KR101806808B1 - 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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고영우
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정상욱
홍재희
홍성은
홍성민
홍기성
박태영
오준석
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Abstract

본 발명은 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물은 에스트로겐 수용체를 포함하고 있는 유방암 세포(MCF-7)에 처리하였을 때, 세포증식률을 크게 증가시키며, 적하수오에 대비하여 세포독성이 현저하게 낮으므로 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 안전한 기능성 식품 및 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating female menopausal syndrome comprising Pleuropterus multiflorus fermented using Lentinus edodes mycelium as effective component}
본 발명은 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
여성은 나이가 들면서 난소의 기능이 저하되고, 이로 인해 에스트로겐의 분비가 크게 감소한다. 이에 따라, 난포자극호르몬(FSH) 및 황체형성호르몬(LH)에 대한 반응이 감소되고, 프로게스테론의 생성도 감소된다. 특히, 50대 전후로 난소의 기능이 완전히 멈추는 폐경이 발생할 확률이 매우 높아지는데, 폐경기에 접어들기 시작하면서부터 완전한 폐경 이후의 시기에 호르몬 균형이 깨지면서 신체에 각종 증상이 야기되는 시기를 흔히 갱년기라 한다. 또한, 난소 제거술, 자궁 적출술 등의 이유로 조기 폐경을 맞게 되는 경우에도 갱년기 증상을 느낄 수 있다.
즉, 여성의 갱년기란 내분비 증후군의 일종으로 난소 기능의 노화로 인해 여성호르몬인 에스트로겐이 감소하게 되어 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 시기를 의미한다. 이러한 갱년기의 증상으로는 안면홍조, 빈맥, 발한, 또는 두통과 같은 혈관성 변화에 의한 증상이 있고, 근육통, 관절통 및 요통과 같은 근골격계 변화에 의한 증상이 있으며, 빈뇨 또는 요실금과 같은 비뇨생식기 변화에 의한 증상과 함께 기억력 감퇴, 우울증, 집중력 감퇴 및 현기증과 같은 뇌신경계 변화에 의한 증상이 있다. 이 외에도 시력감퇴 및 피부와 모발이 변화되는 증상들이 발생되며, 호르몬 변화로 인한 골다공증이나 심혈관계 질환 등 여성의 건강에 치명적인 질환이 발생하기도 한다.
최근 문명의 발달과 과학의 진보로 현대를 살아가는 인간은 그 수명이 점차 연장되어 여성의 경우, 2002년에 평균수명이 80.4세로, 갱년기 증상이 서서히 시작되는 40대 이후부터 30~40여 년 동안 여성의 건강한 삶에 대한 특별한 관심이 필요하다. 갱년기 증상의 가장 큰 원인이 에스트로겐 부족 때문이므로, 치료법으로는 에스트로겐 대체요법이 여성갱년기 증상 개선을 위해 주로 사용되어졌다. 그러나, 갱년기 증상을 갖는 여성의 35~40%만이 에스트로겐 대체요법을 사용하며, 이들조차도 대부분 이 방법을 지속적으로 사용하는 것을 기피한다. 에스트로겐 대체요법은 인위적인 호르몬 투여를 기반으로 하기 때문에 그 자체에 대한 거부반응과 부작용이 따르기 때문이다. 에스트로겐 대체요법의 부작용으로 자궁출혈, 뇌졸중, 심장발작, 유방암, 자궁암 발생 위험이 증가될 수 있음에 대한 많은 연구결과들이 보고되고 있다.
이러한 문제점 때문에 식품형태로 섭취하는 자연적인 방법으로 에스트로겐 요법을 대체하고자 하는 관심이 높아지고 있으며, 부작용이 없으면서도 갱년기의 증상을 완화시키는 효과가 우수한 새로운 갱년기 증상 개선제의 개발이 요구되고 있어, 합성 에스트로겐의 대체물로서 식물성 에스트로겐과 같은 천연식물성 성분을 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
하수오는 적하수오(Polygonum multiflorum)와 백하수오(Cynanchum wilfordii)로 구분하는데, 일반적으로 중국, 일본, 대만 등에서는 약재로 적하수오를 이용하지만, 우리나라에서는 백하수오를 이용하고 있다. 적하수오의 약효성분은 안트라퀴논류로 에모딘(emodin), 크리소파놀(chrysophanol), 레인(rhein), 파이시온(physcion) 등이 주류를 이루고 있고, 백하수오는 프레그난(pregnane) 계열의 배당체인 가가미나인(gagaminine)이 주성분인 것으로 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제1544532호는 백수오 추출물을 표함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2016-0126495호는 발효 백수오 추출물 및 그의 제조방법 및 용도를 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물들을 제조하여 에스트로겐 수용체를 포함하고 있는 유방암 세포(MCF-7)에 각각 처리하였을 때, KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리한 경우 다른 4종의 표고버섯 균사체에 비해 세포증식률이 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해, 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물이 에스트로겐성 물질로서 효과적으로 작용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 적하수오에 대비하여 본 발명의 적하수오 발효물이 간세포 및 대식세포에 대해 세포독성이 거의 없다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물은 에스트로겐 수용체를 포함하고 있는 유방암 세포(MCF-7)에 처리하였을 때, 세포증식률을 크게 증가시키며, 적하수오에 대비하여 세포독성이 현저하게 낮으므로 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 안전한 기능성 식품 및 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 적하수오 발효과정에서 적하수오 입자크기에 따른 표고버섯 균사의 길이(mm)를 나타낸 것이다.
도 2는 적하수오 발효과정에서 배양 온도에 따른 표고버섯 균사의 길이(mm)를 나타낸 것이다.
도 3은 적하수오 발효과정에서 배양 pH에 따른 표고버섯 균사의 길이(mm)를 나타낸 것이다.
도 4는 적하수오 발효과정에서 탄소원 종류에 따른 표고버섯 균사의 길이(mm)를 나타낸 것이다.
도 5는 적하수오 발효과정에서 질소원 종류에 따른 표고버섯 균사의 길이(mm)를 나타낸 것이다.
도 6은 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물을 MCF-7 세포에 각각 처리하였을 때, 세포증식의 증가효과를 나타낸 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상군이며, Es는 에스트라디올(Estradiol)로 양성 대조군을 의미한다.
도 7은 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물과 에스트로겐 길항제인 ICI(fulvestrant)를 MCF-7 세포에 함께 처리하였을 때, 세포감소를 억제하는 효과를 나타낸 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상군이며, ici는 에스트로겐 길항제로 음성 대조군이며, Es는 에스트라디올(Estradiol)으로 양성 대조군을 의미한다.
도 8은 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물의 에스트로겐 활성의 증가효과를 나타낸 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상군이며, Es는 에스트라디올(Estradiol)로 양성 대조군을 의미한다.
도 9는 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물과 적하수오를 간세포(A) 및 대식세포(B)에 각각 처리하였을 때, 세포생존율을 통해 세포독성을 비교분석한 결과이다. 적하수오 발효물은 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 의미하며, 적하수오는 발효하지 않은 적하수오를 의미한다.
도 10은 폐경 유도 동물 모델에 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 경구투여하였을 때, 동물 모델 자궁조직의 위축에 대한 개선효과를 나타낸 결과이다. Con은 난소 절제술을 하지 않고 일반사료 및 생리식염수를 급이한 정상군이며, NC는 난소 절세술을 처치하고 일반사료 및 생리식염수를 급이한 음성 대조군이며, PC는 난소 절세술을 처치하고 아스코르브산(ascorbic acid) 및 α-토코페롤(α-tocopherol)를 급이한 양성 대조군이며, S는 난소 절세술을 처치하고 본 발명의 적하수오 발효물을 급이한 실험군이다.
도 11은 폐경 유도 동물 모델에 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 경구투여하였을 때, 동물 모델의 자궁(A) 및 난소(B) 조직을 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 및 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색한 사진을 나타낸 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에서, 상기 적하수오 발효물은 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯(Lentinus edodes)의 균사체를 이용하여 발효시킨 발효물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표고버섯(Lentinus edodes)은 한국생명공학연구원에 2017년 7월 3일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18583P).
또한, 상기 적하수오 발효물은
1) 적하수오를 증자 및 열풍건조한 후 분쇄하여 분말화하여 25 메쉬 체를 통과하지 않은 적하수오 분말을 수득하는 단계; 및
2) 상기 수득된 적하수오 분말에 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯 균사체를 접종한 후 탄소원으로 글루코오스, 질소원으로서 맥아 추출물을 첨가하여 24~26℃ 및 pH 6~7의 조건에서 35~45일 동안 배양하여 적하수오 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 발효방법으로부터 획득한 적하수오 발효물일 수 있으며,
바람직하게는, 상기 단계 2)에서, 적하수오 분말에 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯 균사체를 접종한 후 25℃ 및 pH 6의 조건에서 40일 동안 배양하여 적하수오 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 발효방법으로부터 획득한 적하수오 발효물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 적하수오 발효물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적하수오 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 최적 버섯균사체 탐색
1) 적하수오 접종 발효균사의 종별 생장 측정
버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물의 최적조건을 확립하기 위하여, 적하수오를 증자 및 열풍건조한 후 톱밥과 동일한 비율(1:1, w/w)로 혼합하여 직경 24mm 및 높이 200mm의 투명한 원통형 시험관에 각각 50g씩 넣은 다음, 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌 후 표고, 동충하초, 상황 및 치마버섯 4종의 버섯균사를 각각 적하수오의 표면부분에 각각 접종하여 하기 표 1에 개시한 바와 같이 표고, 동충하초 및 치마버섯 균사는 26℃의 배양기에서 배양하였으며, 상황균사는 30℃의 배양기에서 배양하였다. 균사체의 성장은 접종면으로부터 아래로 성장한 균사의 길이(mm)를 측정하였으며, 상기 4종의 균사 중 표고버섯 균사체의 밀도가 가장 우수하였다. 표고버섯 발효의 효율성 향상을 위해, (재)장흥군버섯산업연구원에서 배양한 총 5종의 표고버섯 균사(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078 및 KCTC18583P)를 적하수오 발효에 이용한 결과, KCTC18583P > JMI10078 > JMI10075 > JMI10076 > JMI10077 순으로 균사밀도가 높게 측정되었다. 상기 결과를 바탕으로 본 발명의 적하수오 발효물에 사용한 최종 균사는 KCTC18583P의 표고버섯 균사로 결정하였다.
버섯균사 종류에 따른 적하수오의 발효조건 및 이에 대한 균사밀도 측정결과
버섯균사 발효온도(℃) 발효기간(일) 균사밀도(mg/20day)
표고
(Lentinula edodes) 		26 30 48.7±4.2
동충하초
(Codyceps militaris)		 26 30 -
상황
(Phellinus linteus)		 30 30 4.2±0.4
치마버섯
(Schizophyllum commune)		 26 30 6.7±0.2
2. 적하수오의 발효조건 탐색
열풍건조한 적하수오를 분쇄하여 50 메쉬(mesh) 체로 거른 후, 톱밥과 적하수오의 배합비를 달리하여 하기 표 2에 개시한 바와 같이 혼합하였다. 각각의 배지 수분은 60%로 조절하여 직경 24mm 및 높이 200mm의 투명한 원통형 시험관에 각 배지를 50g씩 넣은 후, 121℃에서 30분간 멸균하여 식힌 후, 표고버섯 균사체를 적하수오의 표면부분에 접종하고 하기 표 3에 개시한 조건으로 배양하였다. 균사체의 성장은 접종면으로부터 아래로 성장해간 균사의 길이를 측정하여 나타내었다.
적하수오 및 톱밥의 배합비(%)
구성성분 함량(%)
A B C D E
톱밥 100 70 50 30 0
적하수오 0 30 50 70 100
표고버섯 균사 종류에 따른 적하수오의 발효조건 및 이에 대한 균사밀도 측정결과
버섯균사 발효온도 발효기간(일) 균사밀도
(mg/20day)
JMI10075 26℃ 20 32.7±3.9
JMI10076 26℃ 20 24.6±3.7
JMI10077 26℃ 20 19.4±2.7
JMI10078 26℃ 20 36.5±3.1
KCTC18583P 26℃ 20 47.9±3.2
3. E-스크린 분석(E-screen assay)
E-스크린 분석은 물질의 에스트로겐 작용을 측정하는 방법으로, 에스트로겐 수용체(ER)가 내재적으로 발현되어 있는 유방암 세포주(MCF-7)가 에스트로겐성 물질에 의해 성장이 촉진되는 효과를 이용하는 실험방법이다. 본 발명에서는 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078 및 KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 각각 발효시킨 적하수오 발효물들의 에스트로겐 활성 여부를 E-스크린 분석을 통해 확인하였다.
구체적으로, MCF-7 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM(Dullbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여 5% CO2 및 37℃의 배양기에서 배양하였다. 호르몬을 유도하기 전 세포는 PBS로 세척하였으며, 시료 처리 전 모든 에스트로겐성 소스(estrogenic source)를 제거하기 위해, 2일 동안 10% CD-FBS(charcoal-dextran stripped FBS)가 함유된 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지에서 배양하고 배양된 세포는 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 1000rpm에서 5분간 원심분리하고, 세포수를 측정하여 5×103 세포수/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 후 본 발명의 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078 및 KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 각각 처리하고 7일(144시간) 동안 배양한 후 MTT 분석으로 세포의 증식 정도를 측정하였다.
4. 에스트로겐 수용체 결합 분석(Estrogen receptor binding assay)
에스트로겐 수용체 결합 분석(estrogen receptor binding assay)은 분석 키트에서 제공하는 매뉴얼에 따라 진행하였으며, 결합능력은 시료의 존재하에 polarization value에 의해 결정되었다.
5. 세포 생존율(cell viability) 측정
마우스의 일차(primary) 간세포 및 대식세포는 96웰 플레이트에 5×105 세포수/ml의 농도로 배양하여 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물과 적하수오를 각각 처리하였다. 24시간 처리 후, 0.5㎍/ml의 MTT(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-데펜테르라졸리움 프로미드)를 첨가하여 4시간 동안 포르마잔(formazan)을 형성시켰다. 반응이 끝나면 배지를 제거하고 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 포르마잔을 용해시켜 ELISA 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 대조군(control) 값에 대한 비율로 계산하였다.
6. 동물모델 및 헤마톡실린-에오신( Hematoxylin -Eosin) 및 메이슨 트리크롬 (Masson's trichrome) 염색
생후 7~8주령의 SD 암컷 랫트를 구입하여 일정한 온도(23±1℃)와 습도(50±5%)하에서 1주일 동안 적응시킨 후 인체 폐경을 모방한 갱년기 증상 유발 모델을 만들기 위해 마취하에서 양쪽 난소 절제 수술을 실시하였으며, 난소제거 여성 갱년기 모델을 처치하지 않은 그룹은 정상군(con), 난소제거 여성 갱년기 모델을 처치한 그룹은 실험군(S)으로 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물(이하 '시료'라 함)을 분말화된 형태로 경구투여하였으며, 비교분석을 위해 양성 대조군은 시료 대신 아스코르브산(ascorbic acid) 및 α-토코페롤(α-tocopherol)을 경구투여하였으며, 정상군 및 음성 대조군은 시료 대신 일반사료 및 생리식염수를 급여하였다. 조직염색을 위해, 동물은 희생시켜 혈청 분리 후 조직은 자궁, 난소 및 질 순서로 분리하였다. 조직 관찰은 자궁, 난소 및 질 조직을 절제한 후 인산완충용액 파라포름알데히드(phosphate buffered paraformaldehyde) 고정액으로 3시간 동안 냉고정한 후 세척 및 탈수과정을 거쳐 파라핀에 포매하여 5μm의 두께로 절개한 후 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 및 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 수행하였다.
실시예 1. 적하수오 발효의 최적입도 및 최적온도 확립
적하수오 발효에 최적의 입도를 조사하기 위해, 25 메쉬(mesh), 50 메쉬 및 100 메쉬 체를 통과한 분말과 25 메쉬 체를 통과하지 않은 잔류물의 균사 생육을 조사하였다. 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 적하수오 입도에 따른 표고버섯 균사의 생장은 25 메쉬 체를 통과하지 않은 잔류물들에서 가장 빠르게 나타났으며, 다음으로는 25 메쉬 체를 통과한 적하수오에서 높게 나타났다. 100 메쉬 체를 통과한 적하수오 분말에서는 생장이 거의 일어나지 않았다. 배양온도에 따른 생장 측정 결과, 하기 표 4에 개시한 바와 같이 25℃에서 균사 밀도가 가장 높았으며. 27℃ 및 23℃ 순으로 균사 밀도가 높게 나타났으며, 29℃에서는 균사 밀도가 감소하여 균사의 생장이 오히려 억제되는 것을 확인하였다(도 2). 따라서 표고버섯 균사를 이용하여 적하수오를 발효하였을 때, 균사배양은 25 메쉬 체를 통과하지 않은 잔류 하수오를 25℃에서 배양하는 것이 적합한 것을 확인할 수 있었다.
배양온도에 따른 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사밀도 측정결과
온도 균사 밀도
23℃ +++1)
25℃ +++++
27℃ ++++
29℃ ++
1)+: Poor, ++:Thin, +++:Sparse, ++++:Compact, +++++:Very compact.
실시예 2. 적하수오 발효의 최적 pH 확립
본 실시예 2에서는 pH에 따른 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사의 생장을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 5 및 도 3에 개시한 바와 같이 pH 6 및 7에서 균사생장이 양호하였으며, pH 4의 경우, 균사의 생장이 많이 저조한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 표고버섯 균사의 생장에 최적합한 산도는 pH 6 및 7인 것을 확인할 수 있었다.
pH에 따른 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사 밀도 측정결과
pH 균사 밀도
4 +++1)
5 ++++
6 +++++
7 +++++
1)+: Poor, ++:Thin, +++:Sparse, ++++:Compact, +++++:Very compact.
실시예 3. 적하수오 발효의 탄소원 및 질소원에 따른 균사 생장 확인
탄소원은 균류에 있어서 탄수화물, 단백질, 지질, 핵산 등의 합성과 에너지 공급원으로서 균주의 생장에 필수적인 영양원이다. 본 실시예 3에서는 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사의 생육을 위한 최적 탄소원을 선발하고자 하였다. 그 결과, 하기 표 6 및 도 4에 개시한 바와 같이 모든 처리구(글루코오스, 락토오스, 말토오스 및 수크로오스)에서 생육이 양호하게 나타났으며, 특히 글루코오스 처리구에서 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사의 생육이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 최적 질소원은 타르타르산암모늄(ammonium tartrate), 글루탐산(glutamic acid), 맥아 추출물(malt extract) 및 질산칼륨(potassium nitrate) 중에서 맥아 추출물 처리구에서 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사의 생육이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다(표 7 및 도 5).
탄소원에 따른 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사밀도 측정결과
탄소원 균사 밀도(mg/13day)
글루코오스 48.7±4.2
락토오스 40.2±3.7
말토오스 45.6±4.4
수크로오스 43.1±5.1
질소원에 따른 적하수오 발효를 위한 표고버섯 균사밀도 측정결과
질소원 균사 밀도(mg/13day)
타르타르산암모늄(ammonium tartrate) 17.6±2.1
글루탐산(glutamic acid) 23.9±3.4
맥아 추출물(malt extract) 42.7±3.7
질산칼륨(potassium nitrate) 26.1±2.9
실시예 4. 본 발명의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물 처리에 따른 에스트로겐 활성 확인
에스트로겐 수용체(Estrogen receptor)를 가지고 있는 MCF-7 유방암 세포(breast carcinoma cell)에 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 각각 처리하여 7일 동안 배양한 후 MTT 분석을 통해 세포증식률을 측정하여 비교분석하였으며, 양성 대조군으로 1nM의 에스트라디올(Estradiol)을 사용하였다. E-스크린(E-screen) 방법에 의한 에스트로겐 활성을 측정한 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 5종의 표고버섯 균사체 중에 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리한 경우, MCF-7 세포증식률이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 바탕으로 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물 처리에 의한 MCF-7 세포증식이 에스트로겐 수용체를 통해 매개된 증식인지를 확인하기 위해, 에스트로겐 길항제인 ICI 182.780(fulvestrant, 100nM)을 함께 처리하여 세포증식률의 변화를 측정하였다. 그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이 5종의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물과 에스트로겐 길항제인 ICI를 함께 처리하였을 때, JMI10078 및 KCTC18583P의 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물의 경우, ICI만을 처리한 음성 대조군(ici)에 비해 세포감소가 억제된 것을 확인할 수 있으며, 특히 본 발명의 KCTC18583P의 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리하였을 때 세포감소 억제효과가 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 적하수오 발효물에 의한 MCF-7 세포증식이 에스트로겐 수용체 활성으로 인해 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 5종의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물 처리에 의한 에스트로겐 수용체 활성 정도를 측정하여 비교분석하였다. 그 결과, 도 8에 개시한 바와 같이 본 발명의 KCTC18583P의 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리한 경우, 모든 농도(10, 50 및 100㎍/mL)에서 에스트로겐 활성이 다른 4종의 균사체를 이용하여 발효시킨 각각의 적하수오 발효물에 비해 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 본 발명의 KCTC18583P 의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적 하수오 발효물과 발효시키지 않은 적하수오의 세포독성 비교
상기 실시예 4의 결과에서 5종(JMI10075, JMI10076, JMI10077, JMI10078, KCTC18583P)의 표고버섯 균사체 중에 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리하였을 때, 에스트로겐 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었으나, 식품 및 의약품에 사용되기 위해 에스트로겐성 물질의 안정성을 확인하고자 본 발명의 적하수오 발효물과 발효시키지 않은 적하수오의 세포독성을 측정하여 비교분석하였다. 상기 실시예 4에서 사용한 세포는 유방암 세포(MCF-7)로 일반적인 안정성을 평가하는 세포로 적합하지 않아 간세포 및 대식세포를 대상으로 세포독성 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 9에 개시한 바와 같이 적하수오를 간세포 및 대식세포에 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포생존률이 현저하게 감소되는 반면, 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 처리한 경우 대조군(con)과 유사한 세포생존률을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 적하수오가 농도 의존적으로 세포생존률이 감소되어 세포독성을 나타내었지만 본 발명의 적하수오 발효물은 세포독성이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 난소절제술을 처치한 암컷 랫트를 이용한 폐경 동물 모델에서의 자궁, 난소 및 질 조직의 변화 확인
본 실시예 6에서는 본 발명의 KCTC18583P의 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 폐경 동물 모델에 처리하여 이의 조직(자궁, 난소 및 질) 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 10 및 11에 개시한 바와 같이 자궁(Urerus) 및 난소(Ovary)의 경우, 자궁은 정상군(Con) 및 난소절제술을 처치한 음성 대조군(NC)과 비교해 볼 때, 음성 대조군의 자궁 크기와 두께가 상당히 감소되었으며, 자궁과 난소 사이에 결찰(ligation) 부분부터 조직괴사가 일어나 변색 및 부피 감소 등이 관찰되었다. 반면, 난소절제술을 처치하고 본 발명의 적하수오 발효물(S)을 처리한 경우 자궁의 크기가 정상군(Con)과 유사하게 유지되었으며, 난소의 괴사가 일부 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 질(Vagina) 조직의 경우, 난소절제술을 처치한 음성 대조군(NC)에서 일부 표피조직이 얇아졌지만 난소절제술을 처치하고 본 발명의 적하수오 발효물(S)과 양성 대조군(PC)인 아스코르브산(ascorbic acid) 및 α-토코페롤(α-tocopherol)를 각각 처리한 군에서는 정상군(Con)과 유사한 형태를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC18583P 20170703

Claims (7)

  1. 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 적하수오 발효물은
    1) 적하수오를 증자 및 열풍건조한 후 분쇄하여 분말화하여 25 메쉬 체를 통과하지 않은 적하수오 분말을 수득하는 단계; 및
    2) 상기 수득된 적하수오 분말에 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯 균사체를 접종한 후 탄소원으로 글루코오스, 질소원으로 맥아 추출물을 첨가하여 24~26℃ 및 pH 6~7의 조건에서 35~45일 동안 배양하여 적하수오 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 발효방법으로부터 획득한 적하수오 발효물인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 기탁번호가 KCTC18583P인 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오(Polygonum multiflorum) 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020170087642A 2016-12-29 2017-07-11 표고버섯 균사체를 이용하여 발효시킨 적하수오 발효물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR101806808B1 (ko)

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