KR102576229B1 - 한약재 및 귀리를 표고균사로 발효한 발효물을 활용한 반려동물 건강간식의 제조방법 - Google Patents
한약재 및 귀리를 표고균사로 발효한 발효물을 활용한 반려동물 건강간식의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)로 발효한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물과 고기, 원목표고 추출액, 황기 추출액, 복령 추출액, 죽엽 추출액 및 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 반려동물용 간식에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비파 추출 분말 및 황칠 추출 분말을 혼합한 혼합물에 물을 첨가한 후, 여기에 귀리를 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사체(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물과 고기, 원목표고 추출액, 황기 추출액, 복령 추출액, 죽엽 추출액 및 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 반려동물용 간식에 관한 것이다.
국내 반려동물 시장 규모가 2017년 2조 8900억 원에서 2020년엔 5조 8100억 원까지 성장할 것으로 전망된다. 이 같은 성장세는 반려동물이 또 하나의 가족이라는 인식이 보편화되면서 반려동물의 음식을‘사료’가 아닌‘식품(Pet Food)' 으로 취급하는 경향이 높아진 것이다.
이러한 동향에 맞춰 대기업의 시장 진출도 활발히 진행되고 있다. KGC인삼공사, 풀무원 등 기존 진출 기업에 이어 빙그레도 펫푸드 상표인‘에버그로' 등을 출원하고, 제품도 출시하였다.
미국은 2015년 반려동물 시장 규모가 이미 600억 달러(약 67조 원) 돌파했고, 전체 가정의 약 70%가 반려동물 키우는 것으로 추산되고 있다. 반려동물의 크기, 몸무게 등에 따라 필요한 운동량을 산출하고 모니터링, 시각화해주는 웨어러블 단말기, 자신의 반려동물을 잠시 위탁해야 할 경우 이를 위탁받는 보호자와 연결해주는 매칭 서비스도 등장하고 있다. 영국의 경우 반려동물 가정의 약 20%가 반려동물 보험에 가입하고 있으며 점차 증가하는 추세이다.
장흥의 대표적인 특산품인 원목표고버섯과 각종 한약재를 활용한 가공식품은 현재 사람을 위한 제품으로 한정되어 있다. 표고버섯은 비타민 D가 풍부하여 칼슘의 흡수를 높여 뼈 건강에 도움이 되며, 식이섬유가 풍부하여 장 건강에 도움을 준다. 또한 베타글루칸은 면역력을 높여준다. 이러한 표고버섯의 효능은 사람뿐 아니라 반려동물에게도 동일하게 적용되기 때문에 반려동물 건강간식의 원료로 큰 가치를 가진다. 현재 반려동물 간식의 트렌드는 기호성을 넘어서 건강기능성에 초점이 맞춰져 있다. 6년근 홍삼을 활용한 KGC 인삼공사의‘지니펫’이 대표적인 예이다.
현재 시중에 유통되고 있는 수많은 반려동물 식품 중에는 원재료나 원재료의 안전성을 알 수 없거나 화학성분(방부제, 색소 등)이 첨가되고 영양학적으로 불충분한 저급한 식품이 많은 실정이다. 2013년 중국산 불량 애견 간식으로 인하여 600마리 가량의 반려견이 죽음에 이르렀던 미국의 사례로 인하여 중국을 비롯한 수입산 원료에 대한 불안감이 증가하였다. 이에 많은 업체들이 국내산 원료를 사용하여 제품을 생산하고 있다고 홍보하고 있으나 여전히 원료의 생산이나 제조과정을 소비자가 확인할 수는 없다.
반려묘의 대표 간식인 ‘츄르’의 경우, 일본 제품인 ‘챠오츄르’의 시장 점유율이 상당히 높은 편이다. 현재 한국과 일본의 무역 갈등이 고조된 가운데 일본제품에 대한 불매운동이 심화되면서 국내에서 제조된 습식제품에 대한 수요가 증가하고 있다. 이러한 국산 제품에 대한 소비자의 니즈가 증가하는 흐름에 발맞추어 수입제품을 대체하는 경쟁력 있는 제품의 개발이 필요하다.
한국공개특허 제2021-0026508호에는 맥아박을 이용한 반려동물 간식의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2099464호에는 반려동물 건강개선 영양간식의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 활용한 반려동물 건강간식의 제조방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 반려동물의 각종 질환, 면역력 강화 등에 도움이 되는 표고버섯과 한약재의 성분을 활용하고자 면역효과와 관련된 유용성분인 베타글루칸을 함유한 귀리에 황칠과 비파 추출물을 혼합하고, 혼합된 소재를 특허 기탁한 표고균사로 발효한 발효물을 반려동물용 간식 제조에 사용함으로써, 반려동물이 선호하면서 영양성분 및 항염증 효과가 우수한 반려동물용 건강간식의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 비파를 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계; (2) 황칠을 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계; (3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말을 혼합한 혼합물에 물을 첨가한 후, 여기에 귀리를 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.))를 접종하여 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계; (4) 원목표고에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계; (5) 황기을 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계; (6) 복령을 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계; (7) 분쇄한 죽엽에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계; (8) 백출을 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; (9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 반려동물용 간식을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 반려동물 건강간식은 베타글루칸, 반려동물 필수아미노산 및 비타민 등의 함량이 높고, 표고균사 발효물을 이용하여 반려동물 건강간식 제조에 사용할 경우 영양성분과 기호도를 확보하여 반려동물의 기호에 적합하고 항염증 효과를 지녀 건강에도 유익한 반려동물 건강간식을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 비파 추출 분말의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 울금 추출 분말의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 황칠 추출 분말의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 원목표고 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 5는 본 발명의 죽엽 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명의 백출 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 7은 본 발명의 복령 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 8은 본 발명의 황기 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 9는 본 발명의 비파 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 10은 본 발명의 황칠 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 11은 본 발명의 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 12는 본 발명의 울금 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 13은 한약재 추출액의 농도에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 14는 한약재 표고균사 발효물의 농도에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 15는 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
도 16은 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 GM-CSF 생성율을 비교한 그래프이다.
도 17은 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 IL-1β 생성율을 비교한 그래프이다.
도 18은 반려견 건강간식의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 19는 반려묘 건강간식의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 울금 추출 분말의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 황칠 추출 분말의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 원목표고 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 5는 본 발명의 죽엽 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명의 백출 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 7은 본 발명의 복령 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 8은 본 발명의 황기 추출액의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 9는 본 발명의 비파 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 10은 본 발명의 황칠 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 11은 본 발명의 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 12는 본 발명의 울금 귀리 표고균사 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 13은 한약재 추출액의 농도에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 14는 한약재 표고균사 발효물의 농도에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 15는 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
도 16은 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 GM-CSF 생성율을 비교한 그래프이다.
도 17은 표고균사 발효물 및 건강간식의 농도에 따른 IL-1β 생성율을 비교한 그래프이다.
도 18은 반려견 건강간식의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 19는 반려묘 건강간식의 제조공정을 도식화한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 비파를 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계;
(2) 황칠을 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말을 혼합한 혼합물에 물을 첨가한 후, 여기에 귀리를 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.))를 접종하여 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계;
(4) 원목표고에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계;
(5) 황기을 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계;
(6) 복령을 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계;
(7) 분쇄한 죽엽에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계;
(8) 백출을 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; 및
(9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.))는 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)이고, 상기 균주를 한국생명공학연구원에 2020년 11월 27일자로 기탁하였다. 상기 기탁된 특정 표고 균사는 한약재 추출 분말에서 발효 효율이 높은 균사를 선정한 것이다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 반려동물은 반려견 또는 반려묘일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (9)단계의 고기는 오리고기, 돼지고기, 소고기, 닭고기, 양고기, 말고기 등의 육고기 또는 참치 등의 생선을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (1)단계의 비파 추출 분말은 바람직하게는 비파를 90~110℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 70~90℃에서 8~12시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비파를 100℃에서 3분간 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 80℃에서 10시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (2)단계의 황칠 추출 분말은 바람직하게는 황칠을 140~160℃에서 8~12분간 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 80~90℃에서 7~9시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 황칠을 150℃에서 10분간 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 85℃에서 8시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (3)단계의 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물은 바람직하게는 비파 추출 분말 12~18 g 및 황칠 추출 분말 12~18 g을 혼합한 혼합물에 물 1.4~1.6 L를 첨가한 후, 여기에 귀리를 50~70분 동안 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 22~26℃에서 3~5주 동안 배양한 후 건조 및 분쇄하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비파 추출 분말 15 g 및 황칠 추출 분말 15 g을 혼합한 혼합물에 물 1.47 L를 첨가한 후, 여기에 귀리를 60분 동안 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 24℃에서 4주 동안 배양한 후 건조 및 분쇄하여 제조할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 발효물을 제조하는 것이 균사 생장이 우수하면서, 베타글루칸, 폴리페놀 및 아미노산 함량이 높고, 보다 효율적으로 칼슘 섭취가 가능한 발효물로 제조할 수 있었다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (4)단계의 원목표고 추출액은 바람직하게는 원목표고 8~12 kg에 물 80~120 L를 첨가하여 70~80℃에서 7~9시간 동안 추출한 후 농축하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 원목표고 10 kg에 물 100 L를 첨가하여 75℃에서 8시간 동안 추출한 후 농축하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (5)단계의 황기 추출액은 바람직하게는 황기 4~6 kg을 140~160℃에서 3~10분간 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물 45~55 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 황기 5 kg을 150℃에서 3~10분간 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (6)단계의 복령 추출액은 바람직하게는 복령 4~6 kg을 110~130℃에서 1~2분간 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물 30~40 L를 첨가하여 90~100℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 복령 5 kg을 120℃에서 1분간 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물 35 L를 첨가하여 95℃에서 12시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (7)단계의 죽엽 추출액은 바람직하게는 분쇄한 죽엽 4~6 kg에 물 40~60 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 여과 및 농축하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 분쇄한 죽엽 5 kg에 물 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출한 후 여과 및 농축하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (8)단계의 백출 추출액은 바람직하게는 백출 4~6 kg을 140~160℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물 35~45 L를 첨가하여 80~100℃에서 8~12시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 백출 5 kg을 150℃에서 3분간 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물 40 L를 첨가하여 90℃에서 10시간 추출한 후 농축하여 제조할 수 있다.
본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 비파를 90~110℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 70~90℃에서 8~12시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계;
(2) 황칠을 140~160℃에서 8~12분간 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 80~90℃에서 7~9시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 12~18 g 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말 12~18 g을 혼합한 혼합물에 물 1.4~1.6 L를 첨가한 후, 여기에 귀리를 50~70분 동안 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 22~26℃에서 3~5주 동안 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계;
(4) 원목표고 8~12 kg에 물 80~120 L를 첨가하여 70~80℃에서 7~9시간 동안 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계;
(5) 황기 4~6 kg을 140~160℃에서 3~10분간 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물 45~55 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계;
(6) 복령 4~6 kg을 110~130℃에서 1~2분간 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물 30~40 L를 첨가하여 90~100℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계;
(7) 분쇄한 죽엽 4~6 kg에 물 40~60 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계;
(8) 백출 4~6 kg을 140~160℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물 35~45 L를 첨가하여 80~100℃에서 8~12시간 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; 및
(9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 비파를 100℃에서 3분간 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 80℃에서 10시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계;
(2) 황칠을 150℃에서 10분간 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 85℃에서 8시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 15 g 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말 15 g을 혼합한 혼합물에 물 1.47 L를 첨가한 후, 여기에 귀리를 60분 동안 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 24℃에서 4주 동안 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계;
(4) 원목표고 10 kg에 물 100 L를 첨가하여 75℃에서 8시간 동안 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계;
(5) 황기 5 kg을 150℃에서 3~10분간 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계;
(6) 복령 5 kg을 120℃에서 1분간 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물 35 L를 첨가하여 95℃에서 12시간 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계;
(7) 분쇄한 죽엽 5 kg에 물 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계;
(8) 백출 5 kg을 150℃에서 3분간 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물 40 L를 첨가하여 90℃에서 10시간 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; 및
(9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 반려동물용 간식의 제조방법에서, 상기 (9)단계의 혼합 시 반려견용 간식일 경우, 바람직하게는 오리고기 45~55 g에 황칠비파 귀리 표고균사 발효물 30~40 g, 원목표고 추출액 4~6 g, 황기 추출액 1.5~2.5 g, 백복령 추출액 2.5~3.5 g, 죽엽 추출액 2.5~3.5 g 및 백출 추출액 1.5~2.5 g을 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 오리고기 50 g에 황칠비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출액 5 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 3 g 및 백출 추출액 2 g을 혼합할 수 있다.
또한, 상기 (9)단계의 혼합 시 반려묘용 간식을 경우, 참치 55~65 g에 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 20~30 g, 원목표고 추출액 2.5~3.5 g, 황기 추출액 1.5~2.5 g, 백복령 추출액 2.5~3.5 g, 죽엽 추출액 1.5~2.5 g 및 백출 추출액 4.5~5.5 g을 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 참치 60 g에 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출액 3 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 2 g 및 백출 추출액 5 g을 혼합할 수 있다.
상기와 같은 조건으로 혼합하는 것이 반려동물이 더욱 선호하면서, 베타글루칸, 폴리페놀, 아미노산 및 비타민 함량이 높으면서 항염증 효과를 지녀, 보다 반려동물의 건강에 유익한 간식으로 제조할 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 반려동물용 간식을 제공한다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 비파, 울금, 황칠 추출 분말 제조
(1) 비파 추출 분말의 제조공정은 도 1과 같다. 비파를 100℃에서 3분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 100 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 비파에 정제수를 10배(v/w) 첨가하여 80℃에서 10시간 동안 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 실온에서 냉각하였다. 실온으로 냉각된 비파 추출액을 2 brix로 농축하고 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하였다.
(2) 울금 추출 분말의 제조공정은 도 2와 같다. 울금을 120℃에서 5분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 120 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 울금에 정제수를 10배(v/w) 첨가하여 90℃에서 8시간 동안 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 실온에서 냉각하였다. 실온으로 냉각된 울금 추출액을 1 brix로 농축하고 동결건조하여 울금 추출 분말을 제조하였다.
(3) 황칠 추출 분말의 제조공정은 도 3과 같다. 황칠을 150℃에서 10분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 120 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 황칠에 정제수를 10배(v/w) 첨가하여 85℃에서 8시간 동안 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 실온에서 냉각하였다. 실온으로 냉각된 황칠 추출액을 2 brix로 농축하고 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하였다.
제조예 2. 원목표고, 죽엽, 백출, 복령, 황기 추출액 제조
(1) 원목표고 추출액의 제조공정은 도 4와 같다. 원목표고 10 kg을 블렌더를 사용하여 100 mesh로 분쇄한 후 정제수 100 L를 첨가하여 75℃에서 8시간 동안 추출하였다. 상기 추출한 추출액을 부직포를 이용하여 여과한 후 10 brix로 농축하여 원목표고 추출액을 제조하였다.
(2) 죽엽 추출액의 제조공정은 도 5와 같다. 죽엽 5 kg을 블렌더를 사용하여 80 mesh로 분쇄한 후 정제수 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출하였다. 상기 추출한 추출액을 부직포를 이용하여 여과한 후 5 brix로 농축하여 죽엽 추출액을 제조하였다.
(3) 백출 추출액의 제조공정은 도 6과 같다. 백출 5 kg을 150℃에서 3분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 100 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 백출에 정제수 40 L를 첨가하여 90℃에서 10시간 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 5 brix로 농축하여 백출 추출액을 제조하였다.
(4) 복령 추출액의 제조공정은 도 7과 같다. 복령 5 kg을 120℃에서 1분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 120 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 복령에 정제수 35 L를 첨가하여 95℃에서 12시간 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 5 brix로 농축하여 복령 추출액을 제조하였다.
(5) 황기 추출액의 제조공정은 도 8과 같다. 황기 5 kg을 150℃에서 3~10분간 로스팅한 후 블렌더를 사용하여 80 mesh로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 황기에 정제수 50 L를 첨가하여 80℃에서 12시간 추출하고 부직포를 이용하여 여과한 후 5 brix로 농축하여 황기 추출액을 제조하였다.
제조예 3. 비파 귀리 표고균사 발효물, 황칠 귀리 표고균사 발효물, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물 제조
(1) 비파 추출 분말(제조예 1의 (1)단계) 30 g을 물 1.47 L에 녹이고, 여기에 건조된 귀리 1 kg을 첨가하여 한시간 동안 침지한 후 꺼내었다. 상기 꺼낸 귀리를 균사 배양 봉지에 일정량 나누어 담은 후 오염원을 제거하기 위해 121℃의 고압증기멸균기(autoclave)에서 35분간 멸균하였다. 상기 멸균된 귀리를 클린벤치에서 냉각 후 PDA(Potato dextrose agar, DifcoTM, USA) 배지에서 생육된 표고 균사체(KCTC18874P)를 무균적으로 취해 접종하여 24℃ 인큐베이터에서 4주간 배양하였다. 배양이 완료된 후 원료 안전성을 위해 80℃ 고압증기멸균기(autoclave)에서 15분간 살균작업을 거친 후 비닐을 제거하여 70℃ 드라이 오븐에서 건조를 진행하였다. 그 다음 얻어진 건조물을 분쇄하여 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하였다(도 9).
(2) 황칠 추출 분말(제조예 1의 (3)단계) 30 g을 물 1.47 L에 녹이고, 여기에 건조된 귀리 1 kg을 첨가하여 한시간 동안 침지한 후 꺼내었다. 상기 꺼낸 귀리를 균사 배양 봉지에 일정량 나누어 담은 후 오염원을 제거하기 위해 121℃의 고압증기멸균기(autoclave)에서 35분간 멸균하였다. 상기 멸균된 귀리를 클린벤치에서 냉각 후 PDA(Potato dextrose agar, DifcoTM, USA) 배지에서 생육된 표고 균사체(KCTC18874P)를 무균적으로 취해 접종하여 24℃ 인큐베이터에서 4주간 배양하였다. 배양이 완료된 후 원료 안전성을 위해 80℃ 고압증기멸균기(autoclave)에서 15분간 살균작업을 거친 후 비닐을 제거하여 70℃ 드라이 오븐에서 건조를 진행하였다. 그 다음 얻어진 건조물을 분쇄하여 황칠 귀리 표고균사 발효물을 제조하였다(도 10).
(3) 비파 추출 분말(제조예 1의 (1)단계) 15 g 및 황칠 추출 분말(제조예 1의 (3)단계) 15 g을 혼합한 혼합물에 물 1.47 L에 녹이고, 여기에 건조된 귀리 1 kg을 첨가하여 한시간 동안 침지한 후 꺼내었다. 상기 꺼낸 귀리를 균사 배양 봉지에 일정량 나누어 담은 후 오염원을 제거하기 위해 121℃의 고압증기멸균기(autoclave)에서 35분간 멸균하였다. 상기 멸균된 귀리를 클린벤치에서 냉각 후 PDA(Potato dextrose agar, DifcoTM, USA) 배지에서 생육된 표고 균사체(KCTC18874P)를 무균적으로 취해 접종하여 24℃ 인큐베이터에서 4주간 배양하였다. 배양이 완료된 후 원료 안전성을 위해 80℃ 고압증기멸균기(autoclave)에서 15분간 살균작업을 거친 후 비닐을 제거하여 70℃ 드라이 오븐에서 건조를 진행하였다. 그 다음 얻어진 건조물을 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하였다(도 11).
(4) 울금 추출 분말(제조예 1의 (2)단계) 15 g에 물 1.485 L를 녹이고, 여기에 건조된 귀리 1 kg을 첨가하여 한시간 동안 침지한 후 꺼내었다. 상기 꺼낸 귀리를 균사 배양 봉지에 일정량 나누어 담은 후 오염원을 제거하기 위해 121℃의 고압증기멸균기(autoclave)에서 35분간 멸균하였다. 상기 멸균된 귀리를 클린벤치에서 냉각 후 PDA(Potato dextrose agar, DifcoTM, USA) 배지에서 생육된 표고 균사체(KCTC18874P)를 무균적으로 취해 접종하여 24℃ 인큐베이터에서 4주간 배양하였다. 배양이 완료된 후 원료 안전성을 위해 80℃ 고압증기멸균기(autoclave)에서 15분간 살균작업을 거친 후 비닐을 제거하여 70℃ 드라이 오븐에서 건조를 진행하였다. 그 다음 얻어진 건조물을 분쇄하여 울금 귀리 표고균사 발효물을 제조하였다(도 12).
제조예 4. 반려견, 반려묘 건강간식 간식제조
(1) 반려견 간식개발
반려견 간식개발을 위하여 오리안심, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물(제조예 3의 (3)단계), 원목표고 추출액(제조예 2의 (1)단계), 황기 추출액(제조예 2의 (5)단계), 복령 추출액(제조예 2의 (4)단계), 죽엽 추출액(제조예 2의 (2)단계), 백출 추출액(제조예 2의 (3)단계)의 혼합비를 달리하여 반려견 1, 반려견 2, 반려견 3, 반려견 4 및 반려견 5의 다섯가지 시제품을 제작하여 관능평가를 수행한 결과, 오리안심 50 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출액 5 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 3 g, 백출 추출액 2 g의 혼합비로 제조한 반려견 3의 선호도가 가장 높게 나타나 최종 혼합비율로 선정하였다.
반려견 간식개발 공정은 분쇄한 오리안심 50 g에 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출액 5 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 3 g, 백출 추출액 2 g을 첨가하여 교반기로 10분간 배합하였다. 배합된 내용물을 레토르트 파우치에 주입하여 123℃에서 30분간 멸균한 후 실온에서 방냉한 후 반려견 건강간식을 제조하였다(표 1 및 2).
| 구분 | 반려견 1 | 반려견 2 | 반려견 3 | 반려견 4 | 반려견 5 |
| 오리안심 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 55 | 45 | 35 | 25 | 15 |
| 원목표고 추출액 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 황기 추출액 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 복령 추출액 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 죽엽 추출액 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 백출 추출액 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 합계 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 구분 | 섭취량 | 전체 기호도 |
| 비교예(시판제품) | 7.1 | 7.2 |
| 반려견 1 | 6.9 | 6.8 |
| 반려견 2 | 7.3 | 7.4 |
| 반려견 3 | 8.1 | 8.1 |
| 반려견 4 | 7.6 | 7.5 |
| 반려견 5 | 7.1 | 7.1 |
매우좋음 9점, 좋음 7점, 보통 5점, 나쁨 3점, 매우나쁨 1점
(2) 반려묘 간식개발
반려묘 간식개발을 위하여 참치, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물(제조예 3의 (3)단계), 원목표고 추출액(제조예 2의 (1)단계), 황기 추출액(제조예 2의 (5)단계), 복령 추출액(제조예 2의 (4)단계), 죽엽 추출액(제조예 2의 (2)단계), 백출 추출액(제조예 2의 (3)단계)의 혼합비를 달리하여 반려묘 1, 반려묘 2, 반려묘 3, 반려묘 4 및 반려묘 5 다섯가지 시제품을 제작하여 관능평가를 수행한 결과, 참치 60 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출액 3g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 2 g, 백출 추출액 5 g의 혼합비로 제조한 반려묘 4의 선호도가 가장 높게 나타나 최종 혼합비율로 선정하였다.
반려묘 간식개발 공정은 분쇄한 참치 60 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출액 3g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 2 g, 백출 추출액 5 g을 첨가하여 교반기로 10분간 배합하였다. 배합된 내용물을 레토르트 파우치에 주입하여 123℃에서 30분간 멸균한 후 실온에서 방냉한 후 반려묘 건강간식을 제조하였다(표 3 및 4).
| 구분 | 반려묘 1 | 반려묘 2 | 반려묘 3 | 반려묘 4 | 반려묘 5 |
| 참치 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 55 | 45 | 35 | 25 | 15 |
| 원목표고 추출액 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 황기 추출액 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 복령 추출액 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 죽엽 추출액 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 백출 추출액 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 합계 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 구분 | 섭취량 | 전체 기호도 |
| 비교예(시판제품) | 6.6 | 6.7 |
| 반려묘 1 | 6.4 | 6.5 |
| 반려묘 2 | 6.8 | 6.8 |
| 반려묘 3 | 7.1 | 7.2 |
| 반려묘 4 | 7.9 | 7.8 |
| 반려묘 5 | 7.0 | 7.1 |
매우좋음 9점, 좋음 7점, 보통 5점, 나쁨 3점, 매우나쁨 1점
2. 실험방법
(1) 최적 발효 표고균사 선정
시료별 및 버섯균사별 발효 효율을 측정을 위하여 표고균사체의 성장을 접종면으로부터 아래로 성장해간 균사의 길이를 측정하여 나타낸 결과는 표 5와 같다. JMI-10075 균사는 대조구를 포함한 모든 한약재 추출 분말 첨가구에서 발효되지 않았다. JMI-10071과 JMI-10079 균사는 각 시료의 10~200 g/L 농도에서 발효되었으나 균사의 길이가 2~3 cm으로 생장이 약함을 나타냈다. JMI-10076 균사는 상대적으로 10 g/L, 20 g/L, 50 g/L의 농도에서 4~6 cm의 균사 길이를 보여 발효가 양호하였다. KCTC 18874P 균사는 모든 시료에서 고농도인 300 g/L을 제외하고 균사 발효가 우수함을 나타냈다. 이에 한약재 추출물 표고균사 발효물 제조에 KCTC 18874P 균주(Lentinula edodes(Berk.) JMIF-001)를 선발하여 사용하였다.
(2) 최적 표고균사 발효 온도 선정
표고균사 KCTC 18874P의 최적 발효온도를 측정한 결과는 다음 표 6과 같다. 16℃에서 32℃까지 2℃ 간격으로 온도처리를 한 결과 22℃, 25℃에서 균사 발효가 양호함을 보였고 24℃에서 균사발효가 우수함을 보였다. 이에 한약재 추출물 표고균사 발효물 제조시 균사발효 온도를 24℃로 설정하였다.
| 온도(℃) | 균사생장(25 days) |
| 16 | -a |
| 18 | - |
| 20 | + |
| 22 | ++ |
| 24 | +++ |
| 26 | ++ |
| 28 | + |
| 30 | + |
| 32 | - |
a균사 발효(-: 균사 발효 안됨, +: 균사 발효 약함, ++: 균사 발효 양호, +++: 균사 발효 우수). 균사 발효 안됨: 1 cm 미만, 균사 발효 약함: 2∼3 cm, 균사 발효 양호: 4∼6 cm, 균사 발효 우수: 7 cm 이상
(3) 베타글루칸 분석
- 곡물 베타글루칸
분쇄 시료 80~120 mg을 정확히 달아 튜브에 넣고 50% 에탄올 0.2 mL와 20 mM 인산나트륨 버퍼 4 mL를 가하여 볼텍싱한 후 즉시 100℃의 항온수조에서 3분 동안 배양하였다. 그 후 50℃ 항온수조에 5분간 배양한 후 리체나아제(lichenase) 0.2 mL를 가하여 혼합하고 캡을 밀봉하여 50℃ 항온수조에 1시간 동안 배양하였다. 그 후 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 5 mL를 가하여 볼텍싱한 후 실온으로 식혀 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 상층액에서 즉시 0.1 mL를 취하여 반응 튜브에는 0.1 mL의 β-글루코시다아제를 가하고, 블랭크 반응 튜브에는 0.1 mL의 50mM 아세테이트 버퍼를 가하여 50℃에서 10분 동안 배양한 후 GOPOD 3 mL를 넣고 50℃에서 20분간 배양하여 510 nm 흡광도에서 측정하였다.
- 버섯 베타글루칸
시료의 베타글루칸은 Megazyme kit(Mushroom and Yeast β-glucan Assay Procedure K-YBGL, Megazyme, Ireland)을 이용하여 측정하였다.
먼저 총 글루칸은 100 mesh 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣어 37% HCl 1.5 mL를 넣고 45분간 30℃ 항온 수조에 넣어 분해하였다. 그 후 증류수 10 mL를 넣어 볼텍스(vortex)하고, 100℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 그 후 실온에서 식히면서 2N KOH를 10 mL씩 넣고 200 mM 아세트산나트륨 버퍼로 100 mL로 정용한 후 충분히 혼합하였다. 그 후 상등액 0.1 mL에 200 mM 아세트산나트륨 버퍼(sodium acetate buffer)에 녹인 엑소-1,3-β-글루카나아제 플러스 β-글루코사다아제(exo-1,3-β-glucanase plus β-glucosidase) 0.1 mL를 넣고, reagent blank는 아세테이트 버퍼(acetate buffer) 0.2 mL를 넣고, D-글루코스 스텐다드는 D-글루코스 스텐다드(D-glucose standard) 0.1 mL과 아세테이트 버퍼 0.1 mL를 넣고 혼합한 후 40℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 다음 GOPOD(Glucose oxidase/peroxidase mixture) 3 mL를 넣고 40℃에서 20분 동안 배양한 후, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
α-글루칸(α-Glucan)은 100 mesh 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣고 2M KOH 2 mL씩 넣고 20분간 혼합하였다. 1.2M 아세트산나트륨 버퍼 8 mL를 넣고 섞은 후 아밀로글루코시다아제 플러스 인버테이스(amyloglucosidase plus invertase) 0.2 mL를 넣고, 잘 섞어서 40℃ 항온 수조에서 30분간 배양하였다. 상등액 0.1 mL에 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 0.1 mL, GOPOD 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 배양한 후, 510 nm 흡광도에서 측정하였다. 계산은 총 글루칸 함량에서 α-글루칸 함량을 빼서 β-글루칸의 함량을 정량하였다.
(4) 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량 분석은 Folin-Denis법으로 실험하였다. 시료를 1000배 희석한 후 Folin 시약 0.025 mL를 첨가하여 6분 후에 Na2CO3 포화용액 0.1 mL를 가해 혼합하여 발색시켰다. 1시간 후 발색된 시약을 765 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 gallic acid을 100, 200, 300, 400 및 500 ㎍/mL로 만들어 처리한 후 흡광도와 농도와의 관계를 나타내는 표준곡선을 만들어 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.
(5) 아미노산
아미노산 분석은 시료 0.5 g을 시험관에 넣고 6 N-HCl 10 mL를 넣은 후 시험관 끝을 불로 녹여 앰플로 만들어 밀봉한 후 오토클레이브 110℃에서 24시간 가수분해시킨 후 앰플을 깨고 여과지로 여과하면서 메탄올 50 mL로 정용하여 감압 농축하여 20 mM HCl 5 mL로 정용하였다. 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 얻은 여액을 일정량 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화 시킨 후 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 표 7과 같다.
| 항목 | 분석조건 | |||
| 장비 | Agilent Technologies 1200 Series | |||
| 검출기 | Agilent Technologies 1200 Series FLD | |||
| 컬럼 | AccQ-Tag™ (Waters Co., 150 mm L × 3.9 mm I.D.) |
|||
| 컬럼 온도 | 37℃ | |||
| 완충용액 | A : AccQ-Tag Eluent A(acetate-phosphate buffer) B : AccQ-Tag Eluent B(100% acetonitrile) C : D.W |
|||
| 시간 | A | B | C | |
| 0 | 100 | 0 | 0 | |
| 0.5 | 99 | 1 | 0 | |
| 18 | 95 | 5 | 0 | |
| 19 | 91 | 9 | 0 | |
| 26 | 86.7 | 13.3 | 0 | |
| 30 | 84 | 16 | 0 | |
| 32 | 83 | 17 | 0 | |
| 36 | 0 | 60 | 40 | |
| 39 | 100 | 0 | 0 | |
| 48 | 100 | 0 | 0 | |
| 유속 | 1.0 mL/min | |||
| 주입 용량 | 5 ㎕ | |||
(6) 비타민 B1, B2
검체 0.5 g을 정확히 달아, 증류수 2 mL를 가하여 10분간 볼텍싱하고 아세토니트릴 6 mL를 첨가하여 20분간 혼합한 후 4000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상징액을 취하여 감압건조 후 증류수 10 mL로 정량하였다. 용액을 전량 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 이 중 20 ㎕를 HPLC에 주입하였다(표 8).
| 항목 | 분석조건 | |||
| Instrument | Agilent Technologies 1200 Series | |||
| Column | Agilent XDB-C18 (Method Development Kit) (4.6 × 150 mm, 5 um) |
|||
| Mobile phase | A: 20mM KH2PO4 (pH 2.95) B: 20mM KH2PO4 (pH 2.95)/ACN = 50/50 (v/v) |
|||
| Fuel flow | 0.8~1.0 mL/min | |||
| Column temp. | 30℃ | |||
| Wavelength (nm) | 275 nm | |||
| Injection volume | 20 ㎕ | |||
| Gradient program | Time | Flow(mL/min) | A(%) | B(%) |
| 0.0 | 0.8 | 100 | 0 | |
| 10.0 | 0.8 | 100 | 0 | |
| 12.0 | 1.0 | 100 | 0 | |
| 60.0 | 1.0 | 50 | 50 | |
(7) 칼슘 분석
시료의 칼슘은 습식분해법으로 전처리하여 분석하고 분석 조건은 아래 표 9와 같다. 즉, 시료 0.5 g에 진한 질산 10 mL를 가하여 처음에는 낮은 온도로 가열하고 점차 고온으로 가열하면서 분해(Buchi distillation Unit B-324)시켜 분해액이 백색 투명하게 되면 냉각시키고 분해액에 증류수를 가하여 100 mL로 정용한 다음 여액을 분석용 시료로 하였다. 칼슘의 정량은 원자흡수분광광도계(Perkin Elmer Analyst 400, USA)로 각 원소의 표준 용액 농도를 1, 3 및 5 ppm으로 조제하여 표준 검량 곡선을 작성하여 분석하였다.
| 항목 | 분석조건 |
| Instrument | Atomic Absorption Spectrophotometer (Perkin Elmer Analyst 400) |
| Fuel flow | C2H2, 2.0/min |
| Oxidant flow | Air, 10.0 L/min |
| Wavelength (nm) | Ca: 422.67 |
(8) 인(P) 함량 분석
인 성분은 시료 1 g을 600℃에서 회화시켜 백색회분을 얻은 후, 회분을 2배 희석한 진한 염산 10 mL를 가해 여과하여 수욕 상에서 증발 건조시킨 후 4배 희석한 염산을 10 mL를 가하고 증류수를 가하여 100 mL로 정용하였다. 전처리된 시료 일정량을 발색제인 메타바나듐산암모늄 용액(ammonnium meta vanadate solution) 1 mL를 가하여 증류수로 10 mL 정용하였다. 30분 방치한 후 UV 분광광도계 470 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
(9) 중금속
중금속은 건식회화법으로 전처리하여 분석하였으며 분석 조건은 표 10과 같다. 즉 시료 0.5 g을 600℃에서 회화시켜 백색회분을 얻은 후, 2배 희석한 진한 염산 10 mL를 가해 여과하여 수욕상에서 증발 건조시킨 후 4배 희석한 염산 10 mL를 가한 후, 증류수를 이용하여 100 mL로 정용한 여액을 분석시료로 사용하였다. 각 무기성분의 정량은 원자흡광광도계(Perkin Elmer AAnalyst 400)로 각 원소의 표준 용액 농도를 0.5, 1.0, 3.0 및 5.0 mg/kg으로 조제하여 표준 검량 곡선을 작성하여 분석하였다.
| Content | Analysis condition |
| Instrument | Atomic Absorption spectrophotometer (Perkin Elmer AAnalyst 400) |
| Fuel flow | C2H2, 2.0 mL/min |
| Oxidant flow | Air, 10.0 mL/min |
| Wavelength (nm) | Pb:283.31, Cd:228.80 |
(10) 세포 배양
RAW 264.7 macrophages cell 배양은 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene, Gyeongsan, Korea)에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL 페니실린과 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기(5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)으로 세포의 단층을 씻어내고 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 계대 배양하였고 배지는 2일마다 교환하였다.
(11) 세포생존율 확인
MTT 분석법으로 세포독성을 측정하였다. 각각의 세포를 96 웰 플레이트에 1 ×105 cell/mL의 농도로 배양하여 실험에 사용하였다. 시료를 각각 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도로 24시간 처리한 후, 배지를 제거하고 새로운 배지에 10 ㎕ MTS를 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 540 nm로 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 세포 생존율은 시료 무처리군을 100%로 하여 상대적으로 계산하였다.
(12) NO(Nitric oxide) 생성량 측정
Raw 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 1×105 cell/mL이 되도록 분주하고 24시간 배양한 후, 시료와 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하였다. LPS는 각각 1 ㎍/mL의 농도로 처리하였으며, 각 시료는 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도로 희석하여 세포에 첨가하였다. 24시간 후에 세포 배양액을 회수하여 Griess reagent system 을 이용한 NO assay를 이용하여 NO 생성 억제능을 측정하였다. 각 시료의 NO 생성율은 LPS 처리군을 100%로 하여 상대적으로 계산하였다.
(13) 염증성 사이토카인(GM-CSF, IL-1β) 생성량 측정
세포배양액 내의 염증성 사이토카인 생성량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cells/ml로 조절한 후 6-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 ㎍/mL의 LPS를 처리한 뒤 1시간 후에 각각의 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokine 함량을 측정하였으며, 정량은 ELISA kit를 이용하여 정량하였고, standard에 대한 표준곡선 R2 값은 0.99 이상이었다.
(14) 관능평가
관능검사는 반려동물이 섭취하는 섭취량을 비교하였고, 섭취량이 많을수록 높은 점수를 주게 하였으며, 전체 기호도는 반려동물이 5가지 간식 중 선택하는 횟수와 좋아하는 정도를 비교하여 점수를 매겼다. 채점 기준은 매우좋음 9점, 좋음 7점, 보통 5점, 나쁨 3점, 매우나쁨 1점으로 하였다.
(15) 통계처리
본 실험 결과를 SPSS 통계분석 프로그램(SPSS, ver. 16.0, USA)을 이용해 각 실험군간 평균치와 표준편차를 계산하고 통계적 유의성은 유의성 p<0.05 수준으로 얻어진 결과는 one-way ANOVA 중 Duncans multiple range test로 검증하였다.
실시예 1. 베타글루칸
각 한약재 표고균사 발효물의 베타글루칸 함량은 표 11과 같다. 주로 곡물에서 (1-3)(1-4) β-글루칸이 발견되고, 효모 및 버섯에서는 (1-3)(1-6) β-글루칸이 검출된다. 오직 (1-3)(1-6) β-글루칸만이 항암 및 면역증강 작용을 하는 것으로 알려져 있다. (1-3)(1-4) β-글루칸은 1.07~1.81%의 함량을 나타내고, 울금 귀리 표고균사 발효물의 함량이 1.81%로 가장 높은 함량을 보였다. (1-3)(1-6) β-글루칸은 43.25~48.58%의 함량을 나타냈고, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물의 함량이 48.58%로 가장 높은 함량을 보였다.
| 시료 | (1-3)(1-4) β-glucan | (1-3)(1-6) β-glucan | 총 베타글루칸 |
| 비파 귀리 표고균사 발효물 | 1.07 | 43.25 | 44.32 |
| 황칠 귀리 표고균사 발효물 | 1.16 | 43.64 | 44.8 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 1.55 | 48.58 | 50.13 |
| 울금 귀리 표고균사 발효물 | 1.81 | 47.08 | 48.89 |
한약재 추출 균사 발효물이 첨가된 반려견 시제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸의 함량은 표 12와 같다. 기존에 시판된 반려견 간식제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸 함량은 각각 0.16, 8.34%이고 총 베타글루칸 함량은 8.5%였다. 반려견 시제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸 함량은 각각 0.97~1.36%, 11.74~24.72%로 기존 시판제품보다 유의적인 차이로 증가함을 보였다. (1-3)(1-4) β-글루칸 함량은 1.36%로 오리안심 50 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출물 5 g, 황기 추출물 2 g, 백복령 추출물 3 g, 죽엽 추출물 3 g, 백출 추출물 2 g의 혼합비로 제조한 반려견 3에서 가장 높은 수치를 보였으며, (1-3)(1-6) β-글루칸 함량도 반려견 3에서 가장 높은 수치를 나타냈다. 따라서, 반려견 3을 최종 반려견 시제품으로 선정하였다.
| 시료 | (1-3)(1-4) β-glucan | (1-3)(1-6) β-glucan | 총 베타글루칸 |
| 비교예(시판제품) | 0.16 | 8.34 | 8.5 |
| 반려견 1 | 0.97 | 21.27 | 22.24 |
| 반려견 2 | 1.07 | 20.53 | 21.6 |
| 반려견 3 | 1.36 | 24.72 | 26.08 |
| 반려견 4 | 1.05 | 17.31 | 18.36 |
| 반려견 5 | 1.09 | 11.74 | 12.83 |
한약재 표고균사 발효물이 첨가된 반려묘 시제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸의 함량은 표 13과 같다. 기존에 시판된 반려묘 간식제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸 함량은 각각 0.71, 8.51%이고, 총 베타글루칸 함량은 9.22%였다. 반려묘 시제품의 (1-3)(1-4) β-글루칸 및 (1-3)(1-6) β-글루칸 함량은 각각 1.25~2.12, 15.24~21.98%로 기존 시판제품보다 유의적인 차이로 증가함을 보였다. (1-3)(1-4) β-글루칸 함량은 2.12%로 참치 60 g, 울금 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출물 3 g, 황기 추출물 2 g, 백복령 추출물 3 g, 죽엽 추출물 2 g, 백출 추출물 5 g의 혼합비로 제조한 반려묘 4에서 가장 높은 수치를 보였으며, (1-3)(1-6) β-글루칸 함량도 21.98%로 반려묘 4에서 가장 높은 수치를 나타냈다. 따라서, 반려묘 4를 최종 반려묘 시제품으로 선정하였다.
| 시료 | (1-3)(1-4) β-글루칸 | (1-3)(1-6) β-글루칸 | 총 베타글루칸 |
| 비교예(시판제품) | 0.71 | 8.51 | 9.22 |
| 반려묘 1 | 2.01 | 15.24 | 17.25 |
| 반려묘 2 | 1.89 | 16.11 | 18 |
| 반려묘 3 | 1.64 | 18.41 | 20.05 |
| 반려묘 4 | 2.12 | 21.98 | 24.1 |
| 반려묘 5 | 1.25 | 17.86 | 19.11 |
실시예 2. 총 폴리페놀 함량
표고균사로 발효한 비파, 황칠, 울금 추출물을 함유한 귀리 발효물들의 총 폴리페놀 함량은 울금 귀리 표고균사 발효물과 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물에서 높게 나타났다(표 14).
| 시료 | 총 폴리페놀 |
| 비파 귀리 표고균사 발효물 | 34.8±2.0 |
| 황칠 귀리 표고균사 발효물 | 48.5±1.5 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 52.9±0.6 |
| 울금 귀리 표고균사 발효물 | 53.3±2.2 |
한약재 표고균사 발효물이 첨가된 반려견 시제품의 총 폴리페놀 함량은 표 15와 같다. 기존에 시판된 반려견 건강간식 제품의 총 폴리페놀 함량은 5.8 mg/g으로 나타났으나, 본 발명에서 제조된 반려견 1 내지 5에서는 16.8~21.4 mg/g의 함량을 보였다. 반려견 3의 총 폴리페놀 함량이 21.4 mg/g로 가장 높게 나타났다.
| 시료 | 총 폴리페놀 |
| 비교예(시판제품) | 5.8±0.9 |
| 반려견 1 | 17.8±1.4 |
| 반려견 2 | 18.8±1.2 |
| 반려견 3 | 21.4±1.1 |
| 반려견 4 | 16.8±1.7 |
| 반려견 5 | 17.2±1.4 |
한약재 추출 균사 발효물이 첨가된 반려묘 시제품의 총 폴리페놀 함량은 다음 표 16과 같다. 본 연구결과 제조된 반려묘 건강간식들의 총 폴리페놀 함량은 21.7~31.2 mg/g으로 나타나 기존에 시판된 반려묘 간식제품의 총 폴리페놀 함량 10.1 mg/g보다 두 배 이상 높게 나타남을 확인하였다. 특히 반려묘 4는 다른 시제품보다 높은 수준의 총 폴리페놀 함량을 나타내어, 반려묘 4를 최종 반려묘 시제품으로 선정하였다.
| 시료 | 총 폴리페놀 |
| 비교예(시판제품) | 10.1±0.7 |
| 반려묘 1 | 22.4±1.6 |
| 반려묘 2 | 21.7±1.5 |
| 반려묘 3 | 26.3±1.2 |
| 반려묘 4 | 31.2±1.7 |
| 반려묘 5 | 27.2±1.4 |
실시예 3. 아미노산 함량
각 한약재 표고균사 발효물의 아미노산의 함량은 다음 표 17과 같다. 발효물별 총 아미노산 함량은 66.12~83.79 mg/g의 범위로 첨가된 한약재에 따른 차이를 보였다. 그 중 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물 순으로 높은 아미노산 함량을 보였다.
| Amino acids | 비파 귀리 표고균사 발효물 | 황칠 귀리 표고균사 발효물 | 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 울금 귀리 표고균사 발효물 |
| Arginine | 10.21 | 11.34 | 14.23 | 13.48 |
| Histidine | 6.21 | 7.04 | 9.72 | 9.07 |
| Isoleucine | 8.73 | 8.42 | 10.02 | 9.34 |
| Leucine | 14.46 | 16.82 | 19.34 | 18.02 |
| Lysine | 6.12 | 6.34 | 6.87 | 6.14 |
| Methionine | 3.21 | 4.02 | 3.87 | 3.78 |
| Phenylalanine | 7.01 | 6.87 | 8.01 | 7.98 |
| Threonine | 3.84 | 3.41 | 4.02 | 3.74 |
| Tryptophan | 1.02 | 1.32 | 1.47 | 1.28 |
| Valine | 5.31 | 4.89 | 6.24 | 5.73 |
| 합계 | 66.12 | 70.47 | 83.79 | 78.56 |
한약재 표고균사 발효물이 첨가된 반려견 시제품의 아미노산 함량은 다음 표 18과 같다. 기존에 시판된 반려견 간식제품의 아미노산 함량은 31.01 mg/g으로 나타났으며, 본 발명에서 제조된 반려견 제품들에서 65.93~74.85 mg/g의 함량을 보여 시중 시제품보다 높은 반려견 필수 아미노산 함량을 나타내었다. 필수 아미노산 함량은 오리안심 50 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출액 5 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 3 g, 백출 추출액 2 g의 혼합비로 제조한 반려견 3에서 가장 높은 수치를 보였다.
| Samples | 비교예 (시판제품) |
반려견 1 | 반려견 2 | 반려견 3 | 반려견 4 | 반려견 5 |
| Arginine | 3.24 | 6.32 | 7.23 | 8.32 | 8.24 | 7.01 |
| Histidine | 3.44 | 4.26 | 4.61 | 4.26 | 5.21 | 6.23 |
| Isoleucine | 4.71 | 5.21 | 6.32 | 7.21 | 7.61 | 6.46 |
| Leucine | 5.26 | 10.14 | 9.14 | 12.14 | 8.21 | 9.06 |
| Lysine | 1.78 | 9.34 | 10.34 | 11.34 | 9.36 | 8.27 |
| Methionine | 4.45 | 4.26 | 5.26 | 6.34 | 6.28 | 5.97 |
| Phenylalanine | 3.46 | 7.35 | 6.73 | 6.35 | 6.14 | 5.87 |
| Threonine | 2.21 | 6.71 | 5.42 | 5.71 | 5.41 | 6.01 |
| Tryptophan | 0.34 | 5.02 | 5.15 | 5.84 | 6.32 | 6.14 |
| Valine | 2.12 | 7.32 | 6.93 | 7.34 | 7.01 | 6.78 |
| 합계 | 31.01 | 65.93 | 67.13 | 74.85 | 69.79 | 67.8 |
한약재 표고균사 발효물이 첨가된 반려묘 시제품의 아미노산 함량은 다음 표 19와 같다. 기존에 시판된 반려묘 간식제품의 아미노산 함량은 37.55 mg/g으로 나타났으며, 본 발명에서 제조된 반려묘 제품들에서 65.2~97.33 mg/g의 함량을 보여 시중 시제품보다 높은 반려견 필수 아미노산 함량을 나타내었다. 필수 아미노산 함량은 참치 60 g, 울금 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출액 3 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 2 g, 백출 추출액 5 g의 혼합비로 제조한 반려묘 4에서 가장 높은 수치를 보였으며, 반려묘 필수 아미노산 중 중요 요소로 알려진 타우린 함량 또한 반려묘 4에서 가장 높게 나타났다.
| Samples | 비교예 (시판제품) |
반려묘 1 | 반려묘 2 | 반려묘 3 | 반려묘 4 | 반려묘 5 |
| Arginine | 4.32 | 8.34 | 8.42 | 10.46 | 11.43 | 12.34 |
| Histidine | 3.87 | 5.07 | 6.02 | 8.21 | 9.47 | 13.01 |
| Isoleucine | 3.65 | 4.62 | 4.97 | 7.01 | 7.98 | 11.03 |
| Leucine | 4.21 | 12.03 | 14.25 | 17.63 | 17.24 | 7.21 |
| Lysine | 3.98 | 7.78 | 11.03 | 16.31 | 14.35 | 11.02 |
| Methionine | 3.21 | 4.21 | 3.26 | 2.31 | 4.15 | 5.21 |
| Phenylalanine | 1.71 | 6.87 | 6.43 | 6.24 | 7.73 | 6.21 |
| Threonine | 3.23 | 5.01 | 6.04 | 3.01 | 7.42 | 5.24 |
| Tryptophan | 1.04 | 1.07 | 1.36 | 1.04 | 2.53 | 3.21 |
| Valine | 6.27 | 6.42 | 7.46 | 7.72 | 10.21 | 11.71 |
| Taurine | 2.06 | 3.78 | 4.17 | 4.35 | 4.82 | 4.26 |
| 합계 | 37.55 | 65.2 | 73.41 | 84.29 | 97.33 | 90.45 |
실시예 4. 비타민 B1, B2 함량
각 한약재 추출 균사 발효물의 비타민 B1 및 B2 함량은 다음 표 20과 같다. 발효물의 비타민 B1의 함량은 6.16~11.21 mg/kg의 범위로 한약재에 따른 차이를 보였다. 그 중 울금 귀리 표고균사 발효물이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 비파 귀리 표고균사 발효물 순으로 함량 차이를 보였다. 한약재 추출물에 따른 균사 발효물의 비타민 B2의 총 함량은 26.27~31.78 mg/kg의 범위를 보였으며, B1의 함량과 마찬가지로 울금 귀리 표고균사 발효물에서 가장 높은 함량을 보였다.
| 시료 | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 합계 |
| 비파 귀리 표고균사 발효물 | 7.24 | 27.84 | 35.08 |
| 황칠 귀리 표고균사 발효물 | 6.16 | 26.27 | 32.43 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 8.35 | 29.84 | 38.19 |
| 울금 귀리 표고균사 발효물 | 11.21 | 31.78 | 42.99 |
한약재 추출 균사 발효물이 첨가된 반려견 시제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 표 21과 같다. 기존에 시판된 반려견 간식제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 각각 2.21, 11.93 mg/kg으로 나타났다. 반려견 시제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 각각 8.41~10.26 그리고 23.11~33.42 mg/kg으로 기존 시판 제품보다 유의적인 차이로 증가함을 보였다. 비타민 B1 함량은 10.26 mg/kg으로 오리안심 50 g, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 35 g, 원목표고 추출액 5 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 3 g, 백출 추출액 2 g의 혼합비로 제조한 반려견 3에서 가장 높은 수치를 보였으며, 비타민 B2에서도 반려견 3에서 33.42 mg/kg으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 이 데이터를 기반으로 최종 반려견 시제품을 반려견 3로 선정하였다. 수용성 비타민 중 비타민 B1은 음식물 대사과정에서 필수적이고, 세포기능 발휘를 위한 에너지 생성 및 신경자극 전달에 관여하며 비타민 B2는 에너지 생성, 트립토판의 나이아신 전환, 동맥경화증이나 고혈알 예방, 성장 촉진, 식용 증진 및 질병에 대한 저항력의 강화에 효과적이다.
| 시료 | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 합계 |
| 비교예(시판제품) | 2.21 | 11.93 | 14.14 |
| 반려견 1 | 8.41 | 29.01 | 37.42 |
| 반려견 2 | 9.41 | 30.04 | 39.45 |
| 반려견 3 | 10.26 | 33.42 | 43.68 |
| 반려견 4 | 9.53 | 28.31 | 37.84 |
| 반려견 5 | 8.67 | 23.11 | 31.78 |
한약재 추출 균사 발효물이 첨가된 반려묘 시제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 표 22와 같다. 기존에 시판된 반려묘 간식제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 각각 3.16, 9.34 mg/kg으로 나타났다. 반려묘 시제품의 비타민 B1과 B2의 함량은 각각 7.26~10.07 그리고 28.11~34.42 mg/kg으로 기존 시판제품보다 유의적인 차이로 증가함을 보였다. 비타민 B1 함량은 10.07 mg/kg으로 참치 60 g, 울금 귀리 표고균사 발효물 25 g, 원목표고 추출액 3 g, 황기 추출액 2 g, 백복령 추출액 3 g, 죽엽 추출액 2 g, 백출 추출액 5 g의 혼합비로 제조한 반려묘 4에서 가장 높은 수치를 보였으며, 비타민 B2에서도 마찬가지로 반려묘 4에서 34.42 mg/kg으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 이 데이터를 기반으로 최종 반려묘를 위한 시제품을 반려묘 4로 택하였다.
| 시료 | 비타민 B1 | 비타민 B2 | 합계 |
| 비교예(시판제품) | 3.16 | 9.34 | 12.5 |
| 반려묘 1 | 7.26 | 31.34 | 38.6 |
| 반려묘 2 | 8.34 | 29.34 | 37.68 |
| 반려묘 3 | 8.26 | 31.41 | 39.67 |
| 반려묘 4 | 10.07 | 34.42 | 44.49 |
| 반려묘 5 | 9.01 | 28.11 | 37.12 |
실시예 5. 무기성분 함량
각 한약재 추출 균사 발효물의 칼슘 및 인의 함량은 표 23과 같다. 발효물의 칼슘의 함량은 160.16~450.21 mg/kg의 범위로 한약재에 따른 차이를 보였다. 그 중 비파 귀리 표고균사 발효물이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물 순으로 함량 차이를 보였다. 한약재 추출물에 따른 균사 발효물의 비타민 인의 총 함량은 98.65~257.96 mg/kg의 범위를 보였으며, 칼슘의 함량과 마찬가지로 비파 귀리 표고균사 발효물에서 가장 높은 함량을 보였다.
| 시료 | 칼슘 | 인 | 비율 |
| 비파 귀리 표고균사 발효물 | 450.21 | 257.96 | 1:0.57 |
| 황칠 귀리 표고균사 발효물 | 160.16 | 98.65 | 1:0.62 |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | 380.35 | 246.80 | 1:0.64 |
| 울금 귀리 표고균사 발효물 | 302.38 | 202.88 | 1:0.67 |
한약재 추출 균사 발효물이 첨가된 반려견 시제품의 칼슘과 인의 함량은 표 24와 같다. 기존에 시판된 반려견 간식제품의 칼슘과 인의 함량은 각각 12.12, 243.70 mg/kg으로 나타났고 1:2.02의 비율이었다. 한약재 추출 균사 발효물을 이용한 반려견 시제품의 칼슘과 인의 함량은 각각 231.41~293.41 그리고 159.46~198.24 mg/kg으로 기존 시판제품보다 유의적인 차이는 나타나지 않지만 칼슘과 인의 비율에서 큰 차이를 보였다. 칼슘 함량은 293.41 mg/kg으로 반려견 3에서 가장 높은 수치를 보였으며, 인의 함량은 반려견 1에서 198.24 mg/kg으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 체내에서 칼슘의 흡수는 칼슘과 인의 비율이 중요하므로 영양학적 가치를 증가시키기 위하여는 칼슘 흡수에 적합한 비율(칼슘/인=2~1)을 유지하면서 칼슘과 인의 함량을 증가시키는 것이 필요하다. 인은 많은 식품에 함유되어 있어 결핍이 되는 경우가 거의 없지만, 인의 섭취량이 너무 많게 되면 칼슘의 흡수가 저해되어 칼슘의 손실이 많아지므로 다음 반려견 3의 칼슘과 인의 비율이 반려견이 섭취하였을 때 칼슘의 손실을 최소화하며 다량의 칼슘을 섭취할 수 있기에 선정하였다.
| 시료 | 칼슘 | 인 | 비율 |
| 비교예(시판제품) | 120.12 | 243.70 | 1:2.02 |
| 반려견 1 | 270.31 | 198.24 | 1:0.73 |
| 반려견 2 | 280.12 | 176.34 | 1:0.63 |
| 반려견 3 | 293.41 | 168.21 | 1:0.57 |
| 반려견 4 | 231.41 | 159.46 | 1:0.69 |
| 반려견 5 | 241.21 | 182.32 | 1:0.76 |
한약재 표고균사 발효물이 첨가된 반려묘 시제품의 칼슘과 인의 함량은 표 25와 같다. 기존에 시판된 반려묘 간식제품의 칼슘과 인의 함량은 각각 124.86, 231.46 mg/kg으로 나타났으며 비율은 1:1.85로 환산되었다. 한약재 추출 균사발효물을 이용한 반려묘 시제품의 칼슘과 인의 함량은 각각 198.72~230.12 그리고 150.39~183.71 mg/kg으로 기존 시판제품보다 유의적인 차이는 나타나지 않지만 칼슘과 인의 비율에서 큰 차이를 보였다. 칼슘 함량은 225.26 mg/kg으로 반려묘 4에서 가장 높은 수치를 보였으며, 인의 함량은 반려묘 1에서 183.71 mg/kg으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 다음 시제품 중 칼슘과 인의 비율은 1:0.75로 나타난 반려묘 4가 반려묘들이 섭취하였을 때 칼슘의 손실을 최소화하며 다량의 칼슘을 섭취할 수 있기에 선정하였다.
| 시료 | 칼슘 | 인 | 비율 |
| 비교예(시판제품) | 124.86 | 231.46 | 1:1.85 |
| 반려묘 1 | 230.12 | 183.71 | 1:0.80 |
| 반려묘 2 | 224.86 | 172.43 | 1:0.77 |
| 반려묘 3 | 210.71 | 168.34 | 1:0.80 |
| 반려묘 4 | 225.26 | 169.26 | 1:0.75 |
| 반려묘 5 | 198.72 | 150.39 | 1:0.76 |
실시예 6. 중금속 분석 결과
중금속 분석 결과, 반려견, 반려묘 건강에 위해가 되는 중금속은 검출되지 않음을 확인하였다(표 26).
| 시료 | Heavy metal(mg%) | |
| Pb | Cd | |
| 비파 귀리 표고균사 발효물 | N.D | N.D |
| 황칠 귀리 표고균사 발효물 | N.D | N.D |
| 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 | N.D | N.D |
| 울금 귀리 표고균사 발효물 | N.D | N.D |
| 반려견 건강간식 | N.D* | N.D |
| 반려묘 건강간식 | N.D | N.D |
*N.D: 검출되지 않음
실시예 7. Raw 264.7에 대한 세포독성 분석결과
1) 한약재 추출액 세포독성 분석결과
한약재 추출액의 농도에 따른 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였으며 그 결과는 도 13과 같다. 비파 추출액과 황칠 추출액은 3000 ㎍/mL의 농도에서 각각 69.9%, 61.2%의 세포 생존율을 보여 독성을 나타냈으며, 울금 추출액은 2000 ㎍/mL의 농도에서 69.5%의 세포 생존율로 독성을 나타냈다. 그리하여 비파 추출액과 황칠 추출액은 2000 ㎍/mL, 울금 추출액은 1000 ㎍/mL의 농도로 한약재 추출균사 발효물에 첨가될 수 있도록 최종 설정하였다.
2) 한약재 추출균사 발효물 세포독성 분석결과
마우스 대식세포인 RAW264.7 cell에 대한 한약재 추출균사 발효물의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물, 비파 귀리 표고균사 발효물, 황칠 귀리 표고균사 발효물, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 반려묘 건강간식, 반려견 건강간식의 RAW264.7 cell에 대한 세포독성 분석결과는 도 14과 같다. 각각 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도에서 세포독성을 확인한 결과 모든 시료 및 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다.
실시예 8. NO(Nitric oxide) 생성억제 효과 분석 결과
염증상태에서 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하는 등 인체 면역 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물, 비파 귀리 표고균사 발효물, 황칠 귀리 표고균사 발효물, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 반려묘 건강간식, 반려견 건강간식의 NO 억제효과 분석 결과는 도 15와 같다. LPS 처리군의 NO 생성율을 100%로 할 때 1000 ㎍/mL의 농도에서 귀리 표고균사 발효물은 85.2%, 울금 귀리 표고균사 발효물은 61.4%, 비파 귀리 표고균사 발효물은 88.2%, 황칠 귀리 표고균사 발효물은 84.7%, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물은 68.8%, 반려묘 건강간식은 78.3%, 반려견 건강간식은 81.6%의 NO 생성량을 보여 울금 귀리 표고균사 발효물이 NO 생성율이 가장 낮았고 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 반려묘 건강간식, 반려견 건강간식 순으로 NO 생성율이 낮은 것으로 나타났다.
실시예 9. 염증성 사이토카인 생성량 측정
1) GM-CSF 억제 효과 분석결과
귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물, 비파 귀리 표고균사 발효물, 황칠 귀리 표고균사 발효물, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 반려묘 건강간식, 반려견 건강간식의 GM-CSF 억제 효과 분석결과는 도 16과 같다. LPS 처리군의 NO 생성율을 100%로 할 때 500 ㎍/mL의 농도에서 귀리 표고균사 발효물은 96.2%, 울금 귀리 표고균사 발효물은 56.1%, 비파 귀리 표고균사 발효물은 98.1%, 황칠 귀리 표고균사 발효물은 89.3%, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물은 79.5%, 반려묘 건강간식은 83.1%, 반려견 건강간식은 86.1%의 GM-CSF 생성율을 보였다.
2) IL-1β 억제 효과 분석결과
IL-1β(Interleukin-1β)의 주요 기능은 TNF와 비슷하게 감염이나 다른 자극에 대한 숙주의 염증반응 매개자로서의 역할이다. IL-1β은 미생물을 비롯한 여러 가지 생성 유도물질의 자극을 통하여 단구, 대식세포, 각질세포, NK세포, T세포, B세포, 내피세포, 비만세포, 호중구, 섬유모세포, 신경세포 등 비교적 다양한 세포들에서 생성되고 있다. 그 기능 또한 다양하여 T세포, B세포, 단구, 대식세포, NK세포 등에 주요한 역할을 담당하게 되며 특히나 염증반응을 통한 면역반응이 큰 범위를 차지하고 있다. 귀리 표고균사 발효물, 울금 귀리 표고균사 발효물, 비파 귀리 표고균사 발효물, 황칠 귀리 표고균사 발효물, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 반려묘 건강간식, 반려견 건강간식의 IL-1β 억제 효과 분석결과는 도 17과 같다. LPS 처리군의 NO 생성율을 100%로 할 때 500 ㎍/mL의 농도에서 귀리 표고균사 발효물은 87.2%, 울금 귀리 표고균사 발효물은 35.9%, 비파 귀리 표고균사 발효물은 85.5%, 황칠 귀리 표고균사 발효물은 80.8%, 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물은 40.7%, 반려묘 건강간식은 55.5%, 반려견 건강간식은 60.7%의 IL-1β 생성율을 보였다.
Claims (7)
- (1) 비파를 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계;
(2) 황칠을 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말을 혼합한 혼합물에 물을 첨가한 후, 여기에 귀리를 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.))를 접종하여 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계;
(4) 원목표고에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계;
(5) 황기를 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계;
(6) 복령을 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계;
(7) 분쇄한 죽엽에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계;
(8) 백출을 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물을 첨가하여 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; 및
(9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.))는 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)인 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 반려동물은 반려견 또는 반려묘인 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법.
- (1) 비파를 90~110℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 비파에 물을 첨가하여 70~90℃에서 8~12시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 비파 추출 분말을 제조하는 단계;
(2) 황칠을 140~160℃에서 8~12분간 로스팅한 후 분쇄한 황칠에 물을 첨가하여 80~90℃에서 7~9시간 동안 추출하고 농축 및 동결건조하여 황칠 추출 분말을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)단계의 제조한 비파 추출 분말 12~18 g 및 상기 (2)단계의 제조한 황칠 추출 분말 12~18 g을 혼합한 혼합물에 물 1.4~1.6 L를 첨가한 후, 여기에 귀리를 50~70분 동안 침지한 후 꺼내어 멸균시키고, 표고 균사(Lentinula edodes(Berk.)) JMIF-001(KCTC18874P)를 접종하여 22~26℃에서 3~5주 동안 배양한 후 건조 및 분쇄하여 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물을 제조하는 단계;
(4) 원목표고 8~12 kg에 물 80~120 L를 첨가하여 70~80℃에서 7~9시간 동안 추출한 후 농축하여 원목표고 추출액을 제조하는 단계;
(5) 황기 4~6 kg을 140~160℃에서 3~10분간 로스팅한 후 분쇄한 황기에 물 45~55 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 황기 추출액을 제조하는 단계;
(6) 복령 4~6 kg을 110~130℃에서 1~2분간 로스팅한 후 분쇄한 복령에 물 30~40 L를 첨가하여 90~100℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 복령 추출액을 제조하는 단계;
(7) 분쇄한 죽엽 4~6 kg에 물 40~60 L를 첨가하여 70~90℃에서 10~14시간 추출한 후 농축하여 죽엽 추출액을 제조하는 단계;
(8) 백출 4~6 kg을 140~160℃에서 2~4분간 로스팅한 후 분쇄한 백출에 물 35~45 L를 첨가하여 80~100℃에서 8~12시간 추출한 후 농축하여 백출 추출액을 제조하는 단계; 및
(9) 고기에 상기 (3)단계의 제조한 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물, 상기 (4)단계의 제조한 원목표고 추출액, 상기 (5)단계의 제조한 황기 추출액, 상기 (6)단계의 제조한 복령 추출액, 상기 (7)단계의 제조한 죽엽 추출액 및 상기 (8)단계의 제조한 백출 추출액을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법. - 제4항에 있어서, 상기 (9)단계의 혼합은 고기 45~55 g에 황칠비파 귀리 표고균사 발효물 30~40 g, 원목표고 추출액 4~6 g, 황기 추출액 1.5~2.5 g, 복령 추출액 2.5~3.5 g, 죽엽 추출액 2.5~3.5 g 및 백출 추출액 1.5~2.5 g을 혼합하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (9)단계의 혼합은 고기 55~65 g에 황칠 비파 귀리 표고균사 발효물 20~30 g, 원목표고 추출액 2.5~3.5 g, 황기 추출액 1.5~2.5 g, 복령 추출액 2.5~3.5 g, 죽엽 추출액 1.5~2.5 g 및 백출 추출액 4.5~5.5 g을 혼합하는 것을 특징으로 하는 반려동물용 간식의 제조방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 반려동물용 간식.
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