KR101617141B1 - 항비만 활성을 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리된 항비만 활성이 우수한 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) 균주는 약학적 조성물, 식품 조성물, 항비만제, 사료첨가제 및 식품첨가제 등에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항비만 활성을 갖는 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 김치로부터 분리한 항비만 활성 유산균에 관한 것이다.
비만은 단순히 외모상의 문제뿐만 아니라 당뇨병, 고혈압, 심혈관계 질환, 뇌혈관계 질환, 관절염, 담낭 질환, 유방암 및 대장암 등의 합병증을 유발할 수 있는 심각한 질병으로 보고되어 있다. 식생활의 서구화 및 교통수단의 발달로 신체적 활동량이 저하되어 비만이 증가되면서 이를 억제하기 위한 많은 연구가 행해지고 있다.
비만 억제와 관련한 김치 연구는 적은 편인데, 비특허문헌 1은 흰 쥐에 사료 섭취량의 1%, 5%, 10% 배추 김치즙을 4주 동안 경구투여용 기구 (oral zonde)를 사용하여 섭취시킨 결과 5% 체중감량 효과를 보고하였으며, 비특허문헌 2는 동결건조된 김치 분말을 함유한 "김치 생체 조성물 (kimchi biogenic formula)"을 제조하여 흰 쥐에 섭취시켰을 때 17% 피하지방량 감소와 21% 혈장 중성지방농도 저하효과를 보고하였다. 비특허문헌 3은 김치보충제를 BMI 25이상인 비만여중생에게 6주간 섭취 시켰을 때 8% 체지방 감소효과를 보였다고 보고하였다. 또한 특허문헌 1은 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 갖는, 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주에 대해 기재하고 있다.
비특허문헌 1: Sheo, HJ, Seo, YS : The effect of dietary Chinese cabbage kimchi juice on the lipid metabolism and body weight gain in rats fed high-caloreis-diet. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 33(1), 91-100, 2004
비특허문헌 2: Kong, YH: Effects of kimchi biogenic formula on obesity control in rats fed high fat diet. Master's Thesis, Pusan National University, 2003
비특허문헌 3: Baek, YH, Kwak, JR, Kim, SJ, Han, SS, Song YO. Effects of kimchi supplementation and/or exercise training on body composition and plasma lipids in obese middle school girls. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 30(5), 906-912, 2001
본 발명은 김치로부터 분리된, 항비만 활성을 갖는 균주를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 조성물, 항비만제, 항비만용 음료 및 항비만용 건강기능식품을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) 균주를 제공한다.
상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 중에서 선택되는 1종 이상의 균주를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 항비만 활성이 우수하여 항비만용 약학 조성물, 식품 조성물 또는 기능성 식품, 사료첨가제, 식품첨가제 등 다양한 분야에 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 균주는 김치로부터 분리된 것으로서 김치의 다양한 활용이 증가될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 분리된, 4종의 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus)의 중성지방 함량 감소량(intracellular TG contents)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 분리된 2종의 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus)의 Oil red O 염색법을 이용한 지방 축적도(Lipid accumulation)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 분리된 2종의 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus)의 Oil red O 염색법을 이용한 지방 축적도(Lipid accumulation)를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 김치로부터 항비만 활성이 우수한 균주를 찾고자 연구를 거듭하던 중 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) 균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예>
1. 김치로부터 균주의 분리
6개 도(경상, 충청, 경기, 강원, 제주, 전라)에서 배추김치 29종을 수집하였고, 각각의 유산균을 분리하여 동정된 총 81종의 콜로니를 선발하였다.
2. 김치로부터 분리한 균주 추출물 준비
김치로부터 분리한 균주를 MRS 배지에서 30 ℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균체를 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 PBS(Phosphate buffered saline) 용액으로 헹궈서 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 균체를 1×109 CFU/ml의 농도로 재현탁(resuspension)한 후 FastPrep-24® sample preparation system (MP Biomedicals, CA, USA)를 이용하여 균체를 용해(lysis)하였다. 이를 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 추출하여 실험에 사용하였다.
3. 3T3-L1 전지방세포주 준비(배양 및 분화유도)
3T3-L1 세포는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)로서 지방 조직의 생물학적 연구에 많이 사용되는 세포 주이다. 3T3-L1 세포의 지방분화를 억제하는 물질은 항비만 효능을 가진다고 볼 수 있기 때문에 식품, 의약 등의 분야에서 활용도가 매우 크다.
3T3-L1 전지방세포주를 10% CS (Calf Serum)와 100 unit/㎖의 페니실린과 100 ng/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM (Dulbeeco's Modified Eagle Medium, Gibco) 배양액을 사용하여 37 ℃에서 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 이때 배지를 교환할 때마다 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하였고, 신선한 10% CS 배지를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환하였다. 세포가 단일층으로 플라스크 바닥에 80% 정도 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하여, 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) 용액을 첨가한 뒤 원심분리하였다. 이들 세포를 6-well plate에 2 ×105 cells을 균등하게 분주하였으며, 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 100 unit/㎖의 페니실린과 100 ng/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM (Dulbeeco's Modified Eagle Medium, Gibco) 배양액을 사용하였다. 100% confluent stage 2일 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액에 adipogenic cocktail인 덱사메타손(Dexamethasone) 0.05 μM, IBMX 0.25 mM, 인슐린 2 ㎍/㎖이 함유된 배양액으로 교환하여 3일의 분화를 유도하였다. 3일 후 배양액 교환시 5 ㎍/㎖ 인슐린만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액으로 3일간 처리하였고, 마지막 3일간은 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액을 사용하였다.
4. 김치 유래 균주 추출물의 처리에 따른 중성지방량 측정 (AdipoRed assay)
김치 유래 균주의 추출물이 3T3-L1 지방세포의 분화과정에 미치는 영향을 알아보기 위해 AdipoRed assay를 이용하여 세포 내 중성지방을 측정하였다. 100% confluent stage 2일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, 인슐린 첨가 배양액, FBS 배양액 교환시, 균주 추출액 5.0×106 CFU/㎕의 농도로 처리하여 배양한 후, 1 ㎖의 PBS로 세포표면을 세척한 다음 1 ㎖의 PBS에 30 ㎕의 AdiopoRed assay 시약 (Lonza, Walkersville, MD, USA)을 처리하였다. 상온에서 10분간 반응시킨 후, excitation 485 nm와 emission 572 nm에서 형광세기를 측정하였다.
5. 김치 원료 에탄올 추출물 및 김치 유래 균주 추출물의 처리농도에 따른 지방축적 정도 측정 (Oil Red O staining)
김치 원료 에탄올 추출물 및 김치 유래 균주 추출물이 지방분화과정에서 지방축적 정도에 미치는 효과를 알아보기 위해 Negrel과 Dani의 방법에 따라 Oil Red O 염색을 실시하였다. 100% confluent stage 2일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, 인슐린 첨가 배양액, FBS 배양액 교환시, 균주 추출액 5.0×106 CFU/㎕, 1.0×107 CFU/㎕, 5.0×107 CFU/㎕로 처리하였으며, 9일의 분화 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 10% 포름알데히드로 10분간 고정시켰다. 10% 포름알데히드를 제거하고 다시 포화된 포름알데히드를 넣어 1시간 이상 세포를 고정시켰다. 그 후 60% 이소프로판올을 넣고 바로 제거한 후 증류수로 세척하고 Oil red O 염색용액으로 30분간 지방구를 염색한 후 증류수로 세척하였다. 염색된 지방구의 세포내 지방축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안적으로 김치 원료 에탄올 추출물 및 김치 유래 균주 추출물이 지방분화시 지방축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 축적된 지방 확인을 위해 잘 건조된 상태에서 이소프로판올을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 multi-plate reader를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 이소프로판올을 blank로 사용하였다.
<실험예>
1. 3T3-L1 세포의 지방분화 억제 효능을 갖는 균주 확인
대부분의 지방구는 중성지방(TG)과 페릴리핀 A(perilipin A)와 같은 단백질로 구성되어 있다. 김치로부터 분리한 81종의 균주를 AdipoRed assay를 통해 세포 내에 함유되어 있는 지방구의 주성분인 중성지방 함량을 측정하였다.
3T3-L1 전지방세포가 지방세포로 분화됨에 있어 김치로부터 분리한 균주 81종을 5.0×106 CFU/㎕의 농도로 처리하여 분화를 유도한 후 중성지방 함량을 측정한 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)에서 중성지방 함량 감소효과를 확인하였으며, 특히 종래 항비만 효능이 있다고 알려지지 않은 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) 4종에서 중성지방 함량 감소효과를 확인하였다.
4종의 P. inopinatus의 경우, 대조군에 비해 P. inopinatus 1에서 86.8%, P. inopinatus 2에서 80.5%, P. inopinatus 3에서 87.4%, P. inopinatus 4에서 79.0%를 나타내어 유의적인 감소 경향을 보여주었다. 또한 종래 항비만 활성을 가졌다고 알려진 Lb. rhamnosus GG에 비해 P. inopinatus 2 및 P. inopinatus 4에서 유의적인 감소 경향을 나타내었다 (도1).
본 발명자들은 상기 4종의 균주 중 P. inopinatus 2 및 P. inopinatus 4의 2종을 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 2015년 2월 12일자로 기탁하였다.
| 콜로니 | 균주 명 | 기탁번호 |
| P. inopinatus 2 | 페디오코쿠스 이노피나투스 WIKIM25 | KFCC11609P |
| P. inopinatus 4 | 페디오코쿠스 이노피나투스 WIKIM27 | KFCC11610P |
2.
Pediococcus inopinatus
균주가 지방세포의 지질축적 정도에 미치는 영향 분석
특히 Lb. rhamnosus GG에 비해 유의적인 감소 경향을 나타낸 P. inopinatus 2 및 P. inopinatus 4의 추출물이 3T3-L1 전지방 세포가 지방세포로 분화됨에 있어 지질 축적 정도에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Oil red O 염색법을 실시하였다. 2종의 균주 추출액을 5.0×106 CFU/㎕, 1.0×107 CFU/㎕, 5.0×107 CFU/㎕로 농도로 처리하여 분화를 유도한 후 Oil red O 염색법을 이용하여 지방 축적 정도를 측정한 결과, 분화하지 않은 군에서는 분화된 대조군에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, 각각의 균주에 따라 다른 지방 축적 정도를 보였다 (P. inopinatus 2; 5.0×106 CFU/㎕ 92.0%, 1.0×107 CFU/㎕ 94.0%, 5.0×107 CFU/㎕ 91.1%, P. inopinatus 4; 5.0×106 CFU/㎕ 86.0%, 1.0×107 CFU/㎕ 80.8%, 5.0×107 CFU/㎕ 76.4%). P. inopinatus 2의 경우, 대조군에 비해 5.0×107 CFU/㎕의 농도에서만 유의적인 감소 경향을 보였으며, P. inopinatus 4의 경우, 모든 농도에서 대조군에 비해 유의적인 감소 경향을 보여 P. inopinatus 4의 지질 축적 감소 효능이 더 우수함을 확인할 수 있었다 (도2).
본 발명의 항비만 활성을 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) 균주는 약학적 조성물, 식품 조성물, 항비만제, 사료첨가제 및 식품첨가제 등에 사용될 수 있다.
또한 상기 조성물 등은 항비만 활성을 더욱 증가하기 위해 상기 균주와, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 중에서 선택되는 1종 이상의 균주를 더 포함할 수 있다.
Claims (9)
- 항비만 활성을 갖는 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) WIKIM25(기탁번호: KFCC11609P) 또는 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) WIKIM27(기탁번호: KFCC11610P) 균주.
- 제1항에 있어서, 김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) WIKIM25(기탁번호: KFCC11609P) 또는 페디오코쿠스 이노피나투스 (Pediococcus inopinatus) WIKIM27(기탁번호: KFCC11610P) 균주.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 중에서 선택되는 1종 이상의 균주를 더 포함하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 항비만용 식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 항비만용 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 항비만제.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 항비만용 음료.
- 제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 함유하는 항비만용 건강기능식품.
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2015
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