CN114601832A

CN114601832A - 犬尿喹啉酸在制备改善hiv-1相关神经认知功能障碍药物中的应用

Info

Publication number: CN114601832A
Application number: CN202111459121.9A
Authority: CN
Inventors: 曹虹; 李煜彬; 伦静娴; 高雪锋; 龚泽龙
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明公开了犬尿喹啉酸在制备改善HIV‑1相关神经认知功能障碍药物中的应用，所述色氨酸代谢产物包括犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐。在本发明中，发明人通过体外和体内试验，有效的说明了特定剂量的犬尿喹啉酸能够有效抑制HIV‑1gp120导致的神经细胞的炎症反应和凋亡，修复神经细胞损伤，减轻脑组织损伤，改善HAND造成的认知障碍，从而具有显著改善HIV并发的HAND症状的作用。

Description

犬尿喹啉酸在制备改善HIV-1相关神经认知功能障碍药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及犬尿喹啉酸在制备改善HIV-1相关神经认知功能障碍药物中的应用。

背景技术

HIV-1是人类面临的最具有挑战的传染病之一。虽然高效抗逆转录病毒疗法(HAART，即鸡尾酒疗法)已成功地实现了有效并长期抑制艾滋病毒，但并不能全面清除艾滋病毒感染者体内的病毒。随着感染者预期寿命的延长，慢性并发症成为一个值得关注的问题。HIV-1 感染除了引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)以外，还会导致一系列系统性的并发症，例如慢性炎症和HIV相关神经认知功能障碍(HAND)。HAND的症状表现为涵盖轻度的认知障碍以及严重至神经系统痴呆紊乱，而且，HIV-1并发HAND的可能性很高，大约有50％的HIV感染者会表现出认知障碍，从而严重影响患者的心理健康、运动功能、学习和执行功能。相关技术表明，HAND已被划分为神经退行性疾病，而神经退行性疾病的特征是大脑和脊髓神经元的退化，这种退化可能最终导致神经认知功能的进行性改变。

目前，世界范围内对于开发可以减缓HAND疾病进展和防止神经元死亡的神经保护剂方面的研究进展缓慢，尚无明确的能够有效治疗HAND的特效药物和治疗策略。因此，亟需能够开发一种能够用于预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍的药物或治疗方案，其不仅能够有效改善HIV患者生存质量，而且对于临床中HIV-1并发的HAND治疗及预防具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出色氨酸代谢产物犬尿喹啉酸在制备改善HIV-1相关神经认知功能障碍药物中的应用，能够有效抑制 HIV-1 gp120导致的神经细胞的炎症反应和凋亡，修复神经细胞损伤，减轻脑组织损伤，改善 HAND造成的认知障碍，从而具有显著改善HIV并发的HAND症状的作用。

本发明的第一个方面，提供色氨酸代谢产物在制备预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍试剂中的应用。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述色氨酸代谢产物包括3-羟基犬尿氨酸或其药学上可接受的盐、邻氨苯甲酸或其药学上可接受的盐、犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐中的至少一种。

犬尿氨酸通路的起始步骤是由吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO-1，IDO-2)和色氨酸-2，3- 双加氧酶(TDO)两种酶将色氨酸转化为N-甲酰基-犬尿氨酸，N-甲酰基-犬尿氨酸不稳定，随即由犬尿氨酸甲酰胺酶转化为犬尿氨酸。犬尿氨酸在犬尿氨酸-3-单氧化酶(KMO)作用下完成羟基化生成3-羟基-犬尿氨酸(3-HK)；或在犬尿氨酸酶的催化下生成邻氨苯甲酸(ANA)；或在犬尿氨酸转氨酶家族的催化下生成终产物犬尿喹啉酸。因此，3-羟基-犬尿氨酸(3-HK)、邻氨苯甲酸(ANA)和犬尿喹啉酸也被认为是色氨酸代谢产物。

色氨酸代谢物参与调节包括宿主微生物群信号传导、免疫细胞反应和神经元兴奋性在内的各类生命活动过程。发明人发现，犬尿氨酸途径(KP)在艾滋病-痴呆综合征及其他炎症性脑部疾病等相关神经毒性的发病机制中发挥有重要作用。

在本发明的一些优选实施方式中，所述色氨酸代谢产物为犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述色氨酸代谢产物为犬尿喹啉酸。

犬尿喹啉酸，别名为4-羟基喹啉-2-甲酸，化学式为C₁₀H₇NO₃，分子量为189.17，CAS号为492-27-3，结构式如式1所示。

犬尿喹啉酸(KYNA)作为色氨酸降解犬尿氨酸途径主要的神经活性代谢物，具有极高的应用价值。KYNA在调节神经可塑性和认知方面起着重要作用，发明人发现，胶质细胞中合成的犬尿喹啉酸能够严密控制中脑多巴胺能和谷氨酸等神经递质的释放，是改善脑功能或有效治疗脑功能障碍的重要靶点。而在本发明中，在不同的神经毒性实验条件下，均能发现提高 KYNA水平可以起到神经保护作用。

在本发明的一些优选实施方式中，所述的犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐的使用剂量为5μM～1mM。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐的使用剂量为5μM～100μM。

在本发明的一些优选实施方式中，所述色氨酸代谢产物通过色氨酸给药后经体内代谢产生。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述色氨酸的给药剂量和形式为0.1wt％的浓度自由饮用。

本发明的第二个方面，提供色氨酸代谢产物在制备神经细胞损伤修复试剂中的应用。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述神经细胞包括神经元和胶质细胞。

在本发明的一些优选实施方式中，所述神经细胞为胶质细胞。

在本发明实施例中，发明人以SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞为示例，展示了外源性犬尿喹啉酸对于SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞损伤的修复作用。

在本发明的一些优选实施方式中，所述色氨酸代谢产物包括3-羟基犬尿氨酸或其药学上可接受的盐、邻氨苯甲酸或其药学上可接受的盐、犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐的使用剂量为 5μM～1mM。

在本发明实施例中，发明人利用HIV-1 gp120转基因小鼠构建HAND小鼠模型，以高色氨酸喂养的方式提高脑内内源性KYNA浓度，发现其能降低gp120诱导的神经毒性效应，进而缓解HAND进展。

在本申请中，在体外水平构建外源性gp120诱导的神经毒性模型，施加一定浓度外源性 KYNA处理；同时结合，通过从而为临床治疗HAND提供新靶标、新途径。

本发明的第三个方面，提供色氨酸代谢产物在制备抗炎药物中的应用。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述色氨酸代谢产物包括3-羟基犬尿氨酸或其药学上可接受的盐、邻氨苯甲酸或其药学上可接受的盐、犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐中的至少一种。

本发明的第三个方面，提供犬尿喹啉酸激动剂在制备预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍试剂中的应用。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述犬尿喹啉酸激动剂能够上调犬尿喹啉酸内源性分泌，提高受试者体内犬尿喹啉酸含量。

在本发明的一些优选实施方式中，所述犬尿喹啉酸激动剂包括色氨酸。

本发明的有益效果是：

1.在本发明中，发明人发现犬尿喹啉酸能够有效抑制HIV-1 gp120导致的神经细胞的炎症反应和凋亡，减轻脑组织损伤，改善HAND造成的认知障碍，从而具有显著改善HIV并发的HAND症状的作用。

2.在本发明中，发明人发现了犬尿喹啉酸对于神经细胞促炎因子的表达具有抑制作用，能够显著降低细胞内炎症因子IL-1β、IL-1α和TNF-α的转录，从而发现了犬尿喹啉酸具有较好的炎症抑制效果。

3.在本发明中，发明人发现了犬尿喹啉酸具有较好的细胞修复能力，尤其是对于神经细胞具有较强的保护作用。犬尿喹啉酸能够抑制HIV-1感染后gp120蛋白诱导的细胞凋亡，从而减缓HIV-1感染及并发的HAND症状。

附图说明

图1为本发明实施例中的SD大鼠乳鼠脑皮质原代星形胶质细胞分离与纯化步骤流程图；

图2为本发明实施例中离体培养的原代星形胶质细胞纯化后鉴定结果；

图3为本发明实施例中在一定浓度梯度外源性犬尿喹啉酸的细胞毒性测试结果；

图4为本发明实施例中联合外源性犬尿喹啉酸对gp120诱导的细胞毒性测试结果；

图5为本发明实施例中外源性犬尿喹啉酸治疗前后，gp120诱导的原代星形胶质细胞的炎性因子转录水平，其中，A为IL-1α，B为IL-1β，C为TNF-α；

图6为本发明实施例中外源性犬尿喹啉酸治疗前后，gp120诱导的原代星形胶质细胞的炎性因子蛋白表达情况，其中，A为IL-1β，B为IL-6，C为TNF-α；

图7为本发明实施例中外源性犬尿喹啉酸对gp120诱导下原代星形胶质细胞凋亡的影响情况；

图8为本发明实施例中外源性犬尿喹啉酸对gp120诱导下原代星形胶质细胞衰老的影响情况；

图9为本发明实施例中高色氨酸喂养后，gp120转基因小鼠体内的游离犬尿喹啉酸含量对比，其中，A为脑脊液中游离犬尿喹啉酸含量，B为全脑中游离犬尿喹啉酸含量；

图10为本发明实施例中高色氨酸喂养后，gp120转基因小鼠行为学检测结果，其中，A 为Morris水迷宫测试中小鼠移动距离对比，B为Morris水迷宫测试中小鼠移动速度对比，C 为穿越靶平台次数对比；

图11为本发明实施例中高色氨酸喂养后，gp120转基因小鼠行为学检测结果，其中，A 靶平台象限停留时间与其余象限停留平均时间的百分比对比，B为各象限停留时间对比；

图12为本发明实施例中使用和不使用高色氨酸喂养后，gp120转基因小鼠在Morris水迷宫测试中两组具有代表性的运动轨迹。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

试验材料

下述实施例中的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞的制备方法为：

(1)在无菌环境下，分离SD大鼠新生24-48h乳鼠的大脑皮质组织。

(2)借助体视显微镜，分离并剔除步骤(1)中得到的大脑两侧的血脑膜和海马体，剪碎成约1mm的组织块。加入1mL 0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min。消化完成后，加入DMEM/F12完全培养基终止消化并重悬，通过孔径0.22μm的单细胞滤网过滤得到单细胞悬液。将单细胞悬液移入已经提前包被多聚-L-赖氨酸的细胞培养瓶中培养24h，轻柔换液，继续孵育7～14d，然后每隔3d换液一次。待细胞融合成单层并铺满瓶底后，在37℃、250rpm 摇床上纯化24h，即得SD大鼠新生乳鼠脑皮质原代星型胶质细胞。

对得到的细胞使用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法鉴定，当鉴定结果显示细胞纯度达90％以上时，即可用于后续传代或者铺板加药处理。

SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞的制备过程图如图1所示。

结果发现，通过胰蛋白酶消化以及混合系统差速离心法纯化得到的体外培养SD大鼠新生乳鼠脑皮质原代星型胶质细胞纯度较高，具体形貌特征如图2所示，其在胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色中显示出阳性细胞纯度可达95％以上，其分离纯化效率远高于传统常规方法。

外源性犬尿喹啉酸的细胞毒性试验

为了验证犬尿喹啉酸的使用安全性，在本实施例中，发明人以上述实施例得到的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞作为测试对象，检测不同浓度(5μM、25μM、50μM、100μM、 1mM)的犬尿喹啉酸对其的细胞毒性。

具体操作为：

取细胞密度为10⁵/mL上述实施例得到的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞，分别加入5μM、25μM、50μM、100μM、1mM的犬尿喹啉酸，37℃混合孵育24h，通过CCK8(CellCounting Kit-8)检测试剂盒检测细胞活性。检测方法参考试剂盒说明书。

其中，以不添加外源性犬尿喹啉酸的细胞为空白对照。

结果如图3所示。

可以发现，原代星形胶质细胞细胞在使用剂量为5μM～1mM的犬尿喹啉酸中孵育24h后，细胞存活率未发生显著变化，其细胞数量与对照组不存在显著差异性。说明5μM～1mM浓度范围内的犬尿喹啉酸并不具有细胞毒性，且不会影响细胞的正常生长或增殖，具有一定的使用安全性。

外源性犬尿喹啉酸对HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞损伤的治疗效果

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜蛋白gp120能够诱导星形胶质细胞损伤或凋亡，从而导致神经元损伤。在本实施例中，发明人以经由HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞为模型，测试外源性犬尿喹啉酸(KYNA)对其的治疗或修复效果。

具体步骤如下：

(1)HIV-1 gp120细胞损伤模型的构建：

取细胞密度为10⁵/mL的上述实施例得到的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞，加入 150pM的HIV-1 gp120，混合孵育12h，得到HIV-1 gp120细胞损伤模型。

(2)治疗效果检测：

向步骤(1)得到的细胞损伤模型中分别加入浓度梯度为0μM、5μM、25μM、50μM、 100μM、1mM的KYNA，继续培养12h。通过CCK8(Cell Counting Kit-8)检测试剂盒检测细胞活性。检测方法参考试剂盒说明书。以未经HIV-1 gp120诱导的细胞作为空白对照 (Control)。

结果如图4所示。

可以发现，与空白对照相比，HIV-1 gp120处理组细胞存活率显著下降，说明HIV-1gp120 能够诱导星形胶质细胞凋亡，损害神经元。而在外源性补充KYNA后，星形胶质细胞的存活率显著上升，且在低剂量时上升幅度最大，随使用剂量增大而降低，说明外源性补充KYNA 能够显著改善HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞凋亡。而且，在低剂量(5μM～100μM)外源补充KYNA后，星形胶质细胞存活率甚至超过对照组，说明在一定程度(低剂量，5μM～100 μM)上，外源补充KYNA还能促进其细胞增殖，提高细胞活性。

外源性犬尿喹啉酸对HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞的促炎性细胞因子水平的影响

取细胞密度为10⁵/mL的上述实施例得到的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞，按照下述分组进行检测：

Control组：SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞空白对照，混合孵育12h。

KYNA(5μM)组：细胞密度为10⁵/mL的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞+5μM的KYNA，混合孵育12h。

KYNA(25μM)组：细胞密度为10⁵/mL的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞+25μM的KYNA，混合孵育12h。

gp120(150pM)组：细胞密度为10⁵/mL的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞+150pM 的HIV-1 gp120，混合孵育12h。

gp120(150pM)+KYNA(5μM)组：细胞密度为10⁵/mL的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞+150pM的HIV-1 gp120先混合孵育12h，然后取出细胞密度为10⁵/mL的处理后的细胞，加入5μM的KYNA，混合孵育12h。

gp120(150pM)+KYNA(25μM)组：细胞密度为10⁵/mL的SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞+150pM的HIV-1 gp120先混合孵育12h，然后取出细胞密度为10⁵/mL的处理后的细胞，加入25μM的KYNA，混合孵育12h。

使用Trizol法对各组中的细胞进行总RNA的提取，然后使用TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent试剂盒进行逆转录(操作参考使用说明书)。使用荧光实时定量PCR检测炎性因子 TNF-α、IL-1α和IL-1β的cDNA(以GAPDH为内参)。

TNF-α、IL-1α和IL-1β的荧光实时定量PCR引物参考NCBI中的相应序列(NM_012675.3， NM_017019.2和NM_031512.2)进行设计，扩增体系采用TaKaRa TB

Premix Ex Taq^TMII (Tli RNaseH Plus)说明书设计得到(10μL反应体系)，退火温度根据引物的Tm值设定。

其中，本实施例涉及的引物序列如下所示。

GAPDH内参引物对：

上游引物GAPDH-F：5'-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物GAPDH-R：5'-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3'(SEQ ID NO.2)。

TNF-α引物对：

上游引物TNF-α-F：5'-CCTCTCTGCCATCAAGAGCC-3'(SEQ ID NO.3)；

下游引物TNF-α-R：5'-AAGTAGACCTGCCCGGACTC-3'(SEQ ID NO.4)。

IL-1α引物对：

上游引物IL-1α-F：5'-ATCAGCACCTCACAGCTTCC-3'(SEQ ID NO.5)；

下游引物IL-1α-R：5'-TCTCCTCCCGATGAGTAGGC-3'(SEQ ID NO.6)；

IL-1β引物对：

上游引物IL-1β-F：5'-TTGCTTCCAAGCCCTTGACT-3'(SEQ ID NO.7)；

下游引物IL-1β-R：5'-GGTCGTCATCATCCCACGAG-3'(SEQ ID NO.8)。

荧光实时定量PCR反应体系为：

反应程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环；4℃保存。

其中，以GAPDH为内参，采用相对定量的方法计算基因表达倍数，公式为2-ΔΔCt。

结果如图5所示。

可以发现，单独添加5μM或25μMKYNA对细胞的TNF-α和IL-1β的mRNA水平影响并不显著，但单独添加5μM KYNA显著降低细胞IL-1αmRNA水平。在使用HIV-1 gp120诱导细胞后，细胞中的TNF-α、IL-1α、IL-1βmRNA水平均显著升高，而在进一步补充外源性 KYNA后，可以有效降低HIV-1 gp120诱导的TNF-α、IL-1α、IL-1βmRNA水平，表明补充 KYNA能抑制HIV-1gp120感染后细胞的TNF-α、IL-1α、IL-1βmRNA的表达，从而达到保护细胞的作用。

同时，为了进一步确认外源性犬尿喹啉酸对gp120诱导的炎症和细胞损伤的治疗作用，发明人还使用了酶联免疫吸附测定法重复检测相应的促炎性细胞因子表达水平，以验证上述结论。

TNF-α、IL-1α、IL-1β的酶联免疫吸附测定法参考本领域常规方法。

结果如图6所示。

ELISA检测结果提示与mRNA检测结果一致，HIV-1 gp120诱导细胞后，IL-1β、IL-1α和TNF-α的表达水平明显升高，且与空白对照组及KYNA处理组相比有明显统计学差异。而在外源性添加KYNA后，IL-1β、IL-1α和TNF-α的表达水平显著降低，且与单独HIV-1 gp120 诱导细胞处理组相比有明显统计学差异。说明犬尿喹啉酸确实能够降低HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞的促炎性细胞因子水平。

外源性犬尿喹啉酸对HIV-1 gp120诱导下星形胶质细胞凋亡的影响

取高压灭菌处理后的细胞爬片，经1％多聚赖氨酸预先包被，然后放置于无菌24孔板中，均匀接种细胞密度为10⁵/mL上述实施例得到的原代SD大鼠新生乳鼠脑皮质星形胶质细胞，以制备细胞爬片，待细胞融合度达50-60％，按照下述分组对细胞爬片进行分组：

HIV-1 gp120组：加入150pM的HIV-1 gp120，混合孵育12h。

KYNA组：加入25μM的KYNA，混合孵育12h。

HIV-1 gp120+KYNA组：加入150pM的HIV-1 gp120先处理12h，然后取等量的处理后的细胞加入25μM的KYNA，混合孵育12h。

处理完毕后，巴氏吸管小心吸弃培养液，然后用适量预冷的PBS缓冲液漂洗细胞3次，每次3min。不需要作固定处理，采取活细胞染色的方法，按照细胞凋亡染色试剂盒说明书操作，依次加入细胞染色缓冲液、Hoechst染色液和PI染色液，4℃避光染色20-30min。染色后 PBS漂洗3次，每次5min。注射器针头弯折30°小心勾起爬片，弯镊夹取放在载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察及采集图像数据。

结果如图7所示。

可以发现，使用Hoechst 33342/PI双染，空白对照组和KYNA处理组中星形胶质细胞呈均匀蓝色染色，HIV-1 gp120组诱导细胞后，细胞质固缩，并出现了明显细胞核致密浓染、高亮白色荧光的凋亡细胞，以及红色荧光的坏死细胞。外源补充KYNA后，凋亡细胞及坏死细胞的荧光强度显著减弱。因此，可以说明外源性添加KYNA能够有效治疗gp120诱导的原代星形胶质细胞，可以有效改善细胞的凋亡。

外源性犬尿喹啉酸对HIV-1 gp120诱导下星形胶质细胞衰老的影响

为了确定外源性犬尿喹啉酸对原代星形胶质细胞衰老进程的影响，发明人设置以下试验：

HIV-1 gp120组：加入150pM的HIV-1 gp120，混合孵育12h。

KYNA组：加入25μM的KYNA，混合孵育12h。

处理完毕后，巴氏吸管小心吸弃培养液用适量预冷的PBS缓冲液漂洗细胞3次，每次3 min。加入1mLβ-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色固定液，室温固定15min。吸弃细胞固定液后，用PBS缓冲液漂洗细胞3次，每次3min。吸弃PBS缓冲液，加入1mLβ-半乳糖苷酶染色工作液。用封口膜密封，防止试剂蒸发，37℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察及采集图像数据。

结果如图8所示。

可以发现，根据本实施例中的原代星形胶质细胞SA-β-gal染色结果显示，经HIV-1gp120 诱导后，SA-β-gal染色阳性的细胞数相比空白对照组明显增加，而在使用犬尿喹啉酸后，HIV-1 gp120+KYNA组中的SA-β-gal染色阳性的细胞比例相比HIV-1 gp120诱导组的比例有明显下降，说明犬尿喹啉酸能够有效延缓HIV-1 gp120诱导造成的星形胶质细胞衰老。

动物试验验证

(1)HIV-1 gp120转基因小鼠的构建：

HIV-1 gp120转基因小鼠由南加州大学洛杉矶儿童医院某教授惠赠，该小鼠以GFAP为启动子在星形胶质细胞中高表达可溶性的HIV-1 LAV gp120(X4)蛋白，小鼠均饲养于南方医科大学SPF级实验动物中心。

(2)效果验证：

取步骤(1)中的12月龄得HIV-1 gp120转基因小鼠10只，随机平均分为实验组(gp120 Tgm+Trp)和对照组(gp120 Tgm)两组。为了避免立体定位注射操作不成熟对小鼠造成额外损伤，同时我们期待探索通过高色氨酸饮食提高脑内源性犬尿喹啉酸调节HAND疾病进展的可能性。因此，实验组以自由饮用的方式连续饲喂含0.1％色氨酸(Trp)的生理盐水7天，以提高其脑组织内KYNA浓度，对照组则饲喂等量生理盐水7天，每只小鼠平均每日摄入水分 10-15mL。喂养七天后，通过Morris水迷宫测试分析高色氨酸喂养对gp120转基因小鼠认知功能障碍的改善作用，处死并收集两组小鼠全脑和脑脊液，使用酶联免疫吸附法验证高色氨酸喂养对脑部内源性犬尿喹啉酸含量的影响，并结合行为学评估数据作关联性分析。

结果如图9所示。

图9A和9B展示了实验组经过高色氨酸喂养后，脑脊液和全脑组织中游离犬尿喹啉酸含量相比对照组显著升高，说明高色氨酸显著提高了HIV-1 gp120转基因小鼠脑内内源性犬尿喹啉酸含量。

图10则展示了实验组(gp120 Tgm+Trp)和对照组(gp120 Tgm)HIV-1 gp120转基因小鼠在Morris水迷宫测试中的相关数据图像，通过对比两组HIV-1 gp120转基因小鼠的移动距离、移动速度等，结合图11中对于gp120转基因小鼠穿越靶平台的次数以及在靶平台所在象限(Q4)停留的时间的对比差异(实验组(gp120 Tgm+Trp)时间消耗显著少于对照组(gp120 Tgm)，且存在统计学差异)，可以说明犬尿喹啉酸含量的增多有效的改善了HIV-1gp120转基因小鼠的大脑学习记忆机制。

图12则展示了实验组(gp120 Tgm+Trp)和对照组(gp120 Tgm)的gp120转基因小鼠的路径图，显示出两组小鼠具有代表性的运动轨迹，比较两组探索平台过程的运动轨迹，可以发现实验组在从移除平台后的Q4象限进行高密度搜索，路径重合度高，运动轨迹更接近直线型；而对照组则表现出随机且绕圈的搜索策略为主，路径稀疏且重合度较低，轨迹则多为曲线型。

从上述结果中，可以发现，gp120转基因小鼠在高色氨酸干预后，由于色氨酸有效提高了脑脊液和脑组织中游离犬尿喹啉酸的含量，从而有效缓解了gp120带来的神经损伤，使实验小鼠的空间学习能力和记忆能力均得到改善。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 犬尿喹啉酸在制备改善HIV-1相关神经认知功能障碍药物中的应用

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<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<400> 7

ttgcttccaa gcccttgact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtcgtcatc atcccacgag 20

Claims

1.色氨酸代谢产物在制备预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍试剂中的应用。

2.色氨酸代谢产物在制备神经细胞损伤修复试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述神经细胞包括神经元细胞和胶质细胞。

4.色氨酸代谢产物在制备抗炎药物中的应用。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述色氨酸代谢产物包括3-羟基犬尿氨酸或其药学上可接受的盐、邻氨苯甲酸或其药学上可接受的盐、犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述色氨酸代谢产物为犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐的使用剂量为5μM～1mM。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述犬尿喹啉酸或其药学上可接受的盐的使用剂量为5μM～100μM。

9.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述色氨酸代谢产物通过色氨酸给药后经体内代谢产生，所述色氨酸的给药剂量优选为0.1wt％。

10.犬尿喹啉酸激动剂在制备预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍试剂中的应用。