CN104404092A - 一种共轭亚油酸异构体的生物富集方法 - Google Patents

Abstract

一种共轭亚油酸异构体的生物富集方法，包括生物富集培养基的制备、生产用菌种的制备、共轭亚油酸异构体的生物富集等步骤，得到 c 9, t 11-共轭亚油酸异构体。本发明所得产品中 c 9, t 11-CLA异构体的含量大于质量百分比0.45%，底物的转化率大于90%，产品中 c 9, t 11-CLA异构体的含量显著增加，通过生物富集培养，不仅得到富含 c 9, t 11-CLA异构体的抗癌功能产品，脱脂大豆中的蛋白质和纤维素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纤维等具有保健功能的活性因子，产物的保健功能显著增强，进一步拓宽了该产品的应用范围。

Description

一种共轭亚油酸异构体的生物富集方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA) 是一组十八碳共轭二烯酸的统称，共轭双键有4种位置异构（8,10; 9,11; 10,12; 11,13）和4种几何异构（cis,cis; cis,trans; trans,cis; trans,trans），共有多达16种异构体，如：c9,t11-CLA和t10,c12-CLA异构体等。研究发现CLA具有抗癌、预防动脉粥样硬化、增强机体免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越来越多的研究表明其生理活性具有异构体特异性，现在普遍认为c9,t11-CLA异构体具有抗癌和预防动脉粥样硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反刍动物的奶和肉中的脂肪中，主要由c9,t11-CLA和少量t9,t11-CLA，t10,c11-CLA等异构体构成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。

为实现CLA的大量制备，人们已对生物合成CLA进行了较多研究。但文献报道的CLA产量通常均小于1mg/mL，且存在发酵周期长的缺点。发明专利CN201110105610提出了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，底物添加量为25mg/mL，发酵时间长达120h，CLA的产量只有1.02mg/mL。发明专利CN200410060670.9报道了通过干酪乳杆菌CGMCC 1.574来特异性生物合成c9,t11-CLA异构体的方法，虽然产物纯度高，但是在乳酸菌常用培养基MRS和脱脂奶中的产量约为1mg/mL。在生物合成过程中，只有增加底物亚油酸的量，产物c9,t11-CLA异构体的量才能增加，而当底物的含量超过1mg/mL时，乳酸菌在常用培养基MRS和脱脂奶中的生长就会收到抑制，从而限制了c9,t11-CLA异构体的合成产量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种共轭亚油酸异构体的高效生物富集方法，显著提高共轭亚油酸异构体的生物合成量。

本发明包括以下步骤。

（1）生物富集培养基的制备：将低温脱脂大豆浸泡，经磨浆机先粗磨后精磨，再经胶体磨处理得到混合乳浊液，煮沸，调整蛋白质含量为质量百分比5-15%，优选8%，经巴氏灭菌后得到基础培养基。

（2）生产用菌种的制备：将干酪乳杆菌CGMCC 1.574保藏菌种接入用于生物富集的培养基，37℃培养24h，经三级扩大培养后，得到生产用菌种。

（3）共轭亚油酸异构体的生物富集：向生物富集培养基中接入质量百分比5%的步骤（2）的生产用菌种，同时加入基础培养基质量百分比0.3-0.6%的亚油酸底物，优选0.5%，混匀后于28-40℃，优选37℃，发酵培养12-36h，优选24h，得到c9,t11-CLA异构体。

本发明所述的步骤（1）也可以再向基础培养基中加入质量百分比0%<低聚糖≤6%，优选1%的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到用于生物富集的培养基。

在优化条件下，通过该方法富集后，发酵物中c9,t11-CLA异构体的含量为质量百分比0.46%，亚油酸的转化率为92%。

本发明所用的乳酸菌是干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 1.574，该菌能产生特异性的异构酶，通过生物异构化将亚油酸转化成c9,t11-CLA异构体。

本发明针对生物合成CLA时存在产量低和发酵周期长的缺点，通过优化发酵培养基和条件，有效克服了高浓度亚油酸底物对乳酸菌生长和合成c9,t11-CLA异构体的影响，大大提高了发酵产品中c9,t11-CLA异构体的富集水平。本发明以脱脂大豆为基础培养基原料，将脱脂大豆用水浸泡后，经粗磨、精磨和胶体磨处理后得到的混合乳浊液，再通过添加低聚糖得到乳酸菌生物富集CLA的培养基。该培养基中高浓度蛋白质、纤维素能有效降低亚油酸对乳酸菌生长的抑制作用，亚油酸的添加量可以达到培养基的质量百分比0.6%。

本发明与现有技术相比具有如下优点。

在本发明优选条件下，产品中c9,t11-CLA异构体的含量大于质量百分比0.45%，底物的转化率大于90%。与该菌株在MRS和脱脂奶培养基中c9,t11-CLA异构体的富集水平低于质量百分比0.1%相比，产品中c9,t11-CLA异构体的含量显著增加，可以满足保健品和医药产品的进一步开发应用。

本发明通过生物富集培养，不仅得到富含c9,t11-CLA异构体的抗癌功能产品，脱脂大豆中的蛋白质和纤维素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纤维等具有保健功能的活性因子。所得产物的保健功能显著增强，进一步拓宽了该产品的应用范围。

附图说明

图1为本发明所制备c9,t11-CLA异构体的毛细管电泳图。

图2为亚油酸浓度与c9,t11-CLA异构体合成的关系。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步地说明。

实施例1。

将1份低温脱脂大豆用4份水浸泡过夜后，经磨浆机先粗磨后精磨1次，再经胶体磨处理2次后得到的混合乳浊液，煮沸后调整其中的蛋白质含量为质量百分比8%，得到基础培养基。向基础培养基中加入质量百分比1%的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到生物富集的培养基。向生物富集培养基中接入质量百分比5%的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574生产用菌种，同时加入质量百分比0.5%的亚油酸底物，混匀后于37℃培养24h。通过该方法富集后，所得到的CLA异构体为c9,t11-CLA异构体（图1），发酵物中c9,t11-CLA异构体的含量为质量百分比0.46%，亚油酸的转化率为92%。底物亚油酸的浓度对产物CLA的合成有显著影响，在优化条件下，亚油酸的添加量是基础培养基的质量百分比0.5%（图2）。通过该方法，大大提高了产品中c9,t11-CLA异构体的含量，能满足抗癌、防治心脑血管疾病产品开发的需要。此外，在生物发酵过程中，脱脂大豆中的蛋白质和膳食纤维被水解成多肽和可溶性膳食纤维，多肽含量大于质量百分比1%，可溶性膳食纤维含量大于质量百分比5%，这些保健功能因子进一步增加产品的保健功能和应用前景。 

实施例2。

将1份低温脱脂大豆用4份水浸泡6h后，经磨浆机先粗磨后精磨1次，再经胶体磨处理2次后得到的混合乳浊液，煮沸后调整其中的蛋白质含量为质量百分比5%，加入质量百分比3%的脱脂奶粉，得到基础培养基。向基础培养基中加入质量百分比1%的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到生物富集的培养基。向生物富集培养基中接入质量百分比5%的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574生产用菌种，同时加入质量百分比0.5%的亚油酸底物，混匀后于37℃培养24h，产物中c9,t11-CLA异构体的含量为质量百分比0.48%。将发酵产物低温喷雾干燥或冷冻干燥后，经压片、涂膜加工成片剂，可以有效防止c9,t11-CLA异构体在存放过程中发生氧化反应，得到富含c9,t11-CLA异构体、多肽和可溶性膳食纤维的保健功能产品，产品保质期长达12个月。

Claims (6)

1.一种共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是包括以下步骤：

（1）生物富集培养基的制备：将低温脱脂大豆浸泡，经磨浆机先粗磨后精磨，再经胶体磨处理得到混合乳浊液，煮沸，调整蛋白质含量为质量百分比5-15%，得到基础培养基，经巴氏灭菌后得到用于生物富集的培养基；

（2）生产用菌种的制备：将干酪乳杆菌CGMCC 1.574保藏菌种接入用于生物富集的培养基，37℃培养24h，经三级扩大培养后，得到生产用菌种；

（3）共轭亚油酸异构体的生物富集：向生物富集培养基中接入质量百分比5%的步骤（2）的生产用菌种，同时加入基础培养基质量百分比0.3-0.6%的亚油酸底物，混匀后于28-40℃，发酵培养12-36h，得到c9,t11-共轭亚油酸异构体。

2.根据权利要求1所述的共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中调整蛋白质含量为质量百分比8%。

3.根据权利要求1所述的共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中向基础培养基中加入质量百分比0%<低聚糖≤6%。

4.根据权利要求3所述的共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是向基础培养基中加入质量百分比1%的低聚果糖。

5.根据权利要求1所述的共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中向基础培养基中加入质量百分比1% 的低聚果糖。

6.根据权利要求1所述的共轭亚油酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（3）中加入基础培养基质量百分比0.5%的亚油酸底物，混匀后于37℃，发酵培养24h。