CN113876938A - 融合蛋白疫苗平台的构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及融合蛋白疫苗平台的构建与应用。本发明提供一种疫苗，其包含含有干扰素‑靶抗原‑免疫球蛋白Fc区(或抗体)和Th细胞辅助表位的融合蛋白。本发明还涉及含有干扰素‑靶抗原‑免疫球蛋白Fc(或抗体)区和Th细胞辅助表位的融合蛋白用于制备预防性或治疗性组合物的用途。本发明的疫苗可以通过真核细胞表达系统产生，通过皮下/肌肉或者鼻腔等免疫途径进行接种，能够引起机体强烈的免疫应答。本发明的疫苗可以作为预防性或治疗性疫苗来使用。

Description

融合蛋白疫苗平台的构建与应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物医学技术领域，具体涉及一种疫苗，例如包含含有干扰素-靶抗原-免疫球蛋白Fc区(抗体)为主要骨架的融合蛋白的疫苗。本发明的疫苗可以作为疫苗平台，用于预防乙肝病毒(HBV)感染、HPV、EBV、HIV、SARA-COV2、流感病毒感染和HPV、EBV相关肿瘤的发生以及治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染、治疗HBV、HP、EBV相关肿瘤的用途。
背景技术
全球约有2.57亿慢性病毒感染者，每年约有8.87万人死于HBV所引起的终末期肝病，包括肝功能衰竭、肝硬化、肝细胞肝癌(1-3)肝硬化病人中大约有30％由HBV所引起，大约40％的肝细胞肝癌(HCC)由HBV 所引起(4)。乙型肝炎病毒感染依旧是全球重大公共健康问题。但是目前仍旧没有有效治疗慢性乙型肝炎的策略，现有的HBV治疗方式主要包括抗病毒药物(核苷/核苷酸类似物)和干扰素，它们虽然有一定的治疗效果疗效，但是通常不能诱导有效的免疫应答，从而无法彻底清除HBV感染；而且长期用药导致的副作用较大，抗病毒药物也会产生耐药性。慢性HBV 感染是威胁人类身体健康的主要疾病之一，探索慢性乙型肝炎有效的免疫治疗策略迫在眉睫，研制慢性乙型肝炎的治疗性疫苗具有十分重要的社会意义和经济意义。
季节性流感每年会导致1-4百万人产生严重的疾病并且导致20-50万人死亡(5)。疫苗途径是预防和控制流感的最佳方式，疫苗能够减少疾病的发生并且能够降低感染的严重性，特别是在幼儿和老年人这种有流感并发症的风险群体。即使当前批准的流感疫苗能够在健康的年轻成人体内产生良好的保护效果，但是依旧存在一些需要解决的问题。比如有些疫苗的产生途径依赖于鸡胚，如灭火的流感疫苗和减毒的流感疫苗，这些疫苗的一个缺点是如果流行的毒株是禽类起源的，同时疾病的流行会导致疫苗和鸡胚的需求增加，这会导致鸡胚的供应出现问题(6)。另一个不利因素是这些疫苗的产生需要大量的时间。对于流感病毒来说老年人更容易产生严重的综合征，同时标准的疫苗对于老年人来说一般效果十分不理想，老年人对于免疫系统会随着年龄的增长而逐渐衰弱(7)。鉴于当前流感疫苗所遇见的问题，针对于流感病毒的流行当前迫切需要一种有较强免疫原性，不依赖于鸡胚，可以快速产生的流感疫苗。
2019年12月出现的急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)是2019 冠状病毒疾病(COVID-19)的病原体(8，9)。据报道约80％的COVID-19 病人有轻度到中度的呼吸综合征，然而有大约20％的感染者会出现严重的症状，比如严重的肺炎，严重的急性呼吸窘迫综合征，甚至引起死亡(10)。全球SARS-CoV2感染人数急剧增长，截止2020年6月2日超过620万人感染新型冠状病毒，其中死亡病例超过37万人，新型冠状病毒感染现在依为国际公共健康紧急事件。现在对于新型冠状病毒还没有特效药出现，疫苗是控制与终止新冠大流行的基本对策(11)。
当把抗原与免疫球蛋白Fc区相连接时，抗原的半衰期会得到明显的延长，并且免疫球蛋白Fc区可以与抗原提呈细胞表面的Fc受体相结合从而促进抗原提呈细胞对抗原的加工与提成(12-14)。I型干扰素作为一种抗病毒细胞因子有许多生物活性，其中一个就包含对免疫细胞的刺激作用 (15)。IFNα可以强有力的诱导人的DC细胞的分化与活化(16)。I型干扰素作用于未成熟的DCs后，能够促进DCs细胞表面的MHC分子和共刺激分子的表达，如：MHC class I、CD80和CD86，进而增强DCs活化T细胞的能力(17-19)。有报道指出，在牛痘病毒和淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒 (LCMV)感染后，I型干扰素能够促进DCs的抗原递呈能力(20-22)。此外， I型干扰素作用于DCs后能够通过上调趋化因子受体的表达，促进DCs 迁移到淋巴结，进而促进T细胞的激活(23，24)。最近越来越多的研究表明I型干扰素可作为免疫佐剂来使用。Le Bon等人的研究表明当以弱的免疫原免疫小鼠时，I型干扰素在小鼠体内展现出了强劲的免疫佐剂作用诱导产生了长效抗体和免疫记忆(25)，作者也发现I型干扰素发挥作用的主要细胞类群为DC细胞。同时利用抗体，将疫苗靶向递送给DC，刺激DC 活化和交叉递呈功能，将进一步增强疫苗的活性和效价。
本发明存在提供增强机体对病毒、细菌或肿瘤抗原的反应的疫苗平台的需要。
发明内容
疫苗是预防和控制重大突发传染病的有效方式，疫苗的形式有各种类型，其中重要的一类为蛋白亚单位疫苗。一般来说单纯的蛋白亚单位疫苗，其免疫原性一般较差，这往往限制了蛋白亚单位疫苗的使用。因此一种通用型蛋白亚单位疫苗平台是十分迫切需要的。依据免疫球蛋白Fc区域和I 型干扰素对免疫系统的影响，发明人特提出干扰素α-病毒抗原、细菌或肿瘤-免疫球蛋白Fc区融合蛋白疫苗平台来增强机体对病毒、细菌或肿瘤抗原的反应。本发明提供了一种I型干扰素-蛋白抗原-免疫球蛋白Fc疫苗平台，其中I型干扰素可以作用于抗原提呈细胞使其成熟与迁移从而更好的发挥抗原提呈与激活T细胞的作用，另一方面该疫苗平台的Fc部分可以与抗原提成细胞表面的Fc受体相结合从未增强抗原提成细胞对抗原的摄取从而进一步帮助抗原提呈细胞发挥作用。发明人提出融合Th细胞辅助表位，可以进一步提升I型干扰素-蛋白抗原-免疫球蛋白Fc疫苗的免疫应答效果，是该疫苗的重要组成成分。发明人提出可以利用anti-PD-L1等抗体替换Fc，将疫苗靶向递送给DC，刺激DC活化和交叉递呈功能，将进一步增强疫苗的活性和效价。本发明作为一种新型疫苗平台可以作为病毒感染、细菌感染或肿瘤等疾病的预防性和治疗性疫苗来使用。
在一些实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包含含有干扰素-靶抗原 -免疫球蛋白Fc区(或抗体)的融合蛋白(附加Th表位)。在一些实施方案中，本发明还提供含有干扰素-靶抗原-免疫球蛋白Fc区(或抗体)的融合蛋白(附加Th表位)用于制备预防性或治疗性组合物或试剂盒(例如药物或疫苗组合物或试剂盒)的用途。本发明的疫苗可以通过真核细胞表达系统产生，通过皮下/肌肉或者鼻腔等免疫途径进行接种。对于本发明的融合多肽，其中作为结构单元的抗体(简称Ab)没有特别限制，可以包括例如完整抗体或抗体的片段，例如抗体重链和轻链，或单链抗体，可以为DC靶向活化抗体，包括anti-PD-L1，anti-DEC205，anti-CD80/86等抗体。
本发明的目的是提供了一种疫苗平台，所述疫苗平台由干扰素(IFN) 与肿瘤、细菌或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原，HBsAg抗原或肽段，EBV EBNA1/LMP2/gp350，HIV gp120抗原)-免疫球蛋白Fc区域(或抗体) 组成(附加Th表位)。所述融合蛋白可以为同源或者异源二聚体蛋白。当所述融合蛋白为二聚体时，作为结构单元的干扰素、靶抗原、免疫球蛋白 Fc区(或抗体Ab)可以存在于第一多肽链和/或第二多肽链中，各结构单元的存在方式没有特别限制，例如可以同时存在于一条链中，也可以在一条链中存在任意一个或多个结构单元，而在另一条链中存在另外的一个或多个结构单元。
本发明所述干扰素可以选自I干扰素、II型干扰素和III型干扰素，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)、IFN-λ(IL-28b) 和IFN-ω；所述IFN可来自人源或鼠源；
优选I型干扰素IFN-α(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.1H、SEQ ID NO.1Hm)。
本发明所述免疫球蛋白Fc区可选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4/或IgM 的恒定区氨基酸序列，优选IgG1(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.2-hole、SEQ ID NO.2-knob)。
本发明的融合多肽还可以任选地包含一个或多个Th细胞辅助表位和/ 或连接片段(接头)。例如，当所述融合蛋白为二聚体时，任选地所述融合蛋白还可以在同源二聚体或者异源二聚体的任意一条或两条链(即第一多肽链和/或第二多肽链)中包含一个或多个Th细胞辅助表位和/或连接片段。如本领域技术人员已知的，在融合蛋白的各个结构单元之间可以通过适当的连接片段(接头)连接。可以在本发明的疫苗中使用的连接片段没有特别限制，可以是本领域已知的任何适当肽片段。本发明所述各个结构单元的连接片段可以为柔性多肽序列，可以为连接片段1和2，例如SEQ ID NO.4.1、SEQ ID NO.4.2氨基酸序列所示。
本发明所述各个结构单元组成的多肽序列N端均含有能够促进蛋白分泌的相应信号肽，例如SEQ ID NO.5氨基酸序列所示。
本发明所描述的优选抗原包括乙肝Pres1抗原，包含ad亚型(SEQ ID NO.6.1)ay亚型(SEQ ID NO.6.2)，HBV HBsAg抗原(各个亚型和肽段)，包含adr亚型(SEQ ID NO.7.1)，adw亚型(SEQ ID NO.7.2)，ayw亚型 (SEQ ID NO.7.3)，SARA-COV2 RBD抗原(SEQ IDNO.8)，流感病毒 HA抗原(SEQ ID NO.9)，HPV E7抗原(SEQ ID NO.10)。
本发明所描述的同源二聚体蛋白包含第一条多肽与第二条多肽，第一条多肽与第二条多肽完全相同。第一条多肽与第二条多肽从N段到C段顺序为IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原，HBsAg抗原，EBV EBNA1/LMP2/gp350， HIV gp120抗原)-免疫球蛋白Fc区域；或含有Pan表位的多肽。包含SEQ IDNO.11、12、13、14、11P、12P、13P、14P、11H、12H、13H、11HP、12HP、13HP、14HP、14H、11Hm、12Hm、13Hm、14Hm、11HmP、12HmP、 13HmP、14HmP所示氨基酸序列。
本发明所述异源二聚体包含第一条多肽和第二条对肽，所述第一条多肽与第二条多肽不为同一条多肽，所述第一条多肽从C段到N端分别为 IFN-免疫球蛋白Fc区域，包含SEQ ID NO.15、15P、15H、15HP、15Hm、 15HmP所示核苷酸序列；所述第二条多肽从C段到N段分别为肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc区域；包含SEQ ID NO.16、17、18、19、16P、 17P、18P、19P、16H、17H、18H、19H、16HP、17HP、18HP、19HP、 16Hm、17Hm、18Hm、19Hm、16HmP、17HmP、18HmP、19HmP所示氨基酸序列。
本发明在于提供编码上述IFN-肿瘤或者病毒抗原乙肝Pres1抗原， HBsAg抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原，EBV EBNAl/LMP2/gp350，HIV gp120抗原-免疫球蛋白Fc疫苗平台的氨基酸序列；
本发明还涉及编码所述疫苗平台、融合蛋白的核苷酸片段；
本发明还涉及所述的融合蛋白或疫苗平台的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)构建包含所述编码所述融合蛋白或或疫苗平台的编码基因的表达载体，优选的，所述的表达载体是pEE12.4表达载体；
(2)通过瞬时转染宿主细胞的方法构建包含所述表达载体的宿主细胞，优选的，所述的宿主细胞是293F细胞；
(3)培养所述宿主细胞并收集细胞上清；
(4)通过ProteinA/G的亲和层析柱纯化蛋白纯化所述融合蛋白或疫苗平台。
本发明另外包含该疫苗平台的应用，该疫苗平台可作为乙肝预防性疫苗的使用，该疫苗平台作为乙肝治疗性疫苗的使用，该疫苗平台作为流感预防性疫苗的使用，该疫苗平台作为SARA-COV2、流感、HPV、EBV、 HIV预防性疫苗的使用，述疫苗平台作为HPV、EBV相关肿瘤预防性疫苗的使用。
本发明包含所述疫苗平台所使用的佐剂，其中所述佐剂包括铝佐剂 (Alum)、Toll样受体4激活剂配体MPLA、Toll样受体9配体，M59，寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)和弗氏佐剂。
本发明包含所述疫苗平台作为HBV治疗性疫苗联合乙型肝炎病毒包膜蛋白HBsAg疫苗进行慢性乙型肝炎病毒感染治疗过程中的临床使用。
本发明包含所述疫苗平台作为HBV治疗性疫苗联合核苷或者核苷酸类似物进行慢性乙型肝炎病毒感染治疗过程中的临床使用
本发明包含所述疫苗平台作为HBV、流感、SARA-COV2、HPV、EBV、HIV预防性或治疗性疫苗等与抗病毒药物和其他治疗方法的联合应用； HBV、HPV、EBV相关肿瘤预防性或治疗性疫苗与抗病毒抗肿瘤药物和疗法的联合应用。
相比与现有技术本发明下列有益效果：
1.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台其抗原可以是多种组分变化的，既可以为肿瘤相关抗原也可以为病毒特异型抗原，这增强了疫苗平台使用的灵活性，也增强了此疫苗平台的使用范围。
2.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台，其中的干扰素(IFN)可以增强抗原提呈细胞的迁移与成熟，使其表达的共刺激分增加，从而使其更有利于向T 细胞呈递抗原，同时疫苗平台中的Fc区域(或抗体)，一方面增强了抗原的分子量从而增加了其半衰期，另一方面Fc区(或抗体)可以与抗原提呈细胞表面的Fc受体相结合从而促进抗原提呈细胞对抗原的加工与提成，从而更有利于免疫反应的产生。
3.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台，有真核HEK293细胞表达系统表达， HEK293细胞表达的蛋白不管在分子结构还是理化特征和蛋白修饰及蛋白的生物学功能都与天然蛋白分子更加接近。
4.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台，具有同源或者异源二聚体的两种结构，针对不同的抗原有更优秀的选择。
5.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc疫苗平台，可以通过融合Th细胞辅助表位，例如Pan表位、利用anti-PD-L1等DC靶向抗体、添加刺激免疫应答的各类佐剂，从而激活DC增强DC交叉递呈，产生强大的B细胞、T细胞免疫应答。
6.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台，使用范围广泛不仅可以作为预防性疫苗使用，同时也可以作为治疗性疫苗使用。
7.本发明提供的IFN-肿瘤或者病毒抗原(乙肝Pres1抗原，HBsAg 抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原)-免疫球蛋白Fc(或抗体)疫苗平台，不仅可以单独使用，同时也可以联合现有的HBsAg商业化疫苗、联合核苷/核苷酸类似物一起作为治疗性疫苗来使用。
本发明涉及的序列信息：
1.单元构件序列：
SEQ ID NO.1：小鼠mIFNα4氨基酸序列(mIFNα)
Figure BDA0002565185620000091
SEQ ID NO.1H：Human IFNα2氨基酸序列(hIFNα)
Figure BDA0002565185620000092
SEQ ID.NO.1Hm：Human mutant IFNα2(Q124R)氨基酸序列(hmIFNα)
Figure BDA0002565185620000093
SEQ ID NO.2：人IgG1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000094
SEQ ID No.2-hole：异源二聚体Fc-hole
Figure BDA0002565185620000095
Figure BDA0002565185620000101
SEQ ID No.2-knob：异源二聚体Fc-knob
Figure BDA0002565185620000102
SEQ ID NO.3：Th辅助表位Pan HLA DR-binding epitope(PADER)氨基酸序列
AKFVAAWTLKAAA
SEQ ID NO.4.1：Linker1氨基酸序列：
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO.4.2：Linker 2氨基酸序列：
GSGSGS
SEQ ID NO.5：信号肽氨基酸序列：
MARLCAFLMILVMMSYYWSACSLG
SEQ ID NO.6.1：HBV Pres1(ad亚型)的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000103
SEQ ID NO.6.2：HBV Pres1(ay亚型)的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000104
SEQ ID NO.7.1：HBV HBsAg(adr亚型)的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000105
Figure BDA0002565185620000111
SEQ ID NO.7.2：HBV HBsAg(adw亚型)的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000112
SEQ ID NO.7.3：HBV HBsAg(ayw亚型)的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000113
SEQ ID NO.8：SARS-CoV-2RBD的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000114
SEQ ID NO.9：流感病毒的HA氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000115
SEQ ID NO.10：HPV-E7抗原的氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000121
2.鼠源IFN疫苗mIFNα-抗原-Fc序列：
SEQ ID NO.11：同源二聚体中mIFNα-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000122
SEQ ID NO.12：同源二聚体中mIFNα-RBD(SARS-CoV-2)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000123
Figure BDA0002565185620000131
SEQ ID NO.13：同源二聚体中mIFNα-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000132
SEQ ID NO.14：同源二聚体中mIFNα-E7(HPV)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000133
SEQ ID NO.15：异源二聚体中第一条链mIFNα-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000141
SEQ ID NO.16：异源二聚体mIFNα-Pres1-Fc中第二条链Pres1-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000142
SEQ ID NO.17：异源二聚体mIFNα-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链 RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000143
Figure BDA0002565185620000151
SEQ ID NO.18：异源二聚体mIFNα-HA-Fc中第二条链HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000152
SEQ ID NO.19：异源二聚体mIFNα-E7(HPV)-Fc中第二条链E7-Fc-knob 氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000153
3.鼠源IFN含Pan表位的疫苗IFNα-Pan-抗原-Fc序列：
SEQ ID NO.11P：同源二聚体中mIFNα-Pan-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000154
Figure BDA0002565185620000161
SEQ ID NO.12P：同源二聚体中mIFNα-Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000162
SEQ ID NO.13P：同源二聚体中mIFNα-Pan-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000163
Figure BDA0002565185620000171
SEQ ID NO.14P：同源二聚体中mIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000172
SEQ ID NO.15P：异源二聚体中第一条链mIFNα-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000173
Figure BDA0002565185620000181
SEQ ID NO.16P：异源二聚体mIFN-Pan-Pres1-Fc中第二条链 Pan-Pres1-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000182
SEQ ID NO.17P：异源二聚体mIFNα-Pan-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000183
SEQ ID NO.18P：异源二聚体mIFNα-Pan-HA-Fc中第二条链 Pan-HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000184
Figure BDA0002565185620000191
SEQ ID NO.19P：异源二聚体mIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc中第二条链 Pan-E7-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000192
4.人源IFN疫苗hIFNα-抗原-Fc序列：
SEQ ID NO.11H：同源二聚体中hIFNα-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000193
Figure BDA0002565185620000201
SEQ ID NO.12H：同源二聚体中hIFNα-RBD(SARS-CoV-2)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000202
SEQ ID NO.13H：同源二聚体中hIFNα-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000203
Figure BDA0002565185620000211
SEQ ID NO.14H：同源二聚体中hIFNα-E7(HPV)-Fc氨基酸序列、
Figure BDA0002565185620000212
SEQ ID NO.15H：异源二聚体中第一条链hIFN-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000213
SEQ ID NO.16H：异源二聚体hIFNα-Pres1-Fc中第二条链Pres1-Fc-knob 氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000214
Figure BDA0002565185620000221
SEQ ID NO.17H：异源二聚体hIFNα-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链 RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000222
SEQ ID NO.18H：异源二聚体hIFNα-HA-Fc中第二条链HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000223
SEQ ID NO.19H：异源二聚体hIFNα-E7(HPV)-Fc中第二条链 E7(HPV)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000231
5.人源IFN含Pan表位的疫苗IFNα-Pan-抗原-Fc序列：
SEQ ID NO.11HP：同源二聚体中hIFNα-Pan-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000232
SEQ ID NO.12HP：同源二聚体中hIFNα-Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000233
Figure BDA0002565185620000241
SEQ ID NO.13HP：同源二聚体中hIFNα-Pan-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000242
SEQ ID NO.14HP：同源二聚体中hIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc氨基酸
Figure BDA0002565185620000243
Figure BDA0002565185620000251
SEQ ID NO.15HP：异源二聚体中第一条链hIFNα-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000252
SEQ ID NO.16HP：异源二聚体hIFNα-Pan-Pres1-Fc中第二条链 Pan-Pres1-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000253
SEQ ID NO.17HP：异源二聚体hIFNα-Pan-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000254
Figure BDA0002565185620000261
SEQ ID NO.18HP：异源二聚体hIFNα-Pan-HA-Fc中第二条链 Pan-HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000262
SEQ ID NO.19HP：异源二聚体hIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc中第二条链 Pan-HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000263
Figure BDA0002565185620000271
6.人源突变IFN疫苗hmIFNα-Pan-抗原-Fc序列：
SEQ ID NO.11Hm：同源二聚体中hmIFNα-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000272
SEQ ID NO.12Hm：同源二聚体中hmIFNα-RBD(SARS-CoV-2)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000273
Figure BDA0002565185620000281
SEQ ID NO.14Hm：同源二聚体中hmIFNα-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000282
SEQ ID NO.13Hm：同源二聚体中hmIFNα-E7(HPV)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000283
SEQ ID NO.15Hm：异源二聚体中第一条链hmIFN-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000291
SEQ ID NO.16Hm：异源二聚体hmIFNα-Pres1-Fc中第二条链 Pres1-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000292
SEQ ID NO.17Hm：异源二聚体hmIFNα-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000293
Figure BDA0002565185620000301
SEQ ID NO.18Hm：异源二聚体hmIFNα-HA-Fc中第二条链HA-Fc-knob 氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000302
SEQ ID NO.19Hm：异源二聚体hmIFNα-E7(HPV)-Fc中第二条链 HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000303
7.人源突变IFN含Pan表位疫苗hmIFNα-Pan表位-抗原-Fc序列
SEQ ID NO.11HmP：同源二聚体中hmIFNα-Pan-Pres1-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000304
Figure BDA0002565185620000311
SEQ ID NO.12HmP：同源二聚体中hmIFNα-Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc 氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000312
SEQ ID NO.13HmP：同源二聚体中hmIFNα-Pan-HA-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000313
Figure BDA0002565185620000321
SEQ ID NO.14HmP：同源二聚体中hmIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000322
SEQ ID NO.15HmP：异源二聚体中第一条链hmIFNα4-Fc-hole氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000323
Figure BDA0002565185620000331
SEQ ID NO.16HmP：异源二聚体hmIFNα-Pan-Pres1-Fc中第二条链 Pan-Pres1-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000332
SEQ ID NO.17HmP：异源二聚体hmIFNα-Pan-RBD(SARA-CoV-2)-Fc中第二条链Pan-RBD(SARS-CoV-2)-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000333
SEQ ID NO.18HmP：异源二聚体hmIFNα-Pan-HA-Fc中第二条链 Pan-HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000334
Figure BDA0002565185620000341
SEQ ID NO.19HmP：异源二聚体hmIFNα-Pan-E7(HPV)-Fc中第二条链 Pan-HA-Fc-knob氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000342
8.替代Fc的抗体序列
SEQ ID NO.20：ScFv(PD-L1)氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000343
SEQ ID NO.20-VH：Anti-PD-L1 VH氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000344
SEQ ID NO.20-VL：Anti-PD-L1 VL氨基酸序列
Figure BDA0002565185620000351
附图说明
图1.疫苗平台以同源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段1-靶抗原- 免疫球蛋白Fc(或抗体)顺序排列组合的示意图；
图2.疫苗平台以异源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段 1-IgG1-hole、靶抗原-IgG1-knob(或抗体)组合的示意图；
图3.疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-knob组合和靶蛋白-IgG1-hole(或抗体)的示意图；
图4.疫苗平台以同源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段1-Th细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-免疫球蛋白Fc(或抗体)顺序排列组合的示意图；
图5.疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-hole和Th细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-IgG1-knob(或抗体) 组合的示意图；
图6.疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-knob和Th细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-IgG1-hole(或抗体) 组合的示意图。
图7.Pres1-Fc、IFN-Pres1-Fc非变性蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图
图8.相比于游离preS1，融合蛋白preS1-Fc和IFN-preS1-Fc，能显著增强抗原分子的免疫性，并能引起广谱的中和性抗体的产生。(a)对 C57/BL6(n＝8/组)小鼠采用皮下免疫的方式接种游离的乙肝Pres1、 Pres1-Fc、IFNα-Pres1-Fc蛋白，在指定的时间采用Elisa的方法检测血清中Pres1特异性抗体的水平。(b)三种HBV基因型稳定携带小鼠(n＝4)通过静脉注射的方式注射来自IFNα-Pres1-Fc蛋白免疫小鼠的血清，12小时后检测血清中Pres1抗原的变化。
图9.IFNα-Pres1-Fc可应用为乙型肝炎预防性疫苗。C57/BL6小鼠皮下免疫接种游离的乙肝Pres1、Pres1-Fc、IFNα-Pres1-Fc蛋白，接种28天时，采用尾静脉注射的方式感染1x1011μg的AAV-HBV1.3病毒。(a)病毒接种前及病毒接种后第1、2、3、4周血清Anti-Pres1水平。(b)在指定时间点检测血清中Pres1的水平。(c)通过Elisa的方式检测第1、2、3、 4周血清HBsAg的水平。(d)AAV-HBV1.3病毒接种后，HBsAg阳性小鼠的比例。
图10.IFNα-Pres1-Fc作为慢性乙型感染的治疗性疫苗。C57/BL6小鼠通过尾静脉注射的方式感染1x1011μg的AAV-HBV1.3病毒，感染6周后筛选出稳定感染的小鼠(n＝8/组)，通过皮下免疫的方式接种重组Pres1、 IFNα-Pres1-Fc蛋白，每隔离2周免疫一次一共免疫三次。(a)血清中 Anti-Pres1抗原的检测；(b)血清中Pres1抗原的检测；(c)小鼠血清中HBV相关抗原HBsAg的水平检测
图11.Th细胞辅助表位增强IFNα-Pres1-Fc疫苗的抗体应答
相比于IFN-preS1-Fc，IFN-Pan-preS1-Fc能显著增强抗原分子的免疫原性。对C57/BL6(n＝8/组)小鼠采用皮下免疫的方式接种不含铝佐剂的乙肝Pres1、Pres1-Fc、IFNα-Pres1-Fc蛋白，在指定的时间采用Elisa的方法检测血清中Pres1特异性抗体的水平。
图12.IFNα-Pan-Pres1-Fc作为慢性乙型感染的治疗性疫苗。C57/BL6 小鼠通过尾静脉注射的方式感染1x1011μg的AAV-HBV1.3病毒，感染6 周后筛选出稳定感染的小鼠(n＝8/组)，通过皮下免疫的方式接种重组 Pres1、IFNα-Pres1-Fc蛋白，每隔离2周免疫一次一共免疫三次。(a)血清中Anti-Pres1抗原的检测；(b)血清中Pres1抗原的检测；(c)小鼠血清中HBV相关抗原HBsAg的水平检测；(d)通过QPCR的方式检测小鼠血清中HBV-DNA的水平。
图13.IFNα-Pres1-Fc联合HBsAg商业化疫苗，打破针对于HBsAg引起的免疫耐受，诱导HBsAg-HBsAb血清学转换。HBV Carrier小鼠皮下免疫IFNα-Pres1-Fc与HBsAg商业化疫苗，每两周免疫一次一共免疫三次。 (a)HBV Carrier鼠中血清中Pres1的水平，(b)HBsAg的水平，(c)血清中Anti-Pres1的水平(d)，血清中Anti-HBsAg的水平(e)血清中HBV-DNA 的水平。***，p＜0.001
图14.IFNα-RBD(SARS-CoV2)-Fc相比游离的SARS-Cov2 RBD蛋白，可以引起更强的抗体反应。对Balb/c(n＝8/组)小鼠采用皮下免疫的方式接种游离的SARS-Cov-2 RBD、RBD-Fc、IFNα-RBD-Fc蛋白，在指定的时间采用Elisa的方法检测血清中SARS-Cov2 S蛋白特异性抗体的水平。 ****，p＜0.0001。
图15.IFNα-RBD(SARS-CoV2)-Fc免疫小鼠后产生高滴度抗病毒血清，在体外细胞实验中，可以完全阻断SARS-CoV2假病毒感染。
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案和优势更加清楚明了，下面将参考实施例和附图详细描述本发明。所介绍实施例仅是举例说明本发明，而不是意图限定本发明的范围，所述实例仅是本发明的一部分，而不是全部的实施例。本发明的范围由后附的权利具体要求限定。
实施例1.疫苗平台的设计
干扰素-靶抗原-免疫球蛋白Fc(或抗体)结构单元的疫苗平台，由于三个结构单元构成，第一结构单元为干扰素部分，第二结构单元为免疫球蛋白 Fc区(或抗体)，第三单元为靶抗原。现实构建中，三个结构单元可以以任意形式排列组合并且靶抗原可以通过连接序列2与Th细胞辅助表位相连接。其代表形式如下：
图1.为所述疫苗平台以同源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段1- 靶抗原-免疫球蛋白Fc顺序排列组合的示意图。
图2.为所述疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-hole和靶抗原-IgG1-knob组合的示意图
图3.为所述疫苗平台以异源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段 1-IgG1-knob和靶蛋白-IgG1-hole组合的示意图
接下来我们通过连接片段2，把靶抗原与细胞辅助表位相连接，然后与其他两个疫苗平台组件相结合其代表形式如下：
图4.为所述疫苗平台以同源二聚体的形式，按照干扰素-连接片段1-Th 细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-免疫球蛋白Fc顺序排列组合的示意图。
图5.为所述疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-hole和Th细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-IgG1-knob组合的示意图
图6.为所述疫苗平台以异源二聚体的形式，分别按照干扰素-连接片段 1-IgG1-knob和Th细胞辅助表位-连接片段2-靶抗原-IgG1-hole组合的示意图
实施例2.疫苗平台的构建纯化和生产
我们以乙型肝炎病毒Pres1、冠状病毒SARS-CoV-2RBD蛋白同源二聚体形式为例对该疫苗平台的表达生产进行描述。
1、载体的构建、宿主细胞的转染及诱导表达
1.1、以PEE12.4为载体通过分子克隆的方式将疫苗结构单元构建到该载体上，从而得到可以表达融合蛋白的质粒，然后瞬时转染293F细胞的，收集培养上清，最后通过ProteinA亲和层析柱纯化目标蛋白。
载体构建(以含有HBV preS1抗原为例)
(1)PEE12.4-HindIII-信号肽1-干扰素素-BsiwI-Pres1-BstbI-hIgG1-EcoRI
(2)PEE12.4-HindIII-信号肽1-干扰素
-BsiwI-RBD(SARS-CoV-2)-BstbI-hIgG1-EcoRI
(3)PEE12.4-HindIII-信号肽1-干扰素-Bsiwi-PADER-Pres1-hIgG1-EcoRI
(4)PEE12.4-HindIII-信号肽1-干扰素
-Bsiwi-PADER-RBD(SARS-CoV-2)-hIgG1-EcoRI
各个融合蛋白片段之间的连接序列为
(1)干扰素与Pres1之间为连接片段1
(2)干扰素与RBD(SARS-CoV-2)之间为连接片段1
(3)干扰素与PADER之间连接序列为连接片段1，PADER与Pres1之间连接片段为连接片段2
(4)干扰素与PADER之间连接序列为连接片段1，PADER与 RBD(SARS-CoV-2)之间连接片段为连接片段2
1.2、瞬时转染快速表达目的蛋白：
(1)细胞复苏：Freestyle 293F细胞以3×107cells/ml的浓度于CD OptiCHOTMmedia(含10％DMSO)中冻存。从液氮中取出后在37℃水浴锅中快速溶化，加入到含有10mlOptiCHOTM media的15ml离心管中离心，1,000rpm，5min。弃上清，将细胞沉淀悬浮培养于30ml OptiCHOTM media中，37℃，8％CO2，135rpm。4天后将细胞进行扩大培养，扩大培养时浓度不要超过3×106cells/ml。
(2)转染前两天，准备悬浮培养的293F细胞用于瞬时转染(200ml)，接种密度为0.6-0.8×106cells/ml。
(3)两天后对待转染细胞悬液进行计数，预计细胞密度2.5-3.5×106 cells/ml，随后取细胞悬液1,000rpm离心5min，弃上清。
(4)用50ml的新鲜的Freestyle 293media重新悬浮细胞，再次1,000rpm 离心5min，弃上清液。
(5)用200ml Freestyle 293media重新悬浮293F细胞。
(6)用5ml Freestyle 293media培养基稀释600μg质粒，并利用0.22μM 滤器过滤除菌。
(7)用5ml Freestyle 293media培养基稀释1.8mg PEI并利用0.22μM滤器过滤除菌。随后立即将5ml质粒和5ml的PEI混匀，室温静置5 分钟。
(8)将质粒/PEI混合物加入细胞悬液中，放置在37℃，8％CO2，85rpm 培养箱中培养，同时补加生长因子50ug/L LONGTM R3IGF-1。
(9)4小时后补加200ml EX-CELLTM 293media培养基和2mM Glutamine，将转速调至135rpm继续培养。
(10)24小时后加入细胞增殖抑制剂3.8mM VPA，72小时后加入40ml medium D继续培养，转然后6-8天(细胞存活率低于70％)收集上清液进行下一步纯化。
1. 3、融合蛋白的收集、纯化和电泳验证
2.利用Protein A进行目的蛋白纯化：
(1)样品准备：将悬浮细胞培养液转至500ml离心桶中离心，8,000rpm， 20min弃沉淀，将上清经0.45μM滤器过滤除去杂质，然后加入终浓度为0.05％NaN3防止纯化过程中细菌污染。
(2)组装层析柱：取适量Protein AAgarose(每1ml Protein A纯化20mg human Fc融合蛋白计算)混匀后加入层析柱，室温静置约10min，待Protein A与20％乙醇溶液分层后把底部的出口打开，让乙醇溶液通过重力作用缓慢流出。
(3)分别用10倍柱体积的蒸馏水和Binding buffer(20mM sodium phosphate+0.15M NaCl，pH 7.0)冲洗和平衡层析柱。
(4)利用恒流泵进行上样，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液，重复上样2次。
(5)用10倍柱体积以上的Binding buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白，冲洗至流出液无蛋白检出。
(6)使用Elution Buffer(0.1M Glycine，pH 2.7)进行洗脱，洗脱液分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白指示液(Bio-Rad protein assay) 观察洗脱峰。将洗脱峰的收集管混合后加入适量的1M Tris，pH 9.0 中和(调节pH值至6-8，应于所纯化蛋白等电点相差0.5以上)。
(7)利用Zeba脱盐离心柱或浓缩离心柱将目的蛋白溶液置换到所需要的缓冲液中(注意调节缓冲液pH，避开蛋白的等电点)。利用BSA为标准品，通过SDS-PAGE电泳和NanoDrop2000确定蛋白浓度。
(8)洗脱结束后，依次使用20倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子，再用10倍柱体积的20％乙醇冲洗柱子，最后乙醇溶液要浸没凝胶介质，4℃保存。
3.所述蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图如图7所示。
实施例3.IFNα-Pres1-Fc，Pres1-Fc相较于单纯的Pres1抗原在小鼠体内可以引起更强的免疫应答。
材料：C57BL/6雄性小鼠(5-8)周购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；辣根过氧化物氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG买自北京康为生物技术有限公司；96孔ELISA测定板购自Corning Costar公司；ELISA 显色液购自eBioscience公司；所用酶标仪SPECTRA max PLUS 384购自美国Molecular公司。所用铝佐剂购自SIGMA公司。
方法：
(1)Pres1融合蛋白免疫小鼠，将80pmol IFN-Pres1-Fc或者80pmol的 Pres1-Fc、Pres1蛋白与铝佐剂混合后皮下免疫小鼠。在指定的时间点通过眼眶取血的方式收集小鼠的血清，进行抗体检测。
(2)IFNα-Pres1-Fc所产生的抗体对不同基因型的HBV病毒有广泛的中和作用。5周年龄雄性C57BL/6通过尾静脉的方式感染AAV-HBV 1.3 (其中HBV基因型为B、C、D型)1x1011vg病毒，6周后筛选HBV 抗原持续稳定表达的小鼠进行试验。将筛选出的小鼠(4只/组)通过静脉注射的方式注射来自IFNα-Pres1-Fc免疫小鼠的血清200ul/ 只。12小时后，收集小鼠血清，通过Elisa的方式检测注射抗血清前后小鼠体内Pres1抗原的变化。
(3)ELISA检测血清中anti-Pres1特异性抗体。将Pres1(2ug/ml)包被液以每孔50ul的体系加入到Elisa板(Corning 9018)中，4℃包被过夜。用PBS洗一遍，260ul每孔。5％的封闭液(5％FBS)37℃封闭两小时。用PBS稀释血清样品(1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000)，每孔加50ul到封闭好的Elisa板中37℃孵育1小时。PBST洗5次，每次260ul，每孔加入50ul酶标二抗(enzyme-conjjugated anti-mouse IgG-HRP 1∶5000diluted by PBS)，37℃孵育1小时。用PBST洗五遍，每次260ul，加底物TMB 100ul/孔，室温避光孵育，等待底物显色；每孔加50ul终止液(2N H2SO4)终止显色，酶标仪读板， OD450-630。
结果：游离的Pres1免疫原性较弱，当在Pres1的基础上加上IFNα、Fc部分构成IFNα-Pres1-Fc融合蛋白时其免疫原性得到了极大的提升，如图8 (a)所示。并且由IFNα-Pres1-Fc所引起的抗体，能对不同的HBV基因型病毒产生广泛的中和作用，如图8(b)所示。
实施例4.IFNα-Pres1-Fc可作为乙肝预防性疫苗来使用
材料：C57BL/6(6-8)周雄性小鼠购自北京维通利华生物技术有限公司， HBsAg检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。AAV-HBV 1.3病毒购买自广州派真生物技术有限公司。其他实验材料同实施例3。
方法：
(1)小鼠通过皮下免疫的方式接种80pmol不同形式的Pres1疫苗包括单纯的Pres1、Pes1-Fc、IFNα-Pres1-Fc蛋白，在免疫28天时，收集小鼠血清并对小鼠感染1x1011vgAAV-HBV 1.3病毒，之后每周收集小鼠血清检测血清中的anti-Pres1抗体、HBsAg、Pres1抗原，连续检测四周。在第三周时检测小鼠外周HBV-DNA水平。
(2)ELISA检测血清中Pres1特异性抗原。抗原包被：将Pres1抗体XY007 (4ug/ml)包被液以每孔50ul的体系加入到Elisa板(Corning 9018) 中，4℃包被过夜。用PBS洗一遍，260ul每孔。用5％的封闭液(5％ FBS)37℃封闭两小时。用PBS稀释血清样品(1∶10，1∶100)，每孔加50ul到封闭好的Elisa板中，每个稀释度设置两个复孔，37℃孵育1小时。PBST洗5次，每次260ul，每孔加入50ul酶结合物(来自科华HBsAg检测Kit)，37℃孵育1小时。用PBST洗五遍，每次260ul，加底物TMB 100ul/孔，室温避光孵育，等待底物显色；每孔加50ul终止液(2NH2SO4)终止显色，酶标仪读板，OD450-630。
结果：IFNα-Pres1-Fc免疫组的小鼠在接种病毒前即能产生高水平的Pres1 抗体并且抗体在病毒感染过程中持续维持在较高水平如图9(a)。相较于未进行蛋白免疫组而言，IFN-Pres1-Fc疫苗免疫能够显著预防HBV感染，免疫后产生的抗-preS1抗体能够很快完全清除血清中preS1抗原图9(b)，并且在IFN-Pres1-Fc免疫组接受病毒感染的小鼠大部分表现为外周HBsAg 阴性图9(c、d)。以上实验结果表明，IFN-Pres1-Fc作为疫苗，能够有效预防HBV感染，如图9所示。
实施例5.IFNα-Pres1-Fc作为慢性乙型感染的治疗性疫苗
材料：C57BL/6雄性小鼠(4周)购自北京维通利华生物技术有限公司。
AAV-HBV 1.3购自广州派真生物技术有限公司。HBsAg检测试剂盒购买自上海科华生物技术有限公司，其他实验材料同实施例4。
方法：
(1)HBV Carrier小鼠的筛选，4周龄HBV C57BL/6小鼠通过尾静脉的方式注射1x1011vgAAV-HBV 1.3病毒，1-6周通过检测HBV 抗原HBsAg，筛选出HBsAg稳定表达的小鼠，作为HBV Carrier 小鼠进行实验。
(2)筛选出的小鼠通过皮下注射的方式注射80pmol不同形式的Pres1 蛋白，每两周进行一次一共进行三次免疫。在免疫14天时收集小鼠血清，之后每周采集一次小鼠血清，通过ELISA检测小鼠血清中抗-Pres1抗体、HBsAG、Pres1抗原的水平。在最后一次取血后检测小鼠外周血中的HBV-DNA含量。
结果：我们检测IFN-Pres1-Fc疫苗免疫Carrier小鼠后其血清中preS1 抗原，以及血清中Pres1抗体和HBsAg的变化情况。结果显示，在 IFNα-Pres1-Fc疫苗免疫之后，小鼠高水平的anti-Pres1抗体的产生如图 10(a)所示，并且伴有血清中preS1抗原能够被完全清除，如图10(b)所示，。同时血清中的HBsAg也有一定程度的下降如图10(c)，而未处理对照组以及单独Pres1疫苗免疫组都没有治疗效果图10所示。
实施例6.T细胞辅助表位增强IFNα-Pres1-Fc疫苗的抗体应答
材料：同实施例3
方法：
(1)Pres1融合蛋白免疫小鼠，将80pmol含有Pan表位的 IFN-Pan-Pres1-Fc或者80pmol的IFN-Pan-Pres1-Fc、Pres1-Fc、Pres1 蛋白皮下免疫小鼠。在指定的时间点通过眼眶取血的方式收集小鼠的血清，进行抗体检测。
(2)ELISA检测血清中anti-Pres1特异性抗体，同实施例3。
结果：相比于IFN-preS1-Fc等融合蛋白疫苗，IFN-Pan-preS1-Fc能显著增强抗原分子的免疫原性，并能引起广谱的中和性抗体的产生。对C57/BL6 (n＝8/组)小鼠采用皮下免疫的方式接种不含铝佐剂的乙肝Pres1、 Pres1-Fc、IFNα-Pres1-Fc蛋白，在指定的时间采用Elisa的方法检测血清中 Pres1特异性抗体的水平。
实施例7.IFNα-Pan-Pres1-Fc作为慢性乙型感染的治疗性疫苗
材料：C57BL/6雄性小鼠(4周)购自北京维通利华生物技术有限公司。 AAV-HBV1.3购自广州派真生物技术有限公司。HBsAg检测试剂盒购买自上海科华生物技术有限公司，其他实验材料同实施例4。
方法：
(1)HBV Carrier小鼠的筛选，4周龄HBV C57BL/6小鼠通过尾静脉的方式注射1x1011vg AAV-HBV 1.3病毒，1-6周通过检测HBV 抗原HBsAg，筛选出HBsAg稳定表达的小鼠，作为HBV Carrier 小鼠进行实验。
(2)筛选出的小鼠通过皮下注射的方式注射80pmol不同形式的Pres1 蛋白，每两周进行一次一共进行三次免疫。在免疫14天时收集小鼠血清，之后每周采集一次小鼠血清，通过ELISA检测小鼠血清中抗-Pres1抗体、HBsAG、Pres1抗原的水平。在最后一次取血后检测小鼠外周血中的HBV-DNA含量。
结果：我们检测IFN-Pan-Pres1-Fc疫苗免疫Carrier小时小鼠后其血清中preS1抗原，以及血清中Pres1抗体和HBsAg的变化情况。结果显示，在IFN-Pan-Pres1-Fc疫苗免疫之后，小鼠产生高水平的anti-Pres1抗体的产生如图12(a)所示。并且伴有血清中preS1抗原能够被完全清除如图12(b)所示，同时血清中的HBsAg也有一定程度的下降12(c)，而未处理对照组以及单独Pres1疫苗免疫组都没有治疗效果。并且HBV DNA在IFNα-Pan-Pres1-Fc免疫组中也有明显的下降如图12(d)所示。
实施例8.IFNα-Pan-Pres1-Fc联合HBsAg商业化疫苗，打破针对于HBsAg 引起的免疫耐受，诱导HBsAg-HBsAb血清学转换。
材料：C57BL/6雄性小鼠(4周)购自北京维通利华生物技术有限公司。 AAV-HBV1.3购自广州派真生物技术有限公司。HBsAg检测试剂盒购买自上海科华生物技术有限公司，Anti-HBsAg试剂盒购买自北京万泰生物制药有限公司。商业化HBsAg疫苗购买自艾美汉信疫苗(大连)有限公司。其他实验材料同实施例7。
方法：
(1)HBV Carrier小鼠的筛选，4周龄HBV C57BL/6小鼠通过尾静脉的方式注射1x1011vg AAV-HBV 1.3病毒，1-6周通过检测HBV 抗原HBsAg，筛选出HBsAg稳定表达的小鼠，作为HBV Carrier 小鼠进行实验。
(2)筛选得出的HBV Carrier小鼠，免疫80pmol IFNα-pan-Pres1-Fc，同时免疫商业化HBsAg疫苗2μg连续免疫两次，每次间隔14天。在第一次免疫后14天收集小鼠血清，之后每周采集小鼠血清，并检测血清中anti-Pres1、Pres1、anti-HBsAg、HBsAg的变化。并在最后一次小鼠血清采集时，检测血清中HBV-DNA的水平。
结果：我们发现，以IFNα-Pan-Pres1-Fc联合商业化HBsAg作为治疗慢性乙型肝炎的策略，最终能够打破HBsAg耐受。HBV耐受小鼠中产生的免疫反应能够完全清除血清中preS1抗原能够被图13(a)，而且血清中存在高浓度的Pres1抗体13(c)。令人兴奋的是，IFN-Pan-Pres1-Fc疫苗同时有效清除血清中HBsAg，同时诱导了部分的血清学HBsAb的转化图13(b)和 4(d)，这在临床上被认为是HBV治愈的关键指标。另外我们分别通过荧光定量PCR(real-time PCR)的方法检测了外周血中HBV相关的DNA的表达水平，结果显示，相对于对照组而言，以IFNα-Pan-Pres1-Fc联合商业化 HBsAg的免疫方式能够最终降低外周HBV DNA的水平图13(e)，通过以上结果，我们发明了联合以IFNα-Pan-Pres1-Fc和商业化HBsAg疫苗治疗慢性乙型肝炎的疫苗策略
实施例9.IFNα-RBD(SARS-CoV2)-Fc相比游离的SARS-Cov2 RBD蛋白，可以引起更强的抗体反应
材料：Balb/c雌雄小鼠(6-8周)购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，所用SARS-CoV-2RBD蛋白购买自北京科跃中楷生物技术有限公司。293-hACE2细胞来自张政教授(深圳第三人民医院)提供。Luciferase Reporter检测试剂盒购买自promega公司。
其他实验材料同实施例3。
方法：
(1)IFNα-RBD(SARS-Cov-2)-Fc融合蛋白免疫小鼠，将10ug IFNα-RBD-Fc、RBD-Fc或者10ug RBD蛋白与铝佐剂混合后皮下免疫小鼠。在免疫28天时通过眼眶取血的方式收集小鼠的血清，进行新冠特异性抗体的检测。
(2)检测血清SARS-cov2 RBD抗体。抗原包被：将RBD(1.5ug/ml)包被液以每孔100ul的体系加入到Elisa板(Corning 9018)中，4℃包被过夜。用PBS洗一遍，260ul每孔。用5％的封闭液(5％FBS)100ul，37℃封闭两小时。用PBS稀释血清样品(1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000...)，每孔加100ul到封闭好的Elisa板中37℃孵育1小时。PBST洗5次，每次260ul，每孔加入100ul酶标二抗(enzyme-conjugated anti-mouse IgG-HRP 1∶5000diluted by PBS)，37℃孵育1小时。用PBST洗五遍，每次260ul，加底物 TMB 100ul/孔，室温避光孵育15分钟，等待底物显色。每孔加50ul终止液(2N H2SO4)终止显色，酶标仪读板，OD450-630。滴度计算方法，选取结果为阳性的最大稀释倍数，以该稀释倍数对应的OD值/Cutoff值(0.1)乘 (X)稀释倍数，所得的值为该血清对应的抗体滴度。
(3)SARS-CoV-2S蛋白假病毒体外中和实验。抗血清按1∶3稀释加入到96孔板中，50ul带有luciferase spike蛋白的假病毒颗粒加入到孔中，病毒抗体混合物37℃放置1小时，每孔10^4的293-hACE2细胞加入到96 孔板中。将96孔板放置到37℃细胞培养箱，48小时后检测luciferase的活性。
结果：游离的新冠RBD免疫原性较弱，当在新冠RBD多肽蛋白区域的基础添加IFNα、Fc部分构成IFNα-RBD-Fc融合蛋白时，其免疫原性得到了极大的提升，如图14所示。并且由IFNα-RBD-Fc所引起的抗体，能够在体外阻断SARS-CoV-2S蛋白的假病毒对细胞的感染如图15所示。
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Claims (10)

1.一种疫苗，其包含含有干扰素-靶抗原-免疫球蛋白Fc区(或抗体Ab)为结构单元的融合蛋白，
其中所述干扰素为第一结构单元，可以是I型干扰素、II型干扰素和/或III型干扰素例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)、IFN-λ(IL-28b)和IFN-ω，所述干扰素可来自人源或鼠源，优选所述干扰素为I型干扰素，例如IFN-α，例如小鼠IFN-α4、人IFN-α2、人IFN-α2的突变体(结合人和小鼠的IFN受体)，例如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.1H、SEQ ID NO.1Hm氨基酸序列所示，
其中所述靶抗原为第三结构单元，可以是肿瘤抗原，病原体抗原，如病毒或细菌抗原，
其中所述免疫球蛋白Fc区(或抗体)为第二结构单元，可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和/或IgM的恒定区氨基酸序列，例如IgG1的Fc区，以及用于形成异源二聚体的IgG1-Fc-hole和IgG1-Fc-knob的氨基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.2-hole、SEQ ID NO.2-knob所示的Fc区，其中作为第二结构单元的所述抗体(包括例如抗体重链和轻链，或单链抗体，简称Ab)可以为DC靶向活化抗体，包括anti-PD-L1，anti-DEC205，anti-CD80/86等抗体，
任选地所述疫苗可以为靶向性疫苗，任选地所述融合蛋白还可以包含一个或多个Th细胞辅助表位和/或连接片段。
2.权利要求1所述的疫苗，
其中所述靶抗原是病毒抗原，所述病毒可以为HBV，HPV，EBV，HIV，流感病毒，冠状病毒，如SARS-COV，SARS-COV-2，MERS-CoV，例如，所述抗原可以是HBV Pres1抗原，HBsAg抗原或肽段，SARS-COV2 RBD抗原，流感HA抗原，HPV E7抗原，EBV EBNA1/LMP2/gp350抗原，HIV gp120抗原；
所属病毒抗原可以融合表达增强B细胞和T细胞应答的辅助多肽表位，可以位于抗原表位的N端或C端，例如以Pan HLA DR-binding表位(PADER)，例如SEQ ID NO.3其氨基酸序列所示；
所述各个结构单元的连接片段为柔性多肽序列，可以为连接片段1和2，例如SEQ IDNO.4.1、SEQ ID NO.4.2氨基酸序列所示，
所述结构单元组成的每一条多肽序列N端可以均含有能够促进蛋白分泌的相应信号肽，例如SEQ ID NO.5氨基酸序列所示，
所述疫苗可以通过真核表达系统产生，例如通过真核表达系统293F、CHO细胞产生。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中所述靶抗原是病毒抗原，例如HBV抗原，例如HBVPres1抗原，例如ad亚型或ay亚型HBV Pres1抗原，例如SEQ ID NO.6.1氨基酸序列所示的ad亚型HBV Pres1抗原，例如SEQ ID NO.6.2氨基酸序列所示的ay亚型HBV Pres1抗原；例如HBV HBsAg抗原(包含各个亚型和肽段)，例如SEQ ID NO.7.1氨基酸序列所示的adr亚型HBVHBsAg抗原，例如SEQ ID NO.7.2氨基酸序列所示的adw亚型HBV HBsAg抗原，例如SEQ IDNO.7.3氨基酸序列所示的ayw亚型HBV HBsAg抗原；例如SARS-COV-2抗原，例如SEQ ID NO.8氨基酸序列所示的SARS-COV2 RBD抗原；例如流感病毒抗原，例如SEQ ID NO.9氨基酸序列所示流感病毒HA抗原；例如HPV抗原，例如SEQ ID NO.10氨基酸序列所示的HPV E7抗原；还包括EBV EBNA1/LMP2/gp350，HIV gp120抗原。
4.权利要求1-3任一项所述的疫苗，其中所述融合蛋白为同源二聚体或者异源二聚体融合蛋白，任选地所述融合蛋白还可以在同源二聚体或者异源二聚体的任意一条或两条链(即第一多肽链和/或第二多肽链)中包含一个或多个Th细胞辅助表位和/或连接片段，
任选地所述同源二聚体融合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链完全相同，例如所述第一多肽链和第二多肽链自N端到C端依次包含IFN、靶抗原和免疫球蛋白Fc区(或Ab)，或三个结构单元任意组合次序的多肽，并生成同源二聚体；优选N端到C端依次包含IFN、靶抗原和免疫球蛋白Fc区(或Ab)；其还可以包含Th细胞辅助表位的融合蛋白；
任选地所述异源二聚体融合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链不同，例如所述第一多肽链可以从N端到C端依次包括IFN和免疫球蛋白Fc区(或Ab)，或从N端到C端依次包括免疫球蛋白Fc区(或Ab)和IFN，所述第二条肽链可以包括靶抗原和免疫球蛋白Fc区(或Ab)，其中靶抗原可以位于N端，免疫球蛋白区(或Ab)可以位于C端，或免疫球蛋白区(或Ab)可以位于N端，靶抗原可以位于C端；或三个结构单元任意组合次序的多肽，并生成异源二聚体；优选IFN和靶抗原位分别位于两个多肽的N端，免疫球蛋白Fc区(或Ab)位于两个多肽C端；其还可以包含Th细胞辅助表位的融合蛋白。
5.权利要求4所述的疫苗，其中
1)所述同源二聚体的第一多肽和第二多肽可以包含SEQ ID NO.11、12、13、14、11P、12P、13P、14P、11H、12H、13H、11HP、12HP、13HP、14HP、14H、11Hm、12Hm、13Hm、14Hm、11HmP、12HmP、13HmP、14HmP所示氨基酸序列，
2)所述异源二聚体第一多肽可以包含SEQ ID NO.15、15P、15H、15HP、15Hm、15HmP所示核苷酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO.16、17、18、19、16P、17P、18P、19P、16H、17H、18H、19H、16HP、17HP、18HP、19HP、16Hm、17Hm、18Hm、19Hm、16HmP、17HmP、18HmP、19HmP所示氨基酸序列，
3)所述抗体可以包括DC靶向抗体，免疫检查点阻断抗体，免疫激活抗体等，例如含有anti-PD-L1抗体(SEQ ID NO.20)，anti-DEC205抗体，anti-CD80/86等抗体氨基酸序列的疫苗。
6.编码权利要求1-5任一项所述疫苗中的融合蛋白的核酸分子，包含所述核酸分子的表达载体，或者包含所述核酸分子或表达载体的宿主细胞，例如真核细胞。
7.权利要求1-5任一项所述的疫苗中的融合蛋白在制备组合物或试剂盒，例如药物或免疫原性组合物或试剂盒，重组微生物或者细胞系中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其中所述组合物或试剂盒用于肿瘤或病原体的预防或治疗，例如病毒或细菌的预防或治疗，所述病毒可以为HBV，HPV，EBV，流感病毒，HIV，冠状病毒，如SARS-COV，SARS-COV-2，MERS-CoV，例如，所述组合物或试剂盒用作乙肝预防性或治疗性疫苗，HBV预防性或治疗性疫苗，流感预防性或治疗性疫苗，SARA-COV2预防性或治疗性疫苗，HPV预防性或治疗性疫苗，HPV相关肿瘤预防性或治疗性疫苗，EBV预防性或治疗性疫苗，EBV相关肿瘤预防性或治疗性疫苗，HIV预防性或治疗性疫苗。
9.根据权利要求1-5任一项所述的疫苗或根据权利要求7或8所述的应用，其中所述疫苗、所述组合物或试剂盒可以肌内、静脉内、经皮、皮下或者鼻腔等免疫途径进行接种，其中所述疫苗、所述组合物或试剂盒还可以包括佐剂，所述佐剂可以包括铝佐剂(Alum)、Toll样受体4激活剂配体MPLA、Toll样受体9配体，寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)，M59和弗氏佐剂。
10.根据权利要求1-5任一项所述的疫苗或根据权利要求7或8所述的应用，其中所述疫苗可以与另外的预防性或治疗性疗法联合使用，例如所述疫苗可以为HBV治疗性疫苗，所述HBV治疗性疫苗可以与另外的预防性或治疗性HBV疗法联合使用，例如所述HBV治疗性疫苗可以与乙型肝炎病毒包膜蛋白HBsAg疫苗联合使用，例如用于慢性乙型肝炎病毒感染治疗，例如所述HBV治疗性疫苗可以联合核苷或者核苷酸类似物，例如用于慢性乙型肝炎病毒感染治疗，例如用于流感、SARA-COV2、HPV、EBV、HIV预防性或治疗性疫苗等与抗病毒药物和其他治疗方法的联合应用；HPV、EBV相关肿瘤预防性或治疗性疫苗与抗病毒抗肿瘤药物和疗法的联合应用。
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