WO2020226468A1 - 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 ＷiＫim0108 균주 및 이의 용도 - Google Patents

면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 ＷiＫim0108 균주 및 이의 용도 Download PDF

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inflammatory bowel
pediococcus
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PCT/KR2020/006171
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채성욱
지건영
홍성욱
노성운
이호재
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한국 한의학 연구원
한국식품연구원
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a strain of Pediococcus inofinatus WiKim0108 having an effect of regulating immune function and improving inflammatory bowel disease and a use thereof.
  • Skate belonging to the stingray family, is a cartilage, benthic fish, and is distributed in the coast of Heuksan Island and the west coast of Korea, and is caught in Mokpo and Yeongwang, but due to the recent decline, it is also imported from Chile, convinced, and Argentina.
  • Jeollanam-do fermented skates are used habitually as a traditional food, and the population who enjoys its unique aroma and taste is increasing.
  • Hongtak which is eaten with fermented skateboard with makgeolli, is the most famous, and in the southeastern coast of Jeollanam-do, fermented skateboard is hardly missed for feast food.
  • Skatefish contains a lot of nitrogen compounds, urea and trimethylamine oxide, in the body to control the osmotic pressure in the deep sea, and these components are converted into ammonia and trimethylamine by fermentation, which irritates the nose. A stinging taste is produced.
  • Skate is a high-protein, low-fat fish with 19% protein and 0.9% fat. Like sharks and rays, it contains a lot of betaine and taurine, and has a high content of calcium and urea.
  • the reported functional effects of skate include cell membrane stabilization, cholesterol-regulating effects to prevent vascular disease and heart failure, taurine, which is important for growth and development, linolenic acid and arachidonic acid, which help reduce serum cholesterol and improve brain growth and cognitive function.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease or Behcet's disease a disease including ulcerative colitis, Crohn's disease or Behcet's disease, and it is known that the activation of inflammatory cells is an important etiology, and the activation of inflammatory cells with anti-inflammatory agents, immunosuppressants, etc. Treatment through inhibition is necessary. That is, even in the case of bowel disease, the treatment method must be different depending on the specific etiology, and in particular, in the case of inflammatory bowel disease, the provision of a method for suppressing and alleviating inflammation-related symptoms is the most important factor in the treatment of the disease.
  • Persistent or inadequate activation of the intestinal immune system plays an important role in the pathophysiology of chronic mucosal inflammation, especially infiltrating neutrophils, macrophages, lymphocytes and mast cells, resulting in mucosal destruction and ulcers.
  • TNF- ⁇ is highly expressed in the colon lumen and colon epithelial cells of patients with ulcerative colitis, and according to recent studies, TNF- ⁇ is known to play an important role in the pathogenesis of ulcerative colitis.
  • Infliximab an anti-TNF- ⁇ antibody, is known to be effective not only for the treatment of boils, but also for the treatment of previously untreated Crohn's disease, but these treatments are expensive, and some patients suffer from fluid reactions or infectious complications. The same side effects are caused.
  • 5-aminosalicylic acid drugs that block the production of prostaglandins, such as sulfasalazine, are used, or immunosuppressants such as steroids are used.
  • Sulfasalazine is likely to cause side effects or adverse effects such as fullness, headache, rash, liver disease, leukopenia, agranulocytosis, and male infertility.
  • Steroid-type immunosuppressants are adrenal cortical steroids, which are recognized for their short-term effects, but cannot improve long-term prognosis, and induced infectious diseases, secondary adrenal insufficiency, peptic ulcer, diabetes, mental disorders, steroidal nephropathy, etc.
  • induced infectious diseases secondary adrenal insufficiency, peptic ulcer, diabetes, mental disorders, steroidal nephropathy, etc.
  • Korean Patent No. 1617141 discloses Pediococcus inofinatus having anti-obesity activity
  • Korean Patent No. 1890428 discloses Th1 containing Pediococcus pentosaceus as an active ingredient.
  • -A composition for the prevention, improvement or treatment of -mediated immune disease, Th17-mediated immune disease or Th2-mediated immune disease is disclosed, but Pediococcus inofinatus having the effect of modulating immune function and improving inflammatory bowel disease of the present invention
  • WiKim0108 strain There is no disclosure of the WiKim0108 strain and its use.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention provides a Pediococcus inofinatus WiKim0108 strain having an effect of regulating immune function and improving inflammatory bowel disease, wherein the Pediococcus inofinatus WiKim0108 strain is By confirming that there is no cytotoxicity, has an immunity enhancing effect, has an effect of increasing NO production and ROS production, has an effect of improving the expression of inflammatory cytokines and the number of immune cells, and has an effect of improving bowel disease in an animal model of inflammatory bowel disease. , Completed the present invention.
  • the present invention provides a Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain (accession number: KACC 81091BP) having an effect of regulating immune function and preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It provides a functional food composition for preventing or improving function control and inflammatory bowel disease.
  • Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain
  • the culture of the strain the concentrate of the culture
  • the dried product of the culture and an inflammatory comprising at least one selected from the extract of the culture as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal diseases.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It provides a feed composition for controlling function and preventing or improving inflammatory bowel disease.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It provides a veterinary composition for controlling function and preventing or treating inflammatory bowel disease.
  • the present invention relates to a lactobacillus pediococcus inofinatus and its use having an effect of modulating immune function and improving inflammatory bowel disease, and the pediococcus inofinatus WiKim0108 of the present invention has no cytotoxicity and has an immune enhancing effect. , NO production and ROS production promotion effect, and the expression of inflammatory cytokines and the number of immune cells are enhanced, and since it has the effect of improving bowel disease in an animal model of inflammatory bowel disease, it is possible to regulate immune function and prevent, improve or improve inflammatory bowel disease. It can be very usefully used in therapeutic health functional foods, pharmaceuticals, feed compositions or veterinary compositions.
  • Figure 2 is a result of confirming the raw 264.7 cell survival rate of lactic acid bacteria WiKim0108 isolated from skates.
  • Con is a cell that has not been treated with anything
  • PBS is a cell treated with PBS solution to confirm that there is no difference due to solvent
  • LPS is a cell treated with lipopolysaccharide
  • WiKim0108 is 10 4 ⁇ 10 7 CFU/ It was treated with ml of Pediococcus inofinatus. * Indicates that there is a statistically significant difference compared to Con, which is p ⁇ 0.05.
  • Figure 4 is an analysis result of the generation of NO (Nitric oxide) (A), iNOS expression (B) and ROS (Reactive oxygen species) generation (C) according to the treatment of Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention.
  • NO Nitric oxide
  • B iNOS expression
  • C reactive oxygen species
  • Figure 5 is interleukin (IL)-1 ⁇ (A), IL-6 (B), tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ) (C) and cyclooxygenase 2 according to the treatment of Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention. It is the result of gene expression analysis of (COX-2)(D). * LPS treatment compared to Con; And the group treated with Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention; p ⁇ 0.05 was found that gene expression was increased.
  • FIG. 6 is a result of confirming the weight change (A), the distribution of immune cells (B), and the gene expression level of inflammatory cytokines (C) by administering Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention to an animal model.
  • A weight change
  • B distribution of immune cells
  • C gene expression level of inflammatory cytokines
  • * Indicates that the gene expression was increased in the group treated with Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention compared to Con, p ⁇ 0.05.
  • Figure 7 is after administration of Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention to an animal model in which inflammatory bowel disease is induced, weight change (A), bowel disease activity index (DAI) (B), and length of colon tissue This is the result of confirming the change (C).
  • Figure 8 shows the number of immune cells (T cells, B cells, NK cells, macrophages, dendritic cells) after administration of Pediococcus inofinatus (WiKim0108) of the present invention to an animal model in which inflammatory bowel disease is induced. This is the result of confirming the change.
  • the present invention relates to a strain of Pediococcus inopinatus WiKim0108 (Accession No.: KACC 81091BP) having the effect of controlling immune function and preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.
  • the Pediococcus Inofinatus WiKim0108 strain is preferably isolated from skateboard or skate kimchi, but is not limited thereto.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It relates to a functional food composition for preventing or improving function control and inflammatory bowel disease.
  • the active ingredient is preferably prepared in any one formulation selected from powder, granule, pill, tablet, capsule, candy, syrup, and beverage, but is not limited thereto.
  • the strain or a culture solution thereof may be added as it is, or may be used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. have.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the health functional food composition of the present invention may further include ingredients that are commonly added at the time of food production and are food wise acceptable.
  • ingredients that are commonly added at the time of food production and are food wise acceptable For example, when prepared as a beverage, it may further include one or more components from citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, etc. in addition to the strain of the present invention.
  • the amount that can be included as an active ingredient of the health functional food composition according to the present invention is appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, and symptoms of a person who wants a health functional food for controlling immune function and preventing or improving inflammatory bowel disease. It may be, and preferably contained in about 0.01 to 10.0g per adult basis, and by ingesting foods having such a content, it is possible to obtain an effect of controlling immune function and preventing or improving inflammatory bowel disease.
  • the present invention Pediococcus inopinatus ( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 strain, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture, and an inflammatory comprising at least one selected from the extract of the culture as an active ingredient It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal diseases.
  • the inflammatory bowel disease is preferably ulcerative colitis, Crohn's disease, or Behcet's disease, but is not limited thereto.
  • the term'prevention' in the present invention refers to any action that suppresses or delays the onset of inflammatory bowel disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, and'treatment' refers to inflammatory bowel by administration of the pharmaceutical composition. It refers to any action in which the symptoms of the suspected and onset individual are improved or beneficially altered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • compositions according to the present invention are formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be used.
  • Carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Various compounds or mixtures including calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, in the strain or the endoplasmic reticulum derived from the strain. , Sucrose (sucrose) or lactose (lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, and the term'pharmaceutically effective amount' of the present invention is sufficient to prevent or treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical prevention or treatment. It means an amount, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion, treatment The duration, factors including drugs used in combination or co-use with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or divided into several doses.
  • the above dosage does not in any way limit the scope of the present invention.
  • the term "individual" of the present invention includes, without limitation, mammals including mice, livestock, humans, etc. that are likely to develop inflammatory bowel disease or have developed.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered through a route such as oral administration or rectal administration, and in some cases, may be administered by other routes depending on the purpose.
  • the oral composition should be coated with an active agent or formulated to protect it from degradation in the stomach.
  • the composition can be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It relates to a feed composition for controlling function and preventing or improving inflammatory bowel disease.
  • the strain is as described above, and may be added as a feed composition for the purpose of regulating immune function and preventing or improving inflammatory bowel disease.
  • the feed composition may contain a feed additive.
  • the feed additive of the present invention corresponds to an auxiliary feed in the feed management law.
  • the term'feed' may mean any natural or artificial diet, one meal meal, etc., or a component of the one meal meal for animals to eat, ingest, and digest.
  • the kind of feed is not particularly limited, and feed commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meals or grain by-products; Animal feeds such as proteins, inorganic logistics, oils and fats, minerals, oils and fats, single-cell proteins, zooplanktons or foods. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the present invention is an immunity comprising at least one selected from Pediococcus inopinatus WiKim0108 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and an extract of the culture as an active ingredient. It relates to a veterinary composition for controlling function and preventing or treating inflammatory bowel disease.
  • Excipients and diluents that may be included in the veterinary composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate. , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • the veterinary composition of the present invention may further include a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a spice, an emulsifying agent, a preservative, and the like.
  • the active ingredient is rapidly, sustained or It can be formulated using methods well known in the art to provide delayed release, and the formulations are powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, suppositories. , Sterile injectable solutions, sterile external preparations, and the like.
  • the veterinary composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the animal, and may be administered once to several times a day, and the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, sex, weight, age, and the like. Therefore, the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the new strain used in the present invention takes skate kimchi (10g) purchased from the Skate Farming Association in Youngsanpo, Naju, Jeollanam-do, diluted with sterilized physiological saline, spread on a solid medium for separating MRS lactic acid bacteria, and incubated at 30°C for 48 hours. Different microorganisms were separated and used according to the type of colony. The isolated microorganisms were cultured at 30° C. for 48 hours in minimal nutrient medium (1% glucose, 0.5% yeast extract).
  • the macrophage cell line Raw 264.7 cells (Murine macrophage cell line) used in the present invention was pre-sale and used from Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea).
  • Cell culture medium was used by adding 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (100U/ml) to DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Co., USA) medium, and 37°C, 5% Incubated for 48 hours in CO 2 conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Co., USA
  • Raw 264.7 cells were dispensed into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml and cultured for 3 hours, followed by treatment with LPS (1 ⁇ g/ml) and samples, and cultured for 24 hours.
  • DMEM medium containing 10% MTS solution in the cultured 96-well plate was treated with 100 ⁇ l of each well, and cultured for 3 hours at 490 nm using an ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria). The absorbance was measured. Cell viability was calculated using the following formula (1).
  • DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (100 U/ml) was dispensed into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the samples were treated by concentration. After incubation for hours, LPS (1 ⁇ g / ml) was treated and incubated for 24 hours in a 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • Raw 264.7 cells were dispensed into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml and incubated for 2 hours, and then each sample was treated by concentration and incubated for 1 hour. . Thereafter, LPS (1 ⁇ g/ml) was treated and incubated for 24 hours in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • the obtained supernatant was used as a sample, and the absorbance was measured at 450 nm using a Quantikine ELISA kit (R&D system, USA), and the measured pro-inflammatory cytokines were TNF- ⁇ , interleukin-1 ⁇ (IL- 1 ⁇ ) and interleukin-6 (IL-6) production was analyzed by the sandwich-ELISA method according to the experimental method specified in the kit.
  • the skate kimchi microorganism Pediococcus inofinatus WiKim0108 with excellent anti-inflammatory activity was identified through 16S ribosomal DNA gene sequence analysis. After taking the cells of the selected microorganism and washing the cells twice in sterilized physiological saline, DNA was extracted using a DNeasy tissue kit (Qiagen, Valecia, CA, USA). Universal primer for amplification of 16S ribosomal DNA gene of extracted DNA; 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') (SEQ ID NO: 1) and 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') (SEQ ID NO: 2) primers were used.
  • PCR reaction in 10 ⁇ l of Takara Perfect Premix (Takara, Japan) containing 0.4mM dNTP, 0.5 unit of Taq polymerase, and 4mM Mg 2+ , 1 ⁇ l of DNA template (20 ⁇ g/ml), 1.0 ⁇ M forward primer and 1.0 ⁇ M reverse primers were added at 1 ⁇ l each, and distilled water was added to the rest to obtain a total volume of 20 ⁇ l.
  • PCR amplification was performed with a Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). The PCR reaction was performed at 95°C for 5 minutes (initial denaturation), 94°C for 45 seconds (denaturation), 52°C for 45 seconds (annealing), 72°C for 1 minute (extension) for 30 cycles, and 72°C for 5 minutes. Final extension was performed.
  • the amplified fragment of about 1400bp was transformed after binding to a T vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Base sequence determination was performed using a T vector sequencing primer,
  • the results were identified by comparison with the ribosomal DNA gene sequencing of GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA) using the BLAST analysis program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the determined nucleotide sequence was aligned with Clustal_W and BioEdit programs, and the generated gap was treated as a missing trait in the subsequent analysis process.
  • the calculation of the genetic distance between nucleotide sequences and the generation of neighbor-joining, maximum-likelihood and parsimony phylogenies were performed using the Mega program, and bootstrap analysis was performed with the same specifications for each of the above three analyses to determine the support of the phylogeny. (1,000 replicates).
  • RAW 264.7 cells were dispensed into a 96-well culture plate under the condition of 5 ⁇ 10 3 cells/well and stabilized for 24 hours.
  • 1 ⁇ g / ml of Lipopolysaccharide (LPS; Sigma) and 10 4 ⁇ 10 7 CFU / ml of Pediococcus inopinatus (Pediococcus inopinatus) was treated for 24 hours and then incubated for 24 hours
  • MTS assay Promega
  • the RAW 264.7 cells in 96-well culture plate in 5 ⁇ 10 3 cells / well was seeded with stable conditions for 24 h, LPS (1 ⁇ g / ml) and 10 5 to 10 7 CFU of Phedi OKO / ml kusu Ino Pina tooth (Pediococcus inopinatus) were each treated. After culturing for 24 hours, each cell culture solution was separated, and the change in NO production was analyzed using a grease reagent system (Promega).
  • Pediococcus inopinatus After dispensing RAW 264.7 cells in a 6-well culture plate at 1 ⁇ 10 5 cells/well and stabilizing for 24 hours, LPS (1 ⁇ g/ml) and 10 5 ⁇ 10 7 CFU/ml Pediococcus inofina Tooth ( Pediococcus inopinatus ) was each treated and incubated for 24 hours. After RNA was extracted from each cell using TRIzol reagent (Invitrogen), cDNA was synthesized using TaqMan Reverse Transcription Master Mix (Applied Biosystems).
  • the primers for ⁇ -actin, iNOS, interleukin (IL)-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ (tumor necrosis factor alpha), and COX-2 were purchased from TaqMan Gene Expression assay (Applied Biosystems). The relative expression levels were analyzed using ABI QuantStudio 6 Flex Real Time-PCR and TaqMan PCR Master Mix. The relative expression levels of each gene were quantified with ⁇ -actin and calculated by the ⁇ Ct method.
  • a 5-week-old male mouse (C57BL/6N, Japan SLC Inc.) was purchased from the central experimental animal, adapted for one week, and used in the experiment, and the mice in a healthy state were used for the experiment by observing the general condition during the adaptation period.
  • the breeding environment was maintained at a temperature of 23 ⁇ 3°C, a humidity of 50 ⁇ 5%, and a contrast period of 12 hours (07:00-19:00/lighting time).
  • the experimental animals were reared in a polycarbonate cage (200 ⁇ 320 ⁇ 145mm, Three-shine Co., Daejon Korea) in 3 animals per group, and the feed was Harlan 2018S (Harlan TM , USA) for mice. I was fed free.
  • RO reverse osmosis
  • the experimental group was divided into a normal group (WT), a control group (Con), and a Pediococcus inopinatus administration group (WiKim0108), and the sample administration was performed orally using a mouse zone at a concentration of 10 8 CFU/100 ⁇ l. Was administered.
  • the sample administration period was administered daily for a total of 2 weeks, and the mice were sacrificed at 2 weeks to analyze the immune enhancing effect.
  • DMEM medium Dulbeco's modified eagle's media; Gibco
  • Fetal bovine serum Gibco
  • Each spleen tissue was extracted using DMEM medium containing 1% FBS and a 40 ⁇ m cell strainer (Falcon), and then dispensed into 5 ml FACs tubes (Falcon) under 1 ⁇ 10 6 cell conditions.
  • DSS dextran sulfate sodium salt
  • the experimental group was divided into a normal group (WT), a control group (Con), a positive control group (5-ASA), and a Pediococcus inopinatus administration group (WiKim0108), and the sample administration was 10 8 CFU/100 ⁇ l.
  • the concentration was administered orally using a mouse zone.
  • the sample administration period was 3 weeks in total and was administered daily.
  • 5% DSS negative water was freely fed for 6 days to the experimental group excluding the normal group (WT), and mice were sacrificed at the 3rd week of sample administration. The improvement effect was analyzed.
  • DAI Disease activity index
  • DAI Disease activity index score Score Weight loss Stool consistency Visible blood in feces 0 No weight loss Normal No bleeding One 1 ⁇ 5% 2 6-10% Loose Slight bleeding 3 11-15% 4 15% or more Diarrhea Gross bleeding
  • Example 1 Selection of lactic acid bacteria with excellent anti-inflammatory activity
  • TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 cytokines produced by Raw 264.7 cells by LPS stimulation were analyzed.
  • the production of TNF- ⁇ an inflammatory cytokine, which is a tumor necrosis factor, was slightly decreased (Fig. 1B), and the production of IL-1 ⁇ was measured as 50.7 pg/ml, so that the group treated with only LPS ( 68 pg/ml) was significantly suppressed (Fig. 1C).
  • IL-6 production was also measured at 669.7pg/ml, and showed a tendency to decrease significantly compared to the group treated with only LPS (1211.1pg/ml) (Fig. 1D).
  • the WiKim0108 strain was finally selected, and as a result of confirming the survival rate of Raw 264.7 cells by MTS assay, it showed a high survival rate of 130% or more compared to the control, and the cell survival rate according to the number of viable cells Since there was no decrease of, it was confirmed that there was no significant toxic reaction to Raw 264.7 cells (FIG. 2).
  • the new strain WiKim0108 isolated from skates was 97% identical to the Pediococcus inopinatus standard strain BT, and Pediococcus inopinatus WiKim0108 (Pedicoccus inopinatus WiKim0108).
  • the Pediococcus Inofinatus WiKim0108 was deposited with the Agricultural Genetic Resource Center of the National Academy of Agricultural Sciences on March 8, 2019, and was given the deposit number KACC 81091BP.
  • Phedi OKO kusu Ino Pina tooth not of Phedi OKO kusu Ino Pina tooth (Pediococcus inopinatus) through the cell proliferation of RAW 264.7 cells not inhibited by the treatment of (Pediococcus inopinatus) are cytotoxic, cell proliferation is increased than the control and LPS It was confirmed that there is an immunity enhancing effect through being lower than that of the inflammatory group (Fig. 3).
  • cytokines IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , COX-2
  • IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , COX-2 Changes in gene expression of cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , COX-2) expressed by the activation of immune cells to confirm the immune enhancing efficacy of Pediococcus inopinatus was observed.
  • gene expression of cytokines was increased in the experimental group treated with Pediococcus inopinatus compared to the control group, and a low gene expression increased compared to the inflammatory group treated with LPS (FIG. 5 ).
  • Pediococcus inofina Compared with the normal group and the control group, Pediococcus inofina It was confirmed that the number of CD4 + T cells, B cells, macrophages, and dendritic cells increased in the experimental group administered with Pediococcus inopinatus .
  • cytokines IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , COX-2
  • Example 6 Pediococcus inofinatus in an animal model ( Pediococcus inopinatus ) To improve inflammatory bowel disease
  • Peddie OKO Syracuse Eno Pina tooth Pedy OKO Syracuse Eno Pina tooth (Pediococcus inopinatus) a was administered orally administering the period for a total of three weeks in C57BL / 6N mice to determine inflammatory bowel disease, improvement of (Pediococcus inopinatus) in an animal model 2 At week 5% DSS negative water was fed freely for 6 days to induce inflammatory bowel disease, and then mice were sacrificed. As a result of observing changes in mouse weight and DAI in an animal model of inflammatory bowel disease, weight loss and DAI increased in the control group, the positive control group, and the experimental group administered with Pediococcus inopinatus compared to the normal group. Confirmed.
  • T cells T cells, B cells, NK cells, macrophages, dendritic cells
  • a flow cytometer It was observed that the number of immune cells decreased, and the decrease in the number of immune cells was alleviated in the experimental group administered with the positive control group, Pediococcus inopinatus , compared to the control group (FIG. 8).

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Abstract

본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 유산균 페디오코쿠스 이노피나투스 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스가 세포독성이 없으며, 면역증진 효과가 있고, NO 생성 및 ROS 생성 증진효과가 있으며, 염증성 사이토카인의 발현 및 면역세포 수를 증진시키고, 염증성 장질환 동물모델에서 장질환의 개선 효과가 있으므로, 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능성 식품, 의약품, 사료 조성물 및 수의학적 조성물에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 ＷｉＫｉｍ0108 균주 및 이의 용도
본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
가오리과에 속하는 홍어는 연골, 저서성 어류로서 우리나라의 흑산도 근해와 서해안에 분포하여 목포와 영광에서 어획되고 있으나, 최근 감소추세에 있어 칠레, 우루과이, 아르헨티나 등지에서도 수입하고 있는 실정이다. 주로 전라남도에서는 홍어를 발효시켜 전통식품으로 애용하고 있으며, 그 독특한 향과 맛을 즐겨 섭취하는 인구가 증가하고 있다. 발효한 홍어를 막걸리와 곁들여 먹는 홍탁이 가장 유명하며, 전남 서남해안 지방에서는 잔치 음식에 삭힌 홍어가 거의 빠지지 않는다.
홍어는 바다 심해에서 삼투압 조절을 위해 체내에 질소화합물인 요소 및 트리메틸아민 산화물(trimethylamine oxide)을 많이 함유하고 있는데, 발효에 의해서 이들 성분은 암모니아와 트리메틸아민으로 전환되어 코를 자극하는 강한 향과 톡 쏘는 맛이 생성된다. 홍어는 단백질 19%, 지방 0.9% 정도로 고단백 저지방 어류에 해당하며 상어나 가오리와 같이 베타인(betaine)과 타우린(taurine)이 많이 함유되어 있고, 칼슘과 요소 함량도 높다. 보고된 홍어의 기능적 효과로는 세포막 안정화 작용, 콜레스테롤 조절 작용으로 인한 혈관질환 및 심부전증 예방효과, 성장 발달에 중요한 타우린, 혈청 콜레스테롤 감소와 두뇌성장 발달과 인지기능 향상에 도움을 주는 리놀렌산, 아라키돈산 등 필수 지방산이 함유되어 있으며, EPA와 DHA가 다량 함유되어 관상동맥 질환예방, 혈전증 예방, 두뇌 발달, 시각기능 강화 효과가 있다. 홍어 껍질에 존재하는 콜라겐과 연골에는 뮤코다당 단백질인 콘드로이틴이 함유되어 있어 건강 및 강장 식품으로 알려져 있다. 최근 홍어의 생리활성이나 성분 분석에 대한 연구는 이루어져 있으나, 홍어에 존재하는 미생물에 관한 연구는 많이 부족한 실정이다. 홍어는 한국 전남지역의 전통 발효식품으로서 기존 배추김치와 차별되는 발효미생물도 다양할 것이다.
한편, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 궤양성 대장염, 크론병 또는 베체트병 등을 포함하는 질환으로, 염증 세포의 활성화가 중요한 병인인 것으로 알려져 있고 항염증제, 면역 억제제 등으로 염증세포의 활성화 억제 등을 통한 치료가 필요하다. 즉, 장질환이라고 하더라도 그 구체적 병인 등에 따라 치료방법이 달라야 하며, 특히 염증성 장질환의 경우 염증 관련 증상에 대한 억제 및 완화 방안의 마련이 질환 치료에 가장 중요한 인자이다. 장 면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 만성 점막성 염증의 병리생리에서 중요한 역할을 하며, 특히 호중구, 대식세포, 림프구 및 비만세포의 침윤에 의해 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다.
염증성 장 질환이 있으면 장관의 점막에서 다양한 염증성 사이토카인들이 분비된다. TNF-α는 궤양성 대장염 환자의 대장 루멘과 대장 상피세포에서 높게 나타나며, 최근 연구에 의하면, TNF-α는 궤양성 대장염의 병인으로 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 항-TNF-α 항체인 인플릭시맵(infliximab)은 종기의 치료뿐만 아니라, 기존에 치료되지 않던 크론병의 치료에 효과적이라고 알려져 있으나, 이러한 치료법은 비용이 많이 들고, 일부 환자에게서는 수액 반응 또는 전염성 합병증과 같은 부작용이 야기된다. 현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 예를 들어, 설파살라진 등을 이용하거나 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있다. 설파살라진은 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등과 같은 부작용 또는 역효과를 일으키기 쉽다.
또한, 설파살라진이 장의 환부를 절개한 환자 또는 차도가 있는 환자에게 충분한 재발 억제 효과가 있는지는 불분명하다. 스테로이드류의 면역억제제는 부신피질 스테로이드로서, 단기적인 효과는 인정받고 있지만, 장기적인 예후를 향상시킬 수는 없으며, 유도된 감염성 질환, 2차 부신피질 부전증, 소화성 궤양, 당뇨병, 정신장애, 스테로이드성 신장병 등과 같은 부작용의 측면에서 단지 급성인 경우에만 사용되어야 하는 한계가 있다. 염증성 장질환에 대해 아직까지 신뢰할 만한 치료요법은 없으며 이러한 질환에 대해 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1617141호에 항비만 활성을 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1890428호에 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 및 이의 용도에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 제공하고, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주가 세포독성이 없으며, 면역증진 효과가 있고, NO 생성 및 ROS 생성 증진효과가 있으며, 염증성 사이토카인의 발현 및 면역세포 수를 증진시키고, 염증성 장질환 동물모델에서 장질환의 개선 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 개선효과를 갖는 유산균 페디오코쿠스 이노피나투스 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108은 세포독성이 없으며, 면역증진 효과가 있고, NO 생성 및 ROS 생성 증진효과가 있으며, 염증성 사이토카인의 발현 및 면역세포 수를 증진시키고, 염증성 장질환 동물모델에서 장질환의 개선 효과가 있으므로, 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능성 식품, 의약품, 사료 조성물 또는 수의학적 조성물에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 홍어로부터 분리한 유산균 6종의 항염증 활성을 확인한 결과로, (A)는 NO 생성율(%), (B)는 TNF-α 생성량, (C)는 IL-1β 생성량 및 (D)는 IL-6 생성량을 확인한 결과이다.
도 2는 홍어로부터 분리한 유산균 WiKim0108의 Raw 264.7 세포 생존률을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 처리한 대식세포 RAW 264.7의 세포 증식을 확인한 결과이다. Con은 아무것도 처리하지 않은 세포이고, PBS는 용매에 의한 차이가 없다는 것을 확인하기 위하여 PBS 용액을 처리한 세포이며, LPS는 리포폴리사카라이드를 처리한 세포이고, WiKim0108은 10 4~10 7 CFU/㎖의 페디오코쿠스 이노피나투스를 처리한 것이다. *은 Con 대비 통계적으로 유의한 차이가 있다는 것으로 p<0.05이다.
도 4는 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108) 처리에 따른 NO(Nitric oxide) 생성(A), iNOS 발현(B) 및 ROS(Reactive oxygen species) 생성(C)에 대한 분석 결과이다. *은 Con 대비 LPS 처리; 및 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 처리한 군;에서 NO 생성 또는 iNOS 발현이 증가했다는 것으로 p<0.05이다.
도 5는 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108) 처리에 따른 interleukin(IL)-1β(A), IL-6(B), tumor necrosis factor alpha (TNF-α)(C) 및 cyclooxygenase 2(COX-2)(D)의 유전자 발현 분석 결과이다. *은 Con 대비 LPS 처리; 및 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 처리한 군;에서 유전자 발현이 증가했다는 것으로 p<0.05이다.
도 6은 동물모델에 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 투여하여 체중변화(A), 면역세포의 분포(B) 및 염증성 사이토카인의 유전자 발현량(C)을 확인한 결과이다. *은 Con 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 처리한 군에서 유전자 발현이 증가했다는 것으로 p<0.05이다.
도 7은 염증성 장질환이 유도된 동물모델에 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 투여한 후, 체중변화 (A), 장질환 활성 인덱스(DAI)(B) 및 대장조직의 길이 변화(C)를 확인한 결과이다.
도 8은 염증성 장질환이 유도된 동물모델에 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스(WiKim0108)를 투여한 후, 면역세포들(T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 수지상 세포)의 개수 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP)에 관한 것이다. 상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주는 홍어 또는 홍어김치로부터 분리된 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 유효성분은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기에서 언급한 본 발명의 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병 또는 베체트병인 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서의 용어 '예방'이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 장질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, '치료'란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 장질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 상기 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 균주 또는 상기 균주 유래 소포체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 '개체'란 염증성 장질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 염증성 장질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 WiKim0108 균주가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선을 목적으로 사료 조성물로 첨가할 수 있다. 상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명의 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물이 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다. 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 투여량은 투여경로, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
<재료 및 방법>
1. 신균주 분리
본 발명에서 사용한 신균주는 전라남도 나주시 영산포 홍어 영농조합법인으로부터 구입한 홍어김치(10g)를 취하여 멸균 생리식염수로 십진 희석한 후, MRS 유산균 분리용 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 후에 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하여 사용하였다. 분리한 미생물은 영양 최소배지(1% 글루코오스, 0.5% 효모 추출물)에서 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
2. 홍어김치로부터 분리한 신균주의 항염증 활성 확인
(1) 세포 배양
본 발명에 사용된 대식세포주 Raw 264.7 세포(Murine macrophage cell line)는 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Co., USA) 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(100U/㎖)를 첨가하여 사용하였으며 37℃, 5% CO 2 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
(2) 세포 생존율
Raw 264.7 세포를 1×10 5 cells/㎖의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 3시간 동안 배양한 후, LPS(1㎍/㎖) 및 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 96-웰 플레이트에 10% MTS 용액이 함유된 DMEM 배지를 각각의 웰에 100㎕씩 처리한 후, 3시간 배양하여 ELISA 마이크로플레이트 리더(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률을 하기 식(1)을 이용하여 계산하였다.
식(1)
세포 생존률(% control)= [(처리된 시료의 흡광도)/(대조군의 흡광도)]×100
(3) NO(Nitric oxide) 생성량 측정
10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(100U/㎖)을 포함하는 DMEM 배지에 1×10 5 cells/㎖의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 시료를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양하고, LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 상등액 100㎕를 새로운 96-웰 플레이트에 옮기고 동일한 양의 그리스 시약(Griess reagent) 혼합액(Stock-I: 0.2% naphylendia HCl, Stock-II: 2% sulfanilamide in 5% H 3PO 4)를 첨가하여 15분 후, ELISA 마이크로플레이트 리더(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준품으로 질산나트륨(sodium nitrate)를 사용하였다.
(4) 염증성 사이토카인 분석
염증성 사이토카인 생성량을 측정하기 위하여, Raw 264.7 세포를 1×10 5 cells/㎖의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 2시간 동안 배양한 후, 각각의 시료를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 얻어진 상등액을 시료로 하였고 분석은 Quantikine ELISA 키트(R&D system, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정한 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 TNF-α, interleukin-1β(IL-1β) 및 interleukin-6(IL-6)의 생성량을 키트에 명시된 실험방법에 준하여 샌드위치-ELISA 방법으로 분석하였다.
(5) 통계처리
실험에서 얻은 결과는 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었으며, SPSS(Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원 변량분석(one way ANOVA)을 실시 한 후 Student's t-test로 분석하여 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였다.
3. 유산균의 동정
항염증 활성이 우수한 홍어김치 미생물 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108은 16S ribosomal DNA 유전자 서열 분석을 통하여 동정하였다. 선발 미생물의 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy 조직 키트(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA 유전자 증폭을 위하여 유니버설 프라이머; 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')(서열번호 1)와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 2) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응시 0.4mM dNTP, 0.5 유닛의 Taq 폴리머라아제, 4mM Mg 2+이 함유된 다카라 Perfect Premix(Takara, Japan) 10㎕에, DNA template(20㎍/㎖) 1㎕, 1.0μM 정방향 프라이머 및 1.0μM 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다.
PCR 증폭은 마스터사이클러 그래디언트(Mastercycler gradient)(Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension)을 30cycles 실시하였고, 72℃에서 5분 동안 최종 연장(extension)을 실시하였다. 증폭된 약 1400bp의 fragment를 T 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. T 벡터 시퀀싱 프라이머를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며,
그 결과는 BLAST 분석 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 ribosomal DNA 유전자 시퀀싱과 비교하여 동정하였다. 결정된 염기서열은 Clustal_W 및 BioEdit 프로그램으로 정렬하였고, 발생한 gap은 이후 분석과정에서 결여형질로 처리하였다. 염기서열 간의 유전적 거리 계산과 neighbor-joining, maximum-likelihood 및 parsimony 계통수의 제작은 Mega 프로그램을 사용하여 수행하였고 계통군의 지지도를 알아보기 위해 위의 세 가지 분석에 대해 각각 동일한 사양으로 bootstrap 분석하였다(1,000 replicates).
4. 페디오코쿠스 이노피나투스의 세포증식능력 분석
RAW 264.7 세포를 5×10 3 세포/웰의 조건으로 96웰 배양 플레이트에 분주하여 24시간 동안 안정화시켰다. 1㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS; Sigma) 및 10 4~10 7 CFU/㎖의 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus)를 각각 처리하여 24시간 배양한 후 MTS 어세이(Promega)를 이용하여 세포증식 변화를 분석하였다.
5. 페디오코쿠스 이노피나투스의 NO(Nitric oxide) 생성 분석
RAW 264.7 세포를 96웰 배양 플레이트에 5×10 3 세포/웰 조건으로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, LPS(1㎍/㎖) 및 10 5~10 7 CFU/㎖의 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus)를 각각 처리하였다. 24시간 배양 후 각각의 세포 배양액을 분리하여 그리스 시약 시스템(Promega)을 이용하여 NO 생성량 변화를 분석하였다.
6. 페디오코쿠스 이노피나투스의 ROS(Reactive oxygen species) 생성 분석
RAW 264.7 세포를 6웰 배양 플레이트에 1×10 5 세포/웰의 조건으로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, LPS(1㎍/㎖) 및 10 5~10 7 CFU/㎖의 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 세포를 CellRox Deep Red Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 염색한 후, 유세포 분석기를 이용하여 ROS 생성량 변화를 분석하였다.
7. Real Time-PCR을 이용한 유전자 발현 분석
RAW 264.7 세포를 6웰 배양 플레이트에 1×10 5 세포/웰의 조건으로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, LPS(1㎍/㎖) 및 10 5~10 7 CFU/㎖의 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 세포에 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출한 후 TaqMan Reverse Transcription Master Mix(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
β-actin, iNOS, interleukin(IL)-1β, IL-6, TNF-α(tumor necrosis factor alpha), COX-2(cyclooxygenase 2)의 프라이머는 TaqMan Gene Expression assay(Applied Biosystems)를 구매하였으며, 유전자들의 상대적 발현양은 ABI QuantStudio 6 Flex Real Time-PCR과 TaqMan PCR Master Mix를 이용하여 분석하였다. 각각 유전자의 상대적 발현양은 β-actin으로 정량화하여 ΔΔCt법으로 계산하였다.
8. 동물사육조건
중앙실험동물로부터 5주령 수컷 마우스(C57BL/6N, Japan SLC Inc.)를 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 상태의 마우스를 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다. 시험기간 중 실험동물은 폴리카보네이트(polycarbonate) 케이지(200×320×145mm, Three-shine Co., Daejon Korea)에 군당 3마리로 사육하였고, 사료는 마우스 전용사료 Harlan 2018S(Harlan TM, USA)를 자유 급이 하였다. 음수는 역삼투(Reverse osmosis; RO)수를 자외선으로 소독하여 자유 급이 하였다.
9. 면역증진 동물실험
동물실험은 NIH(National Institutes of Health)의 실험동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 실험하였으며, 한국한의학연구원의 동물실험 윤리 위원회의 승인을 받아 진행하였다(승인번호: 18-042). 실험군은 정상군(WT), 대조군(Con), 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) 투여군(WiKim0108)으로 나누어 실험하였으며, 시료투여는 10 8 CFU/100㎕의 농도로 마우스 존대를 이용하여 경구 투여하였다. 시료투여기간은 총 2주로 매일 투여하였으며, 2주째 마우스를 희생하여 면역증진 효과를 분석하였다.
10. 유세포 분석기를 이용한 면역세포의 개수 분석
각 실험군에서 비장조직을 적출한 후 1% FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 포함하는 DMEM 배지(Dulbeco's modified eagle's media; Gibco)에 보관하였다. 각 비장조직을 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지와 40μm cell strainer(Falcon)를 이용하여 세포를 추출한 후 1×10 6 세포 조건으로 5㎖ FACs 튜브(Falcon)에 분주하였다. 분주된 비장세포를 1% FBS를 포함한 PBS(Phosphate buffer saline)를 이용하여 2번 세척한 후 CD4-FITC, CD8-APC, CD45R/B220-FITC, NK1.1-APC, CD11c-FITC, CD11b-APC 항체를 각각 처리하여 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 1% FBS를 포함하는 PBS를 이용하여 2번 세척한 후 유세포 분석기를 이용하여 면역세포들의 개수 변화를 분석하였다.
11. 염증성 장질환 유도 동물실험
마우스에 염증성 장질환을 유도하기 위해 5%(w/v) 덱스트란 나트륨 황산염(Dextran sulfate sodium salt; DSS, MP Biomedicals) 음수를 제조하였다. 실험군은 정상군(WT), 대조군(Con), 양성 대조군(5-ASA), 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) 투여군(WiKim0108)으로 나누어 실험하였으며, 시료투여는 10 8 CFU/100㎕의 농도로 마우스 존대를 이용하여 경구 투여하였다. 시료투여 기간은 총 3주로 매일 투여하였으며, 시료투여 2주 후 정상군(WT)을 제외한 실험군에 5% DSS 음수를 6일 동안 자유 급이한 후 시료투여 3주째 마우스를 희생하여 염증성 장질환의 개선효과를 분석하였다.
12. 염증성 장질환의 대표 질환 지표 분석
5% DSS 음수를 자유 급이한 후 매일 각 실험군의 체중을 Sartorius Secura 2102-1S 저울을 이용하여 측정하였으며, DAI(Disease activity index) 변화를 기록하였다. DAI(대장염의 정도를 나타내는 질병 활동성 지표)는 표 1을 기준으로 점수를 부여한 후, 총 합으로 나타냈다. 마우스를 희생한 후 각 실험군의 대장조직을 적출하여 대장의 길이를 측정하여 분석하였다.
DAI(Disease activity index) 점수
Score Weight loss Stool consistency Visible blood in feces
0 No weight loss Normal No bleeding
1 1~5%
2 6~10% Loose Slight bleeding
3 11~15%
4 15% 이상 Diarrhea Gross bleeding
실시예 1. 항염증 활성이 우수한 유산균 선발
홍어 및 홍어김치로부터 분리한 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Weissella 속 유산균 100종을 대상으로 유산균 배양액의 항염증 활성을 측정한 결과, 항염증 활성이 우수한 10 균주를 1차 선발하였다. 선발한 유산균 10종을 대상으로 항염증 활성을 확인하기 위하여, Raw 264.7 세포 배양액 내의 NO 농도를 측정하였다. LPS(1㎍/㎖)를 이용하여 Raw 264.7 세포의 NO(nitric oxide) 생성에 대한 억제율을 확인한 결과, WiKim0108 균주의 NO 생성이 LPS 처리군 대비 90.2% 수준인 것을 확인하였다(도 1A).
또한, LPS 자극에 의하여 Raw 264.7 세포가 생산하는 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 분석하였다. NO 생성 억제에 관여하는 요인을 알아보기 위하여 종양괴사인자인 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성이 약간 감소하였고(도 1B), IL-1β 생성은 50.7pg/㎖로 측정되어 LPS만 처리한 군(68pg/㎖)과 비교하여 현저하게 억제하였다(도 1C). IL-6 생성도 669.7pg/㎖로 측정되었으며, LPS만 처리한 군(1211.1pg/㎖)보다 현저하게 감소하는 경향을 나타내었다(도 1D). 이러한 결과는 홍어 유래 유산균이 내재적 염증물질의 생산 억제능을 증대시킴으로써 항염증 작용에 큰 영향을 미치는 것으로 확인하였다.
동일한 방법으로 2차 반복 실험을 수행하여, WiKim0108 균주를 최종 선발하였고 MTS 어세이에 의하여 Raw 264.7 세포의 생존율을 확인한 결과, 대조군과 비교하여 130% 이상의 높은 생존율을 나타내었고, 생균 수에 따른 세포 생존율의 감소는 없었기 때문에 Raw 264.7 세포에 대하여 유의적인 독성반응을 보이지 않는 것으로 확인하였다(도 2).
이후, 상기 홍어로부터 분리한 항염증 활성이 우수한 균주 WiKim0108의 16S rRNA로 총 1359bp의 염기서열(서열번호 3)을 결정하였다.
상기 유산균의 동정 및 분류를 위하여, 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 홍어에서 분리한 신균주 WiKim0108은 Pediococcus inopinatus 표준 균주 BT와 97% 일치하는 것을 확인하였고, 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108( Pediococcus inopinatus WiKim0108)로 명명하였다. 또한, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2019년 3월 8일자로 기탁하여, 기탁번호 KACC 81091BP를 부여받았다.
실시예 2. 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus )의 세포독성 및 면역증진 효능 확인
페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 세포 독성 및 면역증진효과를 검증하기 위해 RAW 264.7 세포에서 세포증식 변화를 관찰하였다. 대조군과 비교하여 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 세포증식이 증가하였으며, LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 실험군과 비교하여 낮은 세포증식 증가를 확인하였다. 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 처리에 의해 RAW 264.7 세포의 세포증식이 억제되지 않음을 통해 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 세포독성은 없으며, 세포증식이 대조군보다 증가하고 LPS를 처리한 염증군보다 낮음을 통해 면역증진 효능이 있음을 확인하였다(도 3).
실시예 3. NO 및 ROS 생성량 변화 확인
NO 생성량 변화를 확인한 결과 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 처리한 실험군에서 대조군과 비교하여 NO의 생성량이 증가하였으며, NO 생성과 관련이 있는 iNOS의 유전자 발현도 증가한 것을 확인하였다.
또한, ROS의 생성량 변화를 확인한 결과, 대조군과 비교하여 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 처리한 실험군에서 ROS의 생성량이 증가하였다. NO 및 ROS 생성량이 대조군보다 증가하고 LPS를 처리한 염증군 보다는 낮음을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 사이토카인들(IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2)의 유전자 발현 변화 확인
페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 면역증진 효능을 확인하기 위해 면역세포의 활성에 의해 발현되는 사이토카인들(IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2)의 유전자 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 처리한 실험군에서 사이토카인들의 유전자 발현이 증가하였으며, LPS를 처리한 염증군과 비교하여 낮은 유전자 발현 증가를 확인하였다(도 5).
실시예 5 동물모델에서 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus )의 면역증진 효능 확인
동물모델에서 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 면역증진 효능을 확인하기 위해 C57BL/6N 마우스에 2주 동안 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 경구 투여한 후, 마우스를 희생하였다. 투여기간 동안 마우스의 체중변화 및 육안적 이상 징후가 관찰되지 않았으며, 이를 통해 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 독성이 없다는 것을 알 수 있었다. 비장조직으로부터 세포를 분리한 후 유세포 분석기를 이용하여 면역세포들(T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 수지상 세포)의 개수를 확인한 결과, 정상군 및 대조군과 비교하여 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 투여한 실험군에서 CD4 + T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지상 세포의 개수가 증가한 것을 확인하였다. 또한, 비장조직에서 사이토카인들(IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2)의 유전자 발현 변화를 분석한 결과, 정상군 및 대조군과 비교하여 사이토카인들의 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 6).
실시예 6. 동물모델에서 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus )의 염증성 장질환 개선효과 확인
동물모델에서 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)의 염증성 장질환 개선효과를 확인하기 위해 C57BL/6N 마우스에 총 3주 동안 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 경구 투여하였으며, 투여기간 2주째 5% DSS 음수를 6일 동안 자유 급이 하여 염증성 장질환을 유도한 후 마우스를 희생하였다. 염증성 장질환 동물모델에서 마우스 체중 및 DAI의 변화를 관찰한 결과, 정상군과 비교하여 대조군, 양성대조군, 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 투여한 실험군의 체중감소 및 DAI가 증가된 것을 확인하였다. 마우스로부터 분리한 대장조직의 길이 변화를 관찰한 결과, 정상군과 비교하여 대조군 및 양성대조군, 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 투여한 실험군의 대장의 길이가 감소하였으며, 대조군과 비교하여 양성대조군, 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 투여한 실험군에서 대장 길이 감소가 완화됨을 확인하였다(도 7).
마우스로부터 비장조직을 적출하여 세포를 분리한 후 유세포 분석기를 이용하여 면역세포들(T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 수지상세포)의 개수 변화를 확인한 결과, 정상군과 비교하여 대조군의 면역세포들의 개수가 감소하였으며, 대조군과 비교하여 양성대조군, 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus)를 투여한 실험군에서 면역세포들의 개수 감소가 완화된 것을 관찰하였다(도 8).
[수탁번호]
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81091BP
수탁일자 : 20190308
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Claims (9)

  1. 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 활성을 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주는 홍어 또는 홍어김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유효성분은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병 또는 베체트병인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역기능 조절 및 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
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