WO2021015514A1 - 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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strain
fatty liver
liver disease
enterococcus lactis
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PCT/KR2020/009531
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채성욱
이주영
홍성욱
노성운
이호재
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한국 한의학 연구원
한국식품연구원
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating fatty liver disease, comprising Enterococcus lactis as an active ingredient.
  • liver disease in Korea is very high at 23.5 per 100,000 people, and is the number one cause of death in their 40s (41.1 people/10,000 people), the second cause of death in their 50s (72.4 people/10 million), and the third cause of death in their 30s.
  • Liver disease, accounting for (10/10,000) is a major cause of death in the middle-aged Korean population.
  • fatty liver refers to a phenomenon in which triglycerides, which are not present in normal cells, are abnormally excessively deposited in liver cells. About 5% of normal liver is composed of adipose tissue, and triglycerides, fatty acids, phospholipids, cholesterol and cholesterol esters are the main components of fat, but once fatty liver occurs, most of the components are replaced by triglycerides and the amount of triglycerides is reduced. Fatty liver is diagnosed if it is more than 5% of the weight of the liver.
  • the fatty liver deteriorates and the fat mass in the hepatocyte becomes large, the important components of the cells including the nucleus are pushed to one side and the function of the hepatocyte decreases, and the expanded hepatocytes due to the accumulated fat in the cells press the microvessels and lymph glands between the hepatocytes. Thus, the circulation of blood and lymph fluid in the liver is impaired. In this case, the liver cells cannot properly receive oxygen and nutrients, and liver function is degraded.
  • Non-alcoholic fatty liver disease is defined as a case where fatty acids accumulate more than 5% in the parenchymal cells of the liver in the form of triglycerides, not liver damage caused by alcohol. Pathologically, it is classified into simple steatosis and steatohepatitis with inflammation. If left untreated for a long time, it can lead to serious liver diseases such as hepatitis, liver fibrosis, and cirrhosis. In Korea, the incidence of non-alcoholic liver disease is also increasing due to lifestyle changes.
  • alcoholic fatty liver occurs due to excessive drinking. Although there is a difference according to genetic characteristics and sex for each individual, liver disease such as alcoholic fatty liver is likely to occur when ingesting more than 80 g of alcohol per day. Women are more likely to develop alcoholic liver disease even in smaller doses. In general, it can be calculated that about 10g of alcohol is contained in 1 soju, 1 beer, 1 Western liquor, and 1 hop of makgeolli. Most of the symptoms are asymptomatic in patients with alcoholic fatty liver, which is the mildest form, but mild tenderness in the right upper abdomen can be complained of when mild hepatic hypertrophy (the liver is larger than normal).
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention provides a composition for the prevention, improvement or treatment of fatty liver disease comprising Enterococcus lactis as an active ingredient, wherein the Enterococcus lactis is a liver cancer cell line
  • Enterococcus lactis is a liver cancer cell line
  • There is no cytotoxicity in (HepG 2 ) effectively reduces the accumulation of triglycerides, lowers ALT levels, reduces liver weight, and expresses genes related to fat metabolism in animal models in which fatty liver is induced through a high fat diet.
  • the present invention is enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture It provides a health functional food composition for preventing or improving fatty liver disease comprising at least one selected as an active ingredient.
  • the present invention enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver disease comprising as an active ingredient.
  • enterococcus lactis Enterococcus lactis
  • WiKim0107 strain accession number: KACC 81090BP
  • the culture of the strain the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It provides a feed additive for preventing or improving fatty liver disease, including as an active ingredient.
  • the present invention enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It provides a veterinary composition for preventing or treating fatty liver disease in animals other than humans, including as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of fatty liver disease comprising Enterococcus lactis as an active ingredient, wherein Enterococcus lactis has no cytotoxicity in liver cancer cell line (HepG 2 ), It is effective in reducing accumulation, lowering ALT levels in animal models in which fatty liver is induced through a high-fat diet, reducing liver weight, and reducing the expression level of genes related to fat metabolism in the liver.
  • Enterococcus lactis has no cytotoxicity in liver cancer cell line (HepG 2 )
  • Figure 2 shows the Enterococcus strain ITS gene band pattern.
  • N is a normal cell without any treatment.
  • FIG. 4 is a result of confirming lipid accumulation after treatment of 1.0 mM free fatty acid (FFA) and WiKim0107 strain in which oleate and palmidate were mixed in a concentration ratio of 2:1 in a liver cancer cell line (HepG 2 ).
  • ### is a statistically significant increase in fat accumulation in the group (FFA) treated with oleate and palmitate mixture (2:1) free fatty acid compared to the normal group (N), p ⁇ 0.001, *** Compared to the group treated with silver oleate and palmitate (2:1) free fatty acid (FFA), fat accumulation in the group treated with the Enterococcus lactis strain of the present invention (WiKim0107) was statistically significantly reduced. That is, p ⁇ 0.001.
  • ## indicates that the liver weight of the high-fat diet group (Veh) was statistically significantly increased compared to the normal group (N), and ## was p ⁇ 0.01. ** indicates that the liver weight of the positive control group and the group administered with Enterococcus lactis strain (WiKim0107) were statistically significantly decreased compared to the high fat diet group (Veh), p ⁇ 0.01.
  • Figure 8 is a liver tissue PLIN2 (Perilipin 2), PPAR ⁇ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), lipid droplets related cell death-inducing DFFA-like effector C (CIDEC), CD36 (cluster of differentiation 36) involved in fatty acid absorption This is the result of confirming the relative mRNA expression level of. ### indicates that the gene expression levels of PLIN2, PPAR ⁇ , CIDEC, and CD36 in the high fat diet group (Veh) were statistically significantly increased compared to the normal group (N), p ⁇ 0.001.
  • the present invention is Enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and at least one selected from the extract of the culture as an active ingredient It relates to a health functional food composition for preventing or improving fatty liver disease comprising as.
  • the Enterococcus lactis WiKim0107 strain is preferably isolated from skateboard or skate kimchi, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent of the extract of the culture of the Enterococcus lactis WiKim0107 strain is preferably water, a lower alcohol of C 1 to C 4 , or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • the fatty liver disease is non-alcoholic or alcoholic simple fatty liver; Non-alcoholic or alcoholic steatohepatitis; And non-alcoholic or alcoholic cirrhosis, but is not limited thereto.
  • the active ingredient is characterized by reducing the content of triglycerides in liver tissue, but is not limited thereto.
  • the active ingredient is preferably prepared in any one formulation selected from powder, granule, pill, tablet, capsule, candy, syrup, and beverage, but is not limited thereto.
  • the strain or a culture solution thereof may be added as it is, or may be used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. have.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the health functional food composition of the present invention may further include ingredients that are commonly added at the time of food production and are food wise acceptable.
  • ingredients that are commonly added at the time of food production and are food wise acceptable For example, when prepared as a beverage, it may further include one or more components from citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, etc. in addition to the strain of the present invention.
  • the amount that can be included as an active ingredient of the health functional food composition according to the present invention may be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, and symptoms of the disease of a person who wants a functional food for preventing or improving fatty liver disease It is recommended to contain about 0.01 to 10.0g per day for adults, and by ingesting foods having such a content, the effect of preventing or improving fatty liver disease can be obtained.
  • the present invention enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver disease comprising as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further include at least one selected from suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention are formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be used.
  • Carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Various compounds or mixtures including calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, in the strain or the endoplasmic reticulum derived from the strain. , Sucrose (sucrose) or lactose (lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, and the term'pharmaceutically effective amount' of the present invention is sufficient to prevent or treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical prevention or treatment. It means an amount, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion, treatment The duration, factors including drugs used in combination or co-use with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or divided into several doses.
  • the above dosage does not in any way limit the scope of the present invention.
  • the term "individual" of the present invention includes, without limitation, mammals including mice, livestock, humans, etc. that are likely to develop fatty liver disease.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered through a route such as oral administration or rectal administration, and in some cases, may be administered by other routes depending on the purpose.
  • the oral composition should be coated with an active agent or formulated to protect it from degradation in the stomach.
  • the composition can be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell.
  • the present invention enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It relates to a feed additive for preventing or improving fatty liver disease containing as an active ingredient.
  • the feed additive of the present invention corresponds to an auxiliary feed in the feed management method.
  • the term'feed' may mean any natural or artificial diet, one meal meal, etc., or a component of the one meal meal for animals to eat, ingest, and digest.
  • the kind of feed is not particularly limited, and feeds commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meals or grain by-products; Animal feeds such as proteins, inorganic logistics, oils and fats, minerals, oils and fats, single-cell proteins, zooplanktons or foods. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the present invention enterococcus lactis ( Enterococcus lactis ) WiKim0107 strain (accession number: KACC 81090BP), the culture of the strain, the concentrate of the culture, at least one selected from the dried product of the culture and the extract of the culture It relates to a veterinary composition for preventing or treating fatty liver disease in animals other than humans, including as an active ingredient.
  • liver cancer cell line (HepG 2 )
  • the liver cancer cell line (HepG 2 ) was purchased and used from ATCC (American Type Culture Collection).
  • the liver cancer cell line (HepG 2 ) was cultured in DMEM-F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium containing 10% FBS and 1% penicillin-striptomycin.
  • the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37°C, and the cultured cells were tested by dispensing a constant number of cells (1 ⁇ 10 5 cells/500 ⁇ l well) into a 24-well plate. After dispensing the cells in a 24-well plate, the cells were completely attached to the 24-well plate to form a cell shape, and the cells were used when they reached 75% confluence.
  • the 100mM palmitate and 100mM oleate stock solutions prepared in (1) above were 165 ⁇ l (1.65mM) of palmitate and 330 ⁇ l (3.3mM) of oleate, and 9,505 ⁇ l of 5% ( w/v) BSA solution was shaken while dropping and mixing (vortexing). Thereafter, it was cooled to room temperature, and then filtered through a 0.2 ⁇ m filter (the prepared mixed solution is stable even if stored at -20°C for 3 to 4 weeks).
  • the new strain used in the present invention takes skate (10 g) purchased from the Skate Farming Association in Youngsanpo, Naju, Jeollanam-do, diluted with sterilized physiological saline, spread on a solid medium for separating MRS lactic acid bacteria, and incubated at 30° C. for 48 hours. Different microorganisms were separated and used according to the shape of. The isolated microorganisms were cultured at 30° C. for 48 hours in minimal nutrient medium (1% glucose, 0.5% yeast extract).
  • the skate microorganism WiKim0107 was identified through 16S ribosomal DNA gene sequence analysis. After taking the cells of the selected microorganism and washing the cells twice in sterilized physiological saline, DNA was extracted using a DNeasy tissue kit (Qiagen, Valecia, CA, USA). Universal primer for amplifying the 16S ribosomal DNA gene of the extracted DNA; 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') (SEQ ID NO: 1) and 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') (SEQ ID NO: 2) primers were used.
  • PCR reaction in 10 ⁇ l of Takara Perfect Premix (Takara, Japan) containing 0.4mM dNTP, 0.5 unit of Taq polymerase, 4mM Mg 2+ , 1 ⁇ l of DNA template (20 ⁇ g/ml), 1.0 ⁇ M forward primer 1.0 ⁇ M reverse primer was added to each 1 ⁇ l, and distilled water was added to the remainder to give a total volume of 20 ⁇ l.
  • PCR amplification was performed with a Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). The PCR reaction was performed at 95°C for 5 minutes (initial denaturation), 94°C for 45 seconds (denaturation), 52°C for 45 seconds (annealing), 72°C for 1 minute (extension), 30 cycles, and 72°C for 5 minutes. The final extension was carried out for minutes.
  • the amplified fragment of about 1400bp was transformed after binding to a T vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  • the new strain WiKim0107 was 97% consistent with the Enterococcus lactis standard strain BT (SEQ ID NO: 3). Thereafter, the new strain was named Enterococcus lactis WiKim0107.
  • the enterovirus nose Syracuse lactis (Enterococcus lactis) Enterobacter received pre-sale of the selected strains selected as WiKim0107 strain from Enterobacter nose Syracuse passive help (Enterococcus faecium) KACC11954 and Biological Resource Center (KCTC) received pre-sale from the National Academy of Agricultural Sciences microbial Bank (KACC) It was compared with the Enterococcus lactis KCTC21015 strain.
  • API 50CHL kit was used to measure the sugar availability of two types of lactic acid and standard strains of the present invention. Each lactic acid strain was inoculated on MRS agar, cultured at 30° C. for 24 hours, and activated. A single colony was collected using a disposable platinum ear, put in 10 ml of 0.85% saline, shaken vigorously, and adjusted to the same turbidity as McFarland Standard 0.5. Thereafter, 1 ml of a solution adjusted to the level of turbidity of 0.5 was added to the API 50CHL medium, mixed, dispensed into strips, and cultured at 30° C. for 48 hours to confirm sugar availability.
  • API 50 CHL kit is used to check whether the 49 kinds of carbohydrates in the strip are fermented. During the incubation period, fermented carbohydrates produce acid and contain a pH indicator, so positive (yellow) and negative (blue) color changes. This is how to read.
  • Enterococcus lactis WiKim0107 is L-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose. ), mannitol, ⁇ methyl-D-mannoside, N-acetyl glucosamine, amygdaline, arbutine, esculine , Salicin (cellobiose), maltose (maltose), lactose (lactose), melibiose (melibiose), saccharose (saccharose), trehalose (trehalose), D-raffinose (D-raffinose), ⁇ -It was confirmed that the sugar of ⁇ -gentiobiose was used, and Enterococcus lactis KCTC21015 was L-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose,
  • Enterococcus faecium KACC11954 is L-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose. ), mannitol, N-acetyl glucosamine, arbutine, esculine, salicin, cellobiose, maltose, lactose ), saccharose, trehalose, and ⁇ -gentiobiose.
  • DNeasy blood & tissue kit (Qiagen, Valecia, CA, USA) was used in this experiment, and the experiment method is as follows.
  • the culture solution of the lactic acid strain was centrifuged (13,000-15,000g, 10 minutes, 4°C) to collect the pellets to remove the supernatant, and then 600 ⁇ l of a nuclear lysis solution was added and resuspended. After incubation at 80° C. for 5 minutes, 3 ⁇ l of RNase solution was added, and the mixture was shaken by turning upside down. After incubation at 37° C. for 1 hour, 200 ⁇ l of a protein precipitation solution was added, and then shaken vigorously and left on ice for 5 minutes.
  • the DNA was washed with 70% ethanol left at room temperature. After dissolving the DNA with 100 ⁇ l sterile water, it was stored at 4°C.
  • the reported primer set was used to amplify the 16S/23S rRNA ITS (intergenic spacer) region from DNA extracted from each strain (Table 1).
  • DNA template 20 ⁇ g/ml
  • PCR amplification was performed with a Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany).
  • the PCR reaction was 30 cycles at 94°C for 5 minutes (initial denaturation), 94°C for 1 minute (denaturation), 55°C for 2 minutes (annealing), 72°C for 2 minutes (extension), and 7 Final extension was performed for a minute.
  • the PCR product was subjected to high-resolution capillary electrophoresis using the QIAxcel advanced system (Qiagen, Valecia, CA, USA) equipment.
  • ITS intergenic spacer
  • Enterococcus lactis and Enterococcus faecium strains had similarly all three ribosomal RNA operons at about 900bp, 500bp, and 410bp.
  • Enterococcus lactis WiKim0107 and Enterococcus lactis KCTC21015 a single ribosomal RNA operon of about 1,200 bp, 750 bp, 460 bp, 400 bp, and 320 bp was further identified, but the Enterococcus faecium strain was No band appeared (Fig. 2).
  • Enterococcus lactis differs from Enterococcus faecium, a closely related species showing homology in the 16S rRNA gene sequence, and thus is isolated from the present invention.
  • One strain was identified as Enterococcus lactis WiKim0107.
  • the former Enterococcus lactis WiKim0107 was deposited with the Agricultural Genetic Resource Center of the National Academy of Agricultural Sciences on March 8, 2019, and was given the deposit number KACC 81090BP.
  • the cultured HepG 2 cells were diluted by concentration for 24 hours and treated, and MTS assay (CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3) -carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co.Madison, WI, USA) to determine cell viability at 490nm by microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) It was measured as.
  • MTS assay CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3) -carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co.Madison, WI, USA
  • the cell survival rate (%) when the WiKim0107 strain of the present invention was treated was approximately similar to that of the normal group (N). Therefore, it was found that the WiKim0107 strain of the present invention had little cytotoxicity.
  • liver cancer cell line HepG 2
  • the increased lipid accumulation was reduced by the treatment of the WiKim0107 strain by treating the prepared 1 mM oleate and palmitate mixture (2:1) free fatty acid.
  • mice Six-week-old male C57BL/6J mice were purified, followed by ingestion of a 60 kcal% fat diet (D12492, Research Diet, Inc) to induce non-alcoholic fatty liver. When the average body weight reached 28 ⁇ 29g, the WiKim0107 strain was administered orally for 10 weeks (1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 9 CFU/mice/day), and the body weight was measured weekly, and as a positive control, milk thistle (MT, 100mg/kg/day) was administered.
  • MT milk thistle
  • Example 4 the content of glucose in blood (serum) collected from the animal model and the content of ALT and AST, which are indicators of liver function, were measured by cardiac puncture.
  • the content of ALT, AST or glucose in the blood of the high fat diet group (Veh) compared to the normal group (N) was statistically significantly increased, and the positive control group and the high fat diet group (Veh) compared to The ALT content in the blood of the Enterococcus lactis strain (WiKim0107) administration group was statistically significantly reduced.
  • Example 5 After Example 5, the experimental animals were sacrificed and the weight and morphological changes were confirmed after liver tissue extraction.
  • the liver weight of the high fat diet group (HFD) was increased compared to the normal group, and in contrast, the liver weight of the WiKim0107 strain administration group and the milk thistle administration group (MT) of the present invention was increased. It was confirmed that there was a statistically significant decrease.
  • the morphological change of the liver was confirmed as disclosed in FIG. 7(B), and the liver of the high fat diet group (Veh) became enlarged compared to the normal group (N), and the enterococcus strain administration group of the present invention compared to the high fat diet group It was confirmed that the liver morphology of (WiKim0107) was similar to that of the normal group.
  • ABSI Taqman probe
  • PLIN2 Perilipin 2
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator
  • CIDEC lipid droplets-related cell death-inducing DFFA-like effector C
  • CD36 cluster of differentiation 36 involved in fatty acid absorption were identified.
  • the gene expression levels of PLIN2, PPAR ⁇ , CIDEC and CD36 in the high fat diet group (Veh) compared to the normal group (N) were statistically significantly increased, and positive compared to the high fat diet group (Veh).
  • the gene expression levels of PLIN2, PPAR ⁇ , CIDEC, and CD36 of the control group and the Enterococcus lactis strain (WiKim0107) administration group were statistically significantly decreased.

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Abstract

본 발명은 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 엔테로코쿠스 락티스는 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 간암 세포주(HepG 2)에서 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키며, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있어 본 발명의 조성물은 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 수의학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
국내 간질환 사망률은 인구 십만명 당 23.5명으로 매우 높으며, 40대 사망원인 1위(41.1명/10만 명), 50대 사망원인 2위(72.4명/10만 명), 30대 사망원인 3위(10명/10만 명)를 차지하는 등 간질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다.
상기 간질환 중에서 지방간은 정상세포 내에는 존재하지 않는 중성지방이 간 세포 내에 비정상적으로 과도하게 침착되는 현상이 나타난 것을 말한다. 정상 간은 약 5%가 지방조직으로 구성되어 있으며 중성지방, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터가 지방의 주요 성분이나, 일단 지방간이 발생하면 대부분의 성분이 중성지방으로 대체되며 중성지방의 양이 간 중량의 5% 이상이면 지방간으로 진단된다. 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포 내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세 혈관과 임파선을 압박하여 간 내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하되는 것이다.
비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 알코올에 의한 간 손상이 아니라, 지방산이 중성지방의 형태로 간의 실질세포 내에 5% 이상 축적된 경우로 정의한다. 병리학적으로는 단순 지방간(simple steatosis)과 염증을 동반한 지방간염(steatohepatitis)으로 분류되는데, 장기간 방치 시, 간염, 간 섬유, 간경변 등의 심각한 간 질환으로 이행될 수 있다. 국내에서도 생활양식의 변화로 인해 비알코올성 간질환 발생빈도가 증가하는 추세이다.
또한, 알콜성 지방간은 과다한 음주로 인해 발생하는데, 개인별로 유전적인 특징, 성별에 따라 차이가 있지만, 하루 80g 이상의 알코올의 섭취를 하는 경우 알콜성 지방간과 같은 간질환이 발생할 가능성이 크다. 여성의 경우 이보다 적은 양으로도 알코올성 간질환이 발생할 가능성이 커진다. 일반적으로 소주 1잔, 맥주 1잔, 양주 1잔, 막걸리 1홉에 약 10g의 알코올이 포함된 것으로 계산할 수 있다. 증상으로는 가장 경미한 형태인 알코올성 지방간 환자들의 경우 대부분 무증상이지만, 경미한 간비대(간이 정상보다 크게 된 상태)가 나타난 경우 오른쪽 상복부에 가벼운 압통을 호소할 수 있다.
한편, 유산균 관련 기술로는 한국등록특허 제1889281호에 다양한 기능성을 가지 신규 유산균 및 이의 용도가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1426275호에 지방합성 억제 및 지방산화 촉진에 의한 체지방 감소 효능을 갖는 5종의 유산균 복합 균주를 유효성분으로 함유하는 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 엔테로코쿠스 락티스는 간암 세포주(HepG 2)에서 세포독성이 없고, 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키며, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 엔테로코쿠스 락티스는 간암 세포주(HepG 2)에서 세포독성이 없으며, 중성지방의 축적을 효과적으로 감소시키고, 고지방식이를 통해 지방간이 유도된 동물모델에서 ALT 수치를 낮추고, 간무게를 감소시키며, 간에서 지방 대사 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 효과가 있는 것이다.
도 1은 엔테로코쿠스 균주의 당 이용능을 확인한 결과이다.
도 2는 엔테로코쿠스 균주 ITS 유전자 밴드 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 간암 세포주(HepG 2)에 WiKim0107 균주를 처리한 후 세포 생존률(%)을 확인한 결과이다. N은 아무것도 처리하지 않은 정상세포이다.
도 4는 간암 세포주(HepG 2)에 올레이트 및 팔미데이트가 2:1의 농도비로 혼합된 1.0mM의 유리지방산(FFA) 및 WiKim0107 균주를 처리한 후, 지방 축적(lipid accumulation)을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 증가했는 것으로, p<0.001이고, ***은 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리한 군(FFA) 대비, 본 발명의 엔테로코쿠스 락티스 균주를 처리한 군(WiKim0107)의 지방 축적이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 5는 실험동물에 엔테로코쿠스 락티스 균주를 투여한 후 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 글루코스 및 간 기능 지표인 ALT, AST의 혈액내 함량을 확인한 결과이다. ##, ###은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 혈액내 ALT, AST 또는 글루코스의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다. *은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 엔테로코쿠스 락티스 균주(WiKim0107) 투여군의 혈액내 ALT 함량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.05이다.
도 7은 실험동물에 엔테로코쿠스 락티스 균주를 투여한 후 간 무게(A) 및 형태학적 변화(B)를 확인한 결과이다. ##은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 간무게가 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, ##은 p<0.01이다. **은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 엔테로코쿠스 락티스 균주(WiKim0107) 투여군의 간무게가 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.01이다.
도 8은 간 조직 내 PLIN2(Perilipin 2), PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), lipid droplets 관련 CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector C), 지방산 흡수에 관여하는 CD36(cluster of differentiation 36)의 상대적 mRNA 발현량을 확인한 결과이다. ###은 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 PLIN2, PPARγ, CIDEC 및 CD36의 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.001이다. *, **, ***은 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 엔테로코쿠스 락티스 균주(WiKim0107) 투여군의 PLIN2, PPARγ, CIDEC 및 CD36의 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, *은 p<0.05이며, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107 균주는 홍어 또는 홍어김치로부터 분리된 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주 배양물의 추출물의 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 지방간 질환은 비알코올성 또는 알코올성 단순 지방간; 비알코올성 또는 알코올성 지방간염; 및 비알코올성 또는 알코올성 간경변 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 유효성분은 간 조직 내 중성지방의 함량을 감소시키는 것이 특징이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 유효성분은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기에서 언급한 본 발명의 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 지방간 질환의 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 균주 또는 상기 균주 유래 소포체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 '개체'란 지방간 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 지방간 질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 WiKim0107 균주가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
1. 간암 세포주(HepG 2)의 배양
간암 세포주(HepG 2)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 간암 세포주(HepG 2)는 10% FBS, 1% 페니실린-스트립토마이신이 포함된 DMEM-F12(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃에서, 5% CO 2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 24웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×10 5 cells/500㎕ well)를 분주하여 실험하였다. 24웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 24웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 갖춘 후 세포가 75%의 포화도(confluence)에 도달했을 때 사용하였다.
2. 유리 지방산 (Free Fatty Acid; FFA) 제조
(1) 100mM 팔미테이트(시그마 P-0500) 및 100mM 올레이트(시그마 P-75010) 저장용액의 제조. 70℃에서 0.1M NaOH 용액을 용매로 이용하여 제조하고, 0.2㎛의 필터를 이용하여 여과한 후, 멸균하였다.
(2) 유리 지방산이 포함되지 않은 5%(W/v)의 BSA(시그마 A-6003) 용액의 제조. 3차 증류수를 용매로 이용하여 제조한 후 멸균하고, 4℃ 냉장보관하였다.
(3) 올레이트 및 팔미테이트의 농도가 2:1이 되도록 혼합한 5mM의 혼합지방산 저장용액 제조. 60℃에서, 상기 (2)에서 제조한 3차 증류수에 녹인 유리 지방산이 포함되지 않은 5%(w/v)의 BSA 용액을 용매로 이용하여 상기 (1)에서 제조한 각각의 지방산의 농도가 5mM이 되도록 지방산 저장용액 10㎖을 제조하였다.
상기 (1)에서 제조한 100mM 팔미테이트 및 100mM 올레이트 저장용액을 165㎕(1.65mM)의 팔미테이트(Palmitate) 및 330㎕(3.3mM)의 올레이트(oleate)를 취해 9,505㎕의 5%(w/v)의 BSA 용액에 방울방울 떨어뜨리면서 흔들며 섞어주었다(vortexing). 이후에 상온으로 식힌 다음, 0.2μm 필터로 여과하였다(상기 제조한 혼합용액은 -20℃에서 3~4주 동안 보관하여도 안정하다).
실시예 1. 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107( Enterococcus lactis WiKim0107)의 분리 및 동정
(1) 신균주 분리
본 발명에서 사용한 신균주는 전라남도 나주시 영산포 홍어 영농조합법인으로부터 구입한 홍어(10g)를 취하여 멸균 생리식염수로 십진 희석한 후, MRS 유산균 분리용 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 후에 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하여 사용하였다. 분리한 미생물은 영양 최소배지(1% 글루코스, 0.5% 효모 추출물)에서 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
(2) 유산균의 동정
홍어 미생물 WiKim0107은 16S ribosomal DNA 유전자 서열 분석을 통하여 동정하였다. 선발 미생물의 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy 조직 키트(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA 유전자 증폭을 위하여 유니버설 프라이머; 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')(서열번호 1)와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 2) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응시 0.4mM dNTP, 0.5 유닛의 Taq 폴리머라아제, 4mM Mg 2+이 함유된 다카라 Perfect Premix(Takara, Japan) 10㎕에, DNA template(20㎍/㎖) 1㎕, 1.0μM 정방향 프라이머 및 1.0μM 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다.
PCR 증폭은 마스터사이클러 그래디언트(Mastercycler gradient)(Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension), 30 사이클을 실시하였고, 72℃에서 5분 동안 최종 연장(extension)을 실시하였다. 증폭된 약 1400bp의 fragment를 T 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. T 벡터 시퀀싱 프라이머를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며, 그 결과는 BLAST 분석 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 ribosomal DNA 유전자 시퀀싱과 비교하여 동정하였다. 결정된 염기서열은 Clustal_W 및 BioEdit 프로그램으로 정렬하였고, 발생한 gap은 이후 분석과정에서 결여형질로 처리하였다. 염기서열 간의 유전적 거리 계산과 neighbor-joining, maximum-likelihood 및 parsimony 계통수의 제작은 Mega 프로그램을 사용하여 수행하였고 계통군의 지지도를 알아보기 위해 위의 세 가지 분석에 대해 각각 동일한 사양으로 bootstrap 분석하였다(1,000 replicates).
홍어로부터 분리한 유산균 WiKim0107 균주의 동정 및 분류를 위하여, 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 신균주 WiKim0107은 Enterococcus lactis 표준 균주 BT와 97% 일치하였다(서열번호 3). 이후 상기 신균주를 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107( Enterococcus lactis WiKim0107)로 명명하였다.
(3) 유산균 배양
상기 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주로 선발된 선발균주를 국립농업과학원 미생물은행(KACC)으로부터 분양받은 엔테로코쿠스 패시움( Enterococcus faecium) KACC11954 및 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받은 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) KCTC21015 균주와 비교하였다.
상기 3종의 유산균주 배양은 MRS broth에 1%(10 4 CFU/㎖) 접종하고 30℃에서 48시간 2회 계대 배양하여, 당 이용능 및 ITS 유전자 분석에 사용하였다.
(4) 유산균의 당 이용능(API 50CHL) 측정
본 발명의 유산균주 및 표준균주 2종의 당 이용능을 측정하기 위해 API 50CHL 키트를 이용하였다. 각각의 유산균주는 MRS 아가에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 사용하였다. 일회용 백금이를 이용하여 단일 콜로니를 채취해 0.85% saline 10㎖에 넣어준 뒤, 세차게 흔들어 준후, McFarland 스탠다드 0.5와 같은 탁도로 조정하였다. 이후 API 50CHL 배지에 탁도 0.5 수준으로 맞춘 액을 1㎖ 첨가하여 혼합 후 스트립(strip)에 분주한 뒤 30℃에서 48시간 배양하여 당 이용능을 확인하였다.
API 50 CHL kit는 스트립에 있는 49가지의 탄수화물의 발효 여부를 확인하는데 사용하며, 배양기간 동안 발효된 탄수화물이 산을 생성하고 pH 지시약이 들어 있어 색의 변화로 양성(노란색) 및 음성(파란색)을 판독하는 방법이다.
본 실험에 사용한 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107, 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) KCTC21015 및 엔테로코쿠스 패시움( Enterococcus faecium) KACC11954 균주들의 당 이용능을 측정한 결과,
Enterococcus lactis WiKim0107는 L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(ribose), 갈락토스(galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), 만니톨(mannitol), α 메틸-D-만노사이드(α methyl-D-mannoside), N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine), 아미그달린(amygdaline), 아르부틴(arbutine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로비오스(cellobiose), 말토스(maltose), 락토스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 사카로스(saccharose), 트레할로스(trehalose), D-라피노스(D-raffinose), β-젠티오비스(β-gentiobiose)의 당을 이용하는 것을 확인하였고, Enterococcus lactis KCTC21015는 L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(ribose), 갈락토스(galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), 만니톨(mannitol), α 메틸-D-만노사이드(α methyl-D-mannoside), N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine), 아미그달린(amygdaline), 아르부틴(arbutine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로비오스(cellobiose), 말토스(maltose), 락토스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 트레할로스(trehalose), β-젠티오비오스(β-gentiobiose), D-타가토스(D-tagatose)의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
Enterococcus faecium KACC11954는 L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(ribose), 갈락토스(galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), 만니톨(mannitol), N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine), 아르부틴(arbutine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로비오스(cellobiose), 말토스(maltose), 락토스(lactose), 사카로스(saccharose), 트레할로스(trehalose), β-젠티오비오스(β-gentiobiose)의 당을 이용하는 것으로 확인하였다.
Enterococcus lactis와 Enterococcus faecium 균주 간의 당 이용능 시험에서 차이점은 Enterococcus lactis에서만 α 메틸-D-만노사이드(α methyl-D-mannoside), 아미그달린(amygdaline), 멜리비오스(melibiose), D-라피노스(D-raffinose)를 이용하는 것이 확인되었다. 대조군으로 사용한 Enterococcus lactis KCTC21015 표준균주와 Enterococcus lactis WiKim0107의 당 이용능 결과는 유사하였으나, 사카로스(saccharose)와 D-라피노스(D-raffinose)의 당 이용능에서 일부 차이는 있었다(도 1).
(5) Genomic DNA 추출 및 엔테로코쿠스 균주의 ITS 유전자 분석
배양한 균주로부터 genomic DNA를 추출하기 위하여 본 실험에서는 DNeasy blood & tissue kit(Qiagen, Valecia, CA, USA)을 사용하였으며, 실험방법은 다음과 같다. 유산균주 배양액을 원심분리(13,000~15,000g, 10분, 4℃)하여 펠렛을 모아 상층액을 제거한 후, 핵 분해 용액(nucleic lysis solution) 600㎕을 첨가하고 resuspending 하였다. 80℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 3㎕의 RNase 용액을 첨가하고 위아래 뒤집어 흔들면서 혼합하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 200㎕의 단백질 침전 용액을 첨가한 후, 세차게 흔들어 5분 동안 얼음에 방치하였다. 원심분리(13,000~16,000g, 2분, 4℃)하여 상층액을 제거한 후, 실온에 방치한 70% 에탄올로 DNA를 세척하였다. 100㎕ 멸균수로 DNA를 녹인 후, 4℃에서 보관하였다.
각 균주로부터 추출한 DNA로부터 16S/23S rRNA ITS(intergenic spacer) 지역을 증폭하기 위하여 보고된 프라이머 세트를 이용하였다(표 1). PCR 반응시 0.4mM dNTP, 0.5units Taq 폴리머라아제, 4mM Mg 2+이 함유된 Takara Perfect Premix(Takara, Japan) 10㎕에 DNA 템플레이트(20㎍/ml) 1㎕, 1.0μM 정방향 프라이머와 1.0μM 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다. PCR 증폭은 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 실시하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 1분(denaturation), 55℃에서 2분(annealing), 72℃에서 2분(extension)을 30 사이클을 실시하였고, 72℃에서 7분간 최종 extension을 실시하였다. PCR product는 QIAxcel advanced system(Qiagen, Valecia, CA, USA) 장비를 이용한 고해상도 모세관(high-resolution capillary) 전기영동을 수행하였다.
PCR 증폭 및 시퀀싱에서 사용된 프라이머 서열
프라이머 서열(5' -> 3')
G1 GAAGTCGTAACAAGG(서열번호 4)
L1 CAAGGCATCCACCGT(서열번호 5)
일부 종간 비교에서 보편적으로 사용되고 있는 16S rRNA 유전자 서열의 유사성이 매우 높을 경우, ribosomal RNA 오페론 중, 16S rRNA 유전자 서열보다 염기 치환율이 빠른 16S-23S rRNA intergenic spacer(ITS) region을 이용하는 방법이 도입되었으며, 상기 ITS는 종간 및 종내 비교를 위한 적절한 영역으로 인정받고 있으며, 16S-23S ITS 서열과 길이 다양성이 이용되고 있다.엔테로코쿠스 락티스와 엔테로코쿠스 패시움 균주의 명확한 종 동정을 위하여 16S-23S ITS band pattern을 확인하였다.
그 결과, 엔테로코쿠스 락티스와 엔테로코쿠스 패시움 균주는 약 900bp, 500bp, 410bp로 3개의 ribosomal RNA operon을 모두 유사하게 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 특이하게, 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107와 엔테로코쿠스 락티스 KCTC21015의 경우, 약 1,200bp, 750bp, 460bp, 400bp, 320bp의 단일 ribosomal RNA operon이 더 확인되었으나, 엔테로코쿠스 패시움 균주에서는 이와 같은 밴드가 나타나지 않았다(도 2). 생화학적 성상 및 16S-23S ITS band pattern 분석의 결과를 종합할 때, 엔테로코쿠스 락티스는 16S rRNA 유전자 서열에서 상동성을 나타내는 근연종인 엔테로코쿠스 패시움과 차이가 있으며, 따라서 본 발명에서 분리한 균주는 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107로 동정하였다. 기 엔테로코쿠스 락티스 WiKim0107을 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2019년 3월 8일자로 기탁하여, 기탁번호 KACC 81090BP를 부여받았다.
실시예 2. Wikim0107 균주의 세포 독성 확인
상기 배양한 HepG 2 세포에 24시간 동안 시료를 농도별로 희석하여 처리하고, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존률을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
그 결과 도 3에 개시한 바와 같이, 본 발명의 WiKim0107 균주를 처리하였을 때의 세포 생존률(%)이 정상군(N)과 거의 유사한 정도로 나타났다. 따라서 본 발명의 WiKim0107 균주는 세포독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. WiKim0107 균주의 처리에 따른 지방 축적(lipid accumulation)의 변화 확인
간암 세포주(HepG 2)에서 상기 제조한 1mM의 올레이트 및 팔미테이트 혼합(2:1) 유리 지방산을 처리하여 증가한 지방 축적(lipid accumulation)이 WiKim0107 균주의 처리에 의해 감소하는지를 확인하였다.
그 결과 도 4에 개시한 바와 같이, WiKim0107 균주의 농도 의존적으로 지방 축적(lipid accumulation)율이 감소한 것을 확인하였다.
실시예 4. 동물 모델의 체중변화 확인
수컷 6주령의 C57BL/6J 마우스 순화 후, 60 kcal% fat diet(D12492, Research Diet, Inc)를 섭취시켜 비알콜성 지방간을 유도하였다. 평균 체중이 28~29g에 도달하면, WiKim0107 균주를 10주 동안 경구 투여(1×10 8, 1×10 9 CFU/mice/day)하면서 매주 체중을 측정하였으며, 양성대조군으로 밀크씨슬(MT, 100mg/kg/day)를 투여하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이, 정상군 대비 고지방식이군(HFD)의 체중이 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 WiKim0107 균주 투여군과 밀크씨슬 투여군(MT)의 체중이 약간 감소한 것을 확인하였다.
실시예 5. 혈액 내 간기능 지표(ALT, AST) 및 글루코스 함량 확인
상기 실시예 4 이후, 심장천자법으로 상기 동물모델로부터 채혈한 혈액(혈청) 내 글루코스(glucose) 함량과 간 기능의 지표인 ALT 및 AST 함량을 측정하였다.
그 결과 도 6에 개시한 바와 같이, 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 혈액내 ALT, AST 또는 글루코스의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 엔테로코쿠스 락티스 균주(WiKim0107) 투여군의 혈액내 ALT 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
실시예 6. 간 무게 및 간의 형태학적 변화
상기 실시예 5 이후, 실험동물을 희생시켜 간 조직 적출 후 무게 및 형태학적 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 7(A)에 개시한 바와 같이 정상군 대비 고지방식이군(HFD)의 간 무게가 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 WiKim0107 균주 투여군과 밀크씨슬 투여군(MT)의 간 무게가 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 7(B)에 개시한 바와 같이 간의 형태학적 변화를 확인하였으며, 고지방식이군(Veh)의 간이 정상군(N)에 비해 비대해졌고, 고지방식이군 대비 본 발명의 엔테로코쿠스 균주 투여군(WiKim0107)의 간 형태가 정상군과 유사하다는 것을 확인하였다.
실시예 7. 지방대사 조절 및 지방산 흡수에 관여하는 유전자의 발현량 확인
상기 실시예 6에서 획득한 간 조직 30mg의 시료로부터 RNA를 분리하였으며, Taqman probe(ABI)를 이용한 역전사 및 Q-PCR을 실시를 통해 지방대사 조절에 관여하는 PLIN2(Perilipin 2), PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), lipid droplets 관련 CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector C), 지방산 흡수에 관여하는 CD36(cluster of differentiation 36)의 상대적 mRNA 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 개시한 바와 같이, 정상군(N) 대비 고지방식이군(Veh)의 PLIN2, PPARγ, CIDEC 및 CD36의 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 고지방식이군(Veh) 대비 양성대조군 및 엔테로코쿠스 락티스 균주(WiKim0107) 투여군의 PLIN2, PPARγ, CIDEC 및 CD36의 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
[통계 처리]
본 발명의 실시예에서 획득한 결과는 SPSS ver 20.0 프로그램을 사용하여 LSD 테스트 및 스튜던트 t-테스트를 수행하여 대조군과 실시군 간의 유의성을 검정하였다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81090BP
수탁일자 : 20190308
Figure PCTKR2020009531-appb-img-000001

Claims (8)

  1. 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주 배양물의 추출물의 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방간 질환은 비알코올성 또는 알코올성 단순 지방간; 비알코올성 또는 알코올성 지방간염; 및 비알코올성 또는 알코올성 간경변 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유효성분은 간 조직 내 중성지방의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  8. 엔테로코쿠스 락티스( Enterococcus lactis) WiKim0107 균주(기탁번호: KACC 81090BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 인간을 제외한 동물의 지방간 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
PCT/KR2020/009531 2019-07-19 2020-07-20 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2021015514A1 (ko)

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