KR101829987B1 - 해조류 대황 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 인체 파필로마바이러스(ｈｐｖ) 감염 치료, 개선 또는 예방용 조성물 - Google Patents
해조류 대황 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 인체 파필로마바이러스(ｈｐｖ) 감염 치료, 개선 또는 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 항바이러스 조성물이다. 또한, 독성이 없으므로 식품의 형태로도 섭취할 수 있다.
Description
본 발명은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유함으로써 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료, 개선 또는 예방할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
인체 파필로마바이러스(HPV)는 동물의 여러 조직의 상피세포에 감염되어 흔히 사마귀로 불리우는 양성종양을 유발하는 것으로 알려져 왔고, 특히 인체 파필로마바이러스(HPV) 16형과 18형은 남녀 생식기, 구강, 피부 등에서의 악성 종양과 관련되며 여성 자궁암의 90% 이상을 차지하는 자궁경부암을 일으키는 주요인자로 밝혀졌다.
구체적으로, 인체 파필로마바이러스(HPV)는 대략 8,000개의 염기서열을 가진 양성 악성 종양을 일으키는 작은 DNA 바이러스로서, 현재까지 게놈의 차이에 따라 100여개 이상의 인체 파필로마바이러스(HPV) 아류형이 확인되었으며, 대략 90개 정도의 HPV는 유전자형이 완전하게 분석되었다. 이러한 타입 중에서 고위험성 인체 파필로마바이러스(HPV) 타입(예를 들면, HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56)은 자궁경부암의 거의 90%와 관계되어 있다.
상기 인체 파필로마바이러스(HPV)에 감염된 자궁경부암의 50% 이상은 HPV-16 타입과 관련이 있으며, 다음으로 HPV-18(12%), HPV-45(8%), HPV-31(5%) 타입과 관련이 있다. 상기 자궁경부암은 산부인과 조기검진을 통해 예방할 수 있는 암이지만, 아직도 전 세계 여성 암 중 유방암에 이어 사망률 2위를 차지하고 있다.
현재, 인체 파필로마바이러스(HPV)에 대한 치료약은 없으며, 주로 백신이 예방용으로 사용되고 있으나 그 부작용 또한 많이 보고되고 있다. 현재까지 개발된 HPV 예방백신은 전 세계적으로 두 가지로서, HPV 16과 18형을 포함하는 2가 백신 서바릭스(Cervarix, GSK사)와 HPV 16과 18형 및 HPV 6과 11형을 포함하는 4가 백신 가다실(GardasilTM, Merck사)이 존재한다.
또한, 인체 파필로마바이러스(HPV)는 in vitro 상에서 배양이 불가능하여 상기 HPV에 대한 항바이러스제의 개발에 어려움을 격고 있다.
따라서, 부작용이 없으며 in vitro 상에서 배양이 가능한 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물이 요구되고 있다.
In vitro antiviral activity of dieckol and phlorofucofuroeckol-A isolated from edible brown alga Eisenia bicyclis against murine norovirus, Algae 2015, 30(3): 241-246
Anticancer and Cancer Preventive Properties of Marine Polysaccharides: Some Results and Prospects, Mar. Drugs 2013, 11, 4876-4901
본 발명의 목적은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 함유하여 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유하여 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하여 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis)을 20 내지 26 ℃의 추출용매에 침지시킨 후 50 내지 80 ℃의 추출용매에 침지시켜 수득된 추출물일 수 있다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 혼합용매는 20 내지 98 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 분획한 것일 수 있다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 조성물은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.
상기 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 약학 조성물의 제형은 액제, 피부 외용제 또는 경구제일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 개선 또는 예방용 식품 조성물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 항바이러스제로 이용되거나 상기 파필로마바이러스(HPV) 감염으로 인한 자궁경부암 및 후두암의 예방을 위한 약학 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 5에 따라 제조된 대황 추출물 및 분획물의 In vitro에서 파필로마바이러스(HPV)의 저해능을 측정한 그래프이다.
본 발명은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유함으로써 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일예로, 본 발명의 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 함유한다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis)은 미역과 다년생으로 울릉도 및 독도의 수심 10 m 이내의 조간대 하부 암반지역에 서식하며, 식용이 가능하고 알긴산의 원료로 이용된다. 또한, 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis)은 요오드, 칼륨 등의 무기질을 다량 함유한다.
상기 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 상기 대황(Eisenia bicyclis)과 추출용매를 1 : 2 내지 20 중량비로 혼합한 후 10분 내지 72시간, 바람직하게는 10분 내지 36시간 동안 추출한 추출물이다. 바람직하게, 대황 추출물은 실온에서의 냉침추출, 온침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 더욱 바람직하게는 냉침추출법과 온침추출법을 함께 수행하는 것이다.
예를 들어, 본 발명의 대황 추출물은 20 내지 26 ℃의 추출용매 침지시켜 10분 내지 5시간 동안 냉침시킨 후 50 내지 80 ℃의 추출용매에 침지시켜 10분 내지 5시간 동안 온침시킨 다음 농축하여 수득할 수 있다. 이때 상기 냉침에 사용된 추출용매와 온침에 사용된 추출용매는 동일한 추출용매인 것이 바람직하다.
상기 대황 추출물을 추출하는 추출용매로는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방에 바람직하게 작용할 수 있는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다. 상기 혼합용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 바람직하게는 20 내지 98 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액, 더욱 바람직하게는 60 내지 95 부피%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물을 들 수 있다.
다른 예로, 본 발명의 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유한다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물은 상기 농축된 대황 추출물에 5 내지 30배(w/w), 바람직하게는 8 내지 20배(w/w)의 물과 혼합한 후 극성용매, 비극성용매를 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 극성용매 분획물 및 비극성용매 분획물을 각각 수득한다. 상기 극성용매로는 n-부탄올 및 물 등을 들 수 있으며, 상기 비극성용매로는 디클로로메탄, 에틸아세테이트 등을 들 수 있다.
상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 해조류 대황(Eisenia bicyclis)을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물' 또는 '분획물'은 추출용매를 처리하여 얻은 추출물 또는 분획물뿐만 아니라 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물은 광의로는 해조류 대황(Eisenia bicyclis)을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 가공물, 예컨대, 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물로 실험을 진행하긴 하였으나, 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피부 외용제, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태(경구제)로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 질내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/kg이다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 의약 또는 식품의 제조를 위한 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방을 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 투여하는 것을 포함하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 해조류 대황의 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 해조류 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 질내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 대황 에탄올 추출물
울릉군 독도에서 채취한 후 동결 건조한 대황 272 g을 세절하고 95% 에탄올(주정) 1.8 L로 실온(24 ℃)에서 1일간씩 2회 반복하여 냉침으로 추출한 후 상기 에탄올을 물중탕시켜 60 ℃에서 5시간 동안 1회 온침으로 추출한 다음 감압 농축하여 대황 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 2 내지 5: 대황 분획물
상기 실시예 1에서 수득된 대황 에탄올 추출물 15.93 g을 증류수 160 mL에 현탁하고 동량의 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올로 각각 3회에 상법에 따라 차례로 분획하여 디클로로메탄 분획(1.91 g, 실시예 2), 에틸아세테이트 분획(4.09 g, 실시예 3), n-부탄올 분획(2.14 g, 실시예 4) 및 물 분획(7.47 g, 실시예 5)을 수득하였다.
<시험예>
1. 실험준비
1-1. 세포 준비
HPV pseudovirus 생산과 in vitro assay를 위해 사용한 293TT(human embryonic kidney cell를 아데노바이러스 E1a가 변형(transform)되게 조작하여 만들어진 293T 세포에 SV40 large T antigen을 발현 시킨 세포 주, Schiller Lab으로부터 제공받음.), 세포는 Dulbeccos modified Eagles medium(DMEM, SH30243, Hyclone, UT, USA)에 heat inactivated 10% FBS(26140079, Hyclone, UT, USA)를 첨가한 배지를 이용해 배양되었으며 5%의 CO2가 공급되는 37 ℃ 조건에서 유지되었다.
1-2. HPV-16 슈도바이러스(pseudovirus)의 생산
1-2-1. 플라스미드 (Plasmid)
In vitro antiviral assay를 위하여 HPV-SEAP 슈도바이러스를 생산하였으며, In vivo challenge test를 위하여 HPV-Luc PV를 생산하였다. HPV-SEAP PV 생산을 위하여 p-SEAP 와 p16L1L2 plasmid, HPV-Luc PV를 생산을 위하여 pc-Luc와 p16L1L2 plasmid 를 사용하였다. 각각의 plasmid는 Schiller Lab(Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda, USA)으로부터 제공 받았다.
1-2-2. 감염 (Transfection)
293TT cell을 5 X 106 개로 75T flask에 seeding 하여 37 ℃, 5% CO2에서 16시간 배양(incubation)한 후, 19 ug의 p16L1/L2와 19 ug의 pSEAP 또는 pc-Luc plasmid를 Lipofectin Reagent(18292-011, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 co-transfection하였다. Transfection 6시간 후 complete media로 교환하고 37 ℃, 48시간 동안 배양 후, 세포를 트립신화(trypsinization)하여 수확하였다. 수확한 세포는 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS, 14190-250, Invitrogen, CA, USA)로 세척(washing)하였다.
1-2-3. 세포수확 및 비리온(virion) 성숙(maturation)
DPBS 1 ml로 재현탁 후, 5% Triton X-100(9002-93-1, Sigma, MO, USA), 25 mM의 암모늄설페이트(pH 9)(A4418, Sigma-Aldrich, MO, USA) 0.2%의 벤조나제 (9025-65-4, Benzonas, Sigma, UK)를 첨가하여 넣고, 24시간 동안 37 ℃에서 배양하여 바이러스를 성숙(maturation) 시켰다.
1-2-4. 염추출 (Salt extraction)
성숙된 비리온(maturated virion)을 5분간 얼음에서 냉각시킨 후, 5N NaCl을 0.17 volume으로 넣고 다시 20분간 얼음에서 배양하였다. 이후 비리온(virion) 용액을 모두 모아 e-튜브(tube)로 옮기고 4 ℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액 만을 모아 opti-prep ultracentrifugation하고, -80 ℃에 보관하였다.
1-2-5. 정제
SIGMA density gradient medium 77 ml에 23 ml DPBS/0.8 M NaCl을 혼합하여 46%의 optiprep gradient용액을 만들고, 이를 이용하여 37%, 33%, 39%의 gradient용액을 DPBS/0.8 M NaCl 용액으로 만들었다(27% : 9.3 ml DPBS/0.8 M NaCl+13.2 ml 46% Optiprep, 33% : 6.4 ml DPBS/0.8 M NaCl+16.1 ml 46%, 39% : 3.4 ml DPBS/0.8 M NaCl+19 ml 46%). 5 ml의 Beckman ultracentrifuge tube(361625, Beckman Coulter, USA)에 각 1ml 씩의 39%, 33%, 27% gradient 용액을 조심스레 넣어 층이 깨어지지 않게 하고, 그 위에 virion 상층액 1 ml을 로딩(loading)한다. Ultracentrifuge(Optima L 90K, Beckman Coulter Ultracentrifuge, USA)를 이용하여, 47,800 rpm, 16 ℃에서 4시간 동안 원심분리하였다. 비리온 분획(virion fraction)을 모아서 -80 ℃에 보관하였다.
1-2-6. HPV PVs의 titration
293TT cell을 5 X 103 씩 96-well plate에 seeding하여 37 ℃, 5% CO2에서 16시간 배양하였다. HPV PVs를 5-fold serial dilution 후, 각 well의 세포에 감염(infection)시켜 72시간 동안 배양하였다. HPV-SEAP PV의 titer 측정은 세포 배양 상층액을 취하여 Great EscAPE SEAP Chemiluminescence Kit(631738, Clontech, CA, USA)를 이용하여 secreted alkaline phosphatase (SEAP)의 활성을 확인함으로써 이루어졌다. 또한 HPV-Luc PV의 titer 측정은 세포 배양 상층액을 취하여, BioLuxGaussia Luciferase Assay Kit(0301008, New England biolabs, MA, USA)를 이용하여 luciferase activity를 확인하였다. Chemiluminescent detection은 Luminescence coulter(Micro beta triLux 1450, PerkinElmer, CT, USA)를 이용하여 relative light units(RLU) 값을 얻어, 각각의 HPV PVs titer를 산출하였다.
1-3.
In vitro
항바이러스 효능 분석
시료에 대한 screening assay와 HPV inhibition assay는 Shaneyfelt의 방법(Shaneyfelt et al., 2006)과 Schiller Lab의 방법(Roden et al., 1996, Unckell et al., 1997, Touze et al., 1998, Selinka et al., 2003, and Klasse et al., 2002)을 응용하였다. In vitro antiviral assay 시작 전, 293TT cell을 5 X 103씩 96-well plate에 seeding하여 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였다. 16시간 후, 배양액을 제거하고 추출물 및 각 분획물을 100 ug/ml 또는 50 ug/ml의 농도로 희석하여 100 ul씩 cell에 분주하였다. 추출물 및 각 분획물을 16시간 처리 한 후, 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척하였다. 106 RLU/ml의 HPV PVs를 100 ul씩 세포에 감염시켜, 48시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였다. Antiviral activity 측정은 세포 배양 상층액을 취하여 Great EscAPE SEAP Chemiluminescence Kit(Clontech, CA, USA)를 이용하여 secreted alkaline phosphatase (SEAP)의 활성을 확인하였다. SEAP activity는 Luminescence coulter(Micro beta triLux 1450, PerkinElmer, CT, USA)를 이용하여 relative light units(RLU) 값을 얻었으며, 추출물 및 각 분획물을 처리하지 않은 cell과 처리한 cell에서의 RLU 값을 비교하여, SEAP activity의 감소를 HPV PVs에 대한 inhibition 효과로 간주하였다.
시험예
1.
In vitro
에서 파필로마바이러스(
HPV
)
저해능
측정
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 5에 따라 제조된 대황 추출물 및 분획물의 In vitro에서 파필로마바이러스(HPV)의 저해능을 측정한 그래프이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 대황 에탄올 추출물 및 실시예 2 내지 5에 따라 제조된 대황 분획물 모두 HPV16 PVs에 대하여 저해능이 우수한 것을 확인하였다.
특히, 실시예 1의 대황 에탄올 추출물은 100 ㎍/ml의 시료 농도에서 90% 이상의 바이러스 저해 효과를 보였으며, IC50 값도 12.5 ㎍/ml 이하로 강한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 분획물 중에서는 실시예 2의 대황 디클로로메탄 분획물이 가장 강력한 항바이러스 활성을 보였으며, 구체적으로 100 ㎍/ml 이상의 시료 농도에서 100%에 가까운 바이러스 저해 효과를 보이는 것을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1.
산제의
제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예
2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예
3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예
4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예
5.
액제의
제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예
6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ug
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ug
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ug
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ug
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예
7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
Claims (9)
- 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis)을 20 내지 26 ℃의 추출용매에 침지시킨 후 50 내지 80 ℃의 추출용매에 침지시켜 수득된 추출물인 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 98 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 분획물은 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 분획한 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물은 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 약학 조성물은 액제, 피부 외용제 또는 경구제인 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 치료 또는 예방용 조성물.
- 해조류 대황(Eisenia bicyclis) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인체 파필로마바이러스(HPV) 감염 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR102189415B1 (ko) | 2019-02-11 | 2020-12-11 | 코스맥스바이오 주식회사 | 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001122796A (ja) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Saga Prefecture | 抗ウイルス物質、その抽出方法、その配合飼料及びウィルス感染症の予防・治療方法 |
-
2016
- 2016-07-15 KR KR1020160089992A patent/KR101829987B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001122796A (ja) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Saga Prefecture | 抗ウイルス物質、その抽出方法、その配合飼料及びウィルス感染症の予防・治療方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 문선영, "In vitro antiviral substances isolated from Eisenia bicyclis against murine norovirus as a norovirus surrogate", 2014, 부경대학교 석사학위논문 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180008119A (ko) | 2018-01-24 |
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