ES2345188T3

ES2345188T3 - Preparaciones de bacterias gram positivas para el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulacion inmune.

Info

Publication number: ES2345188T3
Application number: ES02804652T
Authority: ES
Inventors: Marie-Anne Nahori; Micheline Lagranderie; Gilles Marchal; Bernardo Boris Vargaftig; Jean Lefort; Felix Romain; Georges Hekimian; Philippe Peltre
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2010-09-17
Anticipated expiration: 2022-12-11
Also published as: US7871627B2; CN1602199B; JP2011121977A; KR101048798B1; CN1602199A; WO2003049752A3; WO2003049752A2; NZ555055A; US8404250B2; EP2316466B1; CA2469334C; CY1110727T1; SI1461054T1; DK1461054T3; JP2005516915A; BR0214902A; AU2002356387C1; DK2316466T3; JP4737586B2; EP2316466A2

Abstract

Uso de una composición que contiene bacterias Gram positivas o una fracción de las mismas, en el que dichas bacterias consisten en células bacterianas Gram positivas muertas no desnaturalizadas y dicha fracción se selecciona del grupo consistente en: una fracción tratada con glicosidasa (fracción B), una fracción digerida con DNasa y/o RNasa (fracción C) y una fracción tratada con proteasa (fracción D) de dichas células bacterianas Gram positivas muertas no desnaturalizadas, para la preparación de un medicamento que es capaz de inducir una modulación de la respuesta inmune frente a un antígeno propio o un alérgeno, para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad autoinmune y alergia.

Description

Preparaciones de bacterias Gram positivas para el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden componentes preparados a partir de bacterias Gram positivas tales como bacterias intracelulares facultativas Gram positivas, por ejemplo micobacterias, para el tratamiento de trastornos que comprenden una mala regulación inmune, en humanos y animales. La invención también se refiere a la preparación de dichos componentes y composiciones.

Las enfermedades que comprenden una mala regulación inmune, tales como desequilibrio de Th1-Th2, incluyen diferentes cánceres, enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y diabetes mellitus, y trastornos alérgicos tales como asma, rinitis alérgica, conjuntivitis y dermatitis atópica.

Por ejemplo:

El asma alérgica es una enfermedad común, que implica una inflamación inducida por un alérgeno de las vías respiratorias; los leucocitos, eosinófilos y en ocasiones neutrófilos inflamatorios, se reclutan a las vías respiratorias como consecuencia de la presencia y activación de los linfocitos T que reaccionan con los alérgenos inhalados en el aparato respiratorio. Los linfocitos T CD4+ cumplen una función principal en la iniciación de la inflamación alérgica de las vías respiratorias mediante la producción de citoquinas de tipo Th2, que desencadenan el reclutamiento de eosinófilos a las vías respiratorias y posiblemente su activación posterior. Se ha propuesto que un desequilibrio entre los efectores Th2 y Th1 conduce a la patogenia del asma.

Por lo tanto, se ha propuesto estimular una respuesta inmune Th1 en los pulmones, por ejemplo, por nebulización de IFN-\gamma o por administración de una vacuna micobacteriana; dicha estimulación parece inhibir el desarrollo de procesos alérgicos secundarios en ratones.

Más específicamente, el asma extrínseca o asma atópica (por ejemplo, ocupacional e inducido por drogas) se asocia con la potenciación de una respuesta inmune tipo Th2 con la producción de inmunoglobulina E (IgE) específica, ensayos en piel positivos a aeroalérgenos comunes y/o síntomas atópicos. La obstrucción de las vías respiratorias en el asma extrínseca implica una hiperrespuesta bronquial (HRB) no específica causada por inflamación de las vías respiratorias. Esta inflamación se media por compuestos químicos liberados por una diversidad de células inflamatorias, que incluye mastocitos, eosinófilos y linfocitos. Las acciones de estos mediadores dan como resultado una permeabilidad vascular, secreción de mucus y estrangulamiento del músculo liso bronquial. En el asma atópica, la respuesta inmune que produce inflamación de las vías respiratorias se ocasiona por la clase Th2 de las células T que secretan IL-4 e IL-5. Se ha descrito que el asma intrínseca o criptogénica se desarrolla después de infecciones del aparato respiratorio superior, pero puede surgir de novo en personas de mediana edad o mayores, en los cuales es más difícil de tratar que el asma extrínseca.

Por lo tanto los trastornos alérgicos se median por linfocitos T que secretan citoquinas de T colaboradores 2 (Th2), IL-4, IL-5 e IL-13, dando como resultado altos niveles de IgE en suero y reclutamiento de eosinófilos. Sin embargo, las células Th1 también pueden participar en estas patologías; por ejemplo, las células Th1 se han identificado en lesiones crónicas de la piel atópicas. Un desequilibrio tal de Th1-Th2 también se ha encontrado en otros trastornos tales como algunos cánceres, especialmente cáncer de vejiga o en enfermedades autoinmunes.

Los estudios epidemiológicos, por ejemplo, los realizados por Shirakawa y col. (Science, 1997, 275, 3), demostraron una relación inversa entre la respuesta de tuberculina y los trastornos atópicos. Dichos resultados indican que la inmunización previa contra ciertas bacterias Gram positiva, tales como las bacterias intracelulares facultativas Gram positivas, por ejemplo micobacterias tales como M. tuberculosis, M. bovis o BCG, puede proteger frente a enfermedades atópicas.

Una de las estrategias de tratamiento es la regulación negativa del componente Th2 mediante la inducción de una respuesta de T colaborador 1 (Th1) frente al alérgeno o antígeno relevante, porque se cree que las citoquinas de Th1 y Th2 son mutuamente antagonistas.

Los resultados experimentales de diferentes grupos han mostrado que la inmunización de ratones adultos con bacterias intracelulares incluyendo micobacterias y listeria, de las que se sabe que inducen una respuesta inmune Th1 fuerte, puede compensar la respuesta Th2 inducida por alérgeno o antígeno; en la alergia, por ejemplo, puede reducir la eosinofilia y la HRB asociada.

Es la razón por la que ciertas micobacterias se han propuesto para el tratamiento de trastornos alérgicos y más específicamente del asma.

A este respecto, se han ensayado diferentes tipos de composiciones que incluyen micobacterias:

- Se ha considerado que las vacunas de BCG vivas tienen un efecto potencial en el asma experimental o equivalente, especialmente cuando se proporcionan por vía intranasal (KJ. Erb y col., J. Exp. Med, 1998, 187, 561-569; MA. Nahori y col., Vaccine, 2001, 19, 1484-1495). Sin embargo, a pesar de su utilidad para prevenir la tuberculosis (JB Milstein y col., WHO Bull. OMS, 1990, 68, 93-108), las vacunas de BCG vivas muestran diversos inconvenientes; primero, no pueden darse a sujetos con insuficiencia inmune debido a su virulencia residual; segundo, hay una reacción local a la vacunación intradérmica de BCG que es proporcional a la masa total bacteriana y puede llevar a ulceración local, o en el caso de inyección subcutánea accidental, a reacciones más severas (absceso). Por lo tanto, dicha vacuna, especialmente si se proporciona por la vía intranasal o en aerosol, no se adaptaría a la administración repetida durante un período significativo para la inmunoterapia de trastornos alérgicos del aparato respiratorio, u otros trastornos que implican un desequilibrio Th1-Th2. La administración intranasal o por aerosol puede conducir a efectos adversos inadmisibles de la vacuna de BCG vivas en los pulmones;

\vskip1.000000\baselineskip

El documento GB1027979 describe un proceso para obtener cultivos de Micobacteria liofilizados viables para su uso como una vacuna contra la tuberculosis.

El documento GB764718 describe la liofilización de materiales biológicos sensibles, tales como BCG de Micobacteria, en presencia de dextrano para aumentar el grado de supervivencia.

- Preparaciones muertas por calor de micobacterias

\bullet Las preparaciones muertas por calor de BCG o de Mycobacterium tuberculosis no tienen propiedades sistemáticas protectoras cuando se emplean en vacunas (R. Janssen y col., Immunol., 2001, 102, 4, 441-449; MA Skinner y col., Immunol., 2001, 102, 2, 225-233; GA Rook y col., Novartis Found Symposium, 1998, 217, 73-87 y 87-98). Además, dichas preparaciones inducen una hipersensibilidad de tipo retardado a los derivados de proteína purificada de BCG (PPD) que interfiere con el diagnóstico de la tuberculosis. Sin embargo, debe observarse que algunos autores han considerado que la preinmunización en el período neonato con M. bovis muerta por calor sola o además de M. vaccae puede potencialmente ser útil en la regulación negativa de una respuesta IgE (F. Tukenmez y col., Pediatr. Allergy Immunol., 1999, 10, 2, 107-111; Tukenmez F. y col., J. Asthma, 2000, 37, 4, 329-334; Nahori y col., citado anteriormente);

\bullet Las preparaciones muertas por calor de Mycobacterium vaccae, (CC Wang y col., Immunol. 1998, 93, 3, 307-313; documento WO 00/74715) tienen aplicación clínica en la inmunoterapia de alergia. Algunos resultados demuestran la potencia de las micobacterias muertas por calor como adyuvantes de Th1 y muestran una aplicación potencial de micobacterias recombinantes en modulación inmune específica de antígeno (R. Janssen y col., Immunol., 2001, 102, 4, 441-449; MA Skinner y col. Immunol., 2001, 102, 2, 225-233; CC Wang y col., Immunol. 1998, 93, 3, 307-313; documento WO 00/74715). Incluso aunque dichas preparaciones están activas en inmunoterapia, presentan varios inconvenientes, compartidos con las preparaciones muertas por calor de BCG o de Mycobacterium tuberculosis, que también impiden su uso en inmunoterapia.

\vskip1.000000\baselineskip

De hecho, todas las preparaciones muertas por calor de micobacterias:

- Inducen la producción de TNF-\alpha por macrófagos alveolares, que se comporta como una sustancia tóxica y necrotizante, impidiendo esto el uso de dichas preparaciones muertas por calor en inmunoterapia e

- Inducen efectos secundarios locales (PM Shirtcliffe y col. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 163, 1410-1414), tales como formación de ampollas con picor, induración y necrosis con cicatrices persistentes observadas en ensayos clínicos humanos.

\vskip1.000000\baselineskip

Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones eficaces derivadas de bacterias Gram positivas tales como bacterias intracelulares facultativas Gram positivas, por ejemplo, micobacterias, para el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune tales como un desequilibrio Th1-Th2, por ejemplo, trastornos alérgicos, tolerándose bien dichas composiciones y no teniendo los inconvenientes expuestos aquí anteriormente.

Además dicha composición, debe permitir la identificación de los componentes activos presentes en la preparación. Las preparaciones muertas por calor, que incluyen calentar a 120ºC durante entre 10 y 30 minutos nunca permitiría la identificación de componentes lábiles ante calor.

En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar una nueva preparación bacteriana Gram positiva muerta, de acuerdo con la reivindicación 1, tal como una preparación bacteriana intracelular facultativa Gram positiva muerta, por ejemplo una preparación micobacterial muerta y composiciones que la contengan, para su uso en el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune tal como un desequilibrio Th1-Th2, por ejemplo cáncer, enfermedades autoinmunes y trastornos alérgicos, sin reacciones adversas importantes.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar dicha preparación bacteriana Gram positiva muerta que además de su capacidad para el tratamiento de enfermedades que incluyen desregulaciones inmunes, también preserva la estructura de las moléculas de las células bacterianas con el fin de permitir la identificación de las moléculas activas de estas células bacterianas.

Sorprendentemente, los inventores han demostrado que bacterias Gram positivas tales como bacterias intracelulares facultativas Gram positivas, por ejemplo micobacterias que se matan mediante "métodos suaves", que no desnaturalizan las moléculas de las células bacterianas son capaces de estimular las leucocitos reguladores (células T CD4+ CD25+ y/o células B y/o células dendríticas) in vivo cuando se administran a sujetos que sufren de asma u otra mala regulación inmune. La estimulación de estas células reguladoras produce una reorganización de la reactividad inmune de los sujetos asmáticos que tiene un efecto local y sistémico durante un período prolongado (varias semanas); como resultado, los sujetos alérgicos tratados con estas preparaciones bacterianas intracelulares Gram positivas muertas se protegen del asma durante un período prolongado.

Los inventores también han demostrado que estas preparaciones bacterianas muertas en las que la estructura de las moléculas de células bacterianas se preserva, no induce efectos adversos, tales como inflamación, anemia, trombocitopenia e inducción de la producción de TNF-\alpha.

La presente invención se refiere a una preparación bacteriana, caracterizada porque:

- Contiene bacterias Gram positivas muertas, obtenibles por un proceso que no desnaturaliza la estructura de las moléculas de las células bacterianas, y

- Es capaz de inducir, in vivo, una modulación de la respuesta inmune frente a un antígeno (preparación inmunomoduladora).

\vskip1.000000\baselineskip

La preparación inmunomoduladora, se refiere a una preparación que es capaz de modificar la relación entre las células reguladoras inmunes y colaboradoras inmunes antes o después de la inducción de una respuesta inmune frente a cualquier antígeno (antígeno propio o antígeno ajeno). Las células reguladoras inmunes incluyen leucocitos reguladores, tales como CD4+ CD25+ y/o células B y/o células dendríticas. Por ejemplo, las células T CD4+ CD25+ se describen en Schevach y col., Nat. Rev. Immunol., 2002, 2, 389-400.

De acuerdo con una realización ventajosa de dicha preparación bacteriana, contiene bacterias intracelulares facultativas Gram positivas muertas.

Bacterias intracelulares facultativas Gram positivas se refiere a bacterias Gram positivas con la capacidad de crecer en medio sintético in vitro, así como de infectar células eucariotas de un hospedador mamífero o no mamífero, in vivo y multiplicarse en esas células, por ejemplo macrófagos.

De acuerdo con una realización ventajosa de dicha preparación bacteriana, contiene bacterias intracelulares facultativas Gram positivas muertas escogidas de Listeria sp., Corynobacterium sp., y Actinomycetes que comprende Mycobacteria sp., Nocardia sp. y Rhodococcus sp.

Preferiblemente, dicha preparación bacteriana contiene Mycobacteria bovis, más preferiblemente Mycobacteria bovis BCG.

Un proceso que no desnaturaliza la estructura de las moléculas de las células bacterianas, se refiere a un proceso que no da como resultado una desnaturalización exhaustiva de la configuración espacial de las moléculas; preferiblemente, dicho proceso preserva la estructura tridimensional de las macromoléculas de las células bacterianas tales como proteínas, polisacáridos y lípidos.

Estos procesos, que se denominan "procesos suaves" incluyen el uso de medios físicos que rompen las membranas celulares bacterianas, mientras que preservan la estructura de sus componentes macromoleculares. Estos procesos incluyen: liofilización prolongada, molienda en presencia de perlas de sílice o circonio, uso de la llamada "prensa francesa", aplicación de ultrasonidos e irradiación por rayos gamma. Los expertos habituales en la materia conocen otros procesos que pueden usarse para obtener la preparación bacteriana muerta como se ha definido anteriormente.

- Por ejemplo, la preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada se refiere a que esencialmente, toda el agua se ha retirado de dicha preparación; así pues, la preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada contiene menos del 1,5% del agua residual, preferiblemente menos del 1% y más preferiblemente menos del 0,5%. Sin embargo, en condiciones no óptimas de liofilización, cuando las preparaciones de bacterias liofilizadas contienen más agua residual (aproximadamente 10%), es decir, no se han matado todas las bacterias, la muerte de las bacterias vivientes residuales se obtiene de forma alternativa por el contacto de dichas preparaciones con aire (presión atmosférica); dichas preparaciones tienen las mismas propiedades y actividad que las preparaciones de bacterias muertas por liofilización prolongada descritas anteriormente. El agua residual en la preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada se determina, por ejemplo, por el método colorimétrico de Karl Fisher.

\vskip1.000000\baselineskip

La ausencia de desnaturalización de las moléculas de la preparación de bacterias Gram positivas muertas de acuerdo con la invención se verifica por cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, la estructura de las proteínas puede verificarse por electroforesis en gel de los extractos de la preparación de bacterias Gram positivas muertas, en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes de acuerdo con Laemmli, Nature, 1970, 277, 680-, en comparación con los extractos de proteínas obtenidos de bacterias vivas; las proteínas se visualizan bien directamente, por tinción del gel con colorante apropiado o bien después de la transferencia de las proteínas a la membrana y la tinción con anticuerpos apropiados dirigidos a las proteínas de bacterias Gram positivas. Otros métodos tales como filtración de gel o espectrometría de masas también puede usarse para verificar la estructura de moléculas purificadas de la preparación de bacterias Gram positivas muertas de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha preparación bacteriana, ésta contiene bacterias muertas por liofilización prolongada obtenibles mediante un proceso de liofilización prolongada.

Preferiblemente, dicha preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada se prepara mediante:

(i) la recolección de un cultivo de células bacterianas vivas,

(ii) el lavado de las células bacterianas en agua o en una solución acuosa de una sal tal como el borato,

(iii) la congelación de las células bacterianas en agua o en una solución acuosa de una sal tal como el borato,

(iv) la muerte de las células bacterianas congeladas mediante su secado en un liofilizador, durante un tiempo suficiente para retirar al menos el 98,5% del agua, preferiblemente al menos el 99% y más preferiblemente al menos el 99,5%, y

(v) la recogida de las células bacterianas muertas por liofilización prolongada.

\vskip1.000000\baselineskip

Como alternativa, dicha preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada se prepara mediante un proceso como se ha definido anteriormente con la excepción de que el lavado de las células bacterianas en el paso (ii) se omite.

Preferiblemente, el paso (iv) se realiza a una presión de cámara de secado de aproximadamente entre 0,02 mbar y 0,2 mbar; más preferiblemente entre 0,06 mbar y 0,1 mbar, durante al menos entre 10 y 12 horas, más preferiblemente a lo largo de varios días con una aportación baja de calor y una temperatura de trampa de vapor frío baja para asegurar una baja temperatura de la preparación de bacterias muertas seca a lo largo del secado (sin desnaturalización de las moléculas celulares bacterianas).

En el proceso de liofilización, el estado de liofilización prolongado se alcanza cuando en ausencia de fugas de aire en el liofilizador, la presión de la cámara de vacío no muestra más variación cuando el condensador de hielo y la bomba de vacío se separan de la cámara de vacío durante varios segundos; esto quiere decir que no puede retirarse más agua de la bacteria liofilizada (= presión de vapor de agua estable). Por ejemplo, cuando la trampa fría está a -52ºC, la presión en la cámara de secado puede estar en el intervalo de 0,06 a 0,120 mbar, usualmente de aproximadamente 0,09 mbar, para obtener eficazmente bacterias muertas por liofilización prolongada.

La invención se refiere también a fracciones diferentes de la preparación de bacterias muertas de acuerdo con la invención, seleccionadas del grupo que consiste en:

- Una fracción B que consiste en un extracto tratado con glicosidasa de dicha preparación de bacterias muertas, para eliminar los componentes glicoderivados, tal como péptidoglicanos,

- Una fracción C que consiste en un extracto digerido por DNasa y/o RNasa, de dicha preparación de bacterias muertas, para eliminar ácidos nucleicos,

- Una fracción D, que consiste en un extracto tratado con proteasa, de dicha preparación de bacterias muertas, para eliminar proteínas.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente:

- Dicha fracción B se obtiene por digestión con lisozima.

- Dicha fracción C se obtiene por digestión con DNasa I y/o RNasa A.

- Dicha fracción D se obtiene por digestión con subtilisina.

\vskip1.000000\baselineskip

De acuerdo con una realización ventajosa de dichas fracciones se aíslan de una preparación bacteriana por liofilización prolongada, como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con una realización ventajosa dichas fracciones, éstas consisten en fracciones de micobacterias, preferiblemente fracciones de Mycobacteria bovis, más preferiblemente fracciones de Mycobacteria bovis BCG.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune tal como un desequilibrio Th1-Th2, que comprende una cantidad eficaz de preparación de bacterias muertas y/o al menos una fracción de las mismas, como se ha definido anteriormente, un transportador farmacéuticamente aceptable y/o un aditivo, y/o un adyuvante, y/o un inmunoestimulante y/o un inmunomodulador distinto de la preparación bacteriana de acuerdo con la invención.

Adyuvante se refiere a un producto natural o sintético que potencia la respuesta inmune específica a un antígeno (producción de anticuerpo, activación de células B y T) cuando se administra en asociación con dicho antígeno.

Inmunoestimulante se refiere a un producto natural o sintético que induce una respuesta inmune no específica cuando se administra en asociación con un antígeno (por ejemplo un aumento de la fagocitosis del antígeno).

De acuerdo con la invención, dicha composición puede usarse ventajosamente para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y diabetes mellitus, y trastornos alérgicos tales como asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica.

De acuerdo con una realización ventajosa de dicha composición, ésta consiste en micobacterias, preferiblemente Mycobacteria bovis, más preferiblemente Mycobacteria bovis BCG.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha composición, ésta consiste en bacterias muertas por liofilización prolongada obtenibles por un proceso de liofilización prolongada como se ha definido anteriormente; preferiblemente dichas bacterias muertas por liofilización prolongada se obtienen por un proceso de liofilización como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con otra realización ventajosa más de dicha composición, ésta está en una forma adecuada para administrarse por vía intranasal.

De acuerdo con otra realización ventajosa más de dicha composición, ésta está en una forma adecuada para administrarse por vía oral o sublingual.

En general, la composición puede administrarse por inyección parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por aspiración o nebulización) por vía oral, vía sublingual o típicamente a través de la piel o a través del recto.

Como se especifica, en una realización, la composición de la presente invención está en una forma adecuada para su suministro a las superficies mucosas broncopulmonares. Por ejemplo, la composición puede suspenderse en una formulación líquida para su administración a un paciente en forma de aerosol o por medio de un dispositivo nebulizador similar a los empleados actualmente en el tratamiento del asma.

Como se especifica, en otra realización, la composición de la presente invención está en una forma adecuada para su administración oral. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de comprimidos, cápsulas ordinarias, cápsulas gelatinosas o jarabe para la administración oral. Estas formas de cápsula gelatinosa, cápsulas ordinarias y comprimidos pueden contener excipientes usados convencionalmente en la formulación farmacéutica, tales como adyuvantes o aglutinantes como almidones, gomas y gelatina, adyuvantes como el fosfato de calcio, agentes desintegrantes como el almidón de maíz o los ácidos algínicos, un lubricante como el estearato de magnesio, edulcorantes o saporíferos. Las disoluciones o suspensiones pueden prepararse en medio acuoso o no acuoso mediante la adición de disolventes farmacológicamente compatibles. Éstos incluyen glicoles, poliglicoles, propilenglicoles, poliglicol éter, DMSO y etanol.

La composición puede contener adicionalmente, un transportador farmacéuticamente aceptable y/o un aditivo y/o un inmunoestimulante y/o un adyuvante, tal como un liposoma que contiene las células bacterianas o una fracción o fracciones de las mismas de acuerdo con la presente invención; dichos uno o más aditivos usados para preparar las composiciones farmacéuticas pueden elegirse entre agentes antiagregantes, antioxidantes, colorantes, potenciadores del sabor, o agentes suavizantes, de ensamblaje o aislantes, y en general entre cualquier excipiente usado convencionalmente en la industria farmacéutica.

Mientras que cualquier transportador adecuado conocido para los expertos en la materia puede emplearse en la composición farmacéutica de la presente invención, el tipo de transportador variará dependiendo del modo de administración. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el transportador comprenderá preferiblemente agua, tampón salino, lactosa, glutamato, una grasa o una cera. Para la administración oral, pueden emplearse cualquiera de los transportadores anteriores o un transportador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) como transportadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 4.897.268 y 5.075.109.

Cualquiera de la diversidad de adyuvantes puede emplearse en las composiciones de la presente invención para potenciar la respuesta inmune. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de un catabolismo rápido o para crear reacciones inflamatorias controladas, tales como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de la respuesta inmune, tal como un lípido A, toxina de Bordetella pertussis. Los adyuvantes adecuados están disponibles en el mercado como, por ejemplo, el Adyuvante Incompleto de Freund y el Adyuvante Completo de Freund, que no pueden usarse para la inyección en humanos. Otros adyuvantes adecuados que pueden usarse en humanos incluyen hidróxido de aluminio, microesferas biodegradables, monofosforil A y Quil A.

La frecuencia preferida de administración y la dosificación eficaz variarán de una especie y de un sujeto a otro. Por ejemplo, la cantidad de preparación de micobacterias muertas por liofilización prolongada o fracción o fracciones de las mismas, está en intervalos de dosis que son equivalentes en ratones a aproximadamente de 1 \mug a 10.000 \mug de material (aproximadamente entre 10^{6} y 10^{10} UFC); preferiblemente de 10 \mug a 1.000 \mug; más preferiblemente de 10 \mug y 100 \mug. Las dosis pueden ser mayores o menores, dependiendo de la superficie corporal de la especie o los sujetos y la frecuencia de administración. Por ejemplo, la administración de una o dos dosis una vez cada dos meses puede ser más eficiente en el tratamiento del asma.

La invención también se refiere a productos que contienen una preparación bacteriana de acuerdo con la invención o fracciones de la misma y un producto seleccionado del grupo consistente en fármacos antineoplásicos, antidiabetes e inmunomoduladores, como un preparado combinado para su uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune.

Preferiblemente, dichos productos se eligen de fármacos antihistamínicos y anti-inflamatorios.

La invención también se refiere al uso de una preparación bacteriana de acuerdo con la invención o fracciones de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento del asma, que va a ser administrado por vía oral, sublingual, parenteral o intranasal, en un intervalo de dosis que es equivalente en ratones a de 1 \mug a 10.000 \mug, preferiblemente de 10 \mug a 1.000 \mug, más preferiblemente de 10 \mug a 100 \mug, a intervalos de dos meses, empezando desde al menos dos semanas antes del periodo usual de exposición al alérgeno.

La invención también se refiere al uso de una preparación bacteriana de acuerdo con la invención o fracciones de la misma para la preparación de un medicamento para la prevención de asma en bebé humano, que va a administrarse por vía oral, sublingual, parenteral o intranasal, en un intervalo de dosis que es equivalente en ratones a de 1 \mug a 10.000 \mug, preferiblemente de 10 \mug a 1.000 \mug, más preferiblemente de 10 \mug a 100 \mug.

La presente invención también se refiere a un método para la preparación de dicha preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada, caracterizada porque comprende al menos los pasos de:

(i) recolectar un cultivo de células bacterianas vivas,

(ii) lavar las células bacterias en agua o en una sal acuosa, tal como borato,

(iii) congelar las células bacterianas en agua o en una sal acuosa, tal como borato,

(iv) matar las células bacterianas congeladas mediante su secado en un liofilizador, durante un tiempo suficiente para retirar al menos el 98,5% del agua, preferiblemente al menos el 99% y más preferiblemente al menos el 99,5%, y

(v) recoger las células bacterianas muertas por liofilización prolongada.

\vskip1.000000\baselineskip

Un método alternativo para la preparación de dicha preparación de bacterias muertas por liofilización prolongada, comprende los pasos (i), (iii), (iv) y (v); se omite el lavado de células bacterias en el paso (ii).

Preferiblemente, el paso (iv) se realiza a una presión de cámara de secado de aproximadamente entre 0,02 mbar y 0,2 mbar; más preferiblemente entre 0,06 y 0,1 mbar, durante al menos entre 10 y 12 horas, con el fin de retirar al menos el 98,5% de la agua, mientras que se previene la fusión de las bacterias congeladas y se mantienen las bacterias muertas secas por debajo de la temperatura de desnaturalización de las moléculas de células bacterianas.

De acuerdo con una realización ventajosa de dicho método, éste consiste en la preparación de micobacterias muertas por liofilización prolongada.

La presente invención también se refiere al uso de dicha preparación de células bacterianas muertas o fracción o fracciones de la misma para la preparación de un medicamento para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades que comprenden una mala regulación inmune, tal como un desequilibrio Th1-Th2, por ejemplo, cánceres, enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple, diabetes mellitus y enfermedad de Crohn, trastornos alérgicos, tales como asma, rinitis alérgica o dermatitis atópica.

De acuerdo con dicho uso, dicha preparación de bacterias muertas o fracción o fracciones de las mismas se asocian con un transportador farmacéuticamente aceptable, y/o un inmunoestimulante, y/o un adyuvante y/o cualesquiera aditivos convencionales como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con una realización ventajosa de la invención se usan micobacterias, preferiblemente Mycobacteria bovis, o más preferiblemente Mycobacteria bovis BCG.

De acuerdo con otra realización ventajosa de la invención, se usan bacterias muertas por liofilización prolongada obtenibles por un proceso de liofilización prolongada.

Las preparaciones de bacterias muertas de acuerdo con la invención tienen las siguientes ventajas:

- Protegen a los sujetos frente a enfermedades que comprenden una mala regulación inmune, tales como un desequilibrio Th1-Th2, por ejemplo, asma por ejemplo,

- No son infecciosas y se pueden administrar a sujetos inmunodeficientes,

- No conducen a efectos adversos inflamatorios, probablemente debido, en particular, al hecho de que no inducen la producción de TNF-\alpha, que puede conducir a toxicidad y actividad necrotizante. Además, no producen otros efectos secundarios incluyendo anemia y trombopenia,

- Pueden usarse sin inducción de hipersensibilidad de tipo retardado a derivados de proteína purificada (PPD) de BCG y así pues no interfiere con el diagnóstico de la tuberculosis,

- Y se preparan por un método que preserva la estructura de las moléculas de las células bacterianas (sin desnaturalización exhaustiva de las moléculas), y permite así pues la identificación de las moléculas inmunomoduladoras de dichas preparaciones de bacterias muertas.

\vskip1.000000\baselineskip

La presente invención también se refiere a un kit para su uso en el tratamiento de una enfermedad que comprende una mala regulación inmune, caracterizada porque comprende al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, medios de administración de dicha composición farmacéutica y/o medios para asegurar la conformidad con el tratamiento prescrito.

La presente invención ilustrará además mediante la descripción y las figuras adicionales a continuación, que se refieren a ejemplos que ilustran el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada en asma en ratones, el análisis de la respuesta inmune inducida por BCG muertas por liofilización prolongada, BCG muertas por calor y BCG vivas, o de la producción de BCG muertas por liofilización prolongada, y fracciones de las mismas.

- La figura 1 ilustra el método convencional de preparación de vacuna de BCG viva liofilizada (A) en comparación con el método de preparación de BCG muertas por liofilización prolongada de acuerdo con la presente invención (B): la presión en mbar (-\Delta-) y la temperatura en grados Celsius de las muestras (-\medcirc-) o de las bandejas (-\medbullet-) se indican sobre el tiempo en horas.

- La figura 2 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) en hiperreactividad broncopulmonar en un modelo de asma de ratones BP2 particularmente riguroso (Th2 alto) como se ensayó por reducción en ventilación. La cepa BP2 de ratón es altamente sensible a lo largo del eje Th2/asma. Los ratones también se sensibilizan con OVA (ovoalbúmina) en combinación con alumbre, del que se sabe que es un estimulante de Th2. En comparación, en este modelo de ratones riguroso, no se observa efecto significativo en los grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Se presenta el área bajo la curva (cm^{2}): individual (-\medcirc-), media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- La figura 3 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) en hiperreactividad broncopulmonar en modelo de asma de ratones BP2 usando OVA como alérgeno, como se ensayó mediante resistencia broncopulmonar. En comparación, no se observó efecto significativo en los grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Se presenta la mejora de pausa (Penh), medida a intervalos de 1 minuto: datos individuales (-\medcirc-), media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-). *** Efecto protector estadísticamente significativo (p<0,001) en hiperreactividad broncopulmonar en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 4 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) frente al aumento de eosinófilos en los pulmones, en el modelo de asma de los ratones BP2, como se evaluó por numeración celular de la lavados broncoalveolares (BAL). Por comparación no se observó efecto significativo en los grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Se presentan los datos individuales (-\medcirc-) y la media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- La figura 5 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) frente al aumento de neutrófilos en los pulmones, en el modelo de asma de ratones BP2, como se evaluó por numeración celular de los lavados broncoalveolares. Por comparación, no se observó efecto significativo en los ratones tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Se presentan los datos individuales (-\medcirc-) y la media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-). ** Reducción estadísticamente significativa del número de neutrófilos (p<0,01) en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 6 ilustra la ausencia ventajosa de inflamación pulmonar o daño tisular, con BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) en el modelo de asma de ratones BP2, como se ensayó por nivel muy bajo de fibronectina en lavados broncoalveolares. En comparación, se observa un nivel de fibronectina significativamente más alto en el BAL en los grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Los datos se expresan en UI/ml; los datos individuales (-\medcirc-), media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-). *** Reducción estadísticamente significativa del nivel de fibronectina (p<0,001) en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 7 ilustra el nivel de IL-5 en lavados broncoalveolares de grupos de ratones que se han tratado con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof), o no tratadas. Los datos se expresan en pg/ml; datos individuales (-\medcirc-), media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- La figura 8 ilustra el nivel de IL-5 en el suero de grupos de ratones que se han tratado con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof), o no tratadas. Los datos se expresan en pg/ml; los datos individuales (-\medcirc-), media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- La figura 9 ilustra el nivel de IFN-\gamma (pg/ml) en cultivos de pulmón de grupos de ratones que se han tratado con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof), o no tratadas, los cultivos se han estimulado in vitro con proteína secretada BCG purificada (A) o con anticuerpos anti-CD3 (B). Se presentan los datos individuales (-\medcirc-) y media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- La figura 10 ilustra el nivel de IgE especifica de OVA en el suero de ratones que se ha tratado en un protocolo curativo con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof) o no tratadas. Se presentan los datos individuales (-\medcirc-) y la media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-).

- Las figuras 11A y 12A ilustran la producción de IL-12 (p70 y p40) por macrófagos alveolares de respectivamente ratones BP2 y ratones BALB/c inmunizados con OVA, que se han estimulado in vitro por o bien BCG muertas por calor (calentadas) (-\blacklozenge-), o bien BCG muertas por liofilización prolongada (liofilizadas) (....\blacksquare....). Los datos se expresan en pg/ml por 100.000 células.

- Las figuras 11B (BP2) y 12B (BALB/c) ilustran la ausencia de producción de TNF-\alpha en los macrófagos de ratones estimulados mediante muertas por liofilización prolongada (liofilizadas) comparado con el nivel significativo de TNF-\alpha producido en los macrófagos de ratones estimulados por BCG muertas por calor (calentadas). Los datos se expresan en ng/ml por 100.000 células.

- La figura 13 ilustra la ausencia de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a derivados de proteínas purificadas de BCG (PPD) en ratones que se han tratado con BCG muertas por liofilización prolongada (BCG muertas por liof). En comparación se observa DTH en ratones que se han tratado o bien con BCG vivas o bien con BCG muertas por calor. Se presentan datos individuales (-\medcirc-) y media \pm ETM por grupo de ratones (-\medbullet-). *** Ausencia estadísticamente significativa de hinchazón de la almohadilla plantar (p<0,001) en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 14 ilustra el efecto protector de las BCG muertas por liofilización prolongada (EFD-BCG) en hiperreactividad broncopulmonar a histamina en un modelo de asma de cobaya. Los grupos de animales inmunizados con OVA se trataron con 10 \mug (figura 14B) o 100 \mug (figura 14C), de BCG muertas por liofilización prolongada, o no se trataron (figura 14A). Se presenta la concentración de histamina capaz de crear broncoconstricción antes (símbolos negros) y después (símbolos blancos) de la administración en aerosol de OVA para cada animal. *** Efecto protector estadísticamente significativo en el grupo tratado con 10 \mug (p<0,01) o 100 \mug (p<0,001) de BCG muertas por liofilización prolongada (ensayo no paramétrico de Kruskal-Wallis).

- La figura 15A ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) frente al aumento de eosinófilos en los pulmones, en el modelo de asma de ratones BP2, como se evaluó por numeración celular de los lavados broncoalveolares. Por comparación, no se observa efecto significativo en los grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por calor. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones; n = 7 para cada grupo. *Reducción estadísticamente significativa del número de eosinófilos (p<0,05) en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 15B ilustra el nivel de IL-5 en lavados broncoalveolares de grupos de ratones que se han tratado con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1), o no se han tratado. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones, n = 7 para cada grupo.

- La figura 16 ilustra la preservación de la estructura de las proteínas en las preparaciones de BCG muertas por liofilización prolongada como se evaluó por SDS-PAGE y (A) tinción con anticuerpos antimicobacterias después de la transferencia a membranas PVDF o (B) tinción con Aurodye. Las proteínas aparecen como bandas separadas sin mancha.

- La figura 17 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) en hiperreactividad broncopulmonar en el modelo de asma de ratones BP2 usando un extracto de polen de ray-grass soluble como alérgeno, como se ensayó mediante hiperreactividad broncopulmonar. Se presenta la mejora de pausa (Penh) medida entre 3 y 8 minutos después de la administración de metacolina: los datos se presentan como media \pm ETM por grupo de ratones, n = 8 para cada grupo. **El efecto protector estadísticamente significativo (p<0,01) en hiperreactividad broncoopulmonar en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 18A y B ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) frente al aumento de polimorfonucleares y eosinófilos en los pulmones, en el modelo de asma de ratones BP2, como se ensayó mediante numeración celular de los lavados broncoalveolares. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones. Reducción estadísticamente significativa del número de polimorfonucleares (** p <0,01) en los grupos tratados con 1 mg y 10 mg de BCG muertas por liofilización prolongada; reducción estadísticamente significativa del número de eosinófilos: **p <0,01, *p <0,05 y *p <0,05 en los grupos tratados con respectivamente 100 \mug, 1 mg y 10 mg de BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 18C figura ilustra la correlación entre la disminución del número de polimorfonucleares y eosinófilos en los pulmones de los grupos tratados con BCG con liofilización prolongada (EFD1) (10 \mug, 100 \mug, 1 mg y 10 mg), y la disminución de la producción de IL-4 como se evaluó mediante análisis de células y citoquinas en los lavados broncoalveolares. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones. Reducción estadísticamente significativa del nivel de IL-4 (** p <0,01) en los grupos tratados con 10 \mug, 100 \mug, 1 mg y 10 mg de BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 19 ilustra la prevención de infiltración de leucocitos en los pulmones en los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1), en el modelo de asma de ratones BP2, como se ensayó mediante numeración de infiltrado celular en pulmones. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones, n = 5 para cada grupo. Reducción estadísticamente significativa del número de células (** p <0,001) en los grupos tratados con 10 \mug de BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 20 ilustra la prevención de infiltración de leucocitos en los pulmones en los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada (EFD), en el modelo asma de los ratones BP2, como se ensayó por análisis de citometría de flujo de los macrófagos (CD11b+), las células polimorfonucleares (Gr1+) y las células dendríticas (CD11c+). Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones, n = 5 para cada grupo. Reducción estadísticamente significativa del número de: (i) macrófagos y células dendríticas en todos los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada (10 \mug a 100 \mug, 1 mg y 10 mg), y (ii) polimorfonucleares solamente en los grupos tratados con 100 \mug, 1 mg y 10 mg de BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 21 ilustra el nivel de IFN-\gamma e IL-10 (pg/pulmón) en cultivos de pulmón de grupos de ratones que se han tratado con BCG vivas, BCG muertas por calor, BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) o no tratadas y expuestas a OVA o no, se han estimulado los cultivos in vitro con proteína secretada purificada de BCG. Los datos se expresan como media \pm ETM por grupo de ratones; n = 4 para cada grupo. Aumento estadísticamente significativo de producción de IL-10 (*** p <0,001) solamente en los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada.

- La figura 22 ilustra la ausencia de anemia (A) y trombopenia (B) después de la administración intravenosa de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD-BCG), al contrario que la administración de BCG vivas o BCG muertas por calor por la misma vía.

- La figura 23 ilustra la reacción inflamatoria mínima en el sitio de inyección después de la inyección subcutánea de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1), en comparación con BCG vivas y BCG muertas por calor, como se evaluó por medición del aumento de almohadilla plantar cada semana durante 10 semanas después de la inyección. La flecha indica el día de la inyección; D0 y D36 para EFD y BCG muertas por calor, D0 solamente para BCG vivas.

- La figura 24 ilustra la producción reducida de TNF-\alpha después de estimulación por lipopolisacáridos de explantes de pulmón 18 días después de la inyección intravenosa de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1), en comparación con la inyección de BCG vivas y BCG muertas por calor por la misma vía. Sin producción significativa de TNF-\alpha (*** p <0,001) en el grupo de BCG muertas por liofilización prolongada comparado con el grupo no tratado. En comparación se observa producción significativa de TNF-\alpha en los grupos tratados con BCG vivas y BCG muertas por calor.

- La figura 25 ilustra el aumento del número de células dendríticas plasmocitoides CD11c+ Gr1+ B220+ en el bazo de ratones BALB/c inmunizados 90 días antes con ovoalbúmina, tratados o no con BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) a los días 45 y 65 y expuestas o no a ovoalbúmina. ***Aumento estadísticamente significativo del número de células CD11c+ Gr1+ B220+ (p <0,001) en el grupo tratado, sin aumento del número de células CD11c+ CD8\alpha+ en el grupo tratado.

- La figura 26 ilustra el aumento del número de células CD4+ CD25+ IL-10+ en el bazo de ratones BALB/c inmunizados 90 días antes con ovoalbúmina, tratados o no con BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) a los días 45 y 65 y expuestos o no a ovoalbúmina; las células del bazo se estimularon in vitro con el sobrenadante del cultivo de BCG u OVA o no se estimularon antes del análisis de las poblaciones de leucocitos. ***Aumento estadísticamente significativo del número de células de CD4+ CD25+ IL-10+ (p <0,001) en los grupos tratados.

\newpage

- La figura 27 ilustra el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1) administradas por vía oral, en el modelo de asma de ratón, como se ha evaluado por numeración de infiltrado celular en pulmones. ***Disminución estadísticamente significativa del número de células en pulmones en los grupos tratados (p <0,001).

- La figura 28 ilustra el efecto protector de una dosis de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD) inyectada por vía subcutánea, como se ha evaluado por la prevención de hiperreactividad broncopulmonar en el modelo de asma BALB/c.

- La figura 29 ilustra el retardo de la acción de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD) inyectadas por vía subcutánea, como se ha evaluado mediante la prevención de hiperreactividad broncopulmonar en el modelo de asma BP2. La prevención de hiperreactividad broncopulmonar solamente sucede si está presente un retardo de dos a tres semanas entre la administración de BCG muertas por liofilización prolongada y la exposición.

- La figura 30 ilustra la duración de la acción de las BCG muertas por liofilización prolongada (EFD1), inyectadas por vía subcutánea, como se ha evaluado por la prevención de hiperreactividad broncopulmonar en el modelo de asma BP2; el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada persiste al menos durante dos meses.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Preparación de micobacterias muertas por liofilización prolongada 1) Material y métodos

Las células Mycobacterium bovis BCG (cepa 1173P2 de vacuna pasteur BCG, depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15 (Francia), en el 24 de abril de 1978, con el Nº I-059 (M. Gheorghiu y col., 1983, Bull. Inst. Pasteur ,81,281-288) se cultivan en medio Sauton estéril (HOOCCH(NH_{2}O)CH_{2}CONH_{2}H_{2}O (asparagina), 4 g/l; C_{6}H_{8}O_{7}; H_{2}O (ácido cítrico), 2 g/l; K_{2}HPO_{4} (hidrogenofosfato de dipotasio), 0,5 g/l; MgSO_{4}-H_{2}O (sulfato de magnesio), 0,50 g/l; citrato de FeIII, 0,05 g/l; glicerol, 60 ml; solución de sulfato de zinc (0,155 g de sulfato de zinc en 10 ml de agua libre de pirógenos), 240 \mul/l, pH 7). De forma más precisa, la cepa 1173 P2 se deja crecer en un matraz de cultivo esférico de 250 ml que contiene 130 ml de medio Sauton estéril, a 37ºC, durante 14 días, que corresponde al tiempo en que el cultivo finaliza su fase
exponencial.

El cultivo se centrifuga después a 2.000 g durante 10 minutos, a 4ºC para sedimentar las células BCG. El sobrenadante del cultivo celular se descarta y el sedimento se lava exhaustivamente (tres veces) en agua destilada, cada lavado consiste en resuspender dicho sedimento en agua destilada (20 volúmenes de agua por volumen de sedimento celular) y centrifugar las células a 2.000 g durante 10 minutos, a 4ºC.

Después del último lavado, el sedimento se resuspende en un volumen de agua destilada equivalente o dos veces el volumen del sedimento. Se estratifican 20 g de bacterias en 50 ml de agua y se congelan en muro de botellas, con el fin de formar una capa de aproximadamente 1 cm de grosor. La mezcla se congela a -60ºC.

La suspensión congelada de células en agua se liofiliza después de forma prolongada en las condiciones del protocolo de liofilización prolongada descritas en la figura 1B, para retirar esencialmente todo el agua (agua residual <1,5%). Brevemente, la presión disminuye rápidamente hasta 0,150 mbar, siendo la temperatura del condensador de hielo aproximadamente -50ºC a -54ºC, y comienza el proceso de liofilización. Las muestras se mantienen congeladas, sin que la temperatura se controle de forma exacta. La presión se mantiene después a 0,1 mbar durante 34 h, con el fin de eliminar esencialmente todo el agua (agua residual <1,5%). Existe un aumento progresivo hasta la temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC). Al final del secado, la presión vuelve después lentamente a la presión atmosférica con aire, a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC) y las células BCG muertas por liofilización prolongada (aproximadamente 2 g) se recolectan y se almacenan a temperatura ambiente, con presión atmosférica
del aire.

El agua residual presente en la preparación de BCG muertas por liofilización prolongada se determina usando el método de culombimetría de Karl Fisher y un Culombímetro de 756 KF (METHKOM), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La presencia de células viables en la preparación muerta por liofilización prolongada se verifica mediante:

- La determinación del número de unidades de formación de colonias (UFC) por ml; 0,2 ml de una suspensión de la preparación muerta por liofilización prolongada (1 mg, por ejemplo, aproximadamente 10^{9} células BCG muertas por liofilización prolongada en agua) se siembran en placas en medio agar Middlebrook 7H10 (DIFCO), y se incuban las placas a 37ºC durante un mes, y/o

- La tinción con colorante fluorescente CFDA-SE (diacetato de carboxifluorescina-Succimidil Ester; referencia de MOLECULAR PROBES C-1157) que tiñe solamente células viables; 1 ml de una suspensión de la preparación muerta por liofilización prolongada (aproximadamente 10^{8} células BCG muertas por liofilización prolongada en agua) se mezcla con 100 \mul de una dilución 1/100 en PBS de reactivo CFDA (solución madre: 1 mg/ml en DMSO). La mezcla se incuba en oscuridad a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las bacterias marcadas se centrifugan a 3.000 rpm durante 15 minutos, se lavan dos veces en PBS y se resuspenden en el mismo tampón. Después, la presencia de células viables se examina mediante microscopía de fluorescencia.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados

Las células BCG se mataron por liofilización prolongada siguiendo el protocolo de liofilización prolongada descrito en material y métodos y se resume en la Figura 1B. En comparación, las células BCG se liofilizaron siguiendo el método convencional de preparación de vacuna de BCG vivas: las células BCG (cepa 1173P2) se cultivaron en medio Sauton a 37ºC, se recolectaron al final de la fase exponencial mediante centrifugación y el sedimento celular de BCG se resuspendió en glutamato de sodio (1,5 g/100 ml H_{2}O), a la concentración de 4 mg/ml de BCG. La suspensión de BCG se distribuyó en viales (0,25 ml/vial), se liofilizó de acuerdo con el protocolo ilustrado en la Figura 1A y cada vial que contenía 1,5 \pm 0,5% de H_{2}O se almacenó a temperatura ambiente en vacío (0,06 mbar).

Se ensayó la viabilidad de las células BCG en las diferentes preparaciones como se describe en material y
métodos.

Los siguientes resultados se observaron por el método de culombimetría de Karl Fisher, el ensayo de cultivo y mediante el ensayo de tinción con CFDA-SE:

- 200 mg de preparación de BCG muertas por liofilización prolongada contenían 1,073 mg de agua en una determinación representativa, lo que es equivalente a menos de 0,5% de agua residual.

- no se detectaron bacterias vivas en las muestras de BCG muertas por liofilización prolongada preparadas de acuerdo con el método de la invención,

- se detectaron del 50 al 60% de bacterias vivas en la preparación de BCG muertas por liofilización de acuerdo con el método de preparación de la vacuna BCG convencional.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Preparación de fracciones de micobacterias muertas por liofilización prolongada 1) Fracción deslipidada (fracción A) (ejemplo de referencia)

10 mg/ml de aproximadamente 10^{10} células BCG muertas por liofilización prolongada, suspendidas en tampón borato (Na_{2}B_{4}O_{7} 10H_{2}O 0,363%; H_{3}BO_{3} 0,525%, NaCl 0,619% y Tween 20 0,0005% en agua destilada, pH 8), se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de cloroformo/metanol (9/1) durante 24 horas a temperatura ambiente para extraer lípidos. El cloroformo/metanol se retiró por centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos. El sedimento deslipidado de la extracción de cloroformo/metanol se secó por vacío.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Fracción desglicosilada (fracción B)

10 mg/ml de aproximadamente 10^{10} células BCG muertas por liofilización prolongada, suspendidas en tampón borato (Na_{2}B_{4}O_{7} 10H_{2}O 0,363%; H_{3}BO_{3} 0,525%, NaCl 0,619% y Tween 20 0,0005% en agua destilada, pH 8), se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de acetato de sodio 0,1 M, durante 24 horas a 37ºC, que contenía 1 mg de lisozima para retirar el peptidoglicano. El producto de digestión se calentó durante 2 minutos a 96ºC y el sedimento se recolectó por centrifugación durante 1 hora a 12.000 g.

\vskip1.000000\baselineskip

3) Fracción tratada con DNasa y RNasa (fracción C)

10 mg/ml de aproximadamente 10^{10} células BCG muertas por liofilización prolongada, suspendidas en tampón borato, se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón Tris-HCl 40 mM que contenía 1 mg de DNasa y 1 mg de RNasa y MgCl_{2} 5 mM, durante 24 horas a 37ºC, para retirar los ácidos nucleicos. El producto de digestión se calentó durante 2 minutos a 96ºC y el sedimento se recolectó por centrifugación durante 1 hora a 12.000 g.

\newpage

4) Fracción tratada con proteasa (fracción D)

10 mg/ml de aproximadamente 10^{10} células BCG muertas por liofilización prolongada, suspendidas en tampón borato, se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón de acetato de amonio 0,1 M que contenía 0,1 mg de subtilisina, durante 23 h a 37ºC. Para retirar la proteína completamente, se añadió después 0,1 mg de subtilisina a la mezcla de reacción y se incubó durante 7 horas a 37ºC. El producto de digestión se calentó 2 minutos a 96ºC y el sedimento se recolectó mediante centrifugación durante una hora a 12.000 g.

\vskip1.000000\baselineskip

5) Tratamientos sucesivos (fracción E) (ejemplo de referencia)

10 mg/ml de aproximadamente 10^{10} células BCG muertas por liofilización prolongada se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en tampón borato y se trató sucesivamente con cloroformo/metanol (9/1), lisozima, mezcla de DNasa-RNasa y subtilisina, como se ha descrito anteriormente. El producto de digestión se calentó 2 minutos a 96ºC y el sedimento se recolectó por centrifugación durante 1 hora a 12.000 g.

\vskip1.000000\baselineskip

6) Caracterización del contenido de proteína y polisacárido de la preparación de BCG muertas por liofilización prolongada a) Material y Métodos

Una preparación de la preparación de BCG muertas por liofilización prolongada (10 mg) se suspendió en 1 ml de butanol 4% en agua y se distribuyó en dos tubos eppendorf (500 \mul por tubo) que contenían 1 mg de perlas de zirconio/sílice (0,1 mm) (BIOSPEC PRODUCTS, INC.). Los tubos se colocaron después en un molino mezclador (MM301, RESCH) a un frecuencia de 25 durante 5, 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 ó 470 minutos. Los tubos se centrifugaron después a 10000 rpm durante 30 minutos; se recuperó el sobrenadante, se filtró (filtro de 0,22 \mum, MILLIPORE) y las concentraciones de proteína, aminoácidos y polisacáridos se determinó como sigue:

- la concentración total de proteína se determinó usando el Kit Reactivo de Proteínas Micro BCA (PEERCE),

- la determinación y del análisis de la concentración de aminoácidos se determinó por espectrometría de masas,

- la concentración total de polisacáridos se determinó usando el método de la antrona, de acuerdo con S. Melvin, Anal. Biochem. 1953, 25, 1656-,

\vskip1.000000\baselineskip

Las alícuotas (5 \mug de proteínas) de los extractos de bacterias recogidos a 5, 60 ó 300 minutos se separaron mediante SDS-PAGE, la proteína se transfirió después a una membrana de PVDF y se tiñó con Aurodye® (Pharmacia) o con anticuerpos policlonales dirigidos a proteínas micobacterianas.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Resultados

Los extractos de bacterias recogidos después de 5, 60 ó 300 minutos de la extracción contienen respectivamente 280, 500 y 1258 \mug de proteínas; 190, 420 y 880 \mug de aminoácidos y 697, 1267 y 1765 \mug de polisacáridos.

Los resultados presentados en la figura 16 muestran que el proceso de liofilización prolongada preserva la estructura de las proteínas que están presentes en las preparaciones de BCG muertas como se indica por la presencia de bandas de proteínas separadas sin mancha; el perfil proteínico observado con los extractos de la preparación de BCG muertas por liofilización prolongada es comparable al obtenido con preparaciones de BCG vivas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Efecto protector de las micobacterias muertas por liofilización prolongada en el asma en un modelo de ratón 1) Material y Métodos a) Animales

Los ratones adultos (de 6 a 7 semanas de edad) macho de BP2 (H-2^{q}) se obtuvieron del Centre d'elevage R. Janvier (Le Genest, Saint Isle, Francia) y se mantuvieron en instalaciones animales en condiciones libres de patógenos específicas.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Modelo de ratón de la enfermedad específica de alérgeno tipo asma

Los ratones adultos macho BP2 se inmunizaron por la vía subcutánea (en la parte dorsal del cuello) con 1 \mug de ovoalbúmina (OVA; ICN Laboratories) y 1,6 mg de hidróxido de aluminio adyuvante en solución salina (volumen final de 0,4 ml), a los días 0 (Do) y 7 (D_{7}). La respuesta alérgica se provoca por exposición intranasal de 10 \mug de OVA en 50 \mul de solución salina a los días 96-98. Como alternativa, se usa un extracto de polen de ray-grass soluble en agua como alérgeno, en las mismas condiciones que para OVA excepto que se usan 10 \mug para inmunización.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Preparación de la composición inmunomoduladora micobacteriana

Las BCG muertas por liofilización prolongada, preparadas como se describe en el ejemplo 1 se ensayaron como una vacuna para el asma en el ratón BP2, en comparación con las siguientes preparaciones BCG:

\vskip1.000000\baselineskip

- BCG vivas

La cepa 1173P2 de vacuna Pasteur de Mycobacterium bovis BCG se cultivó como bacilos dispersos en medio Beck-Proskauer (Gheorghiu y col., 1988, J. Biol. Standard., 16, 15-26)) suplementado con Tritón WR 1339 al 0,05% (SIGMA) y glucosa la 6%. Las bacterias se recolectaron en la fase exponencial (de 5 a 7 días) y se almacenaron a
-70ºC en medio Beck-Proskauer suplementado con Tritón al 0,05% y glicerol al 6%. El número de unidades formadoras de colonia (UFC) por ml se determinó mediante la colocación en placas de diluciones adecuadas en tampón salino fosfato (PBS) en medio agar Middlebrook 7H10 (DIFCO). La suspensión se diluyó a la concentración de 10^{8}, 10^{9} ó 10^{10} UFC/ml en PBS justo antes de su inyección (100 \mul).

\vskip1.000000\baselineskip

BCG muertas por calor

Las BCG vivas preparadas como se describe anteriormente se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en solución salina, por ejemplo en un tampón que contiene borato (Na_{2}B_{4}O_{7} 10H_{2}O 0,363%; H_{3}BO_{3} 0,525%, NaCl 0,619% y Tween 20 0,0005% en agua destilada, pH 8) y la suspensión se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 115ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

d) Protocolo curativo de la administración de micobacterias muertas por liofilización prolongada en el modelo de ratón del asma

Los ratones BP2 adulto macho se inmunizaron con OVA como se ha descrito anteriormente. Se inyectó a grupos de 25 ratones 100 \mul de las composiciones BCG preparadas como se ha descrito anteriormente.

- la cepa 1173P2 de vacuna de BCG vivas (10^{7} UFC)

- BCG muertas por calor (10^{8} bacterias muertas que son equivalentes a 10^{7} UFC)

- BCG muertas por liofilización prolongada (10 \mug a 10 mg; 10 \mug es equivalente a 10^{7} UFC), y

- PBS,

por la vía subcutánea (base de la cola) en D_{42}-_{45} y D_{67}-_{70} después de la primera inmunización con OVA.

La respuesta alérgica se provoca por exposición intranasal con 100 \mug de OVA en 50 \mul de solución salina en los días 96-98; el PBS solo se administra por vía intranasal para su comparación.

\vskip1.000000\baselineskip

e) Análisis bronco-pulmonar (HRB)

Se usó un equipamiento pletismográfico barométrico (BUXCO) que permite el estudio de HRB en animales no anestesiados. Los animales inmunizados con OVA, tratados con las diferentes preparaciones de BCG o no tratados se ensayaron 24 horas después de la exposición a OVA o extracto de polen ray-grass soluble en agua. Los animales se colocaron en una cámara pletismográfica. Sus parámetros de ventilación basal se registraron y durante 20 segundos o 1 minuto recibieron inhalación de metacolina (ALDRICH), 100 mM en H_{2}O mediante el uso de un nebulizador convencional, y sus parámetros de ventilación se registraron durante 10 minutos después de la administración en aerosol de metacolina. Se presenta la reducción de la ventilación durante el periodo (área bajo la curva) y se expresó la resistencia bronco-pulmonar como mejora de pausa (Penh), calculada como: (tiempo espiratorio (tE)/40% de tiempo de relajación (trel) - 1) x flujo espiratorio máximo (PEG)/de flujo inspiratorio máximo (PIF) x 0,67, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada minuto se registró un valor medio de Penh. Para la representación gráfica, cada valor se expresó para cada minuto.

\vskip1.000000\baselineskip

f) Lavado broncoalveolar (BAL)

Los ratones se anestesiaron por la vía intraperitoneal con una dosis letal de uretano (1,5 g/kg; SIGMA). La sangre circulante se retiró de la aorta abdominal y se colocó una cánula conectada a una jeringa en la tráquea, y se lavaron los pulmones tres veces con 0,7 ml de PBS y el lavado se recogió en un tubo y se mantuvo en hielo.

El número de células presentes en el BAL se determinó en un equipamiento de conteo automático (ZBI), proporcionado por COULTER. Para determinar los porcentajes de los diferentes tipos celulares (eosinófilos, neutrófilos, macrófagos), las células BAL que se habían centrifugado en portaobjetos de vidrio, se tiñeron con DIFF QUICK (BAXTER)

\vskip1.000000\baselineskip

g) Ensayo de fibronectina

Los BAL se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y la fibronectina presente en el sobrenadante se ensayó por ensayo Inmunométrico Enzimático Competitivo (EIA), siguiendo los protocolos convencionales (Rennard y col., Anal. Biochem., 1980, 205-214).

\vskip1.000000\baselineskip

h) Preparación y análisis de explantes pulmonares

Los pulmones se cortaron en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm por 3 mm. Cuatro o cinco trozos de cada pulmón se colocaron en un pocillo de placa de cultivo tisular que contenía 1 ml de medio de cultivo AIM V (LifeTechnologies). Los explantes pulmonares se cultivaron en medio solo para determinación del nivel basal; como alternativa el filtrado de cultivo de BCG (10 \mug/ml) se añadió al cultivo para revelar células específicas micobacterianas, o Se añadieron al cultivo anticuerpos monoclonales anti-CD3 para revelar la reactividad de linfocitos T. 24 horas después, se ensayó la presencia de diferentes linfoquinas (IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-10...) mediante ELISA usando kits comerciales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El pulmón completo (sin tráquea) se disoció en medio colagenasa y DNasa para enumerar las células infiltradas en una citómetro de flujo usando varios anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos.

\vskip1.000000\baselineskip

i) Análisis histopatológico de los pulmones

Los pulmones completos se fijaron en formaldehído tamponado y se procesaron para su análisis histopatológico. La tinción de Schiff se usó para teñir el mucus y las células que contenían mucus. La tinción de hematoxi-eosina se usó como colorante de contraste. Los porta-objetos se examinaron y se realizó una evaluación de infiltración celular y contenido de mucus por un observador que valoró el porta-objetos sin conocimiento del origen de la muestra (ensayo ciego).

\vskip1.000000\baselineskip

j) Ensayo de citoquinas

Las citoquinas que o bien están presentes en el suero y las muestras de BAL de los grupos de ratones inmunizados, o bien se secretan por los cultivos de explantes de pulmón de estos ratones, se ensayaron como sigue: se ensayaron IFN-\gamma, IL-10 e IL-12 mediante ELISA; se ensayaron TNF-\alpha e IL-5 por EIA (Ensayo Inmunométrico Enzimático).

\vskip1.000000\baselineskip

k) Ensayo de IgE específico de OVA

El nivel de IgE especifico de OVA presente en el suero se ensayó por ELISA; siguiendo los protocolos convencionales (Hansen y col., J. Immunol., 2000, 223-230).

\vskip1.000000\baselineskip

l) Análisis estadístico

El número (n) de animales por grupo era de 4 < n < 8. Se realizó el ensayo de (t) de Student de dos colas para eventos independientes.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados a) Análisis bronco-pulmonar (HRB)

Los animales inmunizados con OVA o un extracto de polen de ray-grass soluble en agua y tratados con las diferentes preparaciones de BGC, o no tratados, se ensayaron 24 horas después de la presentación con OVA o polen ray-grass.

El modelo elegido en estos estudios, que usan ratones BP2 con trasfondo de Th2 que se inmunizan con ovoalbúmina asociada a hidróxido de aluminio, un adyuvante más potente de la reacción alérgica que el adyuvante incompleto de Freund, es así pues más riguroso que el modelo de ratones BALB/c inmunizados con ovoalbúmina en adyuvante incompleto de Freund usado por CC Wand y col., citado anteriormente.

Los datos presentados en las Figuras 2 y 3 indican que en este modelo riguroso de asma, las BCG muertas por liofilización prolongada (10 \mug) tiene un efecto protector estadísticamente significativo (p < 0,001) en bronco-pulmonar, como se ha expresado por una reactividad menor a la metacolina comparada con controles no tratados. Por contraste, en este modelo riguroso de asma, no se observó efecto protector significativo en los animales tratados con BCG vivas (10^{7} UFC) o BCG muertas por calor (10^{8} bacterias muertas). Se observó un efecto protector estadísticamente similar (p < 0,01) en asma con la preparación de BCG muertas por liofilización prolongada (EFD), cuando se usa un extracto de polen de ray-grass soluble en agua como alérgeno (figura 17).

\vskip1.000000\baselineskip

b) Lavado broncoalveolar (BAL)

Se observó una disminución del número de eosinófilos (p < 0,05) y neutrófilos (p < 0,05) en los grupos de ratones tratados con 10 \mug, 100 \mug, 1 mg o 10 mg de BCG muertas por liofilización prologada (figuras 4, 5, 15A,
18A y 18B).

El nivel de fibronectina presente en líquido de exudación de las vías respiratorias que refleja la respuesta inflamatoria, muestra una disminución muy significativa (p < 0,001) en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada (10 \mug, figura 6).

Los ensayos con respecto a IL-5, un linfoquina implicada en el aumento del número de eosinófilos durante las respuestas alérgicas, muestran una disminución tanto en BAL como en la sangre, en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada (figuras 7, 8 y 15).

Los ensayos con respecto a IL-4, una citoquina Th2, muestran una disminución estadísticamente significativa en BAL de los grupos de ratones tratados con 10 \mug, 100 \mug, 1 mg o 10 mg de BCG muertas por liofilización prolongada (figura 18C).

Por comparación, no se observó efecto significativo en ratones tratados con BCG vivas (10^{7} UFC) o BCG muertas por calor (10^{8} bacterias muertas).

Estos resultados muestran que las BCG muertas por liofilización prolongada puede inducir una respuesta inmune capaz de tratar los síntomas del asma como se ha demostrado por la disminución de la respuesta inflamatoria del pulmón (producción de eosinófilos y neutrófilos, exudación de fibronectina). En este sistema riguroso de asma (ratones BP2) con trasfondo de Th2, no se observó protección en grupos tratados con BCG vivas o BCG muertas por
calor.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Análisis de la histopatología y de las células que se infiltran en los pulmones

El análisis histopatológico de los pulmones muestra que el tratamiento con BCG muertas por liofilización prolongada (EFD) previene la infiltración de leucocitos en los pulmones y metaplasia mucosa de los epitelios bronquiales.

Estos resultados se confirman por el análisis de citometría de flujo de las células presentes en los tejidos de pulmón que demuestra que el tratamiento con BCG muertas por liofilización prolongada induce una disminución estadísticamente significativa (p < 0,001) de la infiltración de leucocitos en los pulmones (figura 19); el análisis de las diferentes poblaciones de leucocitos (figura 20), muestra una disminución del número de macrófagos (CD11b^{+}), células polimorfonucleares (Gr1^{+}) y células dendríticas (CD11c^{+}) en los pulmones de los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada.

\vskip1.000000\baselineskip

d) Análisis de citoquina

Las biopsias pulmonares de los grupos de ratones que se han tratado con las diferentes preparaciones de BCG se cultivaron en presencia o en ausencia de proteínas no purificadas secretadas por BCG o Acm anti-CD3, y la producción de IFN-\gamma e IL-10 se ensayó en el sobrenadante.

Los resultados presentados en las figuras 9 y 21 indican que la producción de IFN-\gamma requiere una inmunización con BCG (figura 9A). El IFN-\gamma de nivel inferior observado en el grupo de BCG muertas por liofilización prolongada (figura 9A) no es estadísticamente significativo frente al nivel observado en los grupos inmunizados con otras BCG. La estimulación no específica de linfocitos T con anticuerpos anti-CD3 muestra niveles similares de IFN-\gamma en los diferentes grupos (tratados o no tratados con BCG) lo que sugiere que la inmunización con BCG no modifica el número de linfocitos T presentes en los pulmones (figura 9b).

Los resultados presentados en la figura 21 también muestran un nivel mayor estadísticamente significativo (p < 0,001) de IL-10 en los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada comparado con los grupos tratados con BCG vivas y BCG inactivadas por calor.

Las diferencias del perfil de expresión de citoquinas en los pulmones entre los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada y los grupos tratados con las otras preparaciones de BCG indican que la actividad de BCG muertas por liofilización prolongada se correlaciona con modificaciones en las poblaciones de leucocitos presentes en los tejidos pulmonares después de la suministración del alérgeno. La alta cantidad de IL-10 y la baja cantidad de IFN-\gamma liberadas por los explantes pulmonares podría afirmar la presencia de células reguladoras en tejidos pulmonares de los grupos con BCG muertas por liofilización prolongada, después de la suministración del alérgeno.

\vskip1.000000\baselineskip

e) Nivel de IgE específico anti-OVA

Habiendo realizado la inmunización con OVA antes del tratamiento con las diferentes preparaciones de BCG (protocolo curativo), el nivel de IgE anti-OVA es idéntico para todos los grupos (figura 10), lo que sugiere que el efecto protector observado con BCG muertas por liofilización prolongada no implica un efecto directo en la concentración de IgE.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Análisis de las citoquinas producidas por macrófagos alveolares estimulados por BCG muertas por calor o muertas por liofilización prolongada 1) Material y Métodos

Los ratones BP2 y de ratones BALB/c (H-2^{d}), obtenidos y mantenidos como se ha mencionado en el ejemplo 3, se inmunizaron con OVA como se ha descrito en el ejemplo 3b. Una semana después de la ultima inyección con OVA, los ratones se anestesiaron por la vía intraperitoneal con una dosis letal de uretano (1,5 g/kg; SIGMA). La sangre circulante se retiró de la aorta abdominal y se colocó una cánula conectada a una jeringa en la tráquea, y se lavaron los pulmones dos veces con 0,5 ml y 5 veces con 1 ml de medio HBSS (Life Technologies) que contiene 2% de suero de ternero fetal. El número de macrófagos presentes en el BAL se determinó en un equipamiento de conteo automático (ZBI), proporcionado por COULTER. Los macrófagos se centrifugaron a 1000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente y su concentración se ajustó a 340. 10^{3} células/ml en medio RPMI 1640 que contiene 3% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 10 \mug/ml de estreptomicina. Los macrófagos se distribuyeron después en una placa de 96 pocillos para cultivo tisular (100.000 células/pocillo) y se incubaron durante al menos 2 horas a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%. Después de la retirada de las células no adherentes mediante varios lavados con medio RPMI, se cultivaron los macrófagos en presencia de las BCG muertas por calor o BCG muertas por liofilización prolongada (5 UFC equivalentes por macrófago por ejemplo, 1,6 10^{6} UFC/ml para ambas preparaciones de BCG); lipopolisacárido de E. coli (LPS; 1 \mul/ml) y OVA (10 \mug/ml) se usaron como controles. El sobrenadante del cultivo celular se recolectó a 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas después de la adición de las diferentes preparaciones y se congeló inmediatamente a -20ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados

Los resultados presentados en las figuras 11 y 12 muestran que:

1) El IL-12 que está implicado en la maduración de las células Th1 y la producción de citoquinas antialérgicas (IFN-\gamma) se produce por macrófagos alveolares de ratones BALB/c y BP2 estimulados por preparaciones de BCG muertas por liofilización prologada y muertas por calor,

2) TNF-\alpha una citoquina que puede asociarse con efectos secundarios inflamatorios importantes (necrosis, ulceración ...) se produce sólo por macrófagos alveolares de ratones BALB/c y BP2 estimulados por preparaciones de BCG muertas por calor; no se produce TNF-\alpha por macrófagos alveolares estimulados mediante preparaciones de BCG muertas por liofilización prolongada a las concentraciones usadas en los presentes experimentos.

\vskip1.000000\baselineskip

Estos resultados apoyan los efectos adversos mínimos observados después de las inyecciones con BCG muertas por liofilización prolongada, al contrario que los efectos secundarios observados después de la inyección con BCG muertas por calor y vivas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 La administración de BCG muertas por liofilización prolongada no induce Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a derivados de proteínas purificadas de BCG (PPD) 1) Material y Métodos

Los ratones se inmunizaron con OVA y se trataron con diferentes preparaciones de BCG, o no se trataron, como se describe en el ejemplo 3d. 100 días después de la primera inyección subcutánea con las diferentes preparaciones de BCG, la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a derivados de proteínas purificadas de BCG (PPD) que se usa para el diagnóstico de tuberculosis en humanos se realizó en los diferentes grupos de ratones. Más precisamente, se inyectaron 50 \mul de PPD en solución salina (4 \mug) en la almohadilla plantar de los ratones y 24 horas después se midió la hinchazón de la almohadilla plantar.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados

Los resultados presentados en la Figura 13 muestran que los ratones inmunizados con BCG muertas por liofilización prolongada (equivalente a 10^{7} UFC o 10 \mug) no desarrollaron una hipersensibilidad tipo retardado a derivados de proteínas purificadas de BCG como se demuestra mediante un ensayo cutáneo negativo. Los ratones desarrollaron una pequeña sensibilización frente a PPD sólo después de la inyección de grandes dosis de BCG muertas por liofilización prolongada (1 mg y 10 mg). En comparación, los ratones inmunizados con BCG vivas o BCG muertas por calor, incluso a dosis bajas (10^{7} UFC de BCG vivas o equivalente a 10^{8} bacterias muertas para BCG inactivadas por calor) desarrollaron una hipersensibilidad de tipo retardado a derivados de proteínas purificadas de BCG como se demuestra por un ensayo cutáneo positivo. Estos resultados se correlacionan con los resultados precedentes (figuras 9 y 21) que muestran una pequeña producción de IFN-\gamma bajo estimulación específica, en los grupos tratados con BCG muertas por liofilización prolongada, al contrario que los grupos tratados con otras preparaciones de BCG que muestran producción de mayor nivel de IFN-\gamma bajo estimulación específica. De forma similar, la reactividad de las cobayas a PPD es marginal después del tratamiento con BCG muertas por liofilización prolongada.

Estos resultados indican que después de la inmunización con BCG muertas por liofilización prolongada, un subtipo particular de linfocitos T específicos se selecciona o como alternativa se inmovilizan células T específicas en algunos tejidos particulares. Por consiguiente, a diferencia de la inmunización con BCG vivas o BCG muertas por calor, la inmunización con BCG muertas por liofilización prolongada no interfiere con el diagnóstico de la tuberculosis por el ensayo cutáneo DTH.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Efecto protector de micobacterias muertas por liofilización prolongada (EFD) en asma en un modelo de cobaya 1) Material y métodos

Las cobayas adultas macho (350 g) se inmunizaron por la vía subcutánea con 10 \mug de ovoalbúmina (OVA; ICN Laboratories) y 1 mg de alumbre en solución salina (0,4 ml volumen final).

Tres semanas después, a dichas cobayas (3 grupos de 10 animales) se les inyectó por vía intradérmica BCG muertas por liofilización prolongada (equivalente a 10^{7} o 10^{8} UFC es decir 10 \mug o 100 \mug), o PBS (control).

La reactividad bronco-pulmonar se ensayó en cobayas con un método diferente al usado para ratones. La sensibilidad de cada animal se evaluó con dosis crecientes de histamina en forma de aerosol (20, 50, 100 o 400 \mug), 24 horas antes de la presentación del alérgeno, y la concentración mayor de histamina que daba valores de Penh elevados se consideró que era el nivel basal de sensibilidad a histamina.

Se realizó una medida similar 24 horas después de la presentación del alérgeno; las cobayas inmunizadas con OVA desarrollaron una mayor sensibilidad a histamina, se necesita por tanto menos histamina para obtener los mismos valores de Penh que antes de la exposición.

De forma más precisa:

Seis cobayas de cada grupo se han ensayado con respecto a su reactividad bronco-pulmonar con un ensayo de histamina realizado de 7 a 10 semanas después de la inyección de BCG o producto control (por ejemplo entre 10 y 13 semanas después de la inmunización con ovoalbúmina).

La dosificación de histamina que desencadena una broncoconstricción clara se mide, para cada cobaya, con un pletismógrafo barométrico.

Cada cobaya es su propio control, sabiendo que la reactividad basal se determina el primer día del ensayo.

24 horas después, se administra un aerosol de ovoalbúmina. El 3^{er} se mide la reactividad de histamina de nuevo.

La administración de ovoalbúmina aumenta la hiperreactividad bronco-pulmonar a histamina.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados

Los resultados presentados en la Figura 14 muestran que 5/6 y 6/6 de las cobayas que se han tratado respectivamente con 10 \mug (equivalente a 10^{7} UFC) (figura 14B) o 100 \mug (equivalente a 10^{8} UFC) (figura 14C) de BCG muertas por liofilización prolongada de acuerdo con la invención, están protegidas frente a hiperreactividad bronco-pulmonar (no hay aumento de la sensibilización a histamina) mientras que en el grupo control (figura 14A) (sin tratamiento con BCG) existe un aumento significativo de reactividad bronco-pulmonar a histamina (x4).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Efectos secundarios mínimos de las BCG muertas por liofilización prolongada a) Sin anemia y sin trombopenia

A los ratones se les inyectó por vía intravenosa BCG muertas por liofilización prolongada (10 \mug) o las diferentes preparaciones de BCG como se describe en el ejemplo 3d, o no se trataron. 18 días después de la inyección, se determinaron los números de glóbulos rojos y plaquetas de una muestra de sangre.

Los resultados presentados en la figura 22 muestran que, al contrario que los grupos tratados con BCG vivas y BCG muertas por calor, no se observó anemia ni trombopenia en el grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Reacción inflamatoria mínima en el sitio de inyección

En el día 0, las diferentes preparaciones de BCG, como se ha descrito en el ejemplo 3d, se inyectaron por vía subcutánea (en el área de la almohadilla plantar) a grupos de ratones. Las BCG vivas se inyectaron solamente una vez y las BCG muertas por calor y muertas por liofilización prolongada se inyectaron dos veces (día 0 y día 36). El aumento de la almohadilla plantar se midió después cada semana durante 10 semanas.

Los resultados presentados en la Figura 23 muestran que las BCG muertas por liofilización prolongada muestran efectos secundarios inflamatorios mínimos.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Producción de TNF-\alpha reducida después de la estimulación por LPS

Los explantes pulmonares de ratones tratados 18 días antes con las diferentes preparaciones de BCG como se describe anteriormente, se mantuvieron in vitro en presencia o no de LPS, y la producción de TNF-\alpha se midió por ELISA usando kits comerciales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados presentados en la Figura 24 muestran que, al contrario que el tratamiento con BCG vivas y BCG muertas por calor, el tratamiento con BCG muertas por liofilización prolongada no induce la producción y/o activación de macrófagos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Análisis de las células en los ganglios linfáticos drenantes y en el bazo después de la inyección subcutánea de BCG muertas por liofilización prolongada 1) Material y Métodos

Las células presentes en los ganglios linfáticos drenantes de ratones se trataron 48 horas antes por la vía subcutánea, con las diferentes preparaciones de BCG como se ha descrito en el ejemplo 3d, se analizaron por citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular de diferentes poblaciones de leucocitos, marcadas con diversos fluorocromos.

Las células presentes en el bazo de ratones tratadas por la vía subcutánea con BCG muertas por liofilización prolongada, se analizaron como se ha descrito anteriormente, después de estimulación in vitro en presencia de OVA o sobrenadante de cultivo de BCG o sin estimulación.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Resultados a) Ganglios linfáticos drenantes

El análisis de las células presentes en los ganglios linfáticos drenantes muestra que en comparación con los grupos tratados con BCG vivas y con BCG muertas por calor, las células presentes en los ganglios linfáticos eran entre 3 y 5 veces más numerosas 48 horas después de la inyección subcutánea de BCG muertas por liofilización prolongada. Un análisis cinético de las diferentes poblaciones de leucocitos durante cuatro días después de la inyección de BCG muertas por liofilización prolongada, muestra un aumento transitorio del número de células dendríticas (CD11c^{+}) a las 48 horas, así como un número creciente de linfocitos B220+ y CD4+ entre 6 horas y 96 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Bazo

El análisis de las células presentes en el bazo muestra:

- un aumento significativo en el número de células dendríticas plasmacitoides CD11c^{+} Gr1^{+} B220^{+} en el grupo tratado con liofilización prolongada, no se observó aumento del número de células CD8\alpha^{+} en el mismo grupo (figura 25).

- un aumento significativo en el número de células CD4^{+}CD25^{+} IL-10^{+} en el grupo tratado con liofilización prolongada, estimulado in vitro con OVA o sobrenadante de cultivo de BCG o no estimulado (figura 26).

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados muestran que en el modelo de asma de ratones, las BCG muertas por liofilización prolongada son capaces de inducir un aumento significativo en el número de células que inducen células inmunomoduladoras (células dendríticas plasmacitoides CD11c^{+} Gr1^{+} B220^{+}) o que son ellas mismas células inmunomoduladoras (células CD4^{+} CD25^{+} IL-10^{+}) en los ratones que se han sensibilizado previamente a un alérgeno (OVA o polen de ray-grass soluble en agua) lo que da como resultado un efecto protector frente a los síntomas del asma.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Las BCG muertas por liofilización prolongada están activas por la vía oral

Los ratones que se han inmunizado previamente con OVA, como se ha descrito en el Ejemplo 3d se trataron por vía oral con un 1 mg de liofilizado prolongado en los días 42, 44, 46 y 62, 64 y 66 o no se trataron y después se expusieron o no a OVA el día 96. El efecto protector de las BCG muertas por liofilización prolongada se evaluó por numeración del infiltrado de células en los pulmones como se ha descrito en el ejemplo 3.

Los resultados muestran una disminución significativa p < 0,001 del total de número de células en los pulmones del grupo tratado con BCG muertas por liofilización prolongada, en comparación con el grupo no tratado (figura 27). El análisis de las poblaciones de leucocitos muestra una disminución significativa de los números de macrófagos, células polinucleares y células dendríticas en los pulmones del grupo tratado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Determinación de la dosis activa, el ritmo de administración, la duración y el retardo de acción de BCG muertas por liofilización prolongada

Las BCG muertas por liofilización prolongada se inyectaron por vía subcutánea a ratones previamente inmunizados y después expuestos a OVA, y se ensayó su actividad como se ha descrito en el ejemplo 3.

\vskip1.000000\baselineskip

a) Dosis activa y número de dosis

Los ratones adultos se sensibilizaron con OVA los días 0 y 7, se les inyectó por vía subcutánea BCG muertas por liofilización prolongada una vez el día 45 o dos veces los días 45 y 65, y después se expusieron a ovoalbúmina el día 96. La actividad de BCG muertas por liofilización prolongada se ensayó mediante la prevención de hiper-reactividad bronco-pulmonar en el modelo de asma BP2 como se describe en el ejemplo 3.

La dosis más pequeña (10 \mug) era activa y las dosis mayores que 100 \mug no aumentaron la actividad.

Se observó un efecto protector con una dosis (10 \mug) de BCG muertas por liofilización prolongada solamente (figura 28).

\vskip1.000000\baselineskip

b) Retardo de la acción de BCG muertas por liofilización prolongada

Para determinar la secuencia temporal para obtener la eficacia de BCG muertas por liofilización prolongada, se sensibilizó a los ratones adultos (6 por grupo) con OVA los días 0 y 7, se les inyectó por vía subcutánea 100 \mug de BCG muertas por liofilización prolongada el día 14 y se expusieron después a OVA los días 21, 28 ó 35. La actividad de BCG muertas por liofilización prolongada se ensayó mediante la prevención de hiper-reactividad broncopulmonar en el modelo de asma BP2 como se ha descrito en el ejemplo 3.

La prevención de hiper-reactividad broncopulmonar aparece solamente si está presente un retardo de entre 2 y 3 semanas entre la administración de BCG muertas por liofilización prolongada y la exposición (figura 29); este resultado indica que el reclutamiento y expresión de una población celular dada se requiere antes de que la BCG muerta por liofilización prolongada esté activa. Este resultado confirma también que una dosis de BCG muerta por liofilización prolongada es suficiente para proteger a los ratones frente al asma.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Duración de la acción de BCG muertas por liofilización prolongada.

Para determinar la duración de la acción de BCG muertas por liofilización prolongada, se sensibilizaron ratones adultos (6 por grupo) con OVA los días 0 y 7, se les inyectó por vía subcutánea 100 \mug de BCG muertas por liofilización prolongada los días 45 y 65 y se les expuso después a OVA el día 96 ó 42. La actividad de BCG muertas por liofilización prolongada se evaluó por el efecto preventivo de hiper-reactividad broncopulmonar y por la numeración del infiltrado de células en los pulmones, en el modelo de asma BP2 como se ha descrito en el ejemplo 3.

Los resultados muestran que el efecto protector de BCG muertas por liofilización prolongada persiste durante al menos dos meses (figura 30).

\vskip1.000000\baselineskip

d) Protocolo de administración preventivo frente a curativo de BCG con liofilización prolongada

Los resultados previos como se han presentado anteriormente, demuestran la eficacia de BCG muertas por liofilización prolongada en un "protocolo curativo" (administración después de inmunización con alérgeno). Así pues, para evaluar la eficacia de BCG muertas por liofilización prolongada en un protocolo preventivo, se trataron los ratones como sigue:

- a los ratones adultos (de 6 a 7 semanas de edad; 6 ratones por grupo) se les inyectó por vía subcutánea BCG muertas por liofilización prolongada (100 \mug) los días 14, 21 ó 28 antes de la inmunización con OVA (días -14, -21 y - 28), se inmunizaron con OVA los días 0 y 7 y después se les expuso a OVA el día 14.

- a los ratones neonatos (de 7 a 8 días de edad; 6 a 8 ratones por grupo) se les inyectó por vía subcutánea o vía intranasal BCG muertas por liofilización prolongada (100 \mug) el día 56 antes de la inmunización por OVA (día -56), se les inmunizó con OVA los días 0 y 7 y se expusieron después a OVA el día 14.

\vskip1.000000\baselineskip

La actividad de BCG muertas por liofilización prolongada en el protocolo preventivo se evaluó por el efecto preventivo de hiper-reactividad broncopulmonar en el modelo de asma BP2, como se ha descrito en el ejemplo 3.

Los resultados en ratones adultos muestran un efecto protector de BCG con liofilización prolongada en un protocolo preventivo, solamente cuando la preparación se inyecta varios días antes de la sensibilización (2 semanas y 3 semanas).

Los resultados en ratones neonatos mostraron un efecto protector de BCG con liofilización prolongada en un protocolo preventivo, solamente con la administración subcutánea; la vía intranasal está poco activa en estas condiciones.

Claims

1. Uso de una composición que contiene bacterias Gram positivas o una fracción de las mismas, en el que dichas bacterias consisten en células bacterianas Gram positivas muertas no desnaturalizadas y dicha fracción se selecciona del grupo consistente en: una fracción tratada con glicosidasa (fracción B), una fracción digerida con DNasa y/o RNasa (fracción C) y una fracción tratada con proteasa (fracción D) de dichas células bacterianas Gram positivas muertas no desnaturalizadas, para la preparación de un medicamento que es capaz de inducir una modulación de la respuesta inmune frente a un antígeno propio o un alérgeno, para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad autoinmune y alergia.

2. El uso de una composición o una fracción de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad autoinmune que se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y diabetes mellitus.

3. El uso de una composición o una fracción de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1 para la prevención y/o el tratamiento de una alergia que se selecciona del grupo que consiste en asma, rinitis alérgica, conjuntivitis y dermatitis atópica.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha composición contiene bacterias intracelulares facultativas Gram positivas muertas seleccionadas del grupo que consiste en Listeria sp., Corynobacterium sp., y Actinomycetes que comprenden Mycobacteria sp., Nocardia sp. y Rhodococcus sp.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha micobacteria es Mycobacteria bovis.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha Mycobacteria bovis es Mycobacteria bovis BCG.

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha composición contiene bacterias Gram positivas muertas por liofilización prolongada obtenibles mediante un proceso de liofilización
prolongada.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha composición contiene micobacterias muertas por liofilización prolongada.

9. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha composición contiene menos de 1,5% de agua residual.

10. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha composición contiene menos de 1% de agua residual.

11. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha composición contiene menos del 0,5% de agua residual.

12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que dicha composición se prepara mediante un proceso de liofilización prolongada, que comprende al menos los pasos de:

- recolectar un cultivo de células bacterianas Gram positivas vivas,

- congelar las células bacterianas en agua o en una solución acuosa de una sal,

- matar las células bacterianas congeladas mediante su secado en un liofilizador, durante un tiempo suficiente para retirar al menos el 98,5% del agua, y

- recoger las células bacterianas muertas por liofilización prolongada.

\vskip1.000000\baselineskip

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la muerte de las bacterias congeladas se realiza en una presión de cámara de secado de 0,02 milibares a 0,2 milibares.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13, en el que dicho proceso de liofilización prolongada comprende un paso adicional de lavado de las células bacterianas recolectadas en agua o en una solución acuosa o de una sal, antes de la congelación de dichas células bacterianas.

15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la congelación y/o el lavado de las células bacterianas se realiza en una solución acuosa de borato.

\newpage

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que:

- dicha fracción tratada con glicosidasa es obtenible por digestión con lisozima,

- dicha fracción tratada con DNasa y/o RNasa es obtenible por digestión con DNasa I y/o RNasa A, y

- dicha fracción tratada con proteasa es obtenible por digestión con subtilisina.

\vskip1.000000\baselineskip

17. El uso de una composición o una fracción de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de un medicamento que se pretende que sea administrado por la vía oral, sublingual, intranasal o parenteral.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha vía parenteral es la vía subcutánea.

19. El uso de una composición o una fracción de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del asma, que va a administrarse por vía oral, parenteral, sublingual o intranasal, en un intervalo de dosis que es equivalente en ratones a desde 1 \mug hasta 10.000 \mug, a intervalos de dos meses, empezando desde al menos dos semanas antes del periodo usual de exposición al alérgeno.

20. El uso de una composición o una fracción de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 18, para la preparación de un medicamento para la prevención del asma en un bebé humano, que va a administrarse por vía oral, parenteral, sublingual o intranasal, en un intervalo de dosis que es equivalente en ratones a desde 1 \mug hasta 10.000 \mug.

21. Una composición que contiene bacterias Gram positivas muertas por liofilización prolongada, que es obtenible por el proceso de liofilización prolongada como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

22. La composición de la reivindicación 21, que contiene micobacterias muertas por liofilización prolongada, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

23. Una fracción de células bacterianas Gram positivas muertas, como se ha definido en la reivindicación 16.

24. La composición de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 o la fracción de acuerdo con la reivindicación 23 como un medicamento.

25. Una composición farmacéutica que comprende las bacterias Gram positivas muertas por liofilización prolongada como se ha definido en la reivindicación 21 ó 22 y/o al menos una fracción de las mismas como se ha definido en la reivindicación 23, un transportador farmacéuticamente aceptable y/o un aditivo y/o un inmunoestimulante, y/o adyuvante y/o un inmunomodulador distinto de la composición como se ha definido en la reivindicación 1.

26. Productos que contienen una composición como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una fracción de acuerdo con la reivindicación 23 y un producto seleccionado del grupo que consiste en fármacos antineoplásicos, anti-diabetes e inmunomoduladores como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad autoinmune y alergia.

27. Productos de acuerdo con la reivindicación 26, en los que dicho fármaco es un fármaco anti-histamínico o un fármaco anti-inflamatorio.