CN105039438A - 共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法 - Google Patents
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Abstract
共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，包括：(1)每克干酪乳杆菌CGMCC？1.574中加4mL？50mM、pH6.8磷酸盐缓冲液、5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃处理20min；超声功率200W、每超声处理5s停歇30s、超声处理2次，离心得透性化菌体；(2)用50mM、pH5.8磷酸盐缓冲液洗，收集菌体，将每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积0.5-2.0%吐温-80，混匀，4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，冷冻干燥得包衣菌体；(3)将每克包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积0.1-0.3%γ-亚麻酸，4-40℃反应1-12h；(4)离心分离包衣菌体，回收正己烷，产物为<i>c</i>6,<i>c</i>9,<i>t</i>11-共轭γ-亚麻酸异构体。本发明反应时间短，包衣菌体可重复使用多次，产量显著提高，无环境污染，生产成本显著降低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
共轭γ-亚麻酸是γ-亚麻酸的共轭异构体，是一组十八碳共轭三烯酸的统称，有多种位置异构和几何异构体，如：c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸和c6,t10,c12-共轭γ-亚麻酸异构体等。研究表明共轭γ-亚麻酸具有抗癌、预防动脉粥样硬化、减肥等生理功能，且其生理活性具有异构体特异性，如：c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体具有抗癌的作用。在自然界中，共轭γ-亚麻酸主要存在于反刍动物的奶和肉的脂肪中，主要由c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸等异构体构成，但其含量通常十分低，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。
目前还没有共轭γ-亚麻酸制备方法的报道，人们只是对微生物发酵合成共轭α-亚麻酸进行了一些研究。目前，微生物发酵均在水溶液中进行，由于发酵底物—γ-亚麻酸是脂溶性物质，因此γ-亚麻酸加入发酵液前需经乳化处理，且添加量受到限制，而要从发酵液中获得共轭γ-亚麻酸产物需经有机溶剂萃取，整个生产工艺存在发酵周期长、生产成本高、产量低的缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，显著缩短合成时间、提高产量和转化率、降低生产成本。
本发明包括以下步骤。
（1）菌体的透性化处理：收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574菌体，经溶菌酶处理（所述溶菌酶处理为每克湿菌体中加入4mL50mM、pH6.8磷酸盐缓冲液，5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃处理20min），再经超声波处理，超声功率200W，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，离心得到透性化菌体。
（2）菌体包衣处理：透性化菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-80，混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。
（3）非水酶催化合成：按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的γ-亚麻酸，在4-40℃下反应1-12h。
（4）产物收集：离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体。
本发明所述的步骤（2）中吐温-80的加入量优选为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
本发明所述的步骤（2）中处理温度优选为4-25℃。
本发明所述的步骤（2）中处理时间优选为3-5h。
本发明所述的步骤（3）中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的γ-亚麻酸，在15-30℃下反应2-6h。
本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于非水酶催化合成c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体。
本发明所用的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574，系中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏菌株，编号为1.574，该菌株能产生特异性的亚油酸异构酶，能将多不饱和脂肪酸中的c9,c12双键异构成c9,t11共轭双键，通过生物异构化可将γ-亚麻酸（c6,c9,c12-18:3）转化成在268nm处有特征吸收峰的新物质，而268nm处吸收峰是共轭三烯的特征峰，表明该菌能将γ-亚麻酸转化成c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体。目前，还没有从该菌中分离到有确切催化活性的异构酶纯品。因此，该异构化反应可能是由多酶体系共同催化完成。
在优化条件下，通过该非水酶学合成方法，含体积百分比0.15%γ-亚麻酸的正己烷溶液反应后所合成c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体的含量为体积百分比0.1395%，γ-亚麻酸的转化率为93.0%。本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于步骤（3）的非水酶催化合成c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体，包衣菌体重复使用五次后，其催化活性仍大于90%。
针对现有微生物发酵合成共轭γ-亚麻酸均在水溶液中进行，整个生产工艺存在发酵周期长，从发酵液中提取共轭γ-亚麻酸产物困难，菌体不能重复使用，生产成本高，产量低等诸多缺点。本发明提出了通过微生物菌体在有机溶剂中将γ-亚麻酸催化合成共轭γ-亚麻酸的新方法。该方法首先通过溶菌酶和超声波处理干酪乳杆菌CGMCC1.574，在保持菌体完整性的同时，提高菌体细胞壁和细胞膜的通透性，一方面可以确保在后续包衣处理时细胞内的亚油酸异构酶表面能形成完整包衣层，另一方面可以提高反应底物γ-亚麻酸和产物共轭γ-亚麻酸进出菌体的速率，减少高浓度底物和产物对催化反应的抑制作用，大大缩短反应时间。
本发明选用吐温-80对菌体进行包衣，吐温-80分子中含有一个油酸基团，油酸是菌体中亚油酸异构酶底物的结构类似物，在菌体包衣时，能在酶的催化活性中心形成分子印迹，使菌体在冷冻干燥后酶的催化活性中心构象不变，能在有机溶剂中保持较高的催化活性。同时，本发明结合在菌体包衣处理过程中选用合适的磷酸盐缓冲液、吐温-80浓度和包衣温度、时间，使所得包衣菌体在有机溶剂中仍具有较高的催化能力。包衣后菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中批次发酵所需的数天时间。
本发明所得包衣菌体在正己烷中有较高催化活性，只需离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，即可得到产物c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸。离心所得包衣菌体可多次重复用于非水酶催化合成c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体，显著缩短了生产时间，提高了产量，降低了生产成本。此外，正己烷是食用油脂工业常用的有机溶剂，这也保证了本发明所得c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的使用安全性。
本发明与现有技术相比具有如下优点。
本发明直接对菌体进行包衣处理，作为固定化酶用于催化反应，一方面减少了酶分离纯化的成本，避免了酶在提取时活性的损失；另一方面可以将多酶体系包在一起，使整个反应过程得以顺利进行；再者包衣菌体颗粒大于包衣酶，易于从反应溶液中分离出来，且过滤阻力较小，因此，包衣菌体更加适合用于连续反应的柱式反应器。
本发明通过包衣菌体在有机溶剂中进行催化反应，避免了在传统水溶液反应体系中底物γ-亚麻酸溶解度低和产物共轭γ-亚麻酸提取困难的问题。包衣菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中发酵所需的数天时间。包衣菌体可重复使用多次，显著提高产品产量，且无环境污染，可显著降低生产成本；而传统水溶液体系发酵液中的菌体只能使用一次，生产成本高，且发酵废液处理费用高，易污染环境。
具体实施方式
本发明通过以下实施例作进一步地说明。
实施例1。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，向10克湿菌体中加入40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8），5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃水浴振荡处理20min，取出后冰浴，经功率200W超声波处理，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，5000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入0.9mLγ-亚麻酸，在25℃下搅拌反应4h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为93.0%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为90.7%。
实施例2。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，向10克湿菌体中加入40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8），5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃水浴振荡处理20min，取出后冰浴，经功率200W超声波处理，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，5000g离心5min得到透性化菌体。
透性化菌体用30mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入4mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理2h，5000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入1.8mLγ-亚麻酸，在40℃下搅拌反应12h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到1.8mL产物，其中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为80.9%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为71.3%。
实施例3。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，向10克湿菌体中加入40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8），5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃水浴振荡处理20min，取出后冰浴，经功率200W超声波处理，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，5000g离心5min得到透性化菌体。
透性化菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入1mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理6h，5000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入0.6mLγ-亚麻酸，在4℃下搅拌反应6h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.6mL产物，其中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为90.7%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为86.1%。
实施例4。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，向10克湿菌体中加入40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8），5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃水浴振荡处理20min，取出后冰浴，经功率200W超声波处理，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，5000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体装入柱式生物反应器中，将0.9mLγ-亚麻酸加入到300mL正己烷中混匀，通过泵将含γ-亚麻酸的正己烷溶液注入反应器，流量为3mL/min，收集流出液，将流出液重复注入反应器2次，收集流出液，在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸的含量为90.4%。通过将数个柱式生物反应器串联在一起，可以实现连续生产。
Claims (5)
1.共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，其特征是包括以下步骤：
（1）收集处于对数生长期的干酪乳杆菌CGMCC1.574菌体，每克湿菌体中加入4mL50mM、pH6.8磷酸盐缓冲液、5mg/mL溶菌酶和2mM乙二胺四乙酸钠，37℃处理20min，再经超声波处理，超声功率200W，每超声处理5s停歇30s，超声处理2次，离心得到透性化菌体；
（2）透性化菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-80，混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体；
（3）按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的γ-亚麻酸，在4-40℃下反应1-12h；
（4）离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c6,c9,t11-共轭γ-亚麻酸异构体。
2.根据权利要求1所述的共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，其特征是所述的步骤（2）中吐温-80的加入量为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
3.根据权利要求1所述的共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，其特征是所述的步骤（2）中处理温度为4-25℃。
4.根据权利要求1所述的共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，其特征是所述的步骤（2）中处理时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的共轭γ-亚麻酸异构体的非水酶学合成方法，其特征是所述的步骤（3）中加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的γ-亚麻酸，在15-30℃下反应2-6h。
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