KR20110028558A

KR20110028558A - 면역조절곤란증을 포함하는 질병을 치료하기 위한 그람양성균 제제

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Publication number: KR20110028558A
Application number: KR1020117004873A
Authority: KR
Inventors: 마리-안느 나오리; 미슈린느 라그랑드리; 질르 마르샬; 베르나르도 보리스 바르가프띠; 쟝 르포르; 펠릭스 로멩; 죠르쥬 에끼미앙; 필립 y트르
Original assignee: 엥스띠뛰 파스퇴르; 앵스티띠 나셔날 드 라 쌍뜨 에 드 라 르셰르슈 메디깔
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2011-03-18
Also published as: ES2345188T3; EP1461054B1; KR101124363B1; NZ555055A; US7871627B2; WO2003049752A3; KR20040080434A; JP2011121977A; JP2005516915A; US20070190076A1; US20100272756A1; EP2316466A2; JP4737586B2; EP1461054A2; NZ533422A; WO2003049752A2; CA2469334A1; ATE466585T1; AU2002356387C1; DK2316466T3

Abstract

본 발명은, 연속 동결건조 그람양성 사균을 포함하는 그람양성 통기성 세포내균, 예컨대, 미코박테리아와 같은 그람양성균으로부터 제조된 성분을 포함하는 조성물, 이의 제조방법 및 인간 또는 동물에서 암, 자가면역질환, 알러지 및 결핵과 같은 면역조절곤란증을 포함한 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

면역조절곤란증을 포함하는 질병을 치료하기 위한 그람양성균 제제{Gram positive bacteria preparations for the treatment of diseases comprising an immune dysregulation}

본 발명은 그람양성 통기성 세포내균, 예컨대, 미코박테리아와 같은 그람양성균으로부터 제조된 성분을 포함하는, 인간 또는 동물의 면역조절곤란증을 포함한 질병을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 성분 및 조성물에 관한 것이다.

Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증을 포함하는 질병으로는 여러가지 암, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론씨병 및 당뇨병과 같은 자가면역질환, 천식, 알러지 비염, 결막염 및 아토피 피부염과 같은 알러지 질환이 있다.

예를 들어, 알러지 천식은 흔한 질병으로 알레르겐-유도성 기도 염증을 보이는데, 흡입된 알레르겐과 호흡기에서 반응하는 T 임파구의 존재 및 활성화로 인해 염증성 백혈구, 호산구 및 때로는 호중구가 기도로 몰려든다. 알러지 기도 염증이 시작되는데는 Th2-형 사이토킨 생성을 통해 CD4+ T 임파구가 주요 역할을 하는데, 이로 인해 호산구가 기도로 몰려들고 계속하여 활성화되기도 한다. Th2와 Th1 이펙토간의 불균형으로 인해 천식의 병리가 초래된다고 제안된 바 있다.

따라서, 예컨대 IFN-γ를 분무하거나 미코박테리아 백신을 주사하여 폐의 Th1 면역 반응을 자극하는 것이 제안되었는데, 이러한 자극으로 인해 쥐의 2차 알러지 반응 진행이 억제되는 것 같다.

보다 구체적으로, 외인성 천식이나 아토피 천식(예, 직업성 또는 약물-유도성)은, Th2-형 면역 반응의 증가와 함께 특이적 면역글로블린 E(IgE)의 생성, 통상의 공기 알레르겐 및/또는 아토피 증상에 대한 양성 피부 시험과 연관된다. 외인성 천식에서의 기류 폐쇄는 기도 염증으로 인한 비특이적 기관지 과반응(BHR)과 연루되어 있다. 이러한 염증은 대식세포, 호산구 및 림프구를 포함한 여러 염증 세포가 분비한 화학물질에 의해 매개된다. 이 매개자들의 작용으로 인해 혈관 투과성, 점막 분비 및 기관지 평활근 수축이 일어난다. 아토피 천식에서, 기도 염증을 일으키는 면역 반응은 IL-4와 IL-5를 분비하는 T 세포의 Th2류 세포에 의해 발생된다. 내인성 천식 또는 잠복성 천식은 상기도 감염 후 진행하는 것으로 보고 되나, 중년 또는 노년층 사람들에 있어서는 처음부터 발생할 수도 있고 이런 경우 이들은 외인성 천식보다 치료가 더 어렵다.

이렇게 알러지 질환들은 T 헬퍼 2(Th2) 사이토킨, IL-4, IL-5 및 IL-13을 분비하는 T 림프구에 의해 매개되고, 그 결과 높은 혈청 IgE 농도와 호산구의 동원을 가져온다. 그러나 이러한 병리에 Th1 세포가 관여할 수도 있다. 예를 들어 만성 아토피 피부 병소에서는 Th1 세포가 확인되었다. 이러한 Th1-Th2 불균형은 일부 암, 특히 방광암 또는 자가면역 질병과 같은 다른 질환에서도 발견되었다.

예컨대, 쉬라가와와 콜이 수행한 연구(Shirakawa and coll, Science, 1997, 275, 3)와 같은 역학조사에 의하면 투베르쿨린 반응과 아토피 질환간에는 역관계가 있음이 밝혀졌다. 이 결과는, 그람양성 통기성 세포내균과 같이 어떤 살아있는 그람양성균, 예컨대, M. 투베르쿨로시스, M. 보비스 또는 BCG와 같은 균에 대해 미리 면역이 되어 있으면 아토피 질병을 예방할 수 있다는 것을 말해준다.

치료전략 중 하나는, Th1과 Th2 사이토킨은 서로 길항적이라고 생각되므로, 관련 알레르겐이나 항원에 대한 T 헬퍼 1(Th1) 반응을 유도시켜 Th2 성분을 억제 조절하는 것이다.

서로 다른 군에서의 실험결과에 따르면, 강한 Th1 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 미코박테리아 및 리스테리아를 포함하는 세포내 세균으로 어미 마우스를 면역시키면 알레르겐 또는 항원 유도성 Th2 반응을 상쇄시키는데, 예컨대 알러지에서 이는 호산구와 그 관련 BHR을 감소시킬 수 있다.

이것이 바로 특정 미코박테리아가 알러지 질환, 보다 구체적으로는, 천식 치료를 위해 제안된 이유다.

이와 관련하여, 미코박테리아를 포함하는 서로 다른 종류의 조성물을 시험하였다:

- 생 BCG 백신은 실험용 천식이나 이와 동등한 질병에 대해, 특히, 경비투여되는 경우에 잠재적인 효과를 갖는다고 여겨졌다(KJ. Erb and coll., J. Exp. Med, 1998, 187,561-569; MA. Nahori and coll., Vaccine, 2001, 19,1484-1495). 그러나, 결핵을 예방한다는 유용성에도 불구하고(JB Milstein and coll., WHO Bull. OMS, 1990, 68, 93-108), 생 BCG 백신은 몇 가지 단점을 보이는데, 첫째, 잔류 독성 때문에 면역약화 대상에게 사용할 수 없고, 둘째, 피내주사용 BCG 백신은 국소 반응이 있어 총 세균량에 비례하여 국소 궤양을 일으킬 수 있고 잘못해서 경피주사한 경우에는 보다 심각한 반응(농양)을 일으킬 수 있다. 따라서, 이러한 백신은, 특히 이것이 비강내 투여 또는 분무 투여되었다면, 호흡기 알러지 질환의 면역요법이나 기타 Th1-Th2 불균형과 관련된 다른 질환의 면역요법을 위해 상당 기간동안 반복투여에 사용할 수 없을 것이다. 경비투여 또는 분무 투여로 인해 폐에서 용인할 수 없는 생 BCG 백신 부작용이 초래될 수 있다.

- 열-사멸 미코박테리아 제제

. 열-사멸 BCG 제제 또는 미코박테리움 투베르쿨로시스 제제는 백신으로 사용하는 경우 전신 예방성이 없다(R. Janssen and coll., Immunol., 2001, 102, 4, 441-449; MA Skinner and coll., Immunol., 2001, 102, 2, 225-233; GA Rook and coll., Novartis Found Symposium, 1998, 217, 73-87 and 87-98). 더구나, 이 제제는 결핵 진단을 방해하는 BCG 정제 단백질 유도체(PPD)에 대한 지연형 과감작을 유도한다. 그러나, 일부 저자들은 열-사멸 M. 보비스 단독 또는 M. 바카에와 복합하여 신생아 시기에 미리 면역시키면 IgE 반응을 억제 조절하는데 잠재적으로 도움이 될 수 있다고 생각했다는 점에 주목하여야 한다(F. Tukenmez 및 coll., Pediatr. Allergy Immunol., 1999, 10, 2, 107-111; F. Tukenmez 및 coll., J. Asthma, 2000, 37, 4, 329-334; Nahori 및 coll., 전게서);

. 열-사멸 미코박테리움 바카에(CC Wang and coll., Immunol. 1998, 93, 3, 307-313; WO 00/74715) 제제는 알러지 면역요법에서 임상 적용된 바 있다. 몇몇 결과는 Th1 면역보강제로서의 열-사멸 미코박테리아의 잠재성을 증명하고 재조합 항원-특이적 면역 조절에 있어서의 미코박테리아의 잠재적인 용도를 보여준다(R. Janssen 및 coll., Immunol., 2001, 102. 4, 441-449; MA Skinner and coll., Immunol., 2001, 102, 2, 225-233; CC Wang and coll., Immunol., 1998, 93, 3, 307-313; WO 00/74715). 이 제제들은 비록 면역요법에서 활성이 있기는 하나, 열-사멸 BCG 또는 미코박테리움 투베르쿨로시스와 마찬가지의 몇몇 단점들이 있어서 면역요법에 사용되는 것을 방해한다.

실제로, 모든 열-사멸 미코박테리아 제제들은,

- 폐포 마크로파지에 의한 TNF-α 생성을 유도하는데 이것이 독성물질 및 괴사물질로 작용하기 때문에 상기 열-사멸 제제가 면역요법에 사용되는 것을 방해한다.

- 임상시험에서 관찰되는 소양성 물집, 경화 및 괴사와 흉터지속과 같은 국소성 부작용을 유발한다(PM Shirtcliffe and coll., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 163, 1410-1414).

따라서, 그람양성 통기성 세포내균, 예컨대, 미코박테리아와 같이 그람양성균으로부터 유래하고 예컨대 알러지 질환과 같이 Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증을 포함하는 질병들을 치료하기 위한 효과적인 조성물로서 내성이 좋고 전술한 단점들을 갖지 않는 조성물이 필요하다.

또한, 이러한 조성물은 제제내 존재하는 활성 성분의 확인이 가능해야만 한다. 120℃에서 10분 내지 30분간 가열하는 것을 포함하는 상기 열-사멸 제제에서는 열에 불안정한 성분의 확인이 불가능할 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은, 예컨대, 암, 자가면역질환, 알러지 질환과 같이 Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증을 포함하는 질병을 중요한 부작용 없이 치료하는데 유용한, 그람양성 통기성 세포내 사균 제제와 같이 신규한 그람양성 사균 제제, 예컨대 미코박테리아 사균 제제 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 면역조절곤란증을 포함하는 질병을 치료하는 능력 외에도 세균으로부터의 분자 구조를 보존시켜 이 세균 세포의 활성 분자를 확인할 수 있도록 하는 상기 그람양성 사균 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

놀랍게도, 본 발명자들은 그람양성 통기성 세포내 세균과 같은 그람양성 세균, 예컨대, 세균 세포로부터의 분자들을 변성시키지 않는 "소프트 방법"에 의해 사멸되는 미코박테리아는 천식 또는 다른 면역조절곤란증을 겪는 환자들에게 투여되는 경우에 생체내(in vivo)에서 백혈구 조절 세포(CD4+, CD25+ T-세포 및/또는 B 세포 및/또는 가지 세포)를 자극할 수 있다는 것을 알았다. 이러한 조절 세포들의 자극은, 지속된 기간(수주)동안 국소효과 및 전신효과를 갖는 천식 환자의 면역 반응성을 재형성시키며, 그 결과, 이 그람양성 세포내 사균 제제로 처리한 알러지 환자들은 오랜 기간동안 천식으로부터 예방된다.

본 발명자들은 또한 세균 세포로부터의 분자 구조가 보존되는 상기 사균 제제는 염증, 빈혈, 저혈소판증 및 TNF-α생성 유도와 같은 부작용을 유발하지 않는다는 것을 알았다.

본 발명은 하기한 바에 의해 특징 되는 세균 제제에 관한 것이다:

- 세균 세포로부터의 분자 구조를 변성시키지 않는 방법에 의해 얻은 그람양성 사균을 포함하고;

- 생체내에서 항원(면역조절제제)에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다.

면역조절제제란, 어떠한 항원(자가항원 또는 외래항원)에 대한 면역반응이 유도되기 전 또는 후에 면역 조절과 면역 헬퍼 세포간의 비율을 변형시킬 수 있는 제제를 의미한다. 면역조절세포로는 CD4+ CD25+ T-세포 및/또는 B 세포 및/또는 가지세포와 같은 백혈구 조절 세포가 포함된다. 예를 들어, CD4+ CD25+ T 세포는 스케바크 등의 문헌(Schevach et al., Nat. Rev. Immunol., 2002, 2, 389-400)에 기재되어 있다.

상기 세균 제제의 유리한 양태에 따르면, 이 제제는 사멸된 그람양성 통기성 세포내균을 포함한다.

그람양성 통기성 세포내균이란, 시험관내(in vitro) 합성 배지에서 성장할 수 있는 능력이 있고 생체내(in vivo)에서 포유동물이나 비-포유동물 숙주로부터 유래한 진핵세포를 감염시킬 수 있으며 이 세포내, 예컨대, 마크로파지에서 번식할 수 있는 그람양성균을 의미한다.

상기 세균 제제의 유리한 양태에 따르면, 이 제제는 리스테리아 종, 코리노박테리움 종 및 미코박테리아 종, 노카디아 종 및 로도코커스 종을 포함하는 악티노마이세트로부터 선택된 사멸된 그람양성 통기성 세포내균을 함유한다.

바람직하게는, 상기 세균제제는 미코박테리아 보비스, 보다 바람직하게는 미코박테리아 보비스 BCG를 포함한다.

세균 세포로부터의 분자 구조를 변성시키지 않는 방법이란, 이 분자의 공간배위가 심하게 변성되지 않게 하는 방법을 의미하고 바람직하게는 이 방법은 단백질, 다당류 및 지질과 같이 세균세포로부터의 거대분자들의 삼차원 구조를 보존시킨다.

"소프트 방법"이라고 불리는 이 방법은 세균세포막을 파열시키면서 그 거대분자 성분의 구조는 보전시키는 물리적 수단을 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이 방법은, 연속 동결건조(extended freeze-dried), 실리카 또는 지르코늄 비드 존재하에 분쇄, 소위 "프렌치 프레스"의 사용, 초음파분쇄 및 감마선 방사를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 위에서 정의한 사균제제를 얻기 위해 사용될 수 있는 다른 방법들이 당업자에게 공지되어 있다.

- 예를 들어, 연속 동결건조 사균 제제란, 제제로부터 본질적으로 모든 물이 제거되어 이 연속 동결건조 사균 제제가 1.5% 미만의 잔류수, 바람직하게는 1% 미만, 보다 바람직하게는 0.5% 미만의 잔류수를 함유하는 제제를 의미한다. 그러나, 최적이 아닌 동결건조 조건에서는, 상기 동결건조 세균 제제가 그 이상의 잔류수(약 10%)를 함유하는 경우, 즉, 세균이 모두 사멸된 것은 아닌 경우에는, 대안으로서 이 제제를 공기(대기압)와 접촉시켜 남은 생 세균들을 죽일 수 있는데, 이러한 제제도 전술한 연속 동결건조 사균 제제와 동일한 성질과 활성을 갖는다. 이 연속 동결건조 사균 제제에 있는 잔류수는 예컨대 칼 피셔의 자동수분측정법(coulometric method)으로 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 그람양성 사균 제제에 분자의 변성이 없다는 것은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 그람양성 사균 제제 추출물을 램리(Laemmli, Nature, 1970, 277, 680-)에 따른 변성 및 비-변성 조건에서 겔 전기영동시켜 생 세균으로부터 얻은 단백질 추출물과 비교함으로써 단백질 구조를 확인할 수 있는데, 이 단백질들을 적절한 염료로 착색시키거나 단백질이 막으로 이동한 후 그람양성균 단백질에 대한 적절한 항체로 염색하여 직접 가시화할 수 있다. 본 발명에 따른 그람양성 사균 제제로부터의 정제된 분자의 구조를 확인하기 위해, 겔 여과 또는 질량 분광기와 같은 다른 방법도 사용할 수 있다.

상기 세균제제의 다른 유리한 양태에 따르면, 이 제제는 연속 동결건조법으로 얻을 수 있는 연속 동결건조 사균을 포함한다.

바람직하게는, 이 연속 동결건조 사균 제제는 하기 단계에 의해 제조된다.

i) 생 세균 세포 배양물을 수확하는 단계;

ii) 물 또는 붕산염과 같은 염 수성 용액에서 상기 세균 세포를 세척하는 단계;

iii) 물 또는 붕산염과 같은 염 수성 용액에서 상기 세균 세포를 동결시키는 단계;

iv) 적어도 98.5%의 물, 바람직하게는 적어도 99%의 물, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%의 물이 제거되기에 충분한 시간 동안 상기 동결 세포를 동결건조제로 건조시켜 사멸시키는 단계; 및

v) 상기 연속 동결건조 세균 세포를 수거하는 단계.

다르게는, 세균 세포를 세척하는 단계인 (ii) 단계를 생략한 상기 방법에 의해 연속 동결건조 사균 제제를 제조할 수 있다.

바람직하게는, 상기 (iv) 단계는 약 0.02 mBar 내지 0.2 mBar, 보다 바람직하게는 0.06 mBar 내지 0.1 mBar 압력의 건조챔버 압력에서, 적어도 10 내지 12시간 동안, 보다 바람직하게는 수일 동안, 건조 사균 제제가 건조단계 동안 저온을 유지하도록(세균 세포 분자의 변성이 없슴) 낮은 열 주입과 낮은 냉 증기 트랩 온도로 수행된다.

상기 동결건조법에서, 동결건조기내 공기 누출이 없는 상태에서 아이스 컨덴서 진공펌프가 진공챔버로부터 몇 초동안 분리될 때 진공챔버 압력이 변화를 보이지 않으면 연속 동결건조 상태가 도달되는데, 이때는 동결건조 세균으로부터 더 이상 물이 제거될 수 없다는 것(= 안정한 수증기 압력)을 의미한다. 예를 들어, 상기 냉 트랩이 -52℃일 때는 연속 동결건조 사균을 효과적으로 얻기 위해 건조챔버 내 압력은 0.06-0.120 mBar, 통상적으로는 0.09 mBar일 것이다.

본 발명은 하기 그룹으로부터 선택된 본 발명에 따른 사균 제제의 상이한 분획에 관한 것이기도 하다:

- 인지질을 제거한, 사균 제제의 유기 용매 추출물로 구성된 A 분획,

- 펩티도글리칸과 같이 당-유래 성분을 제거한, 사균 제제의 글리코시다아제-처리 추출물로 구성된 B 분획,

- 핵산을 제거한, 사균 제제의 DNA아제 및/또는 RNA아제-분해 추출물로 구성된 C 분획,

- 단백질을 제거한, 사균 제제의 프로테아제-처리 추출물로 구성된 D 분획,

- 유기용매, 글리코시다아제, DNA아제 및/또는 RNA아제 그리고 최종적으로 프로테아제로 연속 처리한 사멸 제제 추출물로 구성된 E 분획.

바람직하게는:

- 상기 A 분획은 메탄올/클로로포름 혼합액으로 추출하여 얻고,

- 상기 B 분획은 리소짐으로 분해하여 얻으며,

- 상기 C 분획은 DNA아제 I 및/또는 RNA아제 A로 분해하여 얻고,

- 상기 D 분획은 섭틸리신으로 분해하여 얻는다.

상기 분획의 유리한 한 양태에 따르면, 분획은 전술한 연속 동결건조 세균 제제로부터 분리된다.

상기 분획의 유리한 한 양태에 따르면, 분획은 미코박테리아 분획, 바람직하게는 미코박테리아 보비스 분획, 보다 바람직하기로는 미코박테리아 보비스 BCG 분획으로 구성된다.

본 발명은 또한 위에서 정의한 바와 같은 유효량의 사균 제제 및/또는 적어도 그 한 분획, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제 및/또는 면역보강제 및/또는 본 발명의 세균 제제와는 구별되는 면역촉진제 및/또는 면역조절제를 포함하는, Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증을 포함하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

면역보강제란, 항원과 함께 투여되어 항원에 대한 특이적 면역반응(항체 생성, B 세포 및 T 세포 활성화)을 증강시키는 천연 또는 합성 물질을 의미한다.

면역촉진제란, 항원과 결합하여 투여되는 경우 비-특이적 면역반응(예컨대, 항원에 대한 식세포작용의 증가)을 유도하는 천연 또는 합성 물질을 의미한다.

본 발명에 따르면, 이 조성물은 암, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론씨병 및 당뇨병과 같은 자가면역 질환, 천식, 알러지 비염 및 아토피 피부염과 같은 알러지 질환을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다.

상기 조성물의 유리한 한 양태에 따르면, 이 조성물은 미코박테리아, 바람직하게는 미코박테리아 보비스, 보다 바람직하게는 미코박테리아 보비스 BCG로 구성된다.

상기 조성물의 다른 유리한 양태에 따르면, 이 조성물은 위에서 정의한 바와 같은 연속 동결건조법으로 수득한 연속 동결건조 사균으로 구성되고, 바람직하기로는 상기 연속 동결건조 사균은 위에서 정의한 동결건조 방법에 의해 수득된다.

상기 조성물의 다른 유리한 한 양태에 따르면, 이 조성물은 경비투여에 적합한 형태이다.

상기 조성물의 다른 유리한 한 양태에 따르면, 이 조성물은 경구 또는 설하투여에 적합한 형태이다.

일반적으로, 이 조성물은 비경구 주사(예, 피내주사, 근육주사, 정맥주사 또는 경피주사), 경비투여(예, 흡입식 또는 분무식), 경구투여, 설하투여, 또는 피부나 직장을 통해 국소투여될 수 있다.

구체적으로, 한 양태에서, 본 발명의 조성물은 기관지폐 점막 표면으로 전달되기에 적합한 형태이다. 예를 들어, 이 조성물은 환자에게 에어로졸 형태로 또는 현재 천식 치료에 사용되는 것과 유사한 분무장치(네불라이저)를 통해 투여되기 위해 액제로 현탁될 수 있다.

구체적으로, 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 경구투여에 적합한 형태이다. 예를 들어, 이 조성물은 정제, 통상의 캅셀제, 젤라틴 캅셀 또는 경구용 시럽제 형태일 수 있다. 이 젤라틴 캅셀, 통상의 캅셀 및 정제 형태는 전분, 검 및 젤라틴과 같은 면역보강제 또는 결합제, 인산칼슘과 같은 면역보강제, 옥수수전분 또는 알긴산과 같은 붕해제, 스테아린산마그네슘과 같은 활택제, 감미료 또는 향료와 같이 약제분야에서 종래 사용되어 온 부형제를 포함할 수 있다. 용액제 또는 현탁제는 약리학적으로 사용 가능한 용매를 첨가하여 수성 또는 비수성 매질로 제조할 수 있다. 이러한 용매로는 글리콜, 폴리글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리글리콜 에테르, DMSO 및 에탄올이 포함된다.

상기 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제 및/또는 면역촉진제 및/또는 본 발명에 따른 세균 세포 또는 그 분획을 포함한 리포좀과 같은 면역보강제를 포함할 수 있는데, 약제학적 조성물 제조를 위해 사용된 하나 이상의 첨가제는 응집방지제, 항산화제, 염료, 향 개선제 또는 평활제, 조립제 또는 분리제로부터 선택할 수 있고 일반적으로는 약업계에서 종래 사용되어 온 부형제중에서 선택할 수 있다.

당업자에게 공지된 적합한 담체가 모두 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 반면, 담체 형태는 투여방식에 따라 달라질 수 있다. 경피주사와 같이 비경구투여를 위한 담체로는 바람직하게는 물, 식염수 완충제, 락토스, 글루타메이트, 지방 또는 왁스가 포함된다. 경구투여를 위해서는 전술한 담체 중 어느 것이든 고형 담체, 예컨대, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 및 탄산마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어(예, 폴리락틱 갈락티드)도 본 발명의 약제학적 조성물의 담체로 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는 미국특허 제4,897,268호 및 5,075,109호에 기재되어 있다.

다양한 면역보강제들도 본 발명의 조성물의 면역반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 대부분의 면역보강제는 항원이 신속히 이화되거나 제어 면역반응을 일으키는 것을 방지하는 물질, 예컨대, 수산화알루미늄 또는 광유, 그리고 비-특이적 면역반응 자극제, 예컨대, 지질 A, 보르데텔라 퍼투시스 톡신과 같은 물질을 포함한다. 적합한 면역보강제는 상업적으로 구입할 수 있고, 그 예로서 프로인트 불완전 면역보강제 및 프로인트 완전 면역보강제가 있는데 사람 주사제로는 사용할 수 없다. 사람에 사용할 수 있는 다른 적합한 면역보강제로는 수산화알루미늄, 생분해성 마이크로스피어, 모노포스포릴 A 및 퀼 A(Quil A)가 있다.

바람직한 투여 횟수 및 유효 투여량은 종 및 개체에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 연속 동결건조 미코박테리아 사균제제 또는 그 분획은 투여량 범위가 1 ㎍ 내지 10000 ㎍ (약 10⁶ 내지 10¹⁰ CFU)로 이는 마우스에서는 균등량이되고, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 1000 ㎍, 보다 바람직하게는 10 ㎍ 내지 100 ㎍이다. 이 투여량은 종 또는 개체의 체표면 및 투여 횟수에 따라 가감될 수 있다. 예를 들어, 천식치료에서는 두달에 한번씩 1 또는 2회의 투여를 하는 것이 더 효율적이다.

또한 본 발명은, 본 발명에 따른 세균 제제 또는 그 분획을 포함하는 약제와 항암약물, 항당뇨 약물 및 면역조절 약물중에서 선택된 약제를 복합제제로서 포함하는, 면역조절곤란증을 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 동시, 개별 또는 연속사용하기 위한 제품에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 약제는 항히스타민제 및 항염증제 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 적어도 통상의 알레르겐 노출기간 전 2주에서부터 시작하여 두달 간격으로, 마우스에서 균등량인 1 ㎍ 내지 10000 ㎍, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 1000 ㎍, 보다 바람직하게는 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 투여량을 경구, 설하, 비경구 또는 경비투여하는 천식치료제를 제조하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 세균 제제 또는 그 분획의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 마우스에서 균등량인 1 ㎍ 내지 10000 ㎍, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 1000 ㎍, 보다 바람직하게는 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 투여량을 경구, 설하, 비경구 또는 경비투여하는 사람의 천식치료제를 제조하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 세균 제제 또는 그 분획의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 적어도 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 연속 동결건조 사균 제제의 제조 방법에 관한 것이다:

i) 생 세균 세포 배양물을 수확하는 단계;

iii) 물 또는 붕산염과 같은 염 수성 용액에서 상기 세균 세포를 냉동시키는 단계;

iv) 적어도 98.5%의, 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%의 물이 제거되기에 충분한 시간 동안 상기 냉동 세포를 동결건조제로 건조시켜 사멸시키는 단계; 및

v) 상기 연속 동결건조 세균 세포를 수거하는 단계.

다르게는, 세균 세포를 세척하는 단계인 (ii) 단계를 생략하고 (i), (iii) (iv) 및 (v) 단계를 포함하는 방법에 의해 상기 연속 동결건조 사균 제제를 제조할 수 있다.

바람직하게는, 상기 (iv) 단계는 98.5%의 물을 제거하는 한편 냉동된 세균이 녹는것을 방지하고 건조된 사균을 세균 세포분자 변성 온도 이하로 유지하기 위해 약 0.02 mBar 내지 0.2 mBar의 건조챔버 압력에서, 보다 바람직하게는 0.06 mBar 내지 0.1 mBar 압력에서, 적어도 10 내지 12시간 동안 수행된다.

상기 방법의 한 유리한 양태에 따르면, 이 방법은 연속 동결건조 사멸된 미코박테리아를 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명은 또한 상기 사균 세포 제제 또는 그 분획을 Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증을 포함하는 질환, 예컨대, 암, 다발성 경화증, 당뇨병 및 크론씨병과 같은 자가면역질환, 천식, 알러지 비염 또는 아토피 피부염과 같은 알러지 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하는 용도에 관한 것이다.

상기 용도에 따르면, 사균 제제 또는 그 분획은 약제학적으로 허용되는 담체, 및/또는 면역촉진제, 및/또는 면역보강제 및/또는 위에서 정의한 바와 같은 종래의 첨가제와 결합된다.

본 발명의 유리한 한 양태에 따르면, 미코박테리아, 바람직하게는 미코박테리아 보비스, 보다 바람직하게는 미코박테리아 보비스 BCG가 사용된다.

본 발명의 다른 유리한 양태에 따르면, 연속 동결건조 방법으로 수득한 연속 동결건조 사균이 사용된다.

본 발명에 따른 사균 제제는 다음과 같은 장점을 갖는다:

- Th1-Th2 불균형과 같은 면역조절곤란증, 예컨대, 천식을 포함하는 질병을 예방하고,

- 감염성이 없으므로 면역결핍 대상에게 투여할 수 있으며,

- 특히 이 제제는 독성과 괴사활성을 유도하는 TNF-α생성을 유도하지 않기 때문에 염증성 부작용이 없다. 또한, 빈혈 및 저혈소판증을 포함하는 부작용이 없다.

- BCG 정제 단백질 유도체(PPD)에 대한 지연형 과감작을 유도하지 않으면서 사용할 수 있어 결핵 진단을 방해하지 않으며,

- 세균 세포로부터의 분자 구조를 보존(분자의 심한 변성 없는)하는 방법으로 제조되므로 사균 제제로부터 면역조절 분자를 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 상기 약제학적 조성물을 투여하기 위한 수단 및/또는 처방된 치료법에 순응하도록 하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역조절곤란증을 포함한 질병 치료를 위한 키트에 관한 것이다.

이하, 후술되는 설명 및 도면에 의해 본 발명을 더욱 설명하는데, 마우스에서 천식에 미치는 연속 동결건조 사멸 BCG의 예방효과를 예시하는 실시예, 연속 동결건조 사멸 BCG, 열-사멸 BCG 및 생 BCG에 의해 유도된 면역반응 분석 또는 연속 동결건조 사멸 BCG 및 그 분획의 생산에 관한 분석을 언급한다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이고 본 발명의 구성을 어떤 식으로든 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

- 도 1은, 동결건조 생 BCG 백신(A)의 표준 제조 방법을 본 발명에 따른 연속 동결건조 사멸 BCG(B)와 비교하여 도시한 것이다. mBar로 표시된 압력(-Δ-)과 샘플의 섭씨 온도(-○-) 또는 트레이의 섭씨 온도(-●-)가 시간에 따라 경시적으로 나타나 있다.
- 도 2는, 특히 스트린전트(높은 Th2)한 BP2 천식 마우스 모델에서 환기중 기관지-폐 과감작 반응의 감소로 측정한 이 과감작 반응에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)의 예방효과를 도시한 것이다. BP2 마우스 종은 Th2/천식 축을 따라 매우 반응성이다. 마우스는 Th2 자극제로 공지된 명반(황산알루미늄)과 배합된 OVA로 감작되었다. 비교한 결과, 이 스트린전트 마우스 모델에서는 생 BCG 또는 열-사멸 BCG로 처리한 그룹에서는 유의성있는 효과가 관찰되지 않는다. 곡선하면적(㎠)이 개별(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)로 제시된다.
- 도 3은, 기관지-폐 저항성으로 검정한, OVA를 알레르겐으로 사용하여 BP2 천식 마우스 모델에서 기관지-폐 과반응에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)의 예방 효과를 도시한 것이다. 비교해보면, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG로 처리한 그룹에서는 유의성있는 효과가 관찰되지 않는다. 1분 간격으로 측정한 정지증가(enhanced pause, Penh)가, 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)로 제시된다. ***는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리 그룹에서 기관지-폐 과반응에 대한 통계적으로 유의성있는(p<0.001) 예방효과를 나타낸다.
- 도 4는, BP2 천식 마우스 모델에서 기관지폐포액(BAL) 세포계수로 검정한, 폐 호산구 증가에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)의 예방효과를 도시한 것이다. 비교에서, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리 그룹에서는 유의성있는 효과가 관찰되지 않는다. 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다.
- 도 5는, BP2 천식 마우스 모델에서 기관지폐포액(BAL) 세포계수로 검정한, 폐 호중구 증가에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)의 예방효과를 도시한 것이다. 비교에서, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리 그룹에서는 유의성있는 효과가 관찰되지 않는다. 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다. **는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리 그룹에서 통계적으로 유의성있는 호중구 수의 감소(p<0.01)를 나타낸다.
- 도 6은, BP2 천식 마우스 모델에서 기관지폐포액에서 매우 낮은 농도의 피브로넥틴으로 검정한, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)에 대해 폐 염증 또는 조직 손상이 존재하지 않는다는 것을 도시한 것이다. 비교에서, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리 그룹에서는 BAL내 매우 높은 농도의 피브로넥틴이 관찰된다. 데이타는 IU/ml로 표현되는데, 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시되고, ***는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리 그룹에서 통계적으로 유의성있는 피브로넥틴의 감소(p<0.001)를 나타낸다.
- 도 7은, 생 BCG, 열-사멸 BCG, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG) 또는 비처리 마우스 그룹으로부터 기관지폐포액에서의 IL-5 농도를 도시한 것이다. 데이타는 pg/ml로 표현되는데, 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다.
- 도 8은, 생 BCG, 열-사멸 BCG, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG) 또는 비처리 마우스 그룹으로부터 혈청내 IL-5 농도를 도시한 것이다. 데이타는 pg/ml로 표현되는데, 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다.
- 도 9는, 생 BCG, 열-사멸 BCG, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG) 또는 비처리 마우스 그룹에서 폐 배양물내 IFN-γ(pg/ml) 농도를 도시한 것인데, 이 배양균은 정제된 BCG 분비 단백(A) 또는 항-CD3 항체(B)로 생체내(in vivo) 자극되었다. 개별 데이타(-○-), 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다.
- 도 10은, 생 BCG, 열-사멸 BCG, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG) 또는 비처리 치료 프로토콜로 처리된 마우스의 혈청내 OVA-특이적 IgE의 농도를 도시한 것이다. 개별 데이타(-○-)와 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다.
- 도 11A 및 12A는, OVA로 면역시킨 각 BP2 및 BALB/c 마우스에서 폐포 마크로파지에 의한 IL-12(p70 및 p40)의 생산을 도시한 것인데, 이 마우스들은 열-사멸 BCG(가열)(-◆-) 또는 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조)(...■...)로 생체내(in vivo) 자극되었다. 데이타가 100000 세포당 pg/ml로 표현된다.
- 도 11B(BP2) 및 12B(BALB/c)는, 열-사멸 BCG(가열)로 자극한 마우스의 마크로파지에서는 유의성 수준의 TNF-α가 생성된 것에 비하여 연속 동결건조 사멸(동결건조)로 자극한 마우스의 마크로파지에서는 TNF-α가 생성되지 않은 것을 도시한 것이다. 데이타가 100000세포당 ng/ml로 표현된다.
- 도 13은, 연속 동결건조 사멸 BCG(동결건조 사멸 BCG)로 처리한 마우스에서 BCG 정제된 단백질 유도체(PPD)에 대한 지연형 과감작이 존재하지 않는 것을 도시한 것이다. 비교에서, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리한 마우스에서는 DTH가 관찰된다. 개별 데이타(-○-)와 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(-●-)가 제시된다. ***는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리 그룹에서 발바닥 부종이 통계적으로 유의성있는 정도로 존재하지 않음을 나타낸다.
도 14는, 천식 기니피그 모델에서 기관지-폐 히스타민 과반응에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD-BCG)의 예방효과를 도시한 것이다. OVA 면역 동물 그룹은 10 ㎍(도 14B) 또는 100 ㎍(도 14C)의 연속 동결건조 사멸 BCG로 처리되거나 비처리되었다(도 14A). 각 동물에 대해 OVA 에어로졸 투여 전(흑색 심볼) 후(백색 심볼) 기관지 폐색을 일으킬 수 있는 농도가 제시된다. ***는 10 ㎍(p<0.01) 또는 100㎍(p<0.001)의 연속 동결건조 사멸 BCG로 처리한 그룹에서 통계적으로 유의성있는 예방 효과(Kruskal-Wallis non parametric test)를 나타낸다.
- 도 15A는, BP2 천식 마우스 모델에서 기관지폐포액 세포계수로 검정한, 폐 호산구 증가에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD1)의 예방효과를 도시한 것이다. 비교해보면, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리 그룹에서는 유의성있는 효과가 관찰되지 않는다. 데이타가 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(각 그룹당 n=7)로 제시된다. *는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리 그룹에서 통계적으로 유의성있는 호산구 수의 감소(p<0.05)를 나타낸다.
- 도 15B는, 생 BCG, 열-사멸 BCG, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1) 또는 비처리된 마우스의 기관지폐포액내 IL-5의 농도를 도시한 것이다. 데이타가 마우스 그룹당 평균 ±표준편차(각 그룹당 n=7)로 제시된다.
*- 도 16은, SDS-PAGE 및 (A) PVDF 막으로 이동한 후 항-미코박테리아 항체로 염색 또는 (B) 오로다이(Aurodye)로 염색하여 검정한, 연속 동결건조 사멸 BCG 제제내 단백질 구조의 보존을 도시한 것이다. 단백질이 얼룩 없는 뚜렷한 밴드로 나타난다.
- 도 17은, 수용성 화분(ray-grass pollen) 추출물을 알레르겐으로 사용하여 BP2 천식 마우스 모델에서 기관지-폐 과반응에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)의 예방 효과를, 기관지-폐 과반응으로 검정한 것을 도시한 것이다. 메타콜린 투여 후 3분 내지 8분 사이에 측정된 정지증가(Penh)가 존재한다. 데이타는 마우스 그룹당 평균 ±표준편차로 나타내고 각 군에서 n=8 이다. **는 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서 통계적으로 유의성있는(p<0.01) 기관지-폐 과반응에 대한 예방 효과를 나타낸다.
- 도 18A 및 B는, BP2 천식 마우스 모델에서 폐내 다형핵 및 호산구의 증가에 대한 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)의 예방 효과를, 기관지폐포액의 세포 수로 검정한 것을 도시한 것이다. 데이타는 마우스 그룹당 평균 ± 표준편차로 나타낸다. 연속 동결건조 사멸 BCG 1 mg 과 10 mg으로 처리한 군에서 다형핵 수가 통계적으로 유의성있게(**p<0.01) 감소하고, 호산구 수가 통계적으로 유의성있게 감소하는데, 각각 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1) 100 ㎍, 1 mg 및 10 mg 투여군에서 **p<0.01, *p<0.05 및 *p<0.05이다.
- 도 18C는, 연속 동결건조 BCG(EFD1) 투여된 그룹(10 ㎍. 100 ㎍, 1 mg 및 10 mg)의 폐에서 다형핵 수와 호산구 수의 감소와 기관지 폐포액에서의 세포와 사이토킨 분석에 의해 평가한 IL-4 생성의 감소 사이의 상관성을 도시한 것이다. 데이터는 마우스 그룹당 평균 ± 표준편차로 표시된다. 연속 동결건조 사멸 BCG 10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg 및 10 mg을 투여한 그룹에서 IL-4 농도가 통계적으로 유의성있게 감소(**p<0.01)한다.
- 도 19는, BP2 천식 마우스 모델에서 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD1) 처리군의 폐 백혈구 침윤 방지를, 폐 세포 침윤 수로 측정하여 도시한 것이다. 데이터는 마우스 그룹당 평균 ± 표준편차로 나타내는데, 각 그룹에서 n=5 이다. 연속 동결건조 사멸 BCG 10 ㎍ 처리군에서 세포 수가 통계적으로 유의성있게 감소(**p<0.001)한다.
- 도 20은, BP2 천식 마우스 모델에서 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD) 처리군의 폐 백혈구 침윤 방지를, 마크로파지(CD11b+), 다형핵 세포(Grl+) 및 가지세포(CD11c+)에 대한 유세포측정법으로 측정하여 도시한 것이다. 데이터는 마우스 그룹당 평균 ± 표준편차로 나타내는데, 각 그룹에서 n=5 이다. (i) 연속 동결건조 사멸 BCG(10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg 및 10 mg) 처리군에서 마크로파지 수와 가지세포 수; 그리고 (ii) 연속 동결건조 사멸 BCG 100 ㎍, 1 mg 및 10 mg 처리군에서 다형핵 수만 통계적으로 유의성있게 감소한다.
- 도 21은, 생 BCG, 열-사멸 BCG 또는 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)처리되거나 처리되지 않고서 OVA로 접종되거나 접종되지 않은 마우스 군으로부터의 폐 배양물내 IFN-γ 및 IL-10의 농도(pg/폐)를 도시하는데, 상기 배양물은 시험관내(in vitro)에서 정제된 BCG 분비 단백질로 자극되었다. 데이터는 마우스 그룹당 평균 ± 표준편차로 나타내는데, 각 그룹에서 n=4 이다. 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서만 IL-10 생성이 통계적으로 유의성있게(***p<0.001) 증가한다.
- 도 22는, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG를 동일한 경로로 투여한 것과는 대조적으로, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD-BCG)를 정맥 투여한 후에는 빈혈(A)과 저혈소판증(B)이 존재하지 않는 것을 도시한다.
- 도 23은, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)를 경피주사한 후 주사부위에서의 최소 염증 반응을, 생 BCG 및 열-사멸 BCG와 비교하여, 투여 후 10주 동안 매주 발바닥 증가측정에 의해 검정하여 도시한 것이다. 화살표는 주사일을 표시한다; EFD와 열-사멸 BCG은 D1과 D36로, 생 BCG에 대해서만 D0.
- 도 24는, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)을 정맥 주사한 후 18일 후 폐 체외이식편 LPS로 자극한 후 TNF-α생성의 감소를, 동일 경로로 투여한 생 BCG 및 열-사멸 BCG와 비교하여 도시한 것이다. 비처리군과 비교하여 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서 TNF-α가 유의성있게(***p<0.001) 생성되지 않는다. 비교하면 생 BCG 및 열-사멸 BCG 처리군에서 TNF-α가 유의성있게 생성된다.
- 도 25는, 90일전 난알부민으로 면역되고, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)로 45일째와 65일째에 처리되거나 처리하지 않고, 난알부민으로 접종 또는 접종하지 않은, BALB/c 마우스로부터의 비장에서 CD11c+ Grl+ B220+ 형질세포양 가지세포 수의 증가를 도시한 것이다. ***는 처리군에서 CD11c+ Grl+ B220+ 세포 수가 통계적으로 유의성있게(p<0.001) 증가하고, 처리군에서 CD11c+ CD8α+ 세포 수는 증가하지 않는 것을 나타낸다.
- 도 26은, 90일전 난알부민으로 면역시키거나, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)로 45일째와 65일째에 처리하거나 처리하지 않고 난알부민으로 접종 또는 접종하지 않은 BALB/c 마우스의 비장에서 CD4+ CD25+ IL-10+ 세포 수의 증가를 도시한 것인데, 상기 비장 세포는 백혈구 군락 분석 전 시험관내(in vitro)에서 OVA 또는 BCG 배양 상청액으로 자극되거나 자극되지 않았다. ***는 처리군에서 CD4+ CD25+ IL-10+ 세포 수가 통계적으로 유의성있게(p<0.001) 증가하는 것을 나타낸다.
-도 27은, 천식 마우스 모델에서 폐 세포 침윤 수로 검정한, 경구투여 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)의 예방 효과를 도시한 것이다. ***는 처리군에서 폐 세포 수가 통계적으로 유의성있게(p<0.001) 증가하는 것을 나타낸다.
- 도 28은, 천식 BALB/c 모델에서 기관지폐 과반응 방지로 검정한, 경피투여된 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD) 1회 투여량의 예방 효과를 도시한 것이다.
- 도 29는, BP2 천식 모델에서 기관지폐 과반응 예방으로 검정한, 경피투여된 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD)의 반응 지연을 도시한 것이다. 기관지폐 과반응 예방은 연속 동결건조 사멸 BCG 투여와 접종 사이에 2주 또는 3주의 지연이 있을 때만 일어난다.
- 도 30은, BP2 천식 모델에서 기관지폐 과반응 예방으로 검정한, 경피투여된 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD 1)의 작용 지속시간을 도시한 것이다. 연속 동결건조 사멸 BCG 예방 효과는 적어도 두 달 동안 지속된다.

실시예 1: 연속 동결건조 사멸 미코박테리아 제조

1) 재료 및 방법

미코박테리움 보비스 BCG 세포[BCG 파스테르 백신 1173P2 균주, 1978년 4월 25일자로 프랑스 파리의 미생물 배양 기탁기관(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15 (France))에 기탁번호 I-059로 기탁(M. Gheorghiu and coll. , 1983, Bull. Inst. Pasteur, 81,281-288)]를 멸균 소턴 배지(Sauton medium, HOOCCH(NH₂O)CH₂CONH₂H₂O(아스파라긴), 4 g/l; C₆H₈O₇-H₂O(시트르산), 2 g/l; K₂HPO₄(수소화인산 이칼륨), 0.5 g/l; MgSO₄-H₂O(황산마그네슘), 0.50 g/l; 시트르산철(III), 0.05 g/l; 글리세롤, 60 ml; 황산아연용액(무균수 10 ml 중의 황산아연 0.155 g/l), 240 ㎕/l, pH 7)에서 성장시킨다. 보다 정확하게는, 상기 1173 P2 균주를 멸균 소턴 배지 130 ml를 포함하는 250 ml 구형 배양 플라스크에서 배양물이 그 지수기(exponential phase)를 끝내는 시간에 대응하는 시간인 14일 동안 37℃에서 성장시킨다.

이 배양물을 2000 g에서 10 분간 4℃로 원심분리시켜 BCG 세포를 펠렛화 한다. 세포 배양 상청액을 따라버리고 펠렛을 증류수에서 완전히 세척(3회)하는데, 매회 세척은 상기 펠렛을 증류수에 재현탁시키고(세포 펠렛 부피 당 물 20 부피) 2000 g에서 10분간 4℃로 원심분리하는 것으로 구성된다.

마지막 세척 후, 펠렛 부피와 동등하거나 두 배 부피의 증류수에 펠렛을 재현탁한다. 물 50 ml중 세균 20 g을 병 벽위에 도말하고 냉동시켜 두께가 약 1 cm인 층을 형성한다. 이 혼합물은 -60℃로 동결된다.

동결된 세포 수현탁액을 도 1B에 기술한 연속 동결건조 프로토콜 조건하에서 연속 동결건조시켜, 본질적으로 모든 물을 제거(잔류수 < 1.5%)한다. 간략히 말해, 압력이 급속도로 0.150 mBar로 감소하고, 아이스 컨덴서 온도가 약 -50℃ 내지 -54℃로 되며, 동결건조 과정이 시작된다. 샘플은 동결된 채로 남고 온도가 정확히 모니터링되지는 않는다. 그 다음, 압력을 34시간 동안 0.1 mBar로 유지하여 본질적으로 모든 물을 제거한다(잔류수 < 1.5%). 실온까지(약 20℃) 온도를 점진적으로 증가시킨다. 그 다음, 건조가 끝날 무렵, 압력을 실온(약 20℃)에서 점차 공기대기압으로 회복시키고, 연속 동결건조 사멸 BCG 세포(약 2 g)를 수확한 후, 실온, 공기대기압에서 저장한다.

연속 동결건조 사멸 BCG 제제에 존재하는 잔류수는 및 칼 피셔의 잔류수분측정법과 756 KF 코울로미터(Coulometer, METHROM)를 이용하여 제조자설명서 내용에 따라 측정한다.

연속 동결건조 사멸 제제내의 생존 세포 존재는 하기 방법으로 확인한다:

- ml당 콜로니 형성 단위(CFU) 수 측정 방법; 연속 동결건조 사멸 제제 0.2 ml 현탁액(1 mg, 예컨대, 수 중 약 10⁹연속 동결 사멸 BCG 세포)를 미들브룩(Middlebrook) 7H10 아가 배지(DIFCO)에 플레이트한 후 이 플레이트를 37℃에서 한달간 항온배양하고/하거나,

- 생존 세포만을 염색하는 형광염료 CFDA-SE(카복시플루오레세인 디아세테에트- 숙시니딜 에스테르; 분자 프로브 참조번호 C-1157) 착색법; 연속 동결건조 사멸 제제 1 ml 현탁액(수 중 약 10⁸연속 동결 사멸 BCG 세포)을 PBS에 1/100로 희석한 CFDA 시약 100 ㎕(저장용액: DMSO 중 1 mg/ml)와 혼합한다. 이 혼합액을 실온으로 60분간 암실에서 항온배양한다. 표지된 세균을 3000 rpm에서 15분간 원심분리하고, PBS로 2회 세척한 후, 동일 완충액에 재현탁한다. 그 다음, 생존 세포의 존재를 형광현미경으로 조사하였다.

2) 결과

상기 재료 및 방법에서 기술되고 도 1B에 정리된 연속 동결건조 방법에 따라 BCG 세포를 연속 동결건조 사멸시켰다. 비교로, BCG 세포를 생 BCG 백신 제제용 표준 방법에 따라 동결건조하였다: BCG 세포(1173P2 균주)를 소턴 배지에서 37℃로 항온배양하고, 지수기 말기에 원심분리에 의해 수확하였고, BCG 세포 펠렛을 글루탐산나트륨(1.5 g/100 ml H₂0)에서 BCG 4 mg/ml 농도로 재현탁하였다. 이 BCG 현탁액을 바이알(0.25 ml/바이알)에 분배하고 도 1A에 도시된 프로토콜에 따라 동결건조 한 후, 1.5 ± 0.5% H₂O를 함유하는 각 바이알을 실온에서 진공 저장(0.06 mBar) 하였다.

상기 재료 및 방법에 기재된 바에 따라 다른 제제에서의 BCG 세포의 생존성을 검정하였다.

칼 피셔의 잔류수분측정법, 배양물 검정 및 CFDA-SE 염색시험에 의해 하기 결과가 관찰되었다:

- 대표적 측정에서 200 mg의 연속 동결건조 사멸 BCG 제제는 1.073 mg의 물을 함유하였는데, 이는 잔류수 0.5%와 같은 것이다.

- 본 발명의 방법에 따라 제조한 연속 동결건조 사멸 BCG 샘플에서는 생 세균은 발견되지 않았다.

- 표준 BCG 백신 제제 방법에 따라 제조된 연속 동결건조 사멸 BCG 제제에서는 50% 내지 60%의 생 세균이 검출되었다.

실시예 2: 연속 동결건조 사멸 미코박테리아 분획의 제조

1) 지방제거 분획 (A 분획)

붕산염 완충액(증류수 중 Na₂B₄0₇ 1OH₂0 0.363%; H₃BO₃ 0.525%; NaCl 0.619% 및 Tween 20 0.0005 %, pH 8)에 현탁된 약 10¹⁰ 연속 동결건조 사멸 BCG 세포 10 mg/ml를 12000 g로 10분간 원심분리하고 그 상청액을 따라내었다. 펠렛을 클로로포름/메탄올(9/1) 1 ml에서 24 시간 실온으로 재현탁시켜 지방을 추출하였다. 12000 g에서 10분간 원심분리하여 클로로포름/메탄올층을 제거한다. 이 클로로포름/메탄올 추출액으로부터의 얻은 지방제거 펠렛을 진공건조 하였다.

2) 당제거 분획 (B 분획)

붕산염 완충액(증류수 중 Na₂B₄0₇ 1OH₂0 0.363%; H₃BO₃ 0.525%; NaCl 0.619% 및 Tween 20 0.0005 %, pH 8)에 현탁된 약 10¹⁰ 연속 동결건조 사멸 BCG 세포 10 mg/ml를 12000 g로 10분간 원심분리하여 상청액을 따라내었다. 펠렛을, 리소짐 1 mg을 포함하는 0.1 M 아세트산나트륨 1 ml에 24 시간동안 37℃로 재현탁시켜 펩티도글리칸을 제거하였다. 분해물을 96℃에서 2분간 가열하고 12000 g에서 1시간 원심분리시켜 펠렛을 수확하였다.

3) DNA아제 및 RNA아제 처리 분획 (C 분획)

붕산염 완충액에 현탁된 약 10¹⁰ 연속 동결건조 사멸 BCG 세포 10 mg/ml를 12000 g로 10분간 원심분리하여 상청액을 따라내었다. DNA아제 1 mg 및 RNA아제 1 mg 및 MgCl₂5 mM를 함유하는 40 mM Tris-HCl 완충액 1 ml에서, 펠렛을 37℃로 24시간 동안 재현탁시켜 핵산을 제거하였다. 분해물을 96℃에서 2분간 가열하고, 12000 g에서 1시간 원심분리시켜 펠렛을 수확하였다.

4) 프로테아제 처리 분획 (D 분획)

붕산염 완충액에 현탁된 약 10¹⁰ 연속 동결건조 사멸 BCG 세포 10 mg/ml를 12000 g로 10분간 원심분리하여 상청액을 따라내었다. 0.1 mg 섭틸리신을 함유하는 0.1 M 아세트산암모늄 완충액 1 ml에서 펠렛을 37℃로 23시간 동안 재현탁하였다. 단백질을 완전히 제거하기 위해, 0.1 mg 섭틸리신을 반응 혼합물에 부가하고 37℃에서 7시간동안 항온배양하였다. 분해물을 96℃로 2분간 가열한 후 12000 g에서 1시간 원심분리하여 펠렛을 수확하였다.

5) 연속 처리 (E 분획)

붕산염 완충액에 현탁된 약 10¹⁰ 연속 동결건조 사멸 BCG 세포 10 mg/ml를 12000 g로 10분간 원심분리하고 그 상청액을 따라내었다.

붕산염 완충액에 펠렛을 재현탁하고, 전술한 클로로포름/메탄올(9/1), 리소짐, DNA아제-RNA아제 혼합물 및 섭틸리신으로 펠렛을 연속 처리하였다. 분해물을 96℃로 2분간 가열하고, 12000 g에서 1시간 원심분리하여 펠렛을 수확하였다.

6) 연속 동결건조 사멸 BCG 제제의 단백질 및 다당류 함량 특성화

a) 재료 및 방법

연속 동결건조 사멸 BCG 제제(10 mg)를 4% 부탄올 수용액 1 ml에 현탁시키고 지르코늄/실리카 비드(0.l mm) 1 g(BIOSPECPRODUCTS, INC.)을 함유하는 두개의 에펜토프 튜브(튜브당 500 ㎕)에 분배하였다. 그 다음 이 튜브를 5분, 15분, 30분, 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 또는 470분 동안에 25회 빈도로, 믹서 밀(MM301, RESCH)에 두었다. 그 다음 이 튜브를 10000 rpm에서 30분간 원심분리하였다; 그 상청액을 회수하였고, 여과(0.22 ㎛ 필터, 밀리포아)하였으며 단백질, 아미노산 및 다당류 농도를 하기와 같이 측정하였다:

- 마이크로 BCA 단백질 시약 키트(PIERCE)를 이용하여 총 단백질 농도를 측정하였다.

- 질량분석기를 이용하여 아미노산 농도 측정 및 분석을 하였다.

- 문헌(S. Melvin, Anal. Biochem. 1953,25, 1656-)에 기재된 안트론 방법을 이용하여 총 다당류 농도를 측정하였다.

5분, 60분 또는 300분에 수집한 세균 추출물 일정량(단백질 5 ㎍)을 SDS-PAGE로 분리하고, 단백질을 PVDF막 위로 이동시킨 후, 미코박테리아 단백질에 대한 다클론 항체 또는 오로다이(Aurodye R)(Pharmacia)로 염색하였다.

b) 결과

추출 후 5분, 60분 또는 300분에 수집한 세균 추출물은 각각 280 ㎍, 500 ㎍ 및 1258 ㎍의 단백질, 190 ㎍, 420 ㎍ 및 880 ㎍의 아미노산 및 697 ㎍, 1267 ㎍ 및 1765 ㎍의 다당류를 함유한다.

도 16에 제시된 결과는, 얼룩없이 뚜렷한 단백질 밴드의 존재에 의해 알 수 있는 바와 같이 연속 동결건조 방법에서는 사멸된 BCG 제제내 단백질의 구조가 보존된다는 것을 보여준다; 연속 동결건조 사멸 BCG 제제 추출물에서 관찰된 단백질 프로파일은 생 BCG 제제에서 얻은 것과 비교할 만하다.

실시예 3: 마우스 모델에서 연속 동결건조 사멸 미코박테리아의 천식 예방 효과

1) 재료 및 방법

a) 동물

분양기관(Centre d'elevage R. Janvier)(Le Genest, Saint Isle, France)에서 숫컷 어미(6 내지 7주) BP2(H-2^q) 마우스를 얻어 특정 무균 상태로 동물 보관실에서 두었다.

b) 천식-유사 알레르겐 특이적 질환에 대한 마우스 모델

식염수중 난알부민 1 ㎍(OVA; ICN Labratories) 및 수산화알루미늄 면역보강제 1.6 mg(최종 부피 0.4 ml)을 숫컷 어미 BP2 마우스에 0일(D0) 및 7일(D7)에 경피투여(목 뒤쪽)하여 면역시켰다. 96일 내지 98일에 식염수 50 ㎕중의 OVA 10 ㎍을 경비접종하여 면역반응을 자극한다. 다르게는, 면역화에 OVA 10 ㎍을 사용하는 것을 제외하고는, OVA에 대한 조건과 동일한 조건에서 수용성 화분(ray-grass pollen) 추출물을 알레르겐으로 사용한다.

c) 미코박테리아 면역조절 조성물의 제조

실시예 1에 기재된 바에 따라 제조된 연속 동결건조 사멸 BCG를, 하기 BCG 제제와 비교하여, BP2 마우스에서 천식 백신으로서 시험하였다.

- 생 BCG

0.05% 트리톤 WR 1339(SIGMA) 및 6% 글리코스를 보충한 벡-프로스카우어(Beck-Proskauer) 배지(Gheorghiu and coll., 1988, J. Biol. Standard., 16, 15-26)에서 미코박테리움 보비스 BCG 파스테르 백신 1173P2 균주를 분산 간균으로서 성장시켰다. 지수기(5 내지 7일)에 상기 세균을 수확하고, 0.05% 트리톤 및 6% 글리세롤을 보충한 벡-프로스카우어 배지에서 -70℃로 저장하였다. 인산염-완충 식염수(PBS)에 적당히 희석시킨 희석액을 미들브룩(Middlebrook) 7H10 아가 배지(DIFCO)에 플레이팅하여 1 ml 당 콜로니형성단위(CFU) 수를 측정하였다. 이 현탁액을 주사(100 ㎕) 직전에 PBS중에서 10⁸, 10⁹ 또는 10¹⁰ CFU/ml 농도로 희석하였다.

-열 사멸 BCG

전술한 생 BCG를 3000 rmp에서 15분간 원심분리하고 그 상청액을 따라내었다. 펠렛을 식염수, 예컨대 붕산염을 포함하는 완충액(증류수 중 Na₂B₄0₇ 1OH₂0 0.363%; H₃BO₃ 0.525%; NaCl 0.619% 및 Tween 20 0.0005 %, pH 8)에 재현탁시키고 이 현탁액을 115℃에서 15분간 가압멸균하였다.

d) 천식 마우스 모델에서 연속 동결건조 사멸 미코박테리아 투여에 대한 치료 프로토콜

전술한 바와 같이 OVA로 숫컷 어미 BP2 마우스를 면역시켰다. 25마리 마우스군을 전술한 바에 따라 제조한 BCG 조성물 100 ㎕로 주사하였다.

- 생 BCG 백신주 1173P2 (10⁷ CFU),

- 열-사멸 BCG (10⁷ CFU와 균등량인 10⁸ 균체),

- 연속 동결건조 사멸 BCG (10 ㎍ 내지 10 mg; 10 ㎍은 10⁷ CFU와 당량) 및

- PBS를, OVA로 먼저 면역시킨 후 D_42-45 내지 D_65-70일에 경피(꼬리기저) 투여하였다.

96일 내지 98일에 식염수 50 ㎕중의 OVA 100 ㎍을 경비접종하여 면역반응을 자극한다; 비교를 위해 PBS 단독을 경비 투여한다.

e) 기관지-폐(BHR) 분석

마취되지 않은 동물에 대한 BHR 연구를 가능하게 하는 기압 체적변동기록계(BUXCO)를 사용하였다. OVA로 면역되고, 상이한 BCG 제제로 처리되거나 처리되지 않은 동물들을, OVA 접종 또는 수용성 화분 추출물로 접종한 후 24시간 후에 시험하였다. 동물들을 체적변동기록계 챔버에 놓았다. 이 동물들의 기본 환기 파라미터를 기록하였고 20초 또는 1분 동안 표준 네불라이저를 사용하여 메타콜린(ALDRICH) 수중 100 mM을 흡입하였고, 메타콜린 분무 투여 후 10분 동안 환기 파라미터를 기록하였다. 이 기간중의 환기의 감소를 기록(곡선하 면적)하고 기관지폐 저항성을 정지증가(Penh)로 표현하였고, 이는 제조자 설명서에 따라 (호기시간(tE)/이완시간 40%(trel) - 1) x 최대 호기량(PEF)/최대 흡입량(PIF) x 0.67로 계산하였다. 매분마다 평균 Penh값을 기록하였다. 그래프 표현을 위해, 매분마다 각 값을 표현하였다.

f) 기관지폐포액(BAL)

치사량의 우레탄(1.5 g/kg; SIGMA)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시켰다. 복부대동맥으로부터 순환혈을 제거하고 주사기가 연결된 케뉼라를 기관에 설치한 후 폐를 PBS 0.7 ml로 3회 세척한 후 세척액을 튜브에 모아 얼음에 보관하였다.

상기 BAL에 존재하는 세포 수를, 자동계수기(ZBI, COULTER사 제공)로 측정하였다. 상이한 세포형(호산구, 호중구, 마크로파지) 퍼센트를 결정하기 위해, 글라스 슬라이드에 시토스핀된 BAL 세포를 DIFF QUICK(BAXTER)로 염색하였다.

g) 피브로넥틴 검정

BAL을 1000 rpm에서 4℃로 10분간 원심분리하고 그 상청액에 존재하는 피프로넥틴을 경쟁 효소 면역측정법(Enzyme Immunometric Assay, EIA)으로 표준 프로토콜(Rennard and coll., Anal. Biochem. , 1980, 205-214)에 따라 검정하였다.

h) 폐 체외이식편의 제조 및 분석

폐를 3 mm 당 대략 1 mm짜리 소 조각으로 절단하였다. 각 폐에서 얻은 5 조각중 4 조각을 AIM V 배양배지(Life Technologies) 1 ml를 포함하는 조직 배양 플레이트 웰에 놓았다. 폐 체외이식편을 단독으로 배지에서 배양하여 기본수준 측정을 하다; 다르게는 BCG 배양 여과물(10 ㎍/ml)을 배양액에 가하여 미코박테리아 특이 세포를 밝히거나, 항-CD3 단클론 항체를 배양액에 가하여 T 림프구의 반응성을 밝혔다. 24 시간 후에, 상업용 키트를 사용하여 제조자 설명에 따라 ELISA법으로 상이한 림포킨(IFN-γ, TNF-α, IL-10...)의 존재를 검정하였다.

폐 전체(기관은 없슴)를 콜라게나아제와 DNA아제 배지에서 분해시켜, 상이한 형광색소(fluorochrome)로 표지된 다양한 단클론항체를 사용하여 유세포분석기(Flow cytometer)상에서 침윤세포를 계수하였다.

i) 폐의 조직적합성 분석

완충 포름알데히드에서 폐 전체를 고정시키고 조직적합성 분석을 하였다. 점막 및 점막 함유 세포를 염색하기 위해 쉬프 염색(Schiff)을 사용하였다. 대조 염색으로 헤마톡시-에오신을 사용하였다. 슬라이드를 검사하고, 원 샘플에 대한 지식 없이 슬라이드를 기록하는 관찰자가 세포 침윤 및 점막 함량을 평가(맹검)하였다.

j) 사이토킨 검정

면역화 마우스군에서 얻은 혈청 및 BAL 샘플에 존재하거나 이 마우스군으로부터 얻은 폐 체외이식편 배양에 존재하는 사이토킨을 다음의 방법으로 검정하였다: ELISA법으로 IFN-γ, IL-10 및 IL-12를 시험하였고, EIA (Enzyme Immunometric Assay)법으로 TNF-α및 IL-5 를 시험하였다.

k) OVA-특이적 IgE 검정

혈청내 존재하는 OVA-특이적 IgE를 표준 프로토콜(Hansen and coll. , J. Immunol., 2000, 223-230)에 따라 ELISA법으로 검정하였다.

l) 통계 분석

그룹 당 동물 수(n)는 4 < n < 8이었다. 개별 경우에 대해 스튜던트의 양쪽꼬리 t-테스트(student's two-tailed (t) test)로 통계처리 하였다.

2) 결과

a) 기관지-폐(BHR) 분석

OVA 또는 수용성 화분 추출물로 면역되고 상이한 BCG 제제로 처리되거나 처리되지 않은 동물들을, OVA 접종 또는 화분(ray-grass pollen) 접종 후 24시간 후에 시험하였다.

프로인트 불완전 항원보강제보다 더 강력한 알러지 반응 면역보강제인 수산화알루미늄과 결합된 난알부민으로 면역화된 Th2 배경을 갖는 BP2 마우스를 이용하는 이 연구에 선택된 동물들은, 이렇게, 앞서 인용한 CC Wand 및 coll이 사용한 프로인트 불완전 면역보강제에 있는 난알부민으로 면역화된 BALB/c 마우스보다 더 스트린전트하다.

도 2 및 3에 제시된 데이타는 이러한 스트린전트한 천식 모델에서 연속 동결건조 사멸 BCG(10 ㎍)는, 비처리 대조군과 비교하여 메타콜린에 대한 낮은 반응성으로 표현된 바와 같이, 통계적으로 유의한(p<0.001) 기관지-폐 보호 효과가 있다는 것을 알려준다. 반대로, 이렇게 스트린전트한 천식 모델에서, 생 BCG(10⁷ CFU) 또는 열-사멸 BCG(10⁸ 균체)로 처리한 동물에서는 유의성있는 예방 효과가 관찰되지 않았다. 수용성 화분(ray-grass pollen) 추출물을 알레르겐으로 사용한 경우(도 17)에는, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD) 제제에서 상기 천식에서와 유사한 통계적 유의성(p<0.01)이 관찰되었다.

b) 기관지폐포액(BAL)

연속 동결건조 사멸 BCG 10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg 또는 10 mg으로 처리한 마우스군에서 호산구 수의 감소(p < 0.05) 및 호중구 수의 감소(p < 0.05)가 관찰된다(도 4, 5, 15A, 18A 및 18B).

염증반응을 반영하는 기도 삼출물내 피브로넥틴의 농도는, 연속 동결건조 사멸 BCG(10 ㎍, 도 6)로 처리한 마우스군에서 매우 유의성있는 감소(p < 0. 001)를 보여준다.

알러지 반응중의 호산구 수 증가와 관련된 림포킨인 IL-5에 관한 검정은 연속 동결건조 사멸 BCG로 처리한 군에서 BAL과 혈액 모두에서 IL-5가 감소한 것을 보여준다(도 7, 8 및 15).

Th2 사이토킨인 IL-4에 관한 검정은, 연속 동결건조 사멸 BCG 10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg 또는 10 mg으로 처리한 마우스군의 BAL에서 IL-4가 통계적으로 유의성있게 감소한 것을 보여준다(도 18C).

비교해보면, 생 BCG(10⁷ CFU) 또는 열-사멸 BCG(10⁸ 균체)로 처리한 마우스에서는 유의성있는 예방 효과가 관찰되지 않았다.

이러한 결과는, 폐 염증반응의 감소(호중구 및 호산구의 생성, 피브로넥틴 삼출)에 의해 증명되는 바와 같이 연속 동결건조 사멸 BCG는 천식 증상을 치료할 수 있는 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 Th2 배경을 갖는 스트린전트 천식 모델(BP2 마우스)에서, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 처리군에서는 예방 효과가 관찰되지 않았다.

c) 조직적합성 분석과 폐 침윤 세포

폐의 조직적합성 분석은, 연속 동결건조 사멸 BCG(EFD) 처리가 폐의 백혈구 침윤 및 기관지상피의 점막 화생을 예방한다는 것을 보여준다.

이러한 결과는, 연속 동결건조 사멸 BCG 처리가 폐에서 통계적으로 유의성있는 정도(p<0.001)의 백혈구 침윤 감소(도 19)를 유도한다는 것을 증명하는 폐 조직에 존재하는 세포의 유세포분석기(flow cytometry) 분석으로 확인된다; 상이한 백혈구 군락의 분석은(도 20), 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서 마크로파지(CDllb+), 다형핵세포(Grl+) 및 가지세포(CDllc+) 수의 감소를 보여준다.

d) 사이토킨 분석

서로 다른 연속 동결건조 사멸 BCG 제제로 처리된 마우스군으로부터 얻은 폐 생검을 BCG 또는 항-CD3 mAb에 의해 분비되는 정제 단백질의 존재 또는 부존재하에서 배양하고, 그 상청액에서 IFN-γ및 IL-10의 생성을 검정하였다.

도 9 및 21에 제시된 결과는, IFN-γ생성에 BCG 면역화가 필요하다는 것을 알려준다(도 9A). 연속 동결건조 사멸 BCG 군에서 관찰된 낮은 농도의 IFN-γ(도 9A)는 다른 BCG 면역화 군에서 관찰된 농도에 비해 통계적으로 유의성있지 않다. 항-CD3 항체로 T 림프구를 비-특이적으로 자극하면 서로 다른 군(처리 또는 비처리군)에서 유사한 농도의 IFN-γ가 관찰되는데 이는 BCG 면역은 폐에 존재하는 T 림프구 수를 변화시키지 않는다는 것을 암시한다(도 9B).

도 21에 제시된 결과 역시 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 투여군과 비교하여 연속 동결건조 사멸 BCG 투여군에서 관찰되는 통계적으로 유의성있는(p < 0.001) 높은 수준의 IL-10을 보여준다.

연속 동결건조 사멸 BCG 투여군과 다른 BCG 제제 투여군간에 폐의 사이토킨 발현 프로필의 차이는, 알레르겐 전달 후 폐조직에 존재하는 림프구 군락의 변화와 연속 동결건조 사멸 BCG 활성이 상호 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 폐 체외이식편에 의해 분비된 고용량의 IL-10과 저용량의 IFN-γ는 연속 동결건조 사멸 BCG 군 폐조직에서 알레르겐 전달 후 조절 세포가 존재한다는 것을 역설하는 것이다.

e) 항-OVA 특이적 IgE의 농도

상이한 BCG 제제로 처리(치료 프로토콜)로 처리 전 OVA로 면역화하면 항-OVA IgE의 농도는 모든 군에서 동일한데(도 10), 이는 연속 동결건조 사멸 BCG에서 관찰되는 예방 효과가 IgE 농도에 직접 영향 미치지는 않는다는 것을 암시한다.

실시예 4: 열-사멸 또는 연속 동결건조 사멸 BCG로 자극시킨 폐포 마크로파지가 생산한 사이토킨의 분석

1) 재료 및 방법

실시예 3에서 기술한 바에 따라 구입하고 유지시킨 BP2 및 BALB/c 마우스(H-2^d)를 실시예 3b에 기술된 바에 따라 OVA로 면역시켰다. OVA 마지막 주사 후 일주일 후에, 치사량의 우레탄(1.5 g/kg; SIGMA)을 복강 투여하여 마우스를 마취시켰다. 복부대동맥으로부터 순환혈을 제거하고, 주사기가 달린 케뉼라를 기관에 설치한 후 송아지 태아 혈청 2%를 함유하는 HBSS 배지(Life Technologies) 0.5 ml로 2회, 1 ml로 5회 상기 폐를 세척하였다. BAL에 존재하는 마크로파지 수를 콜터사(COULTER)가 공급하는 자동계수기(ZBI)로 측정하엿다. 마크로파지를 1000 rpm에서 20분간 실온으로 원심분리하고, 그 농도를, 송아지 태아 혈청 3%, 글루타민 2 mM, 페니실린 100UI/ml 및 스트렙토마이신 10 ㎍/ml를 함유하는 RPMI 1640 배지중의 340. 10³ 세포/ml의 농도로 맞추었다. 그 다음, 마이크로파지를 조직-배양(100000 세포/웰)용 96 웰 플레이트에 분배하고 5% CO₂존재하에 37℃에서 적어도 2 시간 동안 항온배양하였다. 그 다음, RPMI 배지로 수차례 세척하여 비-부착성 세포를 제거하고, 열-사멸 BCG 또는 연속 동결건조 사멸 BCG(마크로파지당 5당량 CFU, 예컨대, 두 BCG 제제에 대해 1.6 10⁶ CFU/ml) 존재하에 마크로파지를 배양하였다; 이. 콜라이 지질다당류(LPS; 1㎕/ml)와 OVA (10 ㎕/ml)를 대조군으로 사용하였다. 상기 상이한 제제를 첨가한 지 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 세포 배양 상청액을 수집하고 -20℃로 즉시 냉동시켰다.

2) 결과

도 11 및 12의 결과는 다음을 보여준다:

1) Th1 세포성숙 및 항-알러지 사이토킨(IFN-γ) 생성에 관계하는 IL-12는, 연속 동결건조 사멸 및 열-사멸 BCG 제제로 자극된 BALB/c 및 BP2 마우스 폐포 마크로파지에 의해 생성된다.

2) 중요한 염증성 부작용(괴사, 괴양...)과 관련될 수 있는 사이토킨인 TNF-α 는, 열-사멸 BCG 제제로 자극된 BALB/c 및 BP2 마우스 폐포 마크로파지에 의해서 생성되고 본 실험에서 사용한 농도의 연속 동결건조 사멸 BCG 제제에 의해 자극된 폐포 마이크로파지에 의해서만 생성된다;

이러한 결과는, 열-사멸 및 생 BCG 주사 후 발견되는 부작용과는 대조적으로 , 연속 동결건조 BCG 주사 후에 관찰되는 최소의 부작용을 뒷받침한다.

실시예 5: 연속 동결건조 사멸 BCG 투여는 BCG 정제 단백질 유도체(PPD)에 대한 지연형 과감작(DTH)을 유발하지 않는다

1) 재료 및 방법

실시예 3d에 기재된 바와 같이 마우스를 OVA로 면역시키고 상이한 BCG 제제로 처리하거나 처리하지 않았다. 상이한 BCG 제제를 제1회 경피주사하고 100일 후, 상이한 마우스군에 대해, 인간의 결핵진단에 사용되는 BCG 정제 단백질 유도체(PPD)에 대한 지연형 과감작(DTH) 시험을 수행하였다. 보다 정확하게는, 식염수(4 ㎍)중의 PPD 50 ㎕를 마우스 발바닥에 주사하고 24시간 후 발바닥 부종을 측정하였다.

2) 결과

도 13에 제시된 결과는, 연속 동결건조 사멸 BCG(10⁷ CFU 또는 10 ㎍과 동량)로 면역시킨 마우스는, 음성 피부시험에서 보는 바와 같이 BCG 정제 단백질 유도체에 대한 지연형 과감작이 일어나지 않는다는 것을 보여준다. 단지 다량(1 mg 및 10 mg)의 연속 동결건조 사멸 BCG를 주사한 후에만 마우스에서 PPD에 대한 약간의 감작이 일어났다. 비교해보면, 피부 양성시험에 의해 알 수 있는 바와 같이, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG로 면역시킨 마우스에서는 저용량에서조차(생 BCG 10⁷ CFU 또는 열-사멸 BCG 10⁸ 균체) BCG 정제 단백질 유도체에 대한 과감작이 진행한다. 이러한 결과는, 특이적 자극에 대해 높은 수준의 IFN-γ생성을 보이는 다른 BCG 제제 처리군과 대조적으로 연속 동결건조 사멸 BCG 제제 처리군에서는 특이적 자극에 대해 소량의 IFN-γ생성을 보여주는 선행 결과(도 9 및 21)와도 상관성 있는 것이다. 마찬가지로, PPD에 대한 기니 피그의 반응성도 연속 동결건조 사멸 BCG 투여후에는 최소의 정도이다.

이러한 결과는, 연속 동결건조 사멸 BCG 면역화에 따라 특이적 T 림프구의 특정 서브형이 선택되거나 아니면 특이적 T 세포가 어떤 특정 조직에 고정되는 것을 말해준다. 그 결과, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG 면역과는 대조적으로, 연속 동결건조 사멸 BCG 면역은 DTH 피부시험에 의한 결핵 진단을 방해하지 않는다.

실시예 6: 기니피그 모델에서 연속 동결건조(EFD) 사멸 미코박테리아의 천식 예방 효과

1) 재료 및 방법

식염수중 난알부민 10 ㎍(OVA; ICN Laboratories)과 칼륨명반 1 mg(최종부피 0.4 ml)을 경피투여하여. 수컷 어미 기니피그(350 g)를 면역시켰다.

3주 후, 연속 동결건조 사멸 BCG(10⁷ 또는 10⁸ CFU 당량, 즉, 10 ㎍ 또는 100 ㎍) 또는 PBS(대조군)를 상기 기니피그(10마리씩 3군)에 피내투여하였다.

마우스에 대해 사용한 것과는 다른 방법으로 기니피그에 대해 기관지-폐 반응성을 검정한다; 알레르겐을 접종하기 24시간 전에 에어로졸화 히스타민의 용량을 증가시키면서(20, 50, 100 또는 400 ㎍) 각 동물의 감작성을 평가하였고, 상승된 Penh값을 제공하는 히스타민의 최고 농도를 히스타민에 대한 기본 감작 농도로 간주하였다.

알레르겐 접종 24시간 후에도 유사한 측정을 하였다; OVA 면역된 기니피그는 히스타민에 대해 보다 높은 감작성을 진행시키므로, 동일한 Penh값을 얻기 위해서는 접종전보다 적은 양의 히스타민이 필요하다.

보다 정확하게는:

각 그룹의 6마리 기니피그에 대하여 BCG 또는 대조군 생성물 투여 7 내지 10주 후에(예, 난알부민 면역화 후 10 내지 13주 후) 히스타민 시험에 의해 기관지-폐 반응성을 시험하였다.

각 기니피그에 대해 기압 체적변동기록계를 이용하여, 명확한 기관지수축을 유발하는 히스타민 용량을 측정한다.

각 기니피그는 그 자신의 대조군이 되는데 이는 시험 첫날 기본 반응성이 측정되는 것을 알기 때문이다.

24시간 후에, 난알부민 에어로졸을 투여한다. 3일째에 히스타민 반응성을 다시 측정한다.

난알부민의 투여는 히스타민에 대한 기관지-폐 과-반응성을 증가시킨다.

2) 결과

도 14의 결과는, 각각 10 ㎍(10⁷ CFU 당량)(도 14B) 및 100 ㎍(10⁸ CFU 당량)(도 14C)의 본 발명에 따른 연속 동결건조 사멸 BCG로 처리된 5/6 및 6/6 기니피그는 기관지-폐 과반응성에 대해 예방되는데(히스타민 감작 증가가 없슴)반해 대조군(도 14A)(BCG 처리하지 않음)에서는 히스타민에 대한 기관지-폐 과반응성이 유의성있게 증가한다(x4)는 것을 보여준다.

실시예 7: 연속 동결건조 사멸 BCG의 최소의 부작용

a) 빈혈 및 저혈소판증이 없슴

실시예 3d에 기재된 바와 같이 연속 동결건조 사멸 BCG(10 ㎍) 또는 다른 BCG 제제를 마우스에 정맥주사하거나 마우스를 상기 제제로 처리하지 않았다. 주사 후 18일에, 혈액 샘플에서 적혈구 수와 혈소판 수를 측정하였다.

도 22에 제시된 결과는, 생 BCG 및 열-사멸 BCG 처리군과는 대조적으로, 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서는 빈혈이나 저혈소판증이 관찰되지 않았음을 보여준다.

b) 주사부위의 염증반응 최소화

0일에, 실시예 3d에 기재된 서로 다른 BCG 제제들을 마우스군에 경피투여(발바닥 부위에)하였다. 생 BCG 백신은 단 일회만 주사하고 열-사멸 BCG와 연속 동결건조 사멸 BCG는 2회(0일째 및 36일째) 주사하였다. 그 다음 10주간 매주 발바닥증가를 측정하였다.

도 23에 제시된 결과는 연속 동결건조 사멸 BCG는 최소한의 염증 부작용을 보인다는 것을 보여준다.

c) LPS 자극 후 TNF-α 생성의 감소

전술한 바와 같이 상이한 BCG 제제로 미리 18일전에 처리한 마우스로부터의 폐 체외이식편을 LPS 존재하 또는 부존재하에 시험관내(in vitro)에서 유지하고, 상업용 키트를 이용하여 ELISA법으로 제조자 설명서에 따라 TNF-α생성을 측정하였다. 도 24에 제시된 결과는, 생 BCG 및 열-사멸 BCG 처리와는 대조적으로, 연속 동결건조 사멸 BCG 처리는 마크로파지의 생성 및/또는 활성화를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 8: 연속 동결건조 사멸 BCG 경피주사 후 배출 림프절 및 비장에 있는 세포의 분석

1) 재료 및 방법

실시예 3d에 기재된 바와 같은 상이한 BCG 제제들로 48시간 전에 경피주사된 마우스의 배출 림프절에 있는 세포를, 상이한 백혈구 군락의 세포 표면 마커로 향하는 다양한 형광색소로 표지된 단클론항체를 이용하여 유세포측정방법으로 분석하였다.

OVA 또는 BCG 배양 상청액 존재하에 시험관내(in vitro) 자극시킨 후, 또는 자극시키지 않은 후, 연속 동결건조 사멸 BCG 를 경피주사한 마우스의 비장에 존재하는 세포를 전술한 바와 같이 분석하였다.

2) 결과

a) 배출 림프절

배출 림프절에 있는 세포의 분석은, 생 BCG 또는 열-사멸 BCG와 비교하였을 때 연속 동결건조 사멸 BCG 경피투여 48시간 후 림프절내 존재하는 세포가 3배 내지 5배 더 많았다는 것을 보여준다. 연속 동결건조 사멸 BCG 주사 후 4일간의 상이한 백혈구 군락에 대한 역학적 분석은, 48시간에서 가지세포(CD11 c+) 수의 일시적인 증가 및 6시간 내지 96시간에서의 B220+ 및 CD4+ 림프구 수의 증가를 보여준다.

b) 비장

비장내 세포의 분석은 다음의 결과를 보여준다:

- 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군에서 CDllc+ Grl+ B220+ 혈장세포양 가지세포 수가 유의성있게 증가한 반면 동일군에서 CD8a+ 세포 수의 증가는 관찰되지 않음(도 25).

- OVA 또는 BCG 배양 상청액으로 시험관내 자극된 또는 자극되지 않은 연속 동결건조 처리군에서 CD4+ CD25+ IL-10+ 세포 수의 유의성있는 증가(도 26).

이 결과는, 천식 마우스 모델에서 연속 동결건조 사멸 BCG는, 알레르겐(OVA 또는 수용성 화분)으로 미리 감작시킨 마우스에서 면역조절 세포를 유도하는 세포(CDllc+ Grl+ B220+ 혈장세포양 가지세포) 또는 그 자체가 면역조절 세포인 세포(CD4+CD25+IL-10+ 세포)의 수를 유의성있게 증가시키며 그 결과 천식 증상에 대한 예방 효과가 있다는 것을 보여준다.

실시예 9: 연속 동결건조 사멸 BCG는 경구투여에 의해 활성이 있다

실시예 3d에 기재한 바와 같이 OVA로 미리 면역시킨 마우스에 연속 동결건조 사멸 BCG 1 mg을 42일, 44일, 46일 및 62일, 64일 66일에 경구 투여 또는 투여하지 않은 다음, 96일에 OVA 접종 또는 접종하지 않았다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 폐 세포 침윤을 계수하여 연속 동결건조 사멸 BCG의 예방 효과를 평가하였다.

*이 결과는, 비처리군과 비교하여 연속 동결건조 사멸 BCG 처리군 폐에서 총 세포 수가 유의성있게(p<0.001) 감소하였다는 것을 보여준다(도 27). 백혈구 군락 분석은 처리군의 폐에서는 마크로파지, 다형핵 및 가지세포 수가 유의성있게 감소한 것을 보여준다.

실시예 10: 연속 동결건조 사멸 BCG의 활성 투여량, 투여 리듬, 작용 지속시간 및 작용 지연 측정

미리 면역된 마우스에 연속 동결건조 사멸 BCG를 경피주사하고 OVA로 접종한 다음 실시예 3에 기재한 바와 같이 그 활성을 시험하였다.

a) 활성 투여량 및 투여 횟수

어미 마우스를 0일 및 7일에 OVA로 감작시키고 45일에 한 번 또는 45일과 65일에 두 번 연속 동결건조 사멸 BCG를 경피투여한 후, 96일에 난알부민으로 접종하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 BP2 천식 모델에서 기관지폐 과반응성의 예방으로 연속 동결건조 사멸 BCG의 활성을 시험하였다.

최소 투여량(10 ㎍)은 활성이 있었고 100 ㎍이상에서는 활성이 증가하지 않았다.

연속 동결건조 사멸 BCG 일회 투여(10 ㎍)에서만 예방 효과가 관찰되었다(도 28).

b) 연속 동결건조 사멸 BCG 작용의 지연

연속 동결건조 사멸 BCG의 효능을 얻기 위한 시간대를 결정하기 위해, 어미 마우스(1군당 6마리)를 OVA로 0일과 7일에 감작시키고, 14일에 연속 동결건조 사멸 BCG를 경피주사한 후 21일, 28일 또는 35일에 OVA로 접종하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 BP2 천식 모델에서 기관지폐 과반응성의 예방으로 연속 동결건조 사멸 BCG의 활성을 시험하였다.

기관지폐 과반응성 예방은 연속 동결건조 사멸 BCG 투여와 접종 사이에 2주 내지 3주간의 간격이 있을 때만 일어난다(도 29); 이 결과는 연속 동결건조 사멸 BCG가 활성화되기 전에 소정 세포 군락의 모집과 확장이 필요하다는 것을 말해준다. 이 결과는 또한 마우스 천식을 예방하기 위해서는 연속 동결건조 사멸 BCG 1회 투여량만으로 충분하다는 것을 확인해준다.

c) 연속 동결건조 사멸 BCG의 작용 지속시간

연속 동결건조 사멸 BCG의 작용 지속시간을 결정하기 위해, 수컷 어미(1군당 6마리)를 0일 및 7일에 OVA로 감작시키고, 45일과 65일에 연속 동결건조 사멸 BCG 100 ㎍을 경피투여한 다음, 96일 또는 42일에 OVA로 접종하였다. 연속 동결건조 사멸 BCG의 활성은 실시예 3에 기재한 바와 같이 BP2 천식 모델에서 기관지폐 과반응 예방 효과 및 폐 세포 침윤 계수로 측정하였다.

이 결과는, 연속 동결건조 사멸 BCG의 예방 효과는 적어도 두 달간 지속된다는 것을 보여준다(도 30).

d) 연속 동결건조 사멸 BCG 투여의 예방 대 치료 프로토콜

전술한 선행 결과는 "치료 프로토콜"(알레르겐 면역화 후 투여)에서의 연속 동결건조 사멸 BCG의 효능을 증명해준다. 따라서, 예방 프로토콜에서의 연속 동결건조 사멸 BCG의 효능을 평가하기 위해서는, 마우스를 다음과 같이 처리하였다:

- 어미 마우스(생후 6주 또는 7주; 1군당 6마리)를 OVA 면역화 전 14일, 24일 또는 28일 전(날짜-14, -21 및 -28)에 연속 동결건조 사멸 BCG(100 ㎍)를 경피주사하고, 0일과 7일에 OVA로 면역시킨 다음 14일에 OVA로 접종하였다.

- 신생 마우스(생후 7일 내지 8일 마우스, 1군당 6 내지 8마리)를 OVA 면역 전 56일(날짜 -56일)에 연속 동결건조 사멸 BCG (100 ㎍)로 경피주사 또는 경비투여하였고, 0일 및 7일에 OVA로 면역시킨 다음, 14일에 OVA로 접종하였다.

예방 프로토콜에서 연속 동결건조 사멸 BCG의 활성은 실시예 3에 기재한 바와 같이 BP2 천식 모델에서 기관지-폐 과반응성 예방 효과로 평가하였다.

어미 마우스에서의 결과는, 예방 프로토콜에서는 감작 수일 전(2주 및 3주)에 제제를 투여하는 경우에만 연속 동결건조 사멸 BCG가 예방 효과가 있다는 것을 보여준다.

신생 마우스에서의 결과는, 경피주사할 때만 연속 동결건조 사멸 BCG가 예방 프로토콜에서 예방 효과가 있고 이러한 조건에서 경비투여는 활성이 저조하였다는 것을 보여준다.

Claims

자가항원 또는 알레르겐에 대한 면역반응의 조절을 유도하는 유효량의, 변성되지 않은 사멸 미코박테리아 종 세포 또는 하나 이상의 그의 분획을 포함하는 세균 제제를 포함하는, 자가면역질환 및 알러지로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자가면역질환이 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론씨병 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알러지가 천식, 알러지 비염, 결막염 및 아토피 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미코박테리아 종이 미코박테리아 보비스 및 미코박테리아 바카에로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미코박테리아 보비스가 미코박테리아 보비스 BCG 균주인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세균 제제가 적어도 하기 단계를 포함하는 연속 동결건조 방법에 의해 수득될 수 있는, 연속 동결건조되고 변성되지 않은 사멸 미코박테리아 종 세포를 포함하는 동결건조된 제제인 약제학적 조성물:
- 생 미코박테리아 종 세포의 배양물을 수확하는 단계;
- 물 또는 염 수성 용액에서 상기 미코박테리아 종 세포를 동결시키는 단계;
- 98.5% 이상의 물이 제거되기에 충분한 시간 동안 상기 동결된 미코박테리아 종 세포를 동결건조제로 건조시켜 사멸시키는 단계; 및
- 상기 연속 동결건조되고 변성되지 않은 사멸 미코박테리아 종 세포를 수거하는 단계.
제1항에 있어서, 경구투여, 설하투여, 경비투여 또는 비경구투여용으로 제형화된 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 비경구투여가 경피투여인 약제학적 조성물.
자가항원 또는 알레르겐에 대한 면역반응의 조절을 유도하는 유효량의, 제6항에서 정의된 연속 동결건조되고 변성되지 않은 사멸 미코박테리아 종 세포 또는 제1항에서 정의된 변성되지 않은 사멸 미코박테리아 종 세포의 하나 이상의 분획을 포함하는 동결건조된 제제, 및 제1항에서 정의된 세균 제제와 구별되는 약제학적으로 허용되는 담체, 첨가제, 면역촉진제, 면역보강제 또는 면역조절제의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 항당뇨제, 항히스타민제 또는 항염증제의 하나 이상을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.