WO2023121331A1 - 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of respiratory diseases, comprising an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- Asthma chronic obstructive pulmonary disease, allergic rhinitis, cough, cough, acute and chronic bronchitis, bronchiolitis, sore throat, tonsillitis, laryngitis, etc. are typical respiratory diseases.
- Asthma refers to chronic inflammation of the airways, particularly the bronchi. Inflammation caused by asthma can be aggravated by a wide variety of factors such as smoke, allergens, cold wind, exercise, and respiratory infections, and continuous inflammation causes airway deformation and airway hyper-responsiveness. Due to these causes, common symptoms such as wheezing (a symptom in which the airway is narrowed and wheezing or purring breath sounds appear), shortness of breath, coughing, and excessive sputum discharge appear.
- wheezing a symptom in which the airway is narrowed and wheezing or purring breath sounds appear
- shortness of breath, coughing, and excessive sputum discharge appear.
- the respiratory tract is largely composed of a mucous membrane and a muscle called bronchial smooth muscle, and there are many secretory glands in the mucous membrane to continuously secrete necessary secretions.
- the bronchial smooth muscle contracts, the respiratory airway narrows.
- an inflammatory reaction occurs due to a wide variety of factors such as smoke, allergens, cold wind, exercise, and respiratory infections, the secretion from the glands further increases, and this secretion blocks the airway, causing the mucous membrane to swell into the airway, further narrowing the airway. .
- paroxysmal coughing accompanied by wheezing and difficulty in breathing appear severely, and during seizures, dry cough occurs and chest pressure is felt.
- asthmatic patients who have only symptoms of chronic cough and chest tightness without wheezing and unexplained dyspnea, but these symptoms tend to appear suddenly and paroxysmal during daily life.
- magpie swimming is a dicotyledonous plant distributed in the rocky areas of the southern regions including Jeju Island and Ulleungdo. Young leaves are edible and fruits are used for ornamental purposes. In oriental medicine, it is used as a cardiotonic and diuretic, and is known to be effective for hypertension, diabetes, constipation, edema and bruises.
- Korean Patent No. 1168567 related to the extract of Magpie Sutra discloses the antifungal activity of saponin-based substances contained in Suyeong, but so far, There is no mention of a composition for preventing, improving or treating respiratory diseases.
- the present invention has been derived from the above needs, and the present invention provides a composition for preventing, improving or treating respiratory diseases containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient, and the extract is a bronchus of respiratory cells. It reduces the production of the chemokine RANTES, a mediator of inflammation, from epithelial cells, and has the effect of reducing the expression of inflammatory cytokines (IL-6, TNF- ⁇ and MUC5AC), as well as the total number of BAL cells and Reduces the number of neutrophils in BAL, reduces the content of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, and CXCL-1 in BALF, and reduces the expression level of TNF- ⁇ , MIP2, CXCL-1, and MUC5AC genes There is an effect, by confirming that there is an effect of inhibiting lung tissue damage, the present invention was completed.
- IL-6, TNF- ⁇ and MUC5AC inflammatory cytokines
- the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving respiratory diseases, containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of respiratory diseases containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the present invention provides a veterinary composition for the prevention or treatment of respiratory diseases containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the present invention provides a feed additive for the prevention or improvement of respiratory diseases, containing the magpie swimming extract as an active ingredient.
- the present invention relates to a composition for preventing, ameliorating or treating respiratory diseases, containing an extract of Porphyra japonica as an active ingredient. It has the effect of reducing the expression level of inflammatory cytokines (IL-6, TNF- ⁇ and MUC5AC), as well as reducing the total number of BAL cells and neutrophils in BAL in animal models, and IL-1 ⁇ in BALF. , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, CXCL-1 content is reduced, TNF- ⁇ , MIP2, CXCL-1, MUC5AC gene expression levels are reduced, and lung tissue damage is inhibited.
- IL-6 inflammatory cytokines
- TNF- ⁇ and MUC5AC inflammatory cytokines
- Dexa is a positive control group treated with 0.5 ⁇ M of dexamethasone.
- ### indicates a statistically significant increase in the RANTES production rate in the 10 ng/ml TNF ⁇ treated group (TNF ⁇ ) compared to the control group (Control), p ⁇ 0.001, and *** is 10 ng/ml TNF- ⁇ treatment Compared to the group, the RANTES production rate in the Pikeswimming extract treatment group and the positive control group (Dexa) decreased statistically significantly, p ⁇ 0.001.
- Figure 2 is the result of confirming the change in the expression level of the inflammatory cytokine IL-6 after inducing inflammation with LPS in bronchial epithelial cells.
- ### indicates a statistically significant increase in the IL-6 expression level of the LPS-treated group (LPS20) compared to the Control (normal control group), p ⁇ 0.001, *, *** are 25 and 25 of the present invention compared to the LPS group
- the IL-6 expression level of the 50 ⁇ g/ml Pikachu extract treatment group (LM25, LM50) was statistically significantly decreased. * indicates p ⁇ 0.05 and *** indicates p ⁇ 0.001.
- Figure 3 is the result of confirming the change in the expression level of the inflammatory cytokine TNF- ⁇ after inducing inflammation with LPS in bronchial epithelial cells.
- ### indicates a statistically significant increase in the TNF ⁇ expression level in the LPS-treated group (LPS20) compared to the Control (normal control group), p ⁇ 0.001, and *** is 50 ⁇ g/ml of the present invention compared to the LPS group It means that the TNF- ⁇ expression level of the Magpieswimming extract treatment group (LM50) decreased statistically significantly, p ⁇ 0.001.
- Figure 4 is the result of confirming the change in the expression level of the inflammatory cytokine MUC5AC after inducing inflammation with LPS in bronchial epithelial cells.
- ### indicates a statistically significant increase in the MUC5AC expression level in the LPS-treated group (LPS20) compared to the Control (normal control group), p ⁇ 0.001, and *** is 50 ⁇ g/ml of the present invention compared to the LPS group It means that the MUC5AC expression level of the Magpieswimming extract treatment group decreased statistically significantly, p ⁇ 0.001.
- Figure 5 is a schematic diagram showing an experimental schedule for confirming the effect of the magpie swimming extract of the present invention using a respiratory injury animal model.
- BAL bronchoalveolar lavage
- Figure 8 shows CD4 + and CD4 + and Result of confirming the number of CD8 + (A), Gr - 1 + SiglecF - neutrophil cell number (B) and Gr - 1 + CD11b + granulocyte (C), Gr - 1 + SiglecF - neutrophil cell number (D) in the lung am.
- ##, ### indicates a statistically significant increase in the number of immune cells in the BAL or lungs of the respiratory injury control group induced by fine dust compared to the normal group, ## is p ⁇ 0.01, and ### is p ⁇ is 0.001.
- *, **, *** means that the number of immune cells was statistically significantly decreased in the group administered with the Magpiefish swimming extract of the present invention or in the positive control group compared to the control group, * is p ⁇ 0.05, ** is p ⁇ 0.01, *** indicates p ⁇ 0.001.
- FIG. 9 shows the results of confirming the contents of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, and CXCL-1 in BALF after administration of the Magpiefish extract of the present invention to an animal model with respiratory injury.
- ##, ### indicates that the content of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, and CXCL-1 in the BALF of the control group with fine dust-induced respiratory damage increased statistically significantly compared to the normal group.
- ## is p ⁇ 0.01, ### is p ⁇ 0.001.
- *, **, *** indicates a statistically significant decrease in the content of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, and CXCL-1 in BALF in the group administered with the Porcupine Magpie extract of the present invention or the positive control group compared to the control group. That is, * is p ⁇ 0.05, ** is p ⁇ 0.01, *** is p ⁇ 0.001.
- FIG. 10 is a result of confirming the expression levels of TNF- ⁇ , MIP2, CXCL-1, and MUC5AC mRNA in lung tissues after administering the Magpieswimming extract of the present invention to an animal model with respiratory injury.
- ##, ### indicate a statistically significant increase in the expression levels of TNF- ⁇ , MIP2, CXCL-1, and MUC5AC genes in the lung tissues of the control group with respiratory damage induced by fine dust compared to the normal group.
- ## indicates p ⁇ 0.01, and ### is p ⁇ 0.001.
- FIG. 11 shows the results of H&E staining and M-T staining confirming the suppression of pathological damage to lung tissue after administration of the Magpiefish extract of the present invention to an animal model with respiratory injury.
- the present invention relates to a health functional food composition for preventing or improving respiratory diseases, containing an extract of Magpie magpie as an active ingredient.
- the respiratory disease is preferably selected from the group consisting of asthma, chronic obstructive pulmonary disease, bronchitis, sore throat, tonsillitis and laryngitis, but is not limited thereto.
- the aerial part of the magpie scorpion extract is extracted, but it is not limited thereto, and a specific part can be selected and used as needed.
- the magpie swimming extract can be prepared by a method including the following steps, but is not limited thereto:
- step (3) preparing an extract by drying the filtered extract of step (2).
- the extraction solvent is preferably selected from water, C 1 ⁇ C 4 lower alcohol or mixtures thereof, more preferably water or ethanol, and still more preferably ethanol, but is not limited thereto.
- the extraction method all conventional methods known in the art such as hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction may be used. It is preferable to extract the extraction solvent by adding 1 to 20 times the weight of the magpie swimming.
- the extraction temperature is preferably 20 to 100 ° C, but is not limited thereto.
- the extraction time is preferably 1 to 5 hours, more preferably 1 to 3 hours, but is not limited thereto.
- drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, more preferably freeze drying, but not limited thereto.
- the health functional food composition is preferably prepared in any one formulation selected from powder, granule, pill, tablet, capsule, candy, syrup and beverage, but is not limited thereto.
- the health functional food composition of the present invention may be prepared by adding the Porcupine japonica extract as it is or mixing it with other foods or food ingredients, and may be appropriately prepared according to a conventional method.
- foods to which the magpie swimming extract can be added include caramel, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, and beverages , It may be in the form of any one selected from tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in the conventional sense.
- the health functional food composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, coloring agents and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners , pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. It may also contain fruit flesh for the preparation of natural fruit juices and vegetable beverages. The above components may be used independently or in combination.
- the health functional food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, and the natural carbohydrates may include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, dextrin, and cyclosaccharides. polysaccharides such as dextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
- the ratio of the natural carbohydrates is not very important, but is preferably 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g, with respect to 100 g of the composition of the present invention, but is not limited thereto.
- natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of respiratory diseases, containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the pharmaceutical composition containing the Porcupine japonica extract according to the present invention is preferably in any one formulation selected from capsules, powders, granules, tablets, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, but is not limited thereto.
- a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent may be further included in addition to the Pikadopsis extract, and carriers, excipients, or diluents that may be included in the pharmaceutical composition containing the Pikadopsis extract include lactose, dextrose, Sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
- the Pikachu extract of the present invention When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
- the preferred dose of the Pikachu extract of the present invention varies depending on the condition and body weight of the patient, the severity of the disease, the type of drug, the route and duration of administration, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
- the pharmaceutical composition containing the extract of Porcupine japonica of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg/kg per day, preferably at 0.001 to 10 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
- the present invention relates to a veterinary composition for preventing or treating respiratory diseases, containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the veterinary composition of the present invention may further include appropriate excipients and diluents according to conventional methods.
- Excipients and diluents that may be included in the veterinary composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, cetanol, stearyl alcohol, liquid paraffin, sorbitan monostearate , polysorbate 60, methylparaben, propylparaben and mineral oil.
- the veterinary composition according to the present invention may further include fillers, anti-agglomerating agents, lubricants, wetting agents, spices, emulsifiers, preservatives, and the like. Or it may be formulated using a method well known in the art to provide delayed release, and the dosage form may be a powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, solution, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, It may be in the form of a suppository, a sterile injection solution, or a sterile external preparation. An effective amount of the veterinary composition according to the present invention can be appropriately selected according to the individual animal.
- the present invention relates to a feed additive for preventing or improving respiratory diseases containing an extract of Porcupine japonica as an active ingredient.
- the feed additive of the present invention corresponds to supplementary feed under the Feed Management Act.
- the term 'feed' may mean any natural or artificial diet, one meal, etc., or a component of the one meal meal, for or suitable for the animal to eat, ingest, and digest.
- the type of feed is not particularly limited, and feeds commonly used in the art may be used.
- Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meal or grain by-products; Animal feed such as proteins, inorganic materials, oils, mineral oils, oils, single cell proteins, zooplankton, or food may be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
- the inhibitory activity of the inflammatory chemokine RANTES was evaluated using human bronchial epithelial cell lines.
- BEAS-2B human bronchial epithelial cell, ATCC, USA
- DMEM Dulbecco's modified eagle's medium
- FBS fetal bovine serum
- PS penicillin-streptomycin
- the amount of RANTES secretion was measured according to the manufacturer's method using an ELISA kit (R&D systems, USA) to measure the amount of RANTE secretion present in the cell supernatant. Statistical differences were assessed for significance using Student's t-test.
- the amount of RANTES production was statistically significantly increased in the TNF- ⁇ treatment group compared to the control group (Control), and the group treated with the magpie swimming extract of the present invention and the positive control group (Dexa ), the amount of RANTES production was statistically significantly reduced.
- Example 3 After inducing inflammation with LPS in bronchial epithelial cells, inflammatory cytokines IL-6, TNF- ⁇ , mucus secretion protein MUC5AC expression level change confirmation
- BEAS-2B human bronchial epithelial cell, ATCC, USA
- cells a human bronchial epithelial cell line
- PS penicillin-streptomycin
- the medium was replaced, and the sample (25 or 50 ⁇ g/ml) and LPS (20 ⁇ g/ml) were treated and cultured for 24 hours. After 24 hours, the cell supernatant was recovered and the expression levels of IL-6, TNF- ⁇ and MUC5AC were measured.
- respiratory damage particulate matter complex (PM10D); Fine dust (PM10-like, ERM-CZ120) and diesel combustion dust (DEP)] were diluted in 1% alum and administered 3 times at 3-day intervals using the Intro-Nazal-Tracheal (INT) injection method (drug administration for 3 days). , 6 days and 9 days later), an animal model of lung injury was produced by injecting directly into the lungs through the airway.
- INT Intro-Nazal-Tracheal
- the experimental group was a normal group without any treatment (Normal), a control group in which respiratory damage was induced by treatment with fine dust complex (PM10D) (CTL), a positive control group administered with fine dust complex and dexamethasone (Dex_3mg/kg), and fine dust
- the composite and the Magpie Suyeong extract (50 mg/kg, 100 mg/kg) were administered to the Magpie Suyeong extract group (LM_50, LM_100).
- the drug was administered orally every day, and after the experiment, the alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue of mice in each group were separated (FIG. 5).
- BALF alveolar lavage fluid
- FIG. 5 The drug was administered orally every day, and after the experiment, the alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue of mice in each group were separated.
- BALF bronchoalveolar lavage fluid
- Lungs were removed from mice without bronchoalveolar lavage (BALF) separation, and the lung tissue was finely sectioned, placed in 3 ml DMEM medium without fetal bovine serum (FBS), and 1 mg/ml collagenase IV ( C5138, Sigma) was added and the tissue was digested 4 times or more for 30 minutes in a 37° C. shaking incubator to separate lung cells.
- the separated lung cells were washed with a medium and then passed through a cell filter to remove undecomposed tissues or impurities other than cells.
- ACK solution (10-548E, LONZA) was treated at 37°C for 5 minutes to lyse red blood cells, washed again with the culture medium, stained with 0.04% trypan blue (15250061, Invitrogen), and total lung cells number was measured. Total cell counts were observed in BAL and lung tissue to investigate the suppression of inflammation-related cell growth.
- the isolated BAL and lung cells were subjected to immunofluorescence staining using CD4, CD8, Gr - 1, SiglecF, CD11b + antibodies after adjusting the cell number, and cell frequency was measured using a FACS Calibur instrument (BD Biosciences, USA). After analyzing as a percentage (%), it was analyzed in each tissue by applying the total number of cells.
- ELISA was performed to measure the amounts of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-17, MIP2, and CXCL-1 in BALF. After the capture antibody was added, and overnight at 4° C., the cells were washed 4 times with a washing buffer. 100 ⁇ l of biotin-conjugated antibody reagent was treated in each well, reacted at room temperature for 1 hour, washed twice, and then treated with 100 ⁇ l of streptavidin-HRP solution in each well and incubated at room temperature for 1 hour After the reaction, it was washed twice with a washing buffer solution. Here, 100 ⁇ l of the substrate solution was treated and reacted for 20 minutes, and then the reaction was terminated by treatment with 50 ⁇ l of the reaction stop solution, and the absorbance was measured at 450 nm.
- RNA extraction solution was added and ground until dissolved. After centrifugation at 13,000 rpm, RNA was extracted by washing with ethanol and drying. The extracted RNA was used for first strand cDNA synthesis.
- Real-time polymerization of the synthesized cDNA was carried out using an Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA). TNF- ⁇ , MIP2, CXCL-1, MUC5AC primers were used, and G3PDH probe (VIC, Applied Biosystems, USA) was used. Real-time polymerization chain reaction conditions were pre-denaturation at 50 °C for 2 minutes, 94 °C for 10 minutes, and 40 cycles at 95 °C for 0.15 minutes and 60 °C for 1 minute. Relative quantitative (RQ) was calculated using G3PDH as an internal standard for the group treated with Shrike swimming extract and the control group.
- RQ Relative quantitative
- the lung tissue was cut and fixed in 10% neutral-buffered formalin for 24 hours, then dehydrated with alcohol, embedded in paraffin to make a block, and then 4 ⁇ m with a microtome. Thick tissue sections were prepared and H&E (Hematoxylin & Eosin) staining, M-T (Masson-Trichrome) staining, collagen deposition staining, and PAS staining were performed to observe goblet cells and secreted mucus. After staining, it was observed through an optical microscope (Nikon, Japan) at 400 ⁇ magnification.
- Results were reported as mean ⁇ error, and significance was determined using Duncan's multiple comparison analysis method (SPSS statistics version 19.0 statistic software, Inc, IBM, USA) followed by Student's t-test and one-way ANOVA.
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Abstract
본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 갯까치수영 추출물이 호흡기 세포인 기관지 상피세포로부터 염증유발 매개인자인 케모카인 RANTES의 생성량을 감소시키는 효과가 있으므로, 천식 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD)을 포함하는 호흡기질환의 건강기능식품 또는 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기비염, 진해 거담, 급만성기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염, 후두염 등은 호흡기질환의 대표적인 질환이다. 천식(asthma)은 기도, 특별히, 기관지에 생기는 만성 염증을 일컫는다. 천식으로 인해 유발되는 염증은 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여 악화될 수 있으며, 지속적인 염증은 기도의 변형 및 기도의 과민성(hyper-responsiveness)을 야기한다. 이러한 원인에 의하여 천명(wheezing, 기도가 좁아져 쌕쌕거리거나 가랑가랑 하는 호흡음이 나타나는 증상)이나, 숨이 차고 기침이 나며, 과도한 객담이 배출되는 등의 일반적인 증상이 나타난다.
호흡기도는 크게 점막과 기관지 평활근이라는 근육으로 이루어져 있고 점막에는 많은 분비샘이 있어 필요한 분비물을 계속 분비하고 있으며 기관지 평활근이 수축하면 호흡기도가 좁아지게 된다. 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여 염증반응이 일어나면 분비샘에서 나오는 분비물이 더욱 증가하게 되고 이 분비물이 기도를 막아 점막이 기도 안쪽으로 부어오르게 되어 기도를 더욱 좁게 만든다. 이로 인해, 천명을 동반한 발작적인 기침과 호흡곤란이 심하게 나타나며, 발작 시에는 마른기침이 발생되고 흉부압박감을 느끼게 된다. 천명이 없이 만성적 기침과 흉부압박감이 있는 원인을 알 수 없는 호흡곤란 증상만 있는 천식도 많은데 이 증상들은 일상생활 중에서 갑자기 발작적으로 나타나는 경향이 있다.
한편, 갯까치수영(Lysimachia mauritiana)은 제주도, 울릉도를 비롯한 남부지역 바닷가 바위지대에 분포하는 쌍떡잎식물로서 어린잎은 식용하고 열매는 관상용으로 쓰인다. 한방에서는 강심제와 이뇨제로 이용되며 고혈압, 당뇨, 변비, 부종 및 타박상 등에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
갯까치수영 추출물 관련 기술로 한국등록특허 제1168567호에 갯까치수영에 함유된 사포닌(saponin) 계열 물질의 항 곰팡이 활성을 개시하고 있으나, 아직까지는 본 발명의 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대하여 언급된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 갯까치수영 추출물이 호흡기 세포인 기관지 상피세포로부터 염증유발 매개인자인 케모카인 RANTES의 생성량을 감소시키며, 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α 및 MUC5AC)의 발현량을 감소시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 동물모델에서 총 BAL 세포 수 및 BAL 내 호중구 수를 감소시키며, BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 함량을 감소시키고, TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 유전자 발현량을 감소시키는 효과가 있으며, 폐조직 손상억제 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 갯까치수영 추출물이 호흡기 세포인 기관지 상피세포로부터 염증유발 매개인자인 케모카인 RANTES의 생성량을 감소시키며, 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α 및 MUC5AC)의 발현량을 감소시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 동물모델에서 총 BAL 세포 수 및 BAL 내 호중구 수를 감소시키며, BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 함량을 감소시키고, TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 유전자 발현량을 감소시키는 효과가 있으며, 폐조직 손상억제 효과가 있는 것이다.
도 1은 기관지상피세포(BEAS-2B)에서, 갯까치수영 추출물의 처리에 따른 RANTES 생성률을 확인한 결과이다. Dexa는 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) 0.5μM을 처리한 군이다. ###은 대조군(Control) 대비 10ng/㎖의 TNFα 처리군(TNFα)에서의 RANTES 생성률이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 10ng/㎖의 TNF-α 처리군 대비 갯까치수영 추출물 처리군 및 양성대조군(Dexa)에서의 RANTES 생성률이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 2는 기관지 상피세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 염증성 사이토카인 IL-6의 발현량 변화를 확인한 결과이다. ###은 Control(정상대조군) 대비 LPS 처리군(LPS20)의 IL-6 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, *, ***은 LPS군 대비 본 발명의 25 및 50㎍/㎖의 갯까치수영 추출물 처리군(LM25, LM50)의 IL-6 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, ***은 p<0.001이다.
도 3은 기관지 상피세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 염증성 사이토카인 TNF-α의 발현량 변화를 확인한 결과이다. ###은 Control(정상대조군) 대비 LPS 처리군(LPS20)의 TNFα 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 LPS군 대비 본 발명의 50㎍/㎖의 갯까치수영 추출물 처리군(LM50)의 TNF-α 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 4는 기관지 상피세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 염증성 사이토카인 MUC5AC의 발현량 변화를 확인한 결과이다. ###은 Control(정상대조군) 대비 LPS 처리군(LPS20)의 MUC5AC 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 LPS군 대비 본 발명의 50㎍/㎖의 갯까치수영 추출물 처리군의 MUC5AC 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 5는 호흡기 손상 동물모델을 이용하여 본 발명의 갯까치수영 추출물의 효과를 확인하는 실험일정을 나타낸 개략도이다.
도 6은 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 총 BAL(Bronchoalveolar lavage) 세포 수 및 총 폐세포 수를 확인한 결과이다. ###은 정상군 대비 미세먼지로 유도한 호흡기 손상 대조군의 총 BAL 세포수 또는 총 폐세포 수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, *, ***은 대조군 대비 본 발명의 갯까치수영 추출물 투여군 또는 양성대조군에서 총 BAL 세포수 또는 총 폐세포 수가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, ***는 p<0.001이다.
도 7은 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 BAL 내 호중구 수를 확인한 결과이다. ###은 정상군 대비 미세먼지로 유도한 호흡기 손상 대조군의 BAL 내 호중구 수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, *, **, ***은 대조군 대비 본 발명의 갯까치수영 추출물 투여군 또는 양성대조군의 BAL 내 호중구 수가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이며, ***는 p<0.001이다.
도 8은 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 BAL에서의 CD4+ 및 CD8+의 수(A), Gr-1+SiglecF- 호중구 세포수(B) 및 폐에서의 Gr-1+CD11b+ 과립구(C), Gr-1+SiglecF- 호중구 세포수(D)를 확인한 결과이다. ##, ###은 정상군 대비 미세먼지로 유도한 호흡기 손상 대조군의 BAL 또는 폐에서의 면역세포 수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다. *, **, ***은 대조군 대비 본 발명의 갯까치수영 추출물 투여군 또는 양성대조군에서 면역세포수가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이며, ***는 p<0.001이다.
도 9는 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 함량을 확인한 결과이다. ##, ###은 정상군 대비 미세먼지로 유도한 호흡기 손상 대조군의 BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다. *, **, ***은 대조군 대비 본 발명의 갯까치수영 추출물 투여군 또는 양성대조군에서 BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이며, ***는 p<0.001이다.
도 10은 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 폐조직에서 TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC mRNA 발현량을 확인한 결과이다. ##, ###은 정상군 대비 미세먼지로 유도한 호흡기 손상 대조군의 폐조직에서 TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다. *, **, ***은 대조군 대비 본 발명의 갯까치수영 추출물 투여군 또는 양성대조군의 폐조직에서 TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이며, ***는 p<0.001이다.
도 11은 호흡기 손상 동물모델에 본 발명의 갯까치수영 추출물을 투여한 후 폐조직의 병리적 손상억제를 확인한 H&E 염색 및 M-T 염색 결과이다.
본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 갯까치수영 추출물은 갯까치수영의 지상부를 추출한 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않고, 필요에 따라 특정부위를 채택하여 사용할 수 있다.
상기 갯까치수영 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 건조 갯까치수영에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출액을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출액을 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물 또는 에탄올이고, 더욱더 바람직하게는 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 갯까치수영 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20~100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~5시간인 것이 바람직하며, 1~3시간이 더욱 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 단계 (3)에서, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 갯까치수영 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 갯까치수영 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 캐러멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 갯까치수영 추출물을 포함하는 약학조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 갯까치수영 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 갯까치수영 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 본 발명의 갯까치수영 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 갯까치수영 추출물을 포함하는 약학 조성물은 1일 0.0001~100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001~10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 수의학적 조성물의 유효한 양은 동물의 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강상태 또는 성별에 따른 본 발명의 유효성분에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 수의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한 끼 식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 갯까치수영 추출물의 제조
건조 갯까치수영 지상부를 50%(v/v) 에탄올로 2시간 동안 2회 환류 추출한 후 추출액을 여과하고 여과액을 감압농축, 건조하여 추출물을 각각 수득하였다.
실시예 2. 기관지 상피세포(BEAS-2B)에서 호흡기 염증 억제 활성 확인
갯까치수영 추출물의 호흡기 염증 억제 활성은 인체 기관지 상피세포주를 이용하여 염증유발 케모카인 RANTES의 분비 억제 활성을 평가하였다.
FBS(fetal bovine serum) 및 PS(penicillin-streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)으로 인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B(human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포를 배양하였으며, BEAS-2B (5×104 cells/well) 세포를 96웰 플레이트에 10%가 포함된 DMEM 배지에 18시간 배양한 후, 배지를 제거하여 혈청-프리 DMEM으로 배지를 교체하고, 100 및 200㎍/㎖의 갯까치수영 추출물과 10ng/㎖의 TNF-α를 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RANTES 분비량은 ELISA 키트(R&D systems, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액에 존재하는 RANTE의 분비량을 측정하였다. 통계적 차이는 스튜던트 t-테스트를 이용하여 유의성을 평가하였다.
그 결과 도 1에 개시한 바와 같이, 대조군(Control) 대비 TNF-α 처리군에서 RANTES 생성량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 이에 대비하는 본 발명의 갯까치수영 추출물을 처리한 군 및 양성대조군(Dexa)에서는 RANTES 생성량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
실시예 3. 기관지 상피세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, 점액 분비 단백질 MUC5AC 발현량 변화 확인
LPS로 염증을 유도한 인체 기관지 상피세포주에서 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, 점액 분비 단백질 MUC5AC 발현량 변화를 평가하였다.
인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B(human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포는 FBS, 페니실린-스트렙토마이신(PS)를 첨가한 DMEM 배지에 18시간 배양한 후, 배지를 제거하여 혈청-프리 DMEM으로 배지를 교체하고, 시료(25 또는 50㎍/㎖)와 LPS(20㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 세포 상층액을 회수하여 IL-6, TNF-α 및 MUC5AC 발현량을 측정하였다.
그 결과, 대조군(CON) 대비 LPS 유도군의 IL-6, TNF-α 및 MUC5AC 발현량이 현저하게 증가하였으나, 이에 대비하여 갯까치수영 추출물을 처리한 실험군의 IL-6, TNF-α 및 MUC5AC 발현량은 현저하게 감소하였다(도 2 내지 도 4).
실시예 4. 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델에서 호흡기 염증 개선 효과 확인
7주령 BALB/c 수컷 생쥐에게, 호흡기 손상 미세먼지 복합물[(PM10D); 미세먼지(PM10-like, ERM-CZ120) 및 디젤연소분진(DEP)]을 1% 명반에 희석시켜 Intro-Nazal-Tracheal(INT) injection 방법을 이용하여 3일 간격으로 3회(약물투여 3일, 6일, 9일 후) 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 폐 손상 동물모델을 제작하였다. 실험군은 아무런 처리를 하지 않은 정상군(Normal), 미세먼지 복합물(PM10D)을 처리하여 호흡기 손상을 유도한 대조군(CTL), 미세먼지 복합물과 덱사메타손(Dex_3mg/kg)을 투여한 양성대조군, 미세먼지 복합물과 갯까치수영 추출물(50mg/kg, 100mg/kg)을 투여한 갯까치수영 추출물군(LM_50, LM_100)으로 하였다.
약물은 매일 경구투여하고, 실험이 끝난 후 각 군 생쥐의 폐포세척액(BALF) 및 폐조직을 분리하였다(도 5).
(1) 기관지 폐포 세척액 분리
실험 마지막 날에 채혈한 후, 개흉하여 기도를 노출시켜 FBS free DMEM 배지 1㎖을 넣은 주사기를 기관지 (trachea)에 삽입하여 주입시키고, 끈으로 묶어 고정한 후에 기관지 폐포세척을 3회 순환하여 세척액(BALF)을 얻었다. 기관지 폐포 세척액을 4℃, 2,000rpm, 5분 동안 원심분리한 후에, 상층액은 냉동보관하였고, BALF에서 분리한 세포는 ACK 액을 3분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 1% FBS 프리 DMEM 배양액으로 세척한 후, 혈구계수기를 사용하여 총 세포수를 측정하였다.
(2) 기관지 폐포 세척액(BALF) 분리 및 총 호중구 세포 수 확인
혈액을 채혈한 후 해부하여 호중구의 BALF 내 세포 계수를 위해 원심분리 후. 침전된 혈구를 분리하여 0.04% 트리판블루(trypan blue)로 염색한 후 총세포수를 측정하였다. Diff-Quick 염색(Romanowsky stain)을 3회에 걸쳐 처리하였고, 이후 PBS로 2회 세척한 후, 군당 9개의 슬라이드를 제작하여 400× 배율의 광학현미경(Light microscope, Nikon, Japan)을 통해 계수하였다.
(3) 폐 세포 분리 및 총 세포수 확인
기관지 폐포세척액(BALF)을 분리하지 않은 생쥐에서 폐를 적출하여 폐조직을 잘게 절편한 후 우태아혈청(FBS)이 포함되지 않은 3㎖ DMEM 배지에 넣고, 1㎎/㎖의 콜라게나제 IV(C5138, Sigma)를 가하여 37℃ 진탕배양기에서 30분 동안 4회 이상 조직을 분해(digestion)하여 폐세포를 분리하였다. 분리된 폐세포는 배지로 세척한 후 세포여과기에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 이들 세포들로부터 ACK 용액(10-548E, LONZA)을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 배양액으로 세척한 후에 0.04% 트리판블루(15250061, Invitrogen)로 염색한 후 총 폐 세포 수를 측정하였다. 염증 관련 세포의 증가 억제를 조사하기 위하여 BAL 및 폐 조직에서 총 세포수를 관찰하였다.
그 결과 미세먼지 유도 호흡기 질환 마우스 대조군에서 BAL 및 폐의 전체 세포수가 증가하였고, BAL 내 호중구의 수가 확연히 증가하여 폐에서의 염증 수치가 증가하였으며, 이에 대비하여 양성대조군인 덱사메타손 투여군과 갯까치수영 추출물(LM) 투여군에서는 BAL, 폐세포 총 세포수와 BAL 내 호중구 수가 감소하였다(도 6 및 도 7).
(4) 면역형광 세포 염색
분리한 BAL, 폐 세포들은 세포수를 조정한 후 CD4, CD8, Gr-1, SiglecF, CD11b+ 항체를 이용하여 면역형광염색을 실시하였으며, FACS Calibur instrument (BD Biosciences, USA)를 이용하여 세포빈도를 백분율로(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서 분석하였다.
BAL에서 유세포(FACS) 분석을 통해 세포빈도를 분석하여 산출한 결과, 대조군의 BAL에서 CD4+CD8+, Gr-1+SiglecF- neutrophil 면역세포 수가 증가하였고, 폐에서 Gr-1+CD11b+ granulocyte, Gr-1+SiglecF- neutrophil 면역세포 수가 증가하였으며, 이에 대비하여 양성대조군 및 갯까치수영(LM) 추출물 투여군에서는 면역세포 수가 감소하였다(도 8).
(5) 효소면역분석법(ELISA)
BALF 내의 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 포획 항체를 넣고, 4℃에서 밤샘(overnight)한 후, 세척용 완충용액으로 4회 세척하였다. 비오틴이 결합된 항체 시약을 각각의 웰에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2회 세척한 다음, 스트렙타비딘-HRP 용액을 각각의 웰에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후에 다시 세척용 완충용액으로 2회 세척하였다. 여기에 기질용액을 100㎕씩 처리하여 20분 동안 반응시킨 후에, 50㎕의 반응정지 용액을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, BALF에서 염증관련 사이토카인 케모카인인 IL-1α, TNF-α, IL-17, MIP2, CXCL-1의 생산량은 미세먼지 유도 대조군에서 모두 증가하였고, 이에 대비하여 양성대조군과 갯까치수영 추출물(LM) 투여군에서는 통계적으로 유의미하게 감소하였다(도 9).
(6) 폐조직에서 TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 유전자 발현량 확인
생쥐의 폐조직을 적출한 후에 RNA 추출용액 500㎕를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다. 13,000rpm으로 원심분리한 후에 에탄올로 수세하고 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 first strand cDNA 합성에 사용하였다.
합성한 cDNA를 실시간 중합연쇄반응은 Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. TNF-α, MIP2, CXCL-1, MUC5AC 프라이머를 사용하였으며 G3PDH 프로브(VIC, Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 실시간 중합연쇄반응 조건은 프리-변성(pre-denaturation)은 50℃에서 2분, 94℃에서 10분, 및 40사이클을 95℃에서 0.15분, 60℃에서 1분 수행하였다. 갯까치수영 추출물 투여군과 대조군은 내부 표준물질(internal strandard)로 G3PDH를 사용하여 RQ(relative quantitative)를 계산하였다.
| 유전자 | 방향 | 서열(5′->3′) | 서열번호 |
| TNF-α | 정방향 | CCTGTAGCCCACGTCGTAGC | 1 |
| 역방향 | TTGACCTCAGCGCTGAGTTG | 2 | |
| MIP2 | 정방향 | ATGCCTGAAGACCCTGCCAAG | 3 |
| 역방향 | GGTCAGTTAGCCTTGCCTTTG | 4 | |
| CXCL-1 | 정방향 | CCGAAGTCATAGCCACAC | 5 |
| 역방향 | GTGCCATCAGAGCAGTCT | 6 | |
| MUC5AC | 정방향 | AGAATATCTTTCAGGACCCCTGCT | 7 |
| 역방향 | ACACCAGTGCTGAGCATACTTTT | 8 | |
| G3PDH | 프로브 | CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG | 9 |
그 결과, 염증관련 사이토카인 TNF-α, MIP2, CXCL-1과 점액 단백질 MUC5AC의 유전자 발현은 미세먼지 유발 대조군에서 증가하였고, 양성대조군과 갯까치수영 추출물(LM) 투여군에서 유의성 있는 수준으로 감소하였다(도 10).
(7) 조직병리검사
폐조직의 병리적 손상 정도를 관찰하기 위해 폐조직을 절취하여 10% 중화 포르말린(neutral-buffered formalin)에 24시간 동안 고정시킨 다음 알코올로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 블럭을 제작한 다음 마이크로톰으로 4㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색과 콜라겐 deposition 염색인 M-T(Masson-Trichrome) 염색, 배상세포(goblet cell) 및 분비된 점액질을 관찰하기 위해 PAS 염색을 수행하였다. 염색 후 400× 배율의 광학현미경(Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.
그 결과, 미세먼지 유발 대조군의 H&E 염색법을 통해 염증세포 침윤, 폐세포 벽이 두꺼워진 것을 확인할 수 있었고, M-T 염색법을 통해 교원섬유 증가를 확인할 수 있었다. 이에 대비하여 양성대조군인 덱사메타손 투여군과 갯까치수영 추출물(LM) 투여군은 얇은 폐세포 벽과 염증세포 감소, 교원섬유의 감소를 확인할 수 있었다(도 11).
[통계처리]
결과는 평균±오차로 기록하였고, 유의성 검증은 스튜던트 t-테스트 및 일원분석 ANOVA에 따른 던컨의 다중비교분석법(SPSS statistics version 19.0 statistic software, Inc, IBM, USA)을 이용하여 결정하였다.
Claims (9)
- 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 갯까치수영 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 갯까치수영 추출물은 갯까치수영의 지상부를 추출한 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 갯까치수영 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
- 갯까치수영 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제.
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|---|
| KOREA MEDICINAL PLANT GARDEN CORPORATION: "The Name of the Herbal Medicine: Gooseneck Loosestrife", NAVER BLOG, NAVER, KOREA, Korea, XP009547581, Retrieved from the Internet <URL:https://blog.naver.com/syc5910/222005135615> * |
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