CN114470187A - 静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用。静脉注射用药物组合物由抗原和免疫增强剂组成。本发明将由免疫增强剂和病毒抗原组成的药物组合物配置成静脉注射用制剂，采用静脉注射的方式代替传统的肌肉接种疫苗或皮下接种疫苗的方式，打破了人们的常规认知，大大提高了防治病毒病的疗效，不仅可以对一般毒性疾病具有防治效果，还可以用于目前尚无疫苗或者接种疫苗无效的传染性疾病的防控。

Description

静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用。
背景技术
无论是在人医领域还是兽医领域，病毒性疾病的防治一直是最大挑战，从非洲猪瘟到新冠肺炎，全社会对传染病的防治已经上升到了前所未有的重视程度。病毒性疾病严重地威胁着人类和动物健康，但人类防治病毒性疾病的手段仍然有限。目前人们常将灭活病毒、弱化活病毒或基因缺失病毒等抗原配以缓释剂或保护剂等辅料制成疫苗经肌肉、皮下、口服途径免疫人或动物，用于预防病毒性疾病，主要基于缓慢释放抗原持续刺激机体产生抗体达到长时间预防传染病的目的，但对挑战性大的病毒性传染病的防治效果不理想，例如，非洲猪瘟和艾滋病等。针对非洲猪瘟和艾滋病等传染病，研究疫苗难度大，治疗也非常困难。申请号为201610811770.3的中国专利提供一种增强免疫功能的静脉注射剂，公开了灭活乳酸菌经静脉注射可高效提高机体的免疫功能，经测试发现灭活乳酸菌经静脉注射对免疫抑制性病毒病，如猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病等具有良好的防治作用。但采用该方法时，对挑战性大的病毒性传染病的防治效果并不理想。
为了进一步提高针对研制疫苗困难、致病力强或者传播速度快的病毒病的防治效果，本领域亟需研发一种可用于防治挑战性大的病毒性传染病的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服采用传统经肌肉、皮下、口服等途径接种疫苗达到免疫人或动物的方法，或是采用静脉注射灭活乳酸菌等方法对挑战性大的病毒性传染病的防治效果均不理想等缺陷，而提供一种静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用。本发明将由免疫增强剂和病毒抗原组成的药物组合物配置成静脉注射用制剂，采用静脉注射的方式代替传统的肌肉接种疫苗或皮下接种疫苗的方式，打破了人们的常规认知，大大提高了防治病毒病的疗效，不仅可以对一般病毒性疾病具有防治效果，还可以用于目前尚无疫苗或者接种疫苗无效的传染性疾病的防控。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种静脉注射用药物组合物，其由抗原和免疫增强剂组成。
一些实施例中，所述静脉注射的方法可为本领域常规，一般可为静脉滴注或静脉推注。
一些实施例中，所述抗原可包括灭活全抗原、减毒活全抗原、亚单位抗原、裂解抗原、多肽抗原、基因工程抗原和DNA载体抗原中的至少一种，较佳地为灭活全抗原。
其中，所述灭活全抗原的灭活方法可为本领域常规使用的高温高压灭活法、紫外线灭活法、化学试剂灭活法和辐射灭活法中的至少一种，较佳地为高温高压灭活法和/或化学试剂灭活法。所述化学试剂灭活法可包括甲醛灭活法。
一些实施例中，所述抗原可包括病毒性传染病的抗原。
其中，所述病毒性传染病可包括DNA病毒引起的传染性疾病和/或RNA病毒引起的传染性疾病。
其中，所述病毒性传染病可包括人患病毒性疾病、家畜患病毒性疾病和宠物患病毒性疾病中的至少一种。
其中，所述人患病毒性疾病可包括艾滋病、新冠肺炎、病毒性肝炎、流行性感冒、流行性乙型脑炎、非典型肺炎、埃博拉病毒病、登革热、病毒性出血热、轮状病毒腹泻、带状疱疹、手足口病、流行性腮腺炎、麻疹、风疹和腺病毒病中的至少一种。所述流行性感冒可包括甲型流感病毒引发的流行性感冒，较佳地为PR8流感病毒引发的流行性感冒。
其中，所述畜患病毒性疾病可包括非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪日本脑炎、猪水疱性病、猪流感、猪痘、口蹄疫、牛呼吸道合胞体病毒病、牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛副流感、牛轮状病毒病、羊痘病毒病、小反刍兽疫、马流感和马传染性贫血病中的至少一种。
其中，所述宠物患病毒性疾病可包括犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、狂犬病和猫瘟热中的至少一种。
一些实施例中，所述免疫增强剂可包括灭活的乳酸菌、灭活的有害菌、植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中的至少一种。
其中，所述灭活的乳酸菌可包括灭活乳酸菌完整形态菌体和/或灭活乳酸菌破碎菌体。
其中，所述乳酸菌的灭活方法可为本领域常规，一般可包括高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活和辐射灭活中至少一种。
其中，所述乳酸菌可包括乳杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、链球菌属和片球菌属中的至少一种。
所述乳杆菌属可包括德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helviticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acido phlus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fementi)中至少一种，较佳地包括植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)和/或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acido phlus)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6240的植物乳杆菌植物亚种和/或保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6075的嗜酸乳杆菌。
所述肠球菌属可包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，较佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌和/或保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20398的粪肠球菌。
所述乳球菌属可包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordnia)中至少一种，较佳地包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6246乳酸乳球菌乳酸亚种。
所述双歧杆菌属可包括两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)中至少一种，较佳地包括长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6196的长双歧杆菌。
所述明串珠菌属可包括肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、肠膜明串珠乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum)、乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)和酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)中至少一种，较佳地包括肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 21860的肠膜明串珠菌。
所述链球菌属可包括乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、丁二酮乳酸链球菌(Streptococcus diacetilactis)、乳酪链球菌(Streptococcus creamoris)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中的至少一种，较佳地包括嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC20174嗜热链球菌。
所述片球菌属可包括乳酸片球菌(Pediococcus acidi1actic)、戊糖片球菌(Pediococcus pentasiaceus)和小片球菌(Pediococcus parvulus)中至少一种，较佳地包括乳酸片球菌(Pediococcus acidi1actic)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10346的乳酸片球菌。
其中，所述灭活的有害菌可包括灭活有害菌完整形态菌体和/或灭活有害菌破碎菌体。
其中，所述有害菌的灭活方法可为本领域常规，一般可包括高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活和辐射灭活中至少一种。
其中，所述有害菌可包括肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、A群链球菌(Group A streptococcus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、红色诺卡氏菌(Nocardia rubropertincta)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中至少一种，较佳地包括肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。
其中，所述植物多糖类免疫增强剂可包括香菇多糖、黄芪多糖、云芝多糖、人参多糖、银耳多糖和猪苓多糖中的至少一种，较佳地包括香菇多糖。
其中，所述细胞因子类免疫增强剂可包括胸腺肽、转移因子、干扰素和白介素中至少一种，较佳地包括胸腺肽。所述胸腺肽可包括胸腺五肽。
其中，所述化学类免疫增强剂可包括左旋咪唑、异丙肌苷和匹多莫德中至少一种。
其中，所述菌体成分类免疫增强剂可包括脂磷壁酸、β-葡聚糖、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、甘露聚糖肽、甘露寡糖、胞壁酰二肽、细菌细胞壁骨架和核酸中至少一种，较佳地包括脂磷壁酸、β-葡聚糖、聚肌胞和卡介菌多糖核酸中至少一种。所述脂磷壁酸可包括金黄色葡萄球菌脂磷壁酸。
一较佳实施例中，当所述抗原为所述猪伪狂犬病的抗原时，所述免疫增强剂包括灭活的屎肠球菌、灭活的植物乳杆菌植物亚种、灭活的乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活的嗜酸乳杆菌、灭活的长双歧杆菌、灭活的乳酸片球菌、灭活的肠膜明串珠菌、灭活的嗜热链球菌、灭活的粪肠球菌、灭活的肠炎沙门氏菌、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖、胸腺肽和香菇多糖中至少一种。
一较佳实施例中，当所述抗原为所述流行性感冒的抗原时，所述免疫增强剂包括灭活的屎肠球菌、灭活的植物乳杆菌植物亚种、灭活的乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活的嗜酸乳杆菌、灭活的长双歧杆菌、灭活的乳酸片球菌、灭活的肠膜明串珠菌、灭活的嗜热链球菌、灭活的粪肠球菌、灭活的肠炎沙门氏菌、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖、胸腺肽和香菇多糖中至少一种。
一较佳实施例中，所述抗原为猪伪狂犬病的灭活全抗原和/或猪伪狂犬病的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为所述灭活的乳酸菌和/或所述灭活的有害菌，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，且所述静脉注射液中所述猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为105.33TCID50/0.1mL以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的数量为106～1012个。研发过程中发现，当静脉注射液中所述猪伪狂犬病抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量低于105.33TCID50/0.1mL，例如为104.33TCID50/0.1mL时，小鼠静脉注射该注射液，并滴鼻20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒后，第6天开始出现死亡现象，第8天时全部死亡。
一较佳实施例中，所述抗原为猪伪狂犬病的灭活全抗原和/或猪伪狂犬病的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中至少一种，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，且所述静脉注射液中所述猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为105.33TCID50/0.1mL以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的含量为0.02～2mg。
其中，所述猪伪狂犬病毒的TCID50是基于PK-15细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
其中，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，且所述静脉注射液中所述猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为105.33TCID50/0.1mL～107.33TCID50/0.1mL时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的含量为0.02～1mg，例如，0.04mg或0.2mg。
一较佳实施例中，所述流行性感冒的抗原为灭活全抗原和/或减毒活全抗原，所述免疫增强剂为所述灭活的乳酸菌和/或所述灭活的有害菌，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，所述静脉注射液中所述流行性感冒的抗原灭活前的流感病毒的血凝效价为1:29以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的数量为106～1012个。
一较佳实施例中，所述流行性感冒的抗原为灭活全抗原和/或减毒活全抗原，所述免疫增强剂为植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中至少一种，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，所述静脉注射液中所述流行性感冒的抗原灭活前的流感病毒的血凝效价为1:29以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的含量为0.02～2mg。
其中，采用血凝实验测定所述流行性感冒的病毒的血凝效价。
本发明还公开一种防治传染病的静脉注射液，其由如上所述的静脉注射用药物组合物和药学上可接受的注射用溶剂组成。
一些实施例中，所述药学上可接受的注射用溶剂可包括缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液和乳酸林格氏液中的至少一种，较佳地为氯化钠水溶液。
本发明还提供一种如上所述的静脉注射液的制备方法，具体包括如下步骤：将如上所述的静脉注射用药物组合物与所述的药学上可接受的注射用溶剂混合均匀，即可。
一较佳实施例中，所述静脉注射液的制备方法包括如下步骤：将所述抗原与所述的药学上可接受的注射用溶剂混合，制得含所述抗原的溶液；将所述免疫增强剂与所述药学上可接受的注射用溶剂混合，制得含所述免疫增强剂的溶液，再将含所述抗原的溶液和含所述免疫增强剂的溶液混合均匀，即可。
本发明还提供一种防治传染病的静脉注射用粉针剂，其为如上所述的静脉注射用药物组合物的冻干粉。
本发明还提供一种防治传染病的静脉注射用粉针剂的制备方法，具体包括如下步骤：将如上所述的静脉注射用药物组合物冻干，即可。使用时用药学上可接受的注射用溶剂溶解后使用。
本发明还提供一种如上所述静脉注射用药物组合物、如上所述的静脉注射液和如上所述的静脉注射用粉针剂中至少一种在制备用于防治传染病的静脉注射用药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明首次将免疫增强剂和抗原组成静脉注射用药物组合物，采用静脉注射的方式防治传染病，代替传统的肌肉或皮下等接种疫苗方式，打破了人们的常规认知，大大提高了防治病毒病的疗效，可让机体在短时间内产生抗体，为常规思路无法成功研制疫苗的病毒病的防治提供了新手段。这种药物组合物经静脉注射还可用于防治传播力强的病毒性疾病，可以迅速阻断其传播；另外，还可快速净化动物携带的病原。此外，当动物母畜静脉注射该药物组合物后，可通过哺乳方式为仔畜提供高含量母源抗体，进而达到防治传染病垂直传播目的。该组合物静脉注射可同时且高效地增强机体细胞免疫和体液免疫功能，而常规疫苗和常规肌肉、皮下等接种方式很难同时且高效地调节细胞免疫和体液免疫。
例如，对猪伪狂犬Bartha株病毒感染小鼠引发的烈性传染病模型具有良好的防治作用，获得了意想不到的功效，静脉注射本申请产品3天后就可以起到良好的保护作用，采用常规的肌肉或皮下接种疫苗一般需要14天以上起到保护作用，便于烈性传染病的快速防控；还可以同时高效地激活细胞免疫和体液免疫，从而有效地消灭病毒。这种组合物静注后，不仅使中和抗体产生水平高，而且细胞免疫效果好，可以促进T淋巴细胞数量增加，特别是提高辅助性T细胞(Th细胞)的数量。T细胞在抗病毒免疫中发挥着重要作用，其中辅助性T细胞(Th)可以促进B细胞产生抗体，还可以活化细胞毒性T细胞(Tc细胞)分泌抗病毒细胞因子和杀伤被病毒感染的细胞，从而有效清除病毒。常规疫苗采用肌肉、皮下等接种方式很难同时且高效地激活细胞免疫和体液免疫。此外，这种组合物静脉注射后还会促进IL-10的生成，利于减轻机体因感染病毒导致的炎性损伤，从而维护机体健康。
猪伪狂犬Bartha株对小鼠的致病力极强，采用猪伪狂犬Bartha毒株建立了小鼠高致病性的DNA病毒传染病模型，感染该毒株的小鼠一般会在10天之内全部死亡，静脉注射该组合物后，小鼠的保护率可达100％，而且身体状况良好，获得了意想不到的功效。
又采用PR8流感病毒株制备了低致病性的RNA病毒感染模型，感染PR8流感病毒株的小鼠主要表现为体重显著减轻，部分死亡，静脉注射该组合物后小鼠生长正常，体重无显著下降，防治效果突出。
附图说明
本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
图1为效果实施例2中采用正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组和不同处理实验组小鼠感染猪伪狂犬病毒后，小鼠生长状态对比图；
图2为效果实施例3中采用正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组和不同处理实验组小鼠感染猪伪狂犬病毒后，小鼠肺脏做病理切片对比图；
图3为效果实施例17中将灭活的屎肠球菌、植物乳杆菌植物亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的生理盐水溶液混合后通过扫描电镜观察菌体形态的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中和对比例中，各种乳酸菌购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)。
屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecium，保藏编号：CICC 6049)；
长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC 6196)；
植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)；
乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC 6246)；
嗜酸乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillus acidophilus，保藏编号：CICC 6075)；
乳酸片球菌(拉丁名称：Pediococcus acidilactici，保藏编号：CICC 10346)；
粪肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecalis，保藏编号：CICC 20398)；
嗜热链球菌(拉丁名称：Streptococcus thermophilus，保藏编号：CICC 20174)；
肠膜明串珠菌(拉丁名称：Leuconostoc mesenteroides，保藏编号：CICC 21860)。
肠炎沙门氏菌CVCC3377标准菌株购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；
下述实施例和对比例中，聚肌胞注射液：广东南国药业有限公司生产，国药准字H20003724；
卡介菌多糖核酸注射液：吉林亚泰生物药业股份有限公司生产，国药准字S20043033；
金黄色葡萄球菌脂磷壁酸：购自于SIGMA公司，CAS#56411-57-5；
β-葡聚糖：购自于上海源叶生物科技有限公司，CAS#9041-22-9；
胸腺五肽：购自于上海源叶生物科技有限公司，CAS#69558-55-0；
香菇多糖：购自于上海源叶生物科技有限公司，CAS#37339-90-5。
名词解释:
抗原：是指能引起抗体生成的物质，是可诱发免疫反应的物质，一般多以激活体液免疫为主。
疫苗：各类抗原与保护剂(如明胶)和/或缓蚀剂(含油佐剂)等辅料制作的用于预防接种的生物制品，主要以肌肉注射、皮下注射、口服或喷雾为主。
下述实施例和对比例中，猪伪狂犬病毒的TCID50是基于不同稀释度的病毒液接种PK-15细胞培养并记录细胞病变，然后根据Reed-Muench法计算得到的。
实施例1
(1)灭活屎肠球菌溶液的制备：将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于MRS培养基，于37℃温箱培养24h后，将培养瓶中的菌悬液以3000r/min离心5min，弃掉上清液，保留沉淀；将沉淀用0.9％生理盐水清洗3次后，加入合适体积的生理盐水进行重悬，配制成高浓度的屎肠球菌菌液，将其置于高压灭菌锅中，于121℃、压力0.12MPa条件下，灭活15min，4℃保存备用。取合适体积的菌液进行稀释，在显微镜下使用THOMA细菌计数板进行计数，将菌量调整为2.0×109个/mL，制得灭活屎肠球菌溶液。
(2)猪伪狂犬病抗原溶液(灭活猪伪狂犬病毒溶液)的制备方法：采用的病毒株是猪伪狂犬Bartha株，制备过程如下：将病毒接种于猪肾细胞PK-15中进行增殖，当接毒后80％的细胞出现病变时，收取病毒液；在-80℃条件下将收取的病毒液反复冻融3次后，在4℃条件下12000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清液，此后上清液通过硫酸铵盐析和密度梯度超高速离心纯化病毒，制得病毒含量为107.33TCID50/0.1mL的病毒液。然后在病毒液中加入40％的甲醛溶液充分混匀，使甲醛溶液的最终浓度为0.3％，置37℃条件下作用36h，然后放室温继续作用12h，即获得含抗原的溶液，具体为猪伪狂犬病抗原溶液。
(3)防治传染病的静脉注射液体制剂的制备：将步骤(1)制得的灭活的屎肠球菌溶液和步骤(2)制得的灭活猪伪狂犬病毒溶液按体积比为1：1混合，制得灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液；静脉注射液中，猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为5×106.33TCID50/0.1mL，每毫升静脉注射液中配比的灭活的屎肠球菌的数量为1.0×109个。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中，制得病毒含量为106.33TCID50/0.1mL的病毒液，其他条件参数同实施例1；制得的静脉注射液中，猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为5×105.33TCID50/0.1mL。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活植物乳杆菌植物亚种溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6240的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)，其他条件参数同实施例1，制得灭活植物乳杆菌植物亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活乳酸乳球菌乳酸亚种溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6246的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)，其他条件参数同实施例1，制得灭活乳酸乳球菌乳酸亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活嗜酸乳杆菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6075的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，其他条件参数同实施例1，制得灭活嗜酸乳杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例6
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活长双歧杆菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6196的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其他条件参数同实施例1，制得灭活长双歧杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例7
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活乳酸片球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 10346的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，其他条件参数同实施例1，制得灭活乳酸片球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例8
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活肠膜明串珠菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 21860的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，其他条件参数同实施例1，制得灭活肠膜明串珠菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例9
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活嗜热链球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 20174的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，其他条件参数同实施例1，制得灭活嗜热链球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例10
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活粪肠球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 20398的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其他条件参数同实施例1，制得灭活粪肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例11
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活肠炎沙门氏菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC 3377的肠炎沙门氏菌，其他条件参数同实施例1，制得灭活肠炎沙门氏菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例12
(1)0.08mg/mL聚肌胞注射液；
(2)灭活猪伪狂犬病毒溶液的制备方法：采用的病毒株是猪伪狂犬Bartha株，制备过程如下：将病毒接种于猪肾细胞PK-15中进行增殖，当接毒后80％的细胞出现病变时，收取病毒液；在-80℃条件下将收取的病毒液反复冻融3次后，在4℃条件下12000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清液，此后上清液通过硫酸铵盐析和密度梯度超高速离心纯化病毒。制得病毒含量为107.33TCID50/0.1mL的病毒液。然后在病毒液中加入40％的甲醛溶液充分混匀，使甲醛溶液的最终浓度为0.3％，置37℃条件下作用36h，然后放室温继续作用12h，即获得含抗原的溶液，具体为灭活猪伪狂犬病毒溶液。
(3)防治传染病的静脉注射液体制剂的制备：将步骤(1)制得的聚肌胞注射液和步骤(2)制得的灭活猪伪狂犬病毒溶液按体积比为1：1混合，制得聚肌胞+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液；静脉注射液中，猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为5×106.33TCID50/0.1mL，每毫升静脉注射液中配比的聚肌胞的含量为0.04mg。
实施例13
与实施例12相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.04mg/mL的卡介菌多糖核酸溶液，其他条件参数同实施例12，制得卡介菌多糖核酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例14
与实施例12相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.4mg/mL的金黄色葡萄球菌脂磷壁酸溶液，其他条件参数同实施例12，制得金黄色葡萄球菌脂磷壁酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例15
与实施例12相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.4mg/mL的β-葡聚糖溶液，其他条件参数同实施例12，制得β-葡聚糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例16
与实施例12相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.04mg/mL的胸腺五肽溶液，其他条件参数同实施例12，制得胸腺五肽+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
实施例17
与实施例12相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为2mg/mL的香菇多糖，其他条件参数同实施例12，制得香菇多糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射液。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于将猪伪狂犬病抗原溶液替换为等体积的生理盐水。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于将灭活屎肠球菌溶液替换为等体积的生理盐水。
实施例18
(1)灭活屎肠球菌溶液的制备：方法同实施例1中灭活屎肠球菌溶液的制备方法；
(2)PR8流感病抗原溶液(灭活PR8流感病毒溶液)的制备方法：将PR8流感病毒原液用生理盐水按1:10稀释后接种于SPF鸡胚尿囊腔进行病毒扩增。收集扩增病毒的尿囊液于4℃，12000r/min，离心15min，收集上清液，此后上清液通过硫酸铵盐析和密度梯度超高速离心纯化病毒，通过血凝实验测定纯化病毒的血凝效价为1:210。在纯化的病毒液中加入40％的甲醛溶液充分混匀，使甲醛溶液的最终浓度为0.3％，置37℃条件下作用36h，然后放室温继续作用12h，即获得灭活PR8流感病毒溶液；
(3)防治传染病的静脉注射液体制剂的制备：将步骤(1)制得的含灭活的屎肠球菌溶液和步骤(2)制得的含灭活PR8流感病毒的溶液按体积比为1：1混合，制得灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液；静脉注射液中，病毒灭活前的血凝效价为1:29，每毫升静脉注射液中配比的屎肠球菌的数量为1.0×109个。
实施例19
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活植物乳杆菌植物亚种溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6240的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)，其他条件参数同实施例18，制得灭活植物乳杆菌植物亚种+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例20
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活乳酸乳球菌乳酸亚种溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6246的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)，其他条件参数同实施例18，制得灭活乳酸乳球菌乳酸亚种+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例21
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活嗜酸乳杆菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6075的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，其他条件参数同实施例18，制得灭活嗜酸乳杆菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例22
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活长双歧杆菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 6196的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其他条件参数同实施例18，制得灭活长双歧杆菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例23
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活乳酸片球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 10346的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，其他条件参数同实施例18，制得灭活乳酸片球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例24
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活肠膜明串珠菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 21860的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，其他条件参数同实施例18，制得灭活肠膜明串珠菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例25
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活嗜热链球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 20174的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，其他条件参数同实施例18，制得灭活嗜热链球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例26
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活粪肠球菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为保藏编号为CICC 20398的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其他条件参数同实施例18，制得灭活粪肠球菌+灭活猪PR8流感病毒静脉注射液。
实施例27
与实施例18相比，区别仅在于步骤(1)制得灭活肠炎沙门氏菌溶液，具体将保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌(Enterococcus faecium)替换为购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC 3377的肠炎沙门氏菌，其他条件参数同实施例18，制得灭活肠炎沙门氏菌+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例28
(1)0.08mg/mL聚肌胞注射液；
(2)灭活PR8流感病毒溶液的制备方法：将PR8流感病毒原液用生理盐水按1:10稀释后接种于SPF鸡胚尿囊腔进行病毒扩增。收集扩增病毒的尿囊液于4℃，12000r/min，离心15min，收集上清液，此后上清液通过硫酸铵盐析和密度梯度超高速离心纯化病毒，通过血凝实验测定纯化病毒的血凝效价为1:210。在纯化的病毒液中加入40％的甲醛溶液充分混匀，使甲醛溶液的最终浓度为0.3％，置37℃条件下作用36h，然后放室温继续作用12h，即获得灭活PR8流感病毒溶液；
(3)防治传染病的静脉注射液体制剂的制备：将步骤(1)制得的聚肌胞注射液和步骤(2)制得的灭活PR8流感病毒溶液按体积比为1：1混合，制得聚肌胞+灭活PR8流感病毒静脉注射液；静脉注射液中，病毒灭活前的血凝效价为1：29，每毫升静脉注射液中配比的聚肌胞的含量为0.04mg。
实施例29
与实施例28相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.04mg/mL的卡介菌多糖核酸溶液，其他条件参数同实施例28，制得卡介菌多糖核酸+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例30
与实施例28相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.4mg/mL的金黄色葡萄球菌脂磷壁酸溶液，其他条件参数同实施例28，制得金黄色葡萄球菌脂磷壁酸+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例31
与实施例28相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.4mg/mL的β-葡聚糖溶液，其他条件参数同实施例28，制得β-葡聚糖+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例32
与实施例28相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为0.04mg/mL的胸腺五肽溶液，其他条件参数同实施例28，制得胸腺五肽+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
实施例33
与实施例28相比区别仅在于步骤(1)制得浓度为2mg/mL的香菇多糖，其他条件参数同实施例28，制得香菇多糖+灭活PR8流感病毒静脉注射液。
对比例3
与实施例18相比，区别仅在于将灭活屎肠球菌溶液替换为等体积的生理盐水。
对比例4
与实施例18相比，区别仅在于将灭活PR8流感病毒溶液替换为等体积的生理盐水。
效果实施例1
考察不同TCID50的灭活猪伪狂犬Bartha株与灭活乳酸菌配制的防治传染病的静脉注射液对小鼠的保护作用。
设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组和实验组，实验组待测液分别为上述实施例1和实施例2制得的防治传染病的静脉注射液。
每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，其他实验组分别经尾静脉注射0.2mL上述制得的待测液。间隔3d后，除正常对照组以外，对猪伪狂犬病毒模型组和其他实验组小鼠进行攻毒处理，即每只小鼠滴鼻20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。此后连续观察10天，每天记录小鼠死亡数量，结果见表1。
表1
Figure BDA0003495794520000141
注：表1中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
从表1可知，实施例1和实施例2制得的静脉注射液经静脉注射处理后，对小鼠具有极显著的保护作用。正常对照组、实施例1组和实施例2组的死亡总数之间无显著性差异，且死亡数均极显著小于猪伪狂犬病毒模型组。
效果实施例2
针对猪伪狂犬病毒模型，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染猪伪狂犬病毒后，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组和不同处理的实验组，各组待测液和注射方式见表2，共6组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，其他各实验组分别注射0.2mL相应的待测液。除正常对照组以外，猪伪狂犬病毒模型组和各实验组的小鼠在3d后，滴鼻20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。
此后连续观察21天，记录小鼠死亡数量。实验结果见图1和表3，其中，图1是21天时饲养箱中剩余小鼠生存状况图。
表2
Figure BDA0003495794520000142
Figure BDA0003495794520000151
表3
Figure BDA0003495794520000152
注：表3中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示4～6组中，与第3组(灭活猪伪狂犬病毒溶液+灭活屎肠球菌溶液静脉注射组)比较差异显著(P﹤0.05)；##表示4～6组中，与3组比较差异极显著(P﹤0.01)。
从图1和表3结果可知，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射处理小鼠后，对小鼠起到良好的保护作用，保护率可达到100％，同时从图中可看出小鼠体况健康；与编号为4、5和6的实验组相比较，保护率最高，体况最好，说明实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射的保护效果优于肌肉注射，而且这种组合物静脉注射也明显优于单独静脉注射灭活屎肠球菌溶液的效果，保护率也优于单独静脉注射灭活猪伪狂犬病毒溶液。
效果实施例3
针对猪伪狂犬病毒模型，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染猪伪狂犬病毒后，对小鼠肺脏做病理切片，观察病理组织变化。
组别设置、给药方法和免疫方法同效果实施例2，组别设置具体见表2。免疫后，第5天取各组小鼠肺脏，放入4％甲醛溶液中固定24h，再制成切片，组织变化的检测结果见图2和表4；图2中，三角形所示肺出血，箭头所示间质增宽，间质内炎细胞浸润。
表4
编号 与正常对照组比较，组织变化的检测结果
1 --
2 肺出血，肺间质增宽，间质内炎细胞浸润
3 肺组织未出现病变
4 出现肺间质增宽，间质内炎细胞浸润
5 出现肺间质增宽，间质内炎细胞浸润
6 出现肺间质增宽，间质内炎细胞浸润
由图2和表4结果可知，与正常对照组比较，猪伪狂犬病毒模型组出现肺出血，肺间质增宽，间质内炎细胞浸润；实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射处理的小鼠肺组织未出现病变，表现出良好的保护作用。
效果实施例4
针对猪伪狂犬病，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染猪伪狂犬病毒后，小鼠血液中抗体水平的对比实验。
组别设置、给药方法和免疫方法同效果实施例2，组别设置具体见表2。免疫后，第5天小鼠眼眶静脉丛采血。4℃冰箱过夜放置后，3000r/min离心5min，分离血清，保存于-80℃备用。之后采用ELISA方法进行抗体水平检测。由于目前尚无商品化的用于检测小鼠血清中PRV抗体的试剂盒，但可以购买到武汉科前生物股份有限公司的用于检测猪血清中PRV抗体的ELISA试剂盒，因此将检测猪血清PRV抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的二抗替换为HRP–羊抗鼠Ig G来测定小鼠血清中的PRV抗体，因为二抗被更换，所以抗体的检测结果用D450 nm值表示，该检测方法参照了2018年邹舒展等人发表在华南农业大学学报上的文章(请参阅参考文献：邹舒展，李冰，陈安妮，等.3种免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果评价[J].华南农业大学学报,2018,39(4)：1-6)，各组小鼠血清中PRV抗体水平的检测结果见表5。
表5
编号 PRV抗体水平(OD<sub>450nm</sub>值)
1 0.124±0.0172
2 0.176±0.0256<sup>**</sup>
3 0.297±0.046<sup>**△△</sup>
4 0.237±0.010<sup>**△△##</sup>
5 0.178±0.023<sup>**##</sup>
6 0.324±0.054<sup>**△△</sup>
注：表5中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与3组(灭活猪伪狂犬病毒溶液+灭活屎肠球菌溶液静脉注射组)比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与3组比较差异极显著(P﹤0.01)。
由表5可知，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射(第3组)与猪伪狂犬病毒模型组以及编号为4～5的实验组相比较，均极显著地提高了抗体水平。与编号为6的实验组相比较差异不显著。说明实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射可显著提高抗体产生水平，发挥良好的体液免疫作用。
效果实施例5
针对猪伪狂犬病毒模型，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染猪伪狂犬病毒后，脾脏中免疫细胞含量的对比实验。
组别设置、给药方法和免疫方法同效果实施例2，组别设置具体见表2。免疫后，第5天取各组小鼠脾脏，放入加有1mL RPMI Medium 1640培养液的24孔板中，倒掉培养液，注入1mL的胰蛋白酶，把脾脏用灭菌的剪刀剪碎，放入37℃温箱30min左右，加入1mL的PBS终止消化。将脾脏磨碎后，用细胞筛过滤，定容至10mL。放入4℃离心机2500rpm离心6min，弃掉上清液，加10mL的PBS终止反应。放入4℃离心机2500rpm离心6min，倒掉上清液，加入1mLPBS，将沉淀吹打均匀，用细胞筛过滤后，分成两管。取约30uL细胞悬液，加入Anti-Mouse CD3eFITC、Anti-Hu/Mo CD45R(B220)PerCP-Cyanine5.5抗体染色15min，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏中B细胞数量，结果见表6。
同理，加入Anti-Mouse CD3e FITC、Anti-Mo CD4 Alexa Fluor 4700抗体染色15min，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏中Th细胞数量进行检测，结果见表6。
加入Anti-Mouse CD3e FITC、PE anti-mouse CD8a抗体染色15min，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏中Tc细胞数量，结果见表6。
加入Anti-Mouse CD3e FITC、Anti-Mouse NK1.1抗体染色15min，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏中NK细胞数量，结果见表6。
表6
Figure BDA0003495794520000181
注：表6中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与3组(灭活猪伪狂犬病毒溶液+灭活屎肠球菌溶液静脉注射组)比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与3组比较差异极显著(P﹤0.01)。
从表6结果可看出，与正常对照组和模型组相比，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射可以分别显著和极显著的促进脾脏T细胞数量增加。对于脾脏中Th细胞数量，除了与编号为4的实验组相比无明显差异外，均显著或极显著地高于其余各组。与正常对照组和模型组相比较，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射对Tc细胞、B细胞和NK细胞的数量无显著性影响。
将本效果实施例5与效果实施例4相结合起来进行综合分析，可以得知，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射对T细胞免疫和体液免疫同时激活的作用最优。
效果实施例6
针对猪伪狂犬病毒模型，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染猪伪狂犬病毒后，小鼠血液中细胞因子含量的对比实验。
组别设置、给药方法和免疫方法同效果实施例2，组别设置具体见表2。免疫后，第5天从小鼠眼眶静脉丛采血，分离小鼠血清，保存于-80℃备用。之后用ELISA试剂盒检测IL-1β、IFN-γ和IL-10水平，结果见表7。
表7
Figure BDA0003495794520000191
注：表7中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与3组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与3组比较差异极显著(P﹤0.01)。
表7结果可看出，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射(第3组)与对照组和模型组相比较，小鼠血清中IL-10含量均极显著增加，而对IL-1β和IFN-γ含量无显著性影响。IL-10是重要的抗炎细胞因子，因此IL-10含量增加有利于减轻机体感染病毒导致的炎性损伤。结合上面效果实施例2～5进行综合分析，可以得知：实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射通过增强机体体液免疫和细胞免疫功能发挥抗病毒作用保护机体的同时，还会促进IL-10的产生，减轻机体炎性损伤维护机体健康。
效果实施例7
针对猪伪狂犬病毒模型，考察防治传染病的药物制剂静脉注射对感染猪伪狂犬病毒的保护期。
实验设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组、灭活猪伪狂犬病毒+灭活屎肠球菌静脉注射组，共三组，每组30小鼠，雌雄各半，体重18～22g。灭活猪伪狂犬病毒+灭活屎肠球菌静脉注射组经尾静脉注射实施例1制得的防治传染病的静脉注射液0.2mL，正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组分别尾静脉注射0.2mL的生理盐水。此后，分别于3d、7d、14d、21d、28d和35d，每组小鼠取出5只进行处理，其中，猪伪狂犬病毒模型组和灭活猪伪狂犬病毒+灭活屎肠球菌静脉注射组的小鼠分别滴鼻20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，然后连续观察14d记录各组小鼠的死亡数，结果见表8。
表8
Figure BDA0003495794520000192
Figure BDA0003495794520000201
表8可知，实施例1制得的防治传染病的静脉注射液经静脉注射对小鼠的保护期大于35天，而且静脉注射3天后就可以达到100％的保护作用。
效果实施例8
针对猪伪狂犬病毒模型，考察实施例1和实施例3～6制得产品经静脉注射后滴鼻攻毒猪伪狂犬病毒，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组、灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活植物乳杆菌植物亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活乳酸乳球菌乳酸亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活嗜酸乳杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活长双歧杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组，见表9。共7组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g。
正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL；其他各组小鼠尾静脉分别推注实施例1、实施例3～6制得的产品0.2mL。在以上所有实验组小鼠处理3天后，除了正常对照组以外，其他各组小鼠经鼻滴入20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组滴鼻等量的生理盐水。
此后连续观察10天，记录小鼠死亡数量，结果见表10。
表9
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 猪伪狂犬病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例1 静脉注射
4 灭活植物乳杆菌植物亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例3 静脉注射
5 灭活乳酸乳球菌乳酸亚种+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例4 静脉注射
6 灭活嗜酸乳杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例5 静脉注射
7 灭活长双歧杆菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例6 静脉注射
表10
Figure BDA0003495794520000211
注：表10中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
从表10结果可知，与模型组相比较，灭活植物乳杆菌植物亚种、灭活乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活嗜酸乳杆菌、灭活长双歧杆菌分别与灭活猪伪狂犬病毒组合物静脉注射均极显著地降低了小鼠死亡数，并且与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组无显著性差异，表现出良好的保护作用。
效果实施例9
针对猪伪狂犬病毒模型，考察实施例1和实施例7～10制得产品经静脉注射后滴鼻攻毒猪伪狂犬病毒，对小鼠保护作用的对比实验。实验设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组、灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活乳酸片球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活肠膜明串珠菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活嗜热链球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活粪肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组，见表11。共7组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g。
正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL；其他各组小鼠尾静脉分别推注实施例1、实施例7～10制得的产品0.2mL。在以上所有实验组小鼠处理3天后，除了正常对照组以外，其他各组小鼠经鼻滴入20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组滴鼻等量的生理盐水。
此后连续观察10天，记录小鼠死亡数量，结果见表12。
表11
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 猪伪狂犬病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例1 静脉注射
4 灭活乳酸片球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例7 静脉注射
5 灭活肠膜明串珠菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例8 静脉注射
6 灭活嗜热链球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例9 静脉注射
7 灭活粪肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例10 静脉注射
表12
Figure BDA0003495794520000221
注：表12中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
灭活乳酸片球菌、灭活肠膜明串珠菌、灭活嗜热链球菌和灭活粪肠球菌4种乳酸菌分别和灭活猪伪狂犬病毒组合物静脉注射组，与模型组比较可以显著或极显著的降低小鼠死亡数，而且与正常对照组和灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组相比较无显著性差异。说明以上4种灭活乳酸菌分别与灭活猪伪狂犬病毒的组合物静脉注射具有良好的保护作用。
效果实施例10
针对猪伪狂犬病毒模型，考察实施例1和实施例11制得产品经静脉注射后滴鼻攻毒猪伪狂犬病毒，对小鼠保护作用的对比实验。实验设置正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组、灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、灭活肠炎沙门氏菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组，见表13。共7组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g。
正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL；其他各组小鼠尾静脉分别推注实施例1、实施例11制得的产品0.2mL。在以上所有实验组小鼠处理3天后，除了正常对照组以外，其他各组小鼠经鼻滴入20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组滴鼻等量的生理盐水。
此后连续观察10天，记录小鼠死亡数量，结果见表14。
表13
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 猪伪狂犬病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例1 静脉注射
4 灭活肠炎沙门氏菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例11 静脉注射
表14
Figure BDA0003495794520000231
注：表14中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与猪伪狂犬病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
与模型组相比较，灭活肠炎沙门氏菌与灭活猪伪狂犬病毒组合物静脉注射组极显著地降低了小鼠死亡数，而且与正常对照组相比较无显著性差异，另外与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组相比较也无显著性差异，说明灭活肠炎沙门氏菌与灭活猪伪狂犬病毒的组合物静脉注射具有良好的保护作用。
效果实施例11
针对猪伪狂犬病毒模型，考察实施例12～17制得的产品经静脉注射后滴鼻攻毒猪伪狂犬病毒，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设计正常对照组、猪伪狂犬病毒模型组、聚肌胞+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、卡介菌多糖核酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、金黄色葡萄球菌脂磷壁酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、β-葡聚糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、胸腺五肽+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组、香菇多糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组，见表15。共8组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18-22g。
正常对照组和猪伪狂犬病毒模型组：第1天静脉注射生理盐水0.2mL；其他各组小鼠尾静脉分别推注实施例12～17中任一产品0.2mL；在3天后，除正常对照组以外，其他各组小鼠经滴鼻攻毒20uL滴度为106.2TCID50/mL的猪伪狂犬活病毒，正常对照组滴鼻等量的生理盐水滴鼻。此后连续观察10天，记录小鼠死亡数量，实验结果见表16。
表15
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 猪伪狂犬病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 聚肌胞+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例12 静脉注射
4 卡介菌多糖核酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例13 静脉注射
5 金黄色葡萄球菌脂磷壁酸+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例14 静脉注射
6 β-葡聚糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例15 静脉注射
7 胸腺五肽+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例16 静脉注射
8 香菇多糖+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组 实施例17 静脉注射
表16
Figure BDA0003495794520000241
Figure BDA0003495794520000251
注：表16中，*表示与正常组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
从表16可知，聚肌胞、金黄色葡萄球菌脂磷壁酸、胸腺五肽、香菇多糖分别与灭活猪伪狂犬病毒组合物静脉注射组与猪伪狂犬病毒模型组相比，均可极显著地降低小鼠死亡数，而且与正常对照组比较无显著差异，说明具有良好的保护作用。另外，卡介菌多糖核酸和β-葡聚糖分别与灭活猪伪狂犬病毒组合物静脉注射组与模型组比较差异极显著，与正常组相比较差异显著，说明具有较好的保护作用。
效果实施例12
针对PR8流感病毒模型，考察采用不同防治传染病的药物制剂在静脉注射和肌肉注射，并感染PR8流感病毒后，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、PR8流感病毒模型组和不同处理实验组，各组待测液和注射方式见表17，共6组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和PR8病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，不同处理实验组分别注射0.2mL相应的待测液。除正常对照组以外，PR8病毒模型组和不同处理实验组在3天后给小鼠滴鼻150uL(分三次滴鼻，每隔10min滴鼻50μL)血凝效价为1:210的PR8病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。
连续记录各组小鼠体重至攻毒后第6天模型组开始出现死亡为止。统计各组小鼠体重变化(小鼠体重变化＝攻毒后第6天体重-攻毒第1天体重)和死亡情况，结果见表18。
表17
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 PR8流感病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射组 实施例18 静脉注射
4 灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒肌肉注射组 实施例18 肌肉注射
5 生理盐水+灭活PR8流感病毒静脉注射组 对比例3 静脉注射
6 生理盐水+灭活屎肠球菌静脉注射组 对比例4 静脉注射
表18
Figure BDA0003495794520000252
Figure BDA0003495794520000261
注：表18中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与PR8流感病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与PR8流感病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
由表18可知，与正常对照组相比，模型组小鼠体重极显著下降。实施例1制得的产品经静脉注射组与模型组相比较，极显著地增加了小鼠体重，而且与正常对照组相比较无显著性差异，说明小鼠体重恢复到了正常水平。实施例1制得的产品经静脉注射组分别与编号为4～6组比较，也极显著地增加了小鼠体重，说明灭活屎肠球菌和灭活PR8流感病毒组合物静脉注射效果最佳。
效果实施例13
针对PR8流感病毒模型，考察实施例19～22制得的产品经静脉注射后滴鼻攻毒PR8流感病毒后，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、PR8流感病毒模型组和不同处理实验组，各组待测液和注射方式见表19，共7组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和PR8病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，不同处理实验组分别注射0.2mL相应的待测液。除正常对照组以外，PR8病毒模型组和不同处理实验组在3天后给小鼠滴鼻150uL(分三次滴鼻，每隔10min滴鼻50μL)血凝效价为1:210的PR8病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。
连续记录各组小鼠体重至攻毒后第6天模型组开始出现死亡为止。统计各组小鼠体重变化(小鼠体重变化＝攻毒后第6天体重-攻毒第1天体重)和死亡情况，结果见表20。
表19
Figure BDA0003495794520000262
Figure BDA0003495794520000271
表20
编号 体重变化 死亡状况
1 5.79±0.96 0
2 -2.24±4.29<sup>**</sup> 2
3 3.14±1.96<sup>*△△</sup> 0
4 4.29±1.83<sup>△△</sup> 0
5 3.98±2.05<sup>△△</sup> 0
6 3.71±1.95<sup>△△</sup> 0
7 6.43±1.41<sup>△△#</sup> 0
注：表20中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与PR8流感病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与PR8流感病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
由表20可知，灭活植物乳杆菌植物亚种、灭活乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活嗜酸乳杆菌、灭活长双歧杆菌分别与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组，与模型组比较均极显著地提高小鼠体重，而且与正常对照组相比较无显著性差异，并且与灭活屎肠球菌+灭活猪伪狂犬病毒静脉注射组相比较无显著性差异或显著地高于该组。说明以上4种灭活乳酸菌分别与灭活PR8流感病毒的组合物静脉注射具有良好的保护作用。
效果实施例14
针对PR8流感病毒模型，考察实施例23～26制得的产品经静脉注射后滴鼻攻毒PR8流感病毒后，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、PR8流感病毒模型组和不同处理实验组，各组待测液和注射方式见表21，共7组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和PR8病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，不同处理实验组分别注射0.2mL相应的待测液。除正常对照组以外，PR8病毒模型组和不同处理实验组在3天后给小鼠滴鼻150uL(分三次滴鼻，每隔10min滴鼻50μL)血凝效价为1:210的PR8病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。
连续记录各组小鼠体重至攻毒后第6天模型组开始出现死亡为止。统计各组小鼠体重变化(小鼠体重变化＝攻毒后第6天体重-攻毒第1天体重)和死亡情况，结果见表22。
表21
Figure BDA0003495794520000272
Figure BDA0003495794520000281
表22
编号 体重变化 死亡状况
1 4.42±1.31 0
2 -3.88±2.66<sup>**</sup> 1
3 2.19±1.16<sup>**△△</sup> 0
4 4.56±1.33<sup>△△##</sup> 0
5 3.79±1.20<sup>△△#</sup> 0
6 4.30±1.55<sup>△△##</sup> 0
7 3.62±1.12<sup>△△#</sup> 0
注：表22中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与PR8流感病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与PR8流感病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
与模型组比较，灭活乳酸片球菌、肠膜明串珠菌、嗜热链球菌、粪肠球菌分别与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组均极显著地提高了小鼠体重，而且与正常对照组相比较无显著性差异；另外，4种灭活乳酸菌分别与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组的小鼠体重显著或极显著地高于灭活屎肠球菌与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组，说明以上4种灭活乳酸菌分别与灭活PR8流感病毒的组合物静脉注射具有更好的保护作用。
效果实施例15
针对PR8流感病毒模型，考察灭活肠炎沙门氏菌与灭活PR8流感病毒组合物在静脉注射，并感染PR8流感病毒后，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、PR8流感病毒模型组和不同处理实验组，各组待测液和注射方式见表23，共4组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18～22g，适应环境并饲养3天。正常对照组和PR8病毒模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水0.2mL，不同处理实验组分别注射0.2mL相应的待测液。除正常对照组以外，PR8病毒模型组和不同处理实验组在3天后给小鼠滴鼻150uL(分三次滴鼻，每隔10min滴鼻50μL)血凝效价为1:210的PR8病毒，正常对照组用等量的生理盐水滴鼻。
连续记录各组小鼠体重至攻毒后第6天模型组开始出现死亡为止。统计各组小鼠体重变化(小鼠体重变化＝攻毒后第6天体重-攻毒第1天体重)和死亡情况，结果见表24。
表23
编号 组别 待测液 注射方式
1 正常对照组 生理盐水 静脉注射
2 PR8流感病毒模型组 生理盐水 静脉注射
3 灭活屎肠球菌+灭活PR8流感病毒静脉注射组 实施例18 静脉注射
4 灭活肠炎沙门氏菌+灭活PR8流感病毒静脉注射组 实施例27 静脉注射
表24
编号 体重变化 死亡状况
1 5.79±0.96 0
2 -2.24±4.29<sup>**</sup> 2
3 3.14±1.96<sup>*△△</sup> 0
4 4.37±1.13<sup>△△</sup> 1
注：表24中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与PR8流感病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与PR8流感病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)；#表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异显著(P﹤0.05)；##表示与灭活屎肠球菌+灭活PR8病毒静脉注射组比较差异极显著(P﹤0.01)。
与模型组相比较，灭活肠炎沙门氏菌与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组极显著地增加了小鼠体重，而且与正常对照组和相比较无显著性差异；另外，与灭活屎肠球菌和灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组相比较也无显著性差异，说明灭活肠炎沙门氏菌与灭活PR8流感病毒的组合物静脉注射具有良好的保护作用。
效果实施例16
针对PR8流感，考察实施例28～33制得的产品静脉注射后滴鼻攻毒PR8流感病毒，对小鼠保护作用的对比实验。
实验设置正常对照组、PR8流感病毒模型组、聚肌胞+灭活PR8流感病毒静脉注射组、卡介菌多糖核酸注射液+灭活PR8流感病毒静脉注射组、金黄色葡萄球菌脂磷壁酸+灭活PR8流感病毒静脉注射组、β-葡聚糖+灭活PR8流感病毒静脉注射组、香菇多糖+灭活PR8流感病毒静脉注射组、胸腺五肽+灭活PR8流感病毒静脉注射组，共8组，每组10只小鼠，雌雄各半，体重18-22g，见表25。
正常对照组：第1天注射生理盐水0.2mL；PR8流感病毒模型组：第1天注射生理盐水0.2mL；其他各组小鼠尾静脉分别推注实施例28～33中任一产品0.2mL。在3d后，除空白对照组以外，其他各组小鼠滴鼻攻毒血凝效价为1:210的PR8流感病毒150uL(分三次滴鼻，每隔10min滴鼻50uL)。
连续记录各组小鼠体重至攻毒后第7天模型组开始出现死亡为止。统计各组小鼠体重变化(小鼠体重变化＝攻毒后第7天体重-攻毒第1天体重)和死亡情况，结果见表26。
表25
Figure BDA0003495794520000301
表26
编号 体重变化 死亡状况
1 2.67±1.00 0
2 -3.85±2.83<sup>**</sup> 1
3 3.21±1.18<sup>△△</sup> 0
4 2.03±1.33<sup>△△</sup> 0
5 3.90±1.13<sup>△△</sup> 0
6 3.33±1.27<sup>△△</sup> 0
7 1.84±1.24<sup>△△</sup> 0
8 2.78±0.66<sup>△△</sup> 0
注：表26中，*表示与正常对照组比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与正常对照组比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与PR8流感病毒模型组比较差异显著(P﹤0.05)；△△表示与PR8流感病毒模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
由表26可知，与模型组相比较，6种免疫增强剂分别与灭活PR8流感病毒组合物静脉注射组均极显著地增加了小鼠体重，而且与正常对照组相比较无显著性差异，说明小鼠生长均正常，表现出良好的保护作用。
效果实施例17：灭活乳酸菌形态的扫描电镜观察
分别将实施例1中灭活屎肠球菌、实施例3中灭活植物乳杆菌植物亚种、实施例4中灭活乳酸乳球菌乳酸亚种、实施例5中灭活嗜酸乳杆菌和实施例6中灭活长双歧杆菌与生理盐水溶液进行混合，然后离心弃去上清，保留底部菌体沉淀，向保留底部菌体沉淀的试管中倒入2.5％的戊二醛固定液。固定2～4h后，8000rpm离心3～5min，弃去上清，加入磷酸缓冲液清洗并打散菌块。随后加入1％锇酸放置4～6h，再用磷酸缓冲液清洗3次。然后用乙醇梯度脱水，30％、50％、70％、85％、95％各一次，每次脱水大约15～20min，最后100％乙醇脱水两次，每次15～20min，离心后弃去乙醇上清，倒入乙酸异戊酯置换2次，每次20min左右，随后8000rpm离心3～5min，弃去上清乙酸异戊酯。此后进行临界点干燥，将普通定性滤纸裁剪成35mm×18mm的纸条，将边长35mm平均分为3份，对折成小纸包，用订书机将一端订牢，呈小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包，立即用订书机将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室，进行CO2临界点干燥。将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。将碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，将另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻过来后用镊子将菌体轻轻刮薄铺平，离子溅射金后进行扫描电镜观察，结果见图3。
从图3可知，经过高温高压灭活后的乳酸菌部分仍然保持完整菌体形态，部分菌体已经破碎。结合效果实施例8和13可知，无论完整形态菌体还是已经破碎的菌体与灭活病毒抗原一起静脉注射均会起到良好的保护作用。
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种静脉注射用药物组合物，其特征在于，其由抗原和免疫增强剂组成。
2.如权利要求1所述的静脉注射用药物组合物，其特征在于，所述静脉注射用药物组合物满足下述条件中的至少一种：
所述静脉注射的方法为静脉滴注或静脉推注；
所述抗原包括灭活全抗原、减毒活全抗原、亚单位抗原、裂解抗原、多肽抗原、基因工程抗原和DNA载体抗原中的至少一种，较佳地为灭活全抗原；较佳地，所述灭活全抗原的灭活方法为高温高压灭活法、紫外线灭活法、化学试剂灭活法和辐射灭活法中的至少一种，更佳地为高温高压灭活法和/或化学试剂灭活法；较佳地，所述化学试剂灭活法包括甲醛灭活法；
所述抗原包括病毒性传染病的抗原；
较佳地，所述病毒性传染病包括DNA病毒引起的传染性疾病和/或RNA病毒引起的传染性疾病；
较佳地，所述病毒性传染病包括人患病毒性疾病、家畜患病毒性疾病和宠物患病毒性疾病中的至少一种；更佳地，所述人患病毒性疾病包括艾滋病、新冠肺炎、病毒性肝炎、流行性感冒、流行性乙型脑炎、非典型肺炎、埃博拉病毒病、登革热、病毒性出血热、轮状病毒腹泻、带状疱疹、手足口病、流行性腮腺炎、麻疹、风疹和腺病毒病中的至少一种；进一步更佳地，所述流行性感冒包括甲型流感病毒引发的流行性感冒，进一步更佳地为PR8流感病毒引发的流行性感冒；更佳地，所述畜患病毒性疾病包括非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪日本脑炎、猪水疱性病、猪流感、猪痘、口蹄疫、牛呼吸道合胞体病毒病、牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛副流感、牛轮状病毒病、羊痘病毒病、小反刍兽疫、马流感和马传染性贫血病中的至少一种；更佳地，所述宠物患病毒性疾病包括犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、狂犬病和猫瘟热中的至少一种。
3.如权利要求1所述的静脉注射用药物组合物，其特征在于，所述免疫增强剂包括灭活的乳酸菌、灭活的有害菌、植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中的至少一种；
较佳地，所述灭活的乳酸菌包括灭活乳酸菌完整形态菌体和/或灭活乳酸菌破碎菌体；
较佳地，所述乳酸菌的灭活方法包括高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活和辐射灭活中至少一种；
较佳地，所述灭活的有害菌包括灭活有害菌完整形态菌体和/或灭活有害菌破碎菌体；
较佳地，所述有害菌的灭活方法包括高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活和辐射灭活中至少一种；
较佳地，所述有害菌包括肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、A群链球菌(Group A streptococcus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、红色诺卡氏菌(Nocardia rubropertincta)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中至少一种，更佳地包括肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)；
较佳地，所述植物多糖类免疫增强剂包括香菇多糖、黄芪多糖、云芝多糖、人参多糖、银耳多糖和猪苓多糖中的至少一种，更佳地包括香菇多糖；
较佳地，所述细胞因子类免疫增强剂包括胸腺肽、转移因子、干扰素和白介素中至少一种，更佳地包括胸腺肽；更佳地，所述胸腺肽包括胸腺五肽；
较佳地，所述化学类免疫增强剂包括左旋咪唑、异丙肌苷和匹多莫德中至少一种；
较佳地，所述菌体成分类免疫增强剂包括脂磷壁酸、β-葡聚糖、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、甘露聚糖肽、甘露寡糖、胞壁酰二肽、细菌细胞壁骨架和核酸中至少一种，更佳地包括脂磷壁酸、β-葡聚糖、聚肌胞和卡介菌多糖核酸中至少一种；较佳地，所述脂磷壁酸包括金黄色葡萄球菌脂磷壁酸。
4.如权利要求3所述的静脉注射用药物组合物，其特征在于，所述乳酸菌包括乳杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、链球菌属和片球菌属中的至少一种；
较佳地，所述乳杆菌属包括德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helviticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acido phlus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fementi)中至少一种，更佳地包括植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)和/或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acido phlus)，进一步更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6240的植物乳杆菌植物亚种和/或保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6075的嗜酸乳杆菌；
较佳地，所述肠球菌属包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6049的屎肠球菌和/或保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20398的粪肠球菌；
较佳地，所述乳球菌属包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordnia)中至少一种，更佳地包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，进一步更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6246乳酸乳球菌乳酸亚种；
较佳地，所述双歧杆菌属包括两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)中至少一种，更佳地包括长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6196的长双歧杆菌；
较佳地，所述明串珠菌属包括肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、肠膜明串珠乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum)、乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)和酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)中至少一种，更佳地包括肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 21860的肠膜明串珠菌；
较佳地，所述链球菌属包括乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、丁二酮乳酸链球菌(Streptococcus diacetilactis)、乳酪链球菌(Streptococcus creamoris)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中的至少一种，更佳地包括嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，进一步更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20174嗜热链球菌；
较佳地，所述片球菌属包括乳酸片球菌(Pediococcus acidi1actic)、戊糖片球菌(Pediococcus pentasiaceus)和小片球菌(Pediococcus parvulus)中至少一种，更佳地包括乳酸片球菌(Pediococcus acidi1actic)，进一步更佳地包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10346的乳酸片球菌。
5.如权利要求1～4中任意一项所述的静脉注射用药物组合物，其特征在于，所述静脉注射用药物组合物满足下述条件中的任意一种：
当所述抗原为猪伪狂犬病的抗原时，所述免疫增强剂包括灭活的屎肠球菌、灭活的植物乳杆菌植物亚种、灭活的乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活的嗜酸乳杆菌、灭活的长双歧杆菌、灭活的乳酸片球菌、灭活的肠膜明串珠菌、灭活的嗜热链球菌、灭活的粪肠球菌、灭活的肠炎沙门氏菌、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖、胸腺肽和香菇多糖中至少一种；
当所述抗原为流行性感冒的抗原时，所述免疫增强剂包括灭活的屎肠球菌、灭活的植物乳杆菌植物亚种、灭活的乳酸乳球菌乳酸亚种、灭活的嗜酸乳杆菌、灭活的长双歧杆菌、灭活的乳酸片球菌、灭活的肠膜明串珠菌、灭活的嗜热链球菌、灭活的粪肠球菌、灭活的肠炎沙门氏菌、聚肌胞、卡介菌多糖核酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖、胸腺肽和香菇多糖中至少一种；
所述抗原为猪伪狂犬病的灭活全抗原和/或猪伪狂犬病的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为所述灭活的乳酸菌和/或所述灭活的有害菌，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，且所述静脉注射液中所述猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为105.33TCID50/0.1mL以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的数量为106～1012个；较佳地，所述猪伪狂犬病毒的TCID50是基于PK-15细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的；
所述抗原为猪伪狂犬病的灭活全抗原和/或猪伪狂犬病的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中至少一种，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，且所述静脉注射液中所述猪伪狂犬病的抗原灭活前的猪伪狂犬病毒的含量为105.33TCID50/0.1mL以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的含量为0.02～2mg；较佳地，所述猪伪狂犬病毒的TCID50是基于PK-15细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的；
所述抗原为流行性感冒的灭活全抗原和/或流行性感冒的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为所述灭活的乳酸菌和/或所述灭活的有害菌，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，所述静脉注射液中所述流行性感冒的抗原灭活前的流感病毒的血凝效价为1:29以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的数量为106～1012个；较佳地，采用血凝实验测定所述流行性感冒的病毒的效价；
所述抗原为流行性感冒的灭活全抗原和/或流行性感冒的减毒活全抗原，所述免疫增强剂为植物多糖类免疫增强剂、细胞因子类免疫增强剂、化学类免疫增强剂和菌体成分类免疫增强剂中至少一种，当所述静脉注射用药物组合物配置成静脉注射液，所述静脉注射液中所述流行性感冒的抗原灭活前的流感病毒的血凝效价为1:29以上时，每毫升所述静脉注射液中所述免疫增强剂的含量为0.02～2mg；较佳地，采用血凝实验测定所述流行性感冒的病毒的效价。
6.一种防治传染病的静脉注射液，其特征在于，其由如权利要求1～5中任意一项所述的静脉注射用药物组合物和药学上可接受的注射用溶剂组成；
较佳地，所述药学上可接受的注射用溶剂包括缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液和乳酸林格氏液中的至少一种，更佳地为氯化钠水溶液。
7.一种如权利要求6所述的静脉注射液的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将如权利要求1～5中任意一项所述的静脉注射用药物组合物与所述的药学上可接受的注射用溶剂混合均匀，即可；
较佳地，所述静脉注射液的制备方法包括如下步骤：将所述抗原与所述的药学上可接受的注射用溶剂混合，制得含所述抗原的溶液；将所述免疫增强剂与所述药学上可接受的注射用溶剂混合，制得含所述免疫增强剂的溶液，再将含所述抗原的溶液和含所述免疫增强剂的溶液混合均匀，即可。
8.一种防治传染病的静脉注射用粉针剂，其特征在于，其为如权利要求1～5中任意一项所述的静脉注射用药物组合物的冻干粉。
9.一种如权利要求8所述的静脉注射用粉针剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将如权利要求1～5中任意一项所述的静脉注射用药物组合物冻干，即可。
10.一种如权利要求1～5中任意一项所述静脉注射用药物组合物、如权利要求6所述的静脉注射液或如权利要求8所述的静脉注射用粉针剂在制备用于防治传染病的静脉注射用药物中的应用。
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