDL 100 mm dish内における、培養アストロサイトがコンフルエントに達するまで上記の手順で培地交換をおこなった。10〜14 Days後、バイオシェーカーにおける振盪培養はおこなわず、その後は（2）の調整方法に従って、培養アストロサイトの細胞数を調整し、継代をおこなった。以下の実験では、継代後の培養アストロサイト（2代目）を使用した。

（4）培養アストロサイト増殖促進活性実験
培養アストロサイト（2代目）から（2）の手順でアストロサイト細胞液を調整し、剥離防止コートスライドグラス（MAS-GP typeA、MATSUNAMI、Size 76×26 mm、Thickness 0.9〜1.2 mm）を5枚ずつ敷いた角シャーレ（滅菌2号角シャーレ、Size 140 × 100 mm、Height 14.5 mm、栄研器材株式会社）2枚にアストロサイト細胞液を40 mlずつ播種し、培養アストロサイトが十分に定着した96 h後に細胞培養用100 mm dishにスライドグラスを1枚ずつ移し、D-MEM（10% FBS）を10 ml加え、インキュベーター内で培養した。

その後、72 h時点で培地交換をおこない、さらにその72 h後には培地交換とサンプル添加をおこない、サンプル添加48 h後での培養アストロサイトの細胞数や形態の変化を観察した。

添加したサンプルは、実施例１で得られたＦ１〜Ｆ７、コントロール群として、サンプルを溶かす際の溶媒として用いたDMSOを使用し、さらに、実施例２においてポジティブコントロールとして使用したレスベラトロールを、本実験においてはネガティブコントロールとして用いた。

（5）観察方法
観察は、位相差顕微鏡（ECLIPSE Ti-S，Nikon）を用い、140×140 mm²の3つの視野を無作為に決定し、視野内のアストロサイトの細胞核数を計数し、その値をアストロサイトの細胞数とした。また、計数には画像解析用ソフトウェアであるNIS-Elements Ar 3.0（Nikon）を用いた。

（6）統計解析
統計解析用ソフトウェアとして、JMP 8（登録商標）（SAS Institue Inc.）を用いた。上記（5）で計数した細胞数について分散分析（ANOVA）をおこなった。その結果、有意差が認められた場合のみDunnettの方法を用いて事後検定（Past-hoc test）をおこなった。P < 0.05の場合、統計的に有意であるとした。

（7）結果
図３に示したように、サンプル添加後48h後、Ｆ１〜Ｆ７でアストロサイトの増殖が確認された。なかでも、Ｆ４、Ｆ５において有意にアストロサイト増殖促進活性が確認され、特に、Ｆ５において最も顕著なアストロサイト増殖促進活性が確認された。

また、図４に示したように、添加したコントロール群（DMSO、レスベラトロール）、各サンプル（Ｆ１〜Ｆ７）群における、観察をおこなった面積当たりの培養アストロサイトの平均数は、DMSO群： 11.67 cells、レスベラトロール群：7.00 cells、Ｆ１：12.67 cells、Ｆ２：11.67 cells、Ｆ３：18.33 cells、Ｆ４：25.67 cells、Ｆ５：32.33 cells、Ｆ６：14.67 cells、Ｆ７：7.67 cellsという結果になった。増殖したアストロサイト数からも、Ｆ４、Ｆ５において強いアストロサイト増殖促進活性があること、特に、Ｆ５において最も顕著なアストロサイト増殖促進活性があることが確認された。

そして、Ｆ５について、0 h後、3 h後、48 h後と時間を追って観察をおこなうと、図５に示したように、0 h後：5.67 cells、3 h後：21.67 cells、48 h後：32.33 cellsという結果が得られ、Ｆ５を添加した培養アストロサイトは爆発的に増殖したことが確認された。

Claims

以下の工程：
（１）ハナサナギタケ（P.tenuipes）をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程；および
（３）前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程（２）における有機溶媒は、ｎ−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程（３）における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が２０〜８０％である抽出方法によって得られた抽出物。
請求項１の抽出物を含有することを特徴とするアストロサイト増殖促進剤。
以下の工程：
（１）ハナサナギタケ（P.tenuipes）をカイコの蛹に感染させ培養した子実体と宿主蛹の乾燥粉末を熱水抽出して得た熱水抽出液を乾燥させて熱水抽出物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた熱水抽出物を含む水溶液と有機溶媒とによる二層分配を行って水抽出画分と有機溶媒抽出画分とに分離させ、水抽出画分の乾燥体を得る工程；および
（３）前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液を担体にチャージした後、この担体に、水と有機溶媒の混合液を接触させて固相抽出することで抽出液を得る工程
を含み、
前記工程（２）における有機溶媒は、ｎ−ヘキサンまたは酢酸エチルであり、
前記工程（３）における混合液中の有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールのうちのいずれかであり、かつ、濃度が２０〜８０％である
ことを特徴とするアストロサイト増殖促進剤の製造方法。
前記工程（３）において、水と有機溶媒の混合液による固相抽出の前に、前記工程（２）で得られた水抽出画分の乾燥体を含む溶液がチャージされた担体と水とによる固相抽出を行う工程を含むことを特徴とする請求項３のアストロサイト増殖促進剤の製造方法。