CN101130074B - 一种治疗和/或预防乙肝的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗和/或预防乙肝的药物。该治疗和/或预防乙肝的药物，包括西咪替丁和乙肝疫苗。本发明的治疗和/或预防乙肝的药物，主要是通过激活与提高机体的细胞免疫反应，尤其是高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，同时分泌γ-干扰素等有效免疫组分而达到的。本发明的治疗和/或预防乙肝的药物，不仅使用方便，成本低，安全，而且易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗和/或预防乙肝的药物。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的，是一个严重的公共卫生问题，对人类健康的威胁很大。感染乙型肝炎后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬变或原发性肝细胞癌。我国是乙型肝炎病毒感染高流行区，人群感染率为60％，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群携带率为10％。目前，据估计，全世界共有3亿HBsAg携带者，而我国就占其中的三分之一，乙型肝炎传播已成为影响人口素质的重要问题。
作为疫苗可预防的疾病，乙肝疫苗的接种是控制乙型肝炎最有效的措施。乙肝疫苗依据组成成分可分为合成肽疫苗、基因(核酸)疫苗和重组亚单位疫苗。合成肽疫苗是仿特异性抗原的某些肽链或蛋白人工合成的抗原形成的疫苗。基因(核酸)疫苗是相对于基因(核酸)免疫来说的。它是将含有编码特定抗原蛋白质的基因序列克隆到合适的质粒载体上，制备成核酸表达载体，通过肌肉注射等方法将其导入机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应。这一基因免疫过程中所使用的核酸表达载体被称为基因疫苗，又称核酸疫苗。第三类乙肝疫苗是重组亚单位疫苗，即将病毒抗原基因在大肠杆菌或酵母系统中进行表达出蛋白质，提取纯化后与铝佐剂配伍而成。进入80年代，乙型肝炎重组亚单位疫苗的发展非常迅速，自1981年起，默克公司成功研制出乙型肝炎基因S蛋白在酵母中表达后与铝佐剂配伍的重组亚单位疫苗并商品化后，对全球乙型肝炎的预防和控制起重要作用。
目前用于乙肝疫苗商品化的佐剂仅有铝佐剂，通常为氢氧化铝或磷酸铝。铝佐剂的优点有：吸附并储存抗原延长抗原作用时间，能增强APC细胞对抗原的递呈能力，其最主要的优点是能增强体液免疫反应。其最大的缺点是不能增强细胞免疫反应，尤其是不能增强细胞毒淋巴细胞杀伤反应。
由于我国乙肝病毒人群携带率为10％，不仅造成乙型肝炎病毒传播的巨大威胁，同时对于这些携带者而言，其健康一直受到极大的威胁和危害。所以治疗乙肝病毒携带者已成为世界一大难题。现在临床上基于干扰素，或干扰素加抗病毒药物的治疗方案只有30％的有效率，并在停药后病毒反弹，所以总体治疗效果不尽理想。
有效的治疗手段应是基于激发病毒携带者体内的免疫系统。国际上公认的评价治疗性乙肝疫苗的指标是抗原专一性的细胞免疫反应，尤其是要激发高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，并分泌高水平的γ一干扰素等有效免疫组分。
国际上虽然有报道利用乙肝病毒S或C抗原为免疫原与不同免疫增强剂配合，以提高激活机体的细胞免疫水平，但临床效果仍然在评价中。
现有上市的乙肝疫苗是基于乙肝病毒S抗原与铝佐剂配伍的形式，其缺点限制了其疫苗用于乙肝治疗发案的发展。
西咪替丁(西咪替丁Cimetidine，CIM)是一种组胺H2受体拮抗剂，能显著抑制胃酸分泌。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的治疗和/或预防乙肝的药物。
本发明所提供的治疗和/或预防乙肝的药物，包括西咪替丁和乙肝疫苗。
所述乙肝疫苗包括乙肝病毒重组亚单位疫苗和乙肝病毒核酸疫苗。
所述乙肝病毒重组亚单位疫苗具体可为乙肝病毒S抗原、乙肝病毒前S1(preS1)抗原或乙肝病毒前S2(preS2)抗原；
所述乙肝病毒核酸疫苗具体可为为乙肝病毒S抗原核酸疫苗、乙肝病毒preS1抗原核酸疫苗或乙肝病毒preS2抗原核酸疫苗；
所述乙肝病毒S抗原核酸疫苗为在真核细胞表达载体的多克隆位点插入乙肝病毒表面抗原S编码基因得到的重组表达载体；
所述乙肝病毒前S1抗原核酸疫苗为在真核细胞表达载体的多克隆位点插入乙肝病毒前S1抗原编码基因得到的重组表达载体；
所述乙肝病毒前S2抗原核酸疫苗为在真核细胞表达载体的多克隆位点插入乙肝病毒前S2抗原编码基因得到的重组表达载体。
所述真核细胞表达载体具体可为pcDNA3.0。
所述盐酸西咪替丁和乙肝疫苗可混合在一起。其中，所述西咪替丁和所述乙肝病毒重组亚单位疫苗的质量比可为50,0-2,000∶1，优选为1000∶1；所述西咪替丁和所述乙肝病毒核酸疫苗的质量比可为2.5-10∶1，优选为5∶1。
所述西咪替丁和乙肝疫苗还可分别独立包装。使用时，所述西咪替丁和乙肝疫苗先混合后再一同注入机体。
西咪替丁是不溶于水的，而盐酸西咪替丁可以溶于水。所以，当它用于水溶性时，如与DNA质粒混合，要使用盐酸西咪替丁，当与脂溶性物质，如油溶性物质时要使用西咪替丁。
上述西咪替丁可自己制备或从生产厂家购买，如东港市宏达制药有限公司等，溶于盐酸后为盐酸西咪替丁。
所述治疗和/或预防乙肝的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
所述治疗和/或预防乙肝的药物的用量一般为0.06-0.6μg/kg体重/次，每7-30天给药一次，一般共需2-6次。
IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测实验和流式细胞仪检测CD8细胞内IFN-γ表达实验均表明西咪替丁能够使乙肝疫苗诱导机体产生混合的Th免疫反应，在核酸疫苗方面，更偏向Th1，在重组亚单位疫苗方面，产生混合的Th免疫反应；T淋巴细胞扩增实验表明西咪替丁能够使乙肝疫苗对机体产生明显的特异性淋巴细胞扩增反应；流式细胞仪检测体内CTL实验表明盐酸西咪替丁及其衍生物能够增强乙肝疫苗对体内的CTL反应；在核酸疫苗方面，流式细胞仪检测共刺激分子表达实验表明盐酸西咪替丁能够增强APC细胞对抗原的递呈。
本发明将西咪替丁作为乙肝疫苗的佐剂，制备得到治疗和/或预防乙肝的药物。本发明的治疗和/或预防乙肝的药物，主要是通过激活与提高机体的细胞免疫反应，尤其是高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，同时分泌γ-干扰素等有效免疫组分而达到的。本发明的治疗和/或预防乙肝的药物，不仅使用方便，成本低，安全，而且易于推广。
附图说明
图1为实施例1的定量ELLISA检测IgG含量结果
图2为实施例1的定量ELLISA检测IgG1和IgG2a含量结果
图3为实施例1的淋巴细胞扩增反应结果
图4A为实施例1的流式细胞仪检测IL-4在CD4 T细胞中的表达结果
图4B为实施例1的流式细胞仪检测IFN-γ在CD4 T细胞中的表达结果
图5A为实施例1的流式细胞仪检测IFN-γ在CD8 T细胞中表达结果
图5B为实施例1的体内CTL反应结果
图5C为实施例1的流式细胞仪检测体外CTL反应结果
图6为实施例2的定量ELLISA检测IgG含量结果
图7为实施例2的定量ELLISA检测IgG1和IgG2a含量结果
图8为实施例2的淋巴细胞扩增反应结果
图9A为实施例2的流式细胞仪检测IL-4在CD4 T细胞中的表达结果
图9B为实施例2的流式细胞仪检测IFN-γ在CD4 T细胞中的表达结果
图10A为实施例2的流式细胞仪检测IFN-γ在CD8 T细胞中表达结果
图10B为实施例2的体内CTL反应结果
图11为实施例2的流式细胞仪检测CD11c+CD80+，CD11c+CD86+和CD11c+MHCII+在脾脏细
图12为pcD-S2质粒的物理图谱
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、西咪替丁增强乙肝核酸疫苗作用的动物实验
西咪替丁原料药为东港市宏达制药有限公司制品，批号为060513。盐酸西咪替丁的配置方法为将1g西咪替丁原料药溶于0.15M的盐酸中，后调pH值到7.0，最后用生理盐水定容至100ml，得到1g/100ml的CIM溶液。后将1g/100ml CIM溶液用生理盐水稀释为0.5g/100ml和0.25g/100ml的CIM溶液。
rHBsAg纯抗原购自华北制药集团，经CHO细胞表达，并用HPLC系统纯化得到rHBsAg纯抗原(纯度≥99％)。
1、乙肝核酸疫苗pcDNA3-S2的构建
乙肝preS2 cDNA克隆是根据GenBank HBV(AY582136)中preS2序列，利用特异性引物P1：5’-ATGCAGTGGAACTCCACAACATTCC-3’；P2：5’-TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAG-3′。以乙肝病人血清中病毒为模板，反转录为cDNA后，再经PCR扩增preS2，PCR产物回收后，通过T-A配对连接入克隆载体pMD18-T，得到重组质粒pMD18-T/S2。大连宝生物工程公司序列分析结果表明扩增的preS2的核苷酸序列(序列表中的序列1)与AY582136的基因序列一致。限制性内切酶BamH I和EcoRI对重组质粒pMD18-T/S2进行酶切，胶回收preS2基因片段；同时将真核表达载体pcDNA3.0同样用BamH I和EcoRI双酶切。用T4DNA连接酶连接酶切后的pcDNA3.0载体(购自Invitrogen公司)与回收的preS2基因片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单菌落进行扩增培养、提取质粒，利用BamHI和EcoRI双酶切筛选阳性克隆，得到重组质粒pcD-S2(图12)。
pcD-S2质粒通过碱裂解方法粗提并通过PEG8000进行纯化，纯化后的质粒溶于0.9％生理盐水并进行定量，并经真核细胞转染实验证明其表达。
6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分6组，每组6只，实验分组见表1。第1组为免疫抗原组(pcD-S2)，免疫时，用溶于0.9％生理盐水的pcD-S2进行注射，每只每次免疫剂量为100ug pcD-S2，每次每只免疫体积为100ul(100ug)；第2组为抗原加0.25g/100ml CIM组(0.25％CIM+pcD-S2)，免疫前，将0.25g/100ml CIM溶液与浓度为1ug/ul的pcD-S2溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使pcD-S2的免疫剂量为100μg/只/次、CIM的免疫剂量为12.5ug/只/次；第3组为抗原加0.5g/100ml CIM组(0.5％CIM+pcD-S2)，免疫前，将0.5g/100ml CIM溶液与浓度为1ug/ul的pcD-S2溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使pcD-S2的免疫剂量为100μg/只/次、CIM的免疫剂量为25ug/只/次；第4组为抗原加1.0g/100ml CIM组(1％CIM+pcD-S2)，免疫前，将1.0g/100ml CIM溶液与浓度为1ug/ul的pcD-S2溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使pcD-S2的免疫剂量为100μg/只/次、CIM的免疫剂量为50ug/只/次；第5组为pcDNA3组(pcDNA3)，免疫前，将pcDNA3.0溶于0.9％生理盐水中，每次每只免疫体积为100ul，使pcDNA3的免疫剂量为100μg/只/次；第6组为0.5g/100ml CIM组(0.5％CIM)，每次每只免疫0.5g/100ml CIM溶液100ul，使CIM的免疫剂量为25ug/只/次。
每组每只小鼠第0天首次肌肉注射，第一次注射后间隔14天进行再次注射，共注射三次。
表1：注射分组
| 分组 | 抗原(100ug/100ul/只/次) | 佐剂(100ul/只/次) | pcD-S2与CIM的质量比 |
| 1 | pcD-S2 | ||
| 2 | pcD-S2 | 0.25g/100ml CIM | 1∶2.5 |
| 3 | pcD-S2 | 0.5g/100ml CIM | 1∶5 |
| 4 | pcD-S2 | 1.0g/100ml CIM | 1∶10 |
| 5 | pcDNA3 | ||
| 6 | 0.5g/100ml CIM |
1、IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测
第三次肌肉注射后7天采血分离血清，定量ELISA法分别检测IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。依据乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒(北京金豪制药有限公司，批号S20053020)使用说明定量检测IgG，将抗乙肝的参比抗体8IU/ml(IU，国际单位)(北京金豪制药有限公司，批号20060701)按2倍稀释5个梯度，后根据说明最后显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。对于定量ELISA法分别检测IgG1和IgG2a抗体水平，以2ug/ml rHBsAg抗原包被96孔酶标板中的48孔，在同一块96孔酶标板上用2ug/ml兔IgG(Sigma)包被另外48孔，4℃过夜，3％牛血清白蛋白37℃封闭2h；PBST(将Tween 20溶于PBS，使Tween 20的终浓度为0.05％得到的溶液)洗涤4次；将小鼠血清按1∶100倍稀释，将小鼠抗兔IgG(Sigma)从100ng/ml按2倍稀释10个梯度，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG1和IgG2a抗体(Sigma)(均按1∶4000稀释)，37℃孵育1h。每孔加入底物TMB，37℃避光显色5-15min，加入终止液2mol/L H2SO4，每孔50μl，终止显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。结果如图1所示，表明免疫抗原组(pcD-S2)产生低水平的IgG和IgG2a；抗原加CIM(pcD-S2+CIM)能产生较高水平的IgG和IgG2a，且与仅免疫抗原组(pcD-S2)相比，IgG2a的水平有了显著的提高(P＜0.05)；乙肝核酸疫苗加CIM能显著的增强IgG和IgG1水平(P＜0.01)，而IgG2a也有相应的明显变化。上述结果表明，CIM能够使乙肝疫苗诱导机体免疫向Th1型的免疫反应(图1和图2)。图1和图2中的数值为6只小鼠的平均值±标准差；**表示P＜0.01；mIU是毫国际单位。
2、T淋巴细胞扩增
第三次肌肉注射后7天处死小鼠，在无菌条件下，取小鼠脾脏，研碎，用红细胞裂解液除去红细胞，并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液，PBS液洗3次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加rHBsAg抗原至终浓度为5μg/ml，一份加ConA至终浓度为5μg/ml作为阳性对照，一份加BSA至终浓度为2μg/ml作为阴性对照，另一份不加刺激物，培养48 h后，每孔加入20μl的MTT，培养4 h后，2,000转离心5分钟，弃细胞上清，添加100μL DMSO，37度温箱放置15分钟后，酶标仪读取490nm处的OD值，计算刺激指数(stimulated index，SI)，SI=(实验组0D-培养基0D)/(细胞OD-培养基OD)。其中，实验组OD是指抗原刺激的细胞读取的OD值，细胞OD是指未经抗原刺激的细胞读取的OD值。结果如图2所示，表明免疫抗原组(pcD-S2)仅能产生低水平的淋巴细胞扩增，而抗原加CIM(CIM+pcD-S2)能产生较高水平的淋巴细胞扩增(P＜0.05)。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗对机体产生明显的特异性淋巴细胞扩增反应(图3)。图3中，ConA和BSA各是6只小鼠的平均值±标准差，其它为6只小鼠的平均值±标准差；*表示P<0.05。
3、流式细胞仪检测CD4细胞内IL-4和IFN-γ表达
小鼠在第三次肌肉注射后7天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按10 μg/mlrHBsAg，刺激12～14 hr后，2μL 100 μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体(eBioscience公司，美国)4℃封闭15 min，PBS洗3次，抗CD4-FITC抗体(eBiOSCience公司)4℃染色30 min，PBS洗3次，4％多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10 min，PBS洗3次，抗IL-4-PE或IFN-γ-FITC抗体(eBioscience公司)染色15 min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。IFN-γ表达结果如图4B所示，表明抗原组(pcD-S2)有低水平IFN-γ表达，而抗原加CIM(pcD-S2+CIM)有明显的IFN-γ的表达。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝疫苗产生IFN-γ。另外，IL-4表达结果如图4A所示，表明抗原组(pcD-S2)有低水平IL-4表达，而抗原加CIM(pcD-S2+CIM)有明显的IL-4的表达。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝疫苗产生IL-4。综合上述两个结果表明，盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗产生偏向Th1方向的免疫反应。图4A和图4B为表达IL-4或IFN-γ的CD4+细胞数；Na
ve表示6只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图4A和图4B中的数值为6只小鼠的平均值±标准差；*表示P＜0.05；料表示P＜0.01。
4、流式细胞仪检测CD8细胞内IFN-γ表达
CTL反应与免疫系统的IFN-γ表达密切相关，是反映CTL反应的一种重要的细胞因子。
小鼠在第三次肌肉注射后7天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按1×106个细胞加入10-6mol的乙肝S抗原短肽(aa208～215)(上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，刺激12～14 hr后，2μL100μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体(eBiOSCience公司，美国)4℃封闭15 min，PBS洗3次，抗CD8-PE抗体(eBioscience公司，美国)4℃染色30 min，PBS洗3次，4％多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10 min，PBS洗3次，抗IFN-γ-FITC抗体(eBioscience公司，美国)染色15 min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。结果如图5A所示，表明抗原组(pcD-S2)有低水平IFN-γ表达，而抗原加CIM(pcD-S2+CIM)能有较高的IFN-γ。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝核酸疫苗产生IFN-γ，与盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗疫诱导机体向Th1型方向发展一致(图5A)。图5A中纵坐标为表达IFN-γ的CD8+细胞数；Na
ve表示6只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图5A中的数值为6只小鼠的平均值±标准差；**表示P＜0.01。
5、流式细胞仪检测体外CTL
正常未免疫的5-7周龄C57BL/6小鼠被处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，后将分离得到的T淋巴细胞二等份。其中一分孵育10-6M乙肝S抗原短肽(aa208～215)(上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，另一分孵育相等量的无关的肽OVA(aa323～339)(上海吉尔生化有限公司，货号为P01662)，每皿的体积为1-2mL，37℃，5％CO2培养4小时(此步可以根据实验组的多少适当增加靶细胞数目)。4小时后将细胞转入15mL的细胞管中，2000rmp离心5分钟，将孵育OVA(aa 257-264)的靶细胞用低浓度的CFSE(0.5uM)染色，孵育乙肝S抗原短肽靶细胞用高浓度的CFSE(5uM)染色，37℃避光轻摇染色15分钟。染色后用等体积的胎牛血清终止反应，2000rmp离心5分钟，弃上清，用10mL的PBS洗3次。将低浓度和高浓度染色的靶细胞等体积的混合，按每只小鼠2×107个细胞由尾静脉注射上述各免疫组小鼠及正常小鼠体内，进行体内细胞毒反应。注射后4小时，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，铜网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。杀伤率(％)＝[1-(特异性杀伤的百分数/非特异性杀伤的百分数)]×100。结果如图5B和5C所示，表明免疫抗原组(pcD-S2)能产生低水平的CTL反应，而抗原加CIM(pcD-S2+CIM)能产生较高水平的CTL反应，这与盐酸西咪替丁能够激发乙肝核酸疫苗产生更多的CD8+IFN-γ一致。结果表明盐酸西咪替丁能够增强乙肝疫苗对体内的CTL反应。图5B，流式细胞仪检测的荧光强度，Na
ve表示正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图5C表示杀伤的百分比，Na
ve表示6只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照，数值为6只小鼠的平均值。
实施例2、西咪替丁增强乙肝亚单位疫苗细胞免疫的动物实验
各浓度的盐酸西咪替丁和rHBsAg同实施例1。
商品用氢氧化铝重组乙肝疫苗(以下简称rHBsAg+Alum)购自华北制药集团，批号为20010036。
6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分6组，每组5只，实验分组见表2。每只小鼠第0天首次肌肉注射，第14天再次肌肉注射一次。分为如表2所示的9组：第1组免疫抗原组(rHBsAg)，免疫时，用溶于0.9％生理盐水的rHBsAg进行注射，每只每次免疫剂量为0.5ug rHBsAg，每次每只免疫药物体积为200ul；第2组抗原加0.25g/100ml CIM组(rHBsAg+0.25％CIM)，免疫前，将0.25g/100ml CIM溶液与0.5ug/100ul的rHBsAg溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使rHBsAg的免疫剂量为0.5μg/只/次、CIM的免疫剂量为12.5μg/只/次；第3组抗原加0.5g/100ml CIM组(rHBsAg+0.5％CIM)，免疫前，将0.5g/100ml CIM溶液与0.5ug/100ul的rHBsAg溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使rHBsAg的免疫剂量为0.5μg/只/次、CIM的免疫剂量为25ug/只/次；第4组抗原加1.0g/100ml CIM组(rHBsAg+1.0％CIM)，免疫前，将1.0g/100ml CIM溶液与0.5ug/100ul的rHBsAg溶液(溶剂为0.9％生理盐水)以1∶1的体积比混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使rHBsAg的免疫剂量为0.5μg/只/次、CIM的免疫剂量为50ug/只/次；第5组抗原加铝佐剂组(rHBsAg+Alum)，免疫前，将商品用氢氧化铝重组乙肝疫苗50ul和150ul的0.9％Nacl混合，每次每只免疫药物体积为200ul，使rHBsAg的免疫剂量为0.5μg/只/次；第6组为1.0g/100mlCIM组(1％CIM)，免疫前，将1.0gCIM溶于0.15M的盐酸中，后将pH值调至中性，终体积为100ml，每次每只免疫体积为100ul，使CIM的免疫剂量为50ug/只/次。
表2：注射分组(200ul)
| 分组 | 抗原(0.5ug/100ul) | 佐剂(100ul) | rHBsAg与CIM的质量比 |
| 1 | rHBsAg | ||
| 2 | rHBsAg | 0.25g/100ml CIM | 1∶500 |
| 3 | rHBsAg | 0.5g/100ml CIM | 1∶1000 |
| 4 | rHBsAg | 1.0g/100ml CIM | 1∶2000 |
| 5 | rHBsAg+Alum | 0.9％NaCl | |
| 6 | 1.0g/100ml CIM |
1、IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测
首次肌肉注射后21天采血分离血清，定量ELISA法分别检测IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。依据乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒(北京金豪制药有限公司，批号S20053020)使用说明定量检测IgG，将抗乙肝的参比抗体8IU/ml(IU，国际单位)(北京金豪制药有限公司，批号20060701)按2倍稀释5个梯度，后根据说明最后显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。对于定量ELISA法分别检测IgG1和IgG2a抗体水平，以2ug/ml rHBsAg抗原包被96孔酶标板中的48孔，在同一块96孔酶标板上用2ug/ml兔IgG(Sigma)包被另外48孔，4℃过夜，3％牛血清白蛋白37℃封闭2h；PBST(0.05％Tween 20溶于PBS)洗涤4次；将小鼠血清按1∶100倍稀释，将小鼠抗兔IgG(Sigma公司，美国)从100ng/ml按2倍稀释10个梯度，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG、IgG1和IgG2a抗体(Sigma)(均按1∶4000稀释)，37℃孵育1h。每孔加入底物TMB，37℃避光显色5-15min，加入终止液2mol/L H2SO4，每孔50μl，终止显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。结果如图6和图7所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)产生低水平的IgG和IgG2a；抗原加CIM(rHBsAg+CIM)能产生较高水平的IgG和IgG2a，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，IgG2a的水平有了显著的提高(P＜0.05)；乙肝疫苗加CIM能显著的增强IgG和IgG2a水平(P＜0.01)，而IgG1也有相应的明显变化。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗诱导机体免疫产生Th混合型的免疫反应。图6和图7中的数值为5只小鼠的平均值±标准差；mIU是毫国际单位。
2、T淋巴细胞扩增
首次肌肉注射后21天处死小鼠，在无菌条件下，取小鼠脾脏，研碎，用红细胞裂解液除去红细胞，并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液，PBS液洗3次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加rHBsAg抗原至终浓度为5μg/ml，一份加ConA至终浓度为5μg/ml作为阳性对照，一份加BSA至终浓度为2μg/ml作为阴性对照，另一份不加刺激物，培养48 h后，每孔加入20μl的MTT，培养4h后，2,000转离心5分钟，弃配像细胞上清，添加100μLDMSO，37度温箱放置15分钟后，酶标仪读取492nm处的OD值，计算刺激指数(stimulated index，SI)，SI＝(实验组OD-培养基OD)/(细胞OD-培养基OD)。
其中，实验组OD是指抗原刺激的细胞读取的OD值，细胞OD是指未经抗原刺激的细胞读取的OD值。结果如图8所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)仅能产生低水平的淋巴细胞扩增，而抗原加CIM(rHBsAgq+CIM)能产生较高水平的淋巴细胞扩增(P＜0.05)，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的淋巴细胞扩增(P＜0.05)；并且乙肝疫苗加盐酸西咪替丁同时能明显的增强乙肝疫苗的淋巴细胞扩增，(P＜0.05)。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗对机体产生明显的特异性淋巴细胞扩增反应。图8中，ConA和BSA各是5只小鼠的平均值±标准差，其它为5只小鼠的平均值±标准差。
3、流式细胞仪检测CD4细胞内IL-4和IFN-γ表达
小鼠在首次肌肉注射后21天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按10μg/mlrHBsAg，刺激12～14 hr后，2μL100μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体(eBiOSCience)4℃封闭15 min，PBS洗3次，抗CD4-FITC抗体(eBioscience)4℃染色30 min，PBS洗3次，4％多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10 min，PBS洗3次，抗IL-4-PE或IFN-γ-FITC抗体(eBiOSCience)染色15 min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。IFN-γ表达结果如图9B所示，表明抗原组(rHBsAg)有低水平IFN-γ表达，而抗原加CIM(rHBsAg+CIM)有明显的IFN-γ的表达；且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的IFN-γ的表达；并且乙肝疫苗加盐酸西咪替丁同时能明显的增强乙肝疫苗的IFN-γ表达。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝疫苗产生IFN-γ。另外，IL-4表达结果如图9A所示，表明抗原组(rHBsAg)有低水平IL-4表达，而抗原加CIM(rHBsAg+CIM)有明显的IL-4的表达；且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，两者都能表达更多的IL-4。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝疫苗产生IL-4。综合上述两个结果表明，盐酸西咪替丁能够使乙肝疫苗产生混合的Th免疫反应。图9A和图9B为表达IL-4或IFN-γ的CD4+细胞数；Na
ve表示5只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图9A和图9B中的数值为5只小鼠的平均值±标准差。
4、流式细胞仪检测CD8细胞内IFN-γ表达
CTL反应与免疫系统的IFN-γ表达密切相关，是反映CTL反应的一种重要的细胞因子。
小鼠在首次肌肉注射后2l天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按1×106个细胞加入10-6mol的乙肝S抗原短肽(aa208～215)，刺激12～14 hr后，2μL100μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体4℃封闭15 min，PBS洗3次，抗CD8-PE抗体4℃染色30 min，PBS洗3次，4％多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10 min，PBS洗3次，抗IFN-γ-FITC抗体染色15 min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。结果如图10A所示，表明抗原组(rHBsAg)有低水平IFN-γ表达，而抗原加CIM(rHBsAg+CIM)能有较高的IFN-γ；且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的IFN-γ的表达；并且乙肝疫苗加LMS同时能明显的增强乙肝疫苗的IFN-γ表达。上述结果表明，盐酸西咪替丁能够很好的诱导乙肝疫苗产生IFN-γ(图10A)。图10A中纵坐标为表达IFN-γ的CD8+细胞数；Na
ve表示5只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图10A中的数值为5只小鼠的平均值±标准差。
5、流式细胞仪检测体外CTL
正常未免疫的5-7周龄C57BL/6小鼠被处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，后将分离得到的T淋巴细胞二等份。其中一分孵育10-6M乙肝S抗原短肽(aa208～215)(上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，另一分孵育相等量的无关的肽OVA，每皿的体积为l-2mL，37℃，5％C02培养4小时。4小时后将细胞转入15mL的细胞管中，2000rmp离心5分钟，将9呼育OVA(aa 323～339)(上海吉尔生化有限公司，货号为P01662)的靶细胞用低浓度的CFSE(0.5uM)染色，孵育乙肝S抗原短肽靶细胞用高浓度的CFSE(5uM)染色，37℃避光轻摇染色15分钟。染色后用等体积的胎牛血清终止反应，2000rmp离心5分钟，弃上清，用10mL的PBS洗3次。将低浓度和高浓度染色的靶细胞等体积的混合，按每只小鼠2×107个细胞由尾静脉注射上述各免疫组小鼠及正常小鼠体内，进行体内细胞毒反应。注射后4小时，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，铜网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。杀伤率＝[1-(特异性杀伤的百分数/非特异性杀伤的百分数)]×100。结果如图10B所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)能产生低水平的CTL反应，而抗原加CIM(rHBsAg+CIM)能产生较高水平的CTL反应，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗CTL反应；并且乙肝疫苗加盐酸西咪替丁同时能显著的增强乙肝疫苗的CTL反应；结果表明盐酸西咪替丁能够增强乙肝疫苗对体内的CTL反应。图10B中纵坐标为杀伤的百分比；Na
ve表示5只正常未免疫的C57BL/6小鼠对照。图10B中的数值为5只小鼠的平均值±标准差。
6、流式细胞仪检测共刺激分子表达
小鼠在首次免疫后3天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，用抗CD11c-FITC抗体、抗CD80-PE抗体、抗CD86-PE抗体、抗MHCII-PE抗体(eBiOSCiences，San Diego，USA))，4℃染色30 min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。结果如图11所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)能表达低水平的CD11c+CD80+，CD11c+CD86+、CD11c+MHCII+，而抗原加CIM(rHBsAg+CIM)有较高水平的CD11c+CD80+，CD11c+CD86+、CD11c+MHCII+表达；与免疫抗原组(rHBsAg)相比，明显的提高乙肝疫苗共刺激分子的表达；并且乙肝疫苗加盐酸西咪替丁同时能显著的增强乙肝疫苗的共刺激分子的表达；上述结果表明盐酸西咪替丁能够增强APC细胞对抗原的递呈(图11)。图11中，Nave表示正常未免疫的C57BL/6小鼠对照；图11中的数值为一次代表性的结果；图11中的百分数为共刺激分子与CD11c+在脾脏细胞中所占百分数；FL1-H表示FL1探测器所检测的绿色荧光，FL2表示FL2探测器所检测的红色荧光。
序列表
<160>1
<210>1
<211>846
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400>1
atgcagtgga actccacaac attccaccaa actctgctag accccagagt gaggggccta 60
tactttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca 120
cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gagcacagca 180
tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240
ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca 300
cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt 360
cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc 420
atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc 480
gtttgtcctc tacttccagg aacatcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg 540
attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga 600
aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg 660
gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 720
ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780
tacaacatct tgagtccctt tttacctcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840
atttga 846
Claims (4)
1.一种治疗和/或预防乙肝的药物，包括西咪替丁和乙肝疫苗；
所述乙肝疫苗包括乙肝病毒重组亚单位疫苗和乙肝病毒核酸疫苗；
所述乙肝病毒重组亚单位疫苗为rHBsAg；
所述乙肝病毒核酸疫苗为pcD-S2；
所述pcD-S2的构建方法如下：
根据GenBank HBV AY582136中preS2序列，利用特异性引物P1：5’-ATGCAGTGGAACTCCACAACATTCC-3’和P2：5’-TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAG-3′，以乙肝病人血清中病毒为模板，反转录为cDNA后，再经PCR扩增preS2，PCR产物回收后，通过T-A配对连接入克隆载体pMD18-T，得到重组质粒pMD18-T/S2；
限制性内切酶BamH I和EcoR I对重组质粒pMD18-T/S2进行酶切，胶回收preS2基因片段；同时将真核表达载体pcDNA3.0同样用BamH I和EcoR I双酶切；用T4 DNA连接酶连接酶切后的pcDNA3.0载体与回收的preS2基因片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单菌落进行扩增培养、提取质粒，利用BamHI和EcoRI双酶切筛选阳性克隆，得到重组质粒pcD-S2；
所述西咪替丁和乙肝疫苗混合在一起；
所述乙肝疫苗为乙肝病毒重组亚单位疫苗，所述西咪替丁和所述乙肝病毒重组亚单位疫苗的质量比为500-2,000∶1；
所述乙肝疫苗为乙肝病毒核酸疫苗，所述西咪替丁和所述乙肝病毒核酸疫苗的质量比为2.5-10∶1。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述西咪替丁和所述乙肝病毒重组亚单位疫苗的质量比为1000∶1。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述西咪替丁和所述乙肝病毒核酸疫苗的质量比为5∶1。
4.根据权利要求1至3中任一所述的药物，其特征在于：所述西咪替丁为盐酸西咪替丁。
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