WO2021194040A1 - 간기능 개선 또는 지방축적 억제 미생물 및 그의 용도 - Google Patents

간기능 개선 또는 지방축적 억제 미생물 및 그의 용도 Download PDF

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    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • KCTC14142BP Lactobacillus salivarius LMT15-14
  • Lactobacillus plantarum LMT19-1 Accession No. KCTC14141BP
  • Lactobacillus Bacteria of the genus Lactobacillus are a genus of gram-positive, facultative anaerobic or microaerophilic, rod-shaped, non-spore-forming bacteria. Lactobacillus is a major part of the lactobacilli group. In humans, Lactobacillus is a major component of the microbiota in many body parts, such as the digestive, urinary, and reproductive systems.
  • Lactobacillus Bacteria of the genus Lactobacillus are present in foods such as yogurt. In addition, some Lactobacillus species have physiological activities such as anti-inflammatory activity. For example, some lactobacilli are reported to be effective in irritable bowel syndrome (IBS).
  • IBS irritable bowel syndrome
  • obesity refers to excessive accumulation of fat in the body.
  • Obesity is known to cause diseases such as fatty liver, hyperlipidemia, high blood sugar, arteriosclerosis, and diabetes.
  • Obesity appears as the number of adipocytes increases as a result of adipogenesis and the lipid content of adipocytes increases.
  • Adipocytes play a major role in synthesizing and storing excess calories as triglycerides, and as a result of adipogenesis, the size and number of adipocytes increase and intracellular lipid accumulation is accelerated.
  • Fatty liver is caused by the accumulation of excess fat in the liver. In general, when more than 5% of the liver's weight is accumulated, it is diagnosed as fatty liver. Such fatty liver can be divided into alcoholic fatty liver caused by excessive drinking and non-alcoholic fatty liver occurring regardless of alcohol.
  • Nonalcoholic fatty liver disease is not a single disease, but includes various diseases ranging from mild fatty liver to chronic hepatitis and cirrhosis. Nonalcoholic fatty liver appears to be associated with metabolic syndrome such as obesity, adult-type diabetes, and hyperlipidemia. If excessive calorie intake continues, fat accumulates in the body fat cells and liver, and various substances harmful to the liver from the increased fat, such as cytokines This secretion leads to steatohepatitis and cirrhosis.
  • Bacteria of the genus Lactobacillus are major members of the normal microbial community that inhabits the human gut, and have long been known to be important in maintaining a healthy digestive system and vaginal environment, according to US Public Health Service guidelines. According to , all Lactobacillus strains currently deposited with the ATCC are classified as 'Bio-safety Level 1', which is recognized as having no known potential risk of causing disease in humans or animals.
  • lactic acid bacteria have been known to have excellent immune response modulating effects, anticancer and antioxidant effects through previous studies, but not much is known about the effects of Lactobacillus strains on reducing body fat content or treating fat-related diseases.
  • One purpose is a microorganism selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) having triglyceride suppression, fat oxidation promotion and fat synthesis inhibitory activity. to provide that combination.
  • Another object is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver function improvement or obesity-related diseases, containing the microorganism or a culture or extract thereof, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • Another object is to provide a food composition for preventing or improving liver function or obesity-related diseases, containing the microorganism or a culture or extract thereof, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • One aspect is a microorganism selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) having triglyceride suppression, fat oxidation promotion and fat synthesis inhibitory activity. provide that combination.
  • Another aspect provides a culture or extract of a microorganism or a combination thereof selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP).
  • the extract may be a protein extract of a microorganism or a combination thereof.
  • the extract may be a lysate obtained by lysing microorganisms or a combination thereof, or a supernatant remaining after removing the precipitate by centrifugation thereof.
  • the combination is Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) in any ratio by weight may be mixed with The mixing ratio may be, for example, 1:0.3 to 3.0.
  • the microorganism or a combination thereof, or a culture or extract thereof has acid resistance, bile acid resistance, oxidation promoting activity, fat synthesis inhibitory activity, or both activities, which inhibits the accumulation of fat.
  • inhibiting or reducing accumulated fat inhibiting the expression of one or more genes selected from the group consisting of SREBP-1c and FAS, promoting the expression of one or more genes selected from the group consisting of PPAR-1 ⁇ and CPT1 increasing the phosphorylation level of AMPK, increasing the level of adiponectin in the blood when administered to a subject, reducing at least one selected from the group consisting of body weight and amount of fat in the body when administered to a subject, and liver It may be one or more selected from the group consisting of improving function.
  • the fat may be a triglyceride.
  • the acid resistance is 80% or more, 85% or more, 90% or more, 80 to 90%, 80% to 95%, 85% to 90%, or It may be 90 to 95%.
  • the bile acid resistance has a survival rate of 75% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 75 to 90%, 75 to 95%, 80 to 90 when cultured for 2 hours at 37°C in MRS medium containing 0.3% bile acid. %, 80% to 95%, 85% to 90%, or 90 to 95%.
  • the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof may promote the expression of one or more genes selected from the group consisting of PPAR-1 ⁇ and CPT1.
  • the promotion increases the expression of one or more genes selected from the group consisting of PPAR-1 ⁇ and CPT1 by 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more or more, 10% to 100%, 20% to 100%, 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, Or 90% to 100% may be increased.
  • the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof may inhibit the expression of one or more genes selected from the group consisting of SREBP-1c and FAS.
  • the inhibition is 10% or more, 15% or more, 20% or more of the expression of one or more genes selected from the group consisting of SREBP-1c and FAS compared to the case in which the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof is not present, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more or more, 10% to 100%, 20% to 100%, 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, Or 90% to 100% may be reduced.
  • the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof may inhibit the amount of fat or its accumulation.
  • the inhibition reduces the amount or accumulation of fat by 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35 % or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more, 10% to 100%, 20 % to 100%, 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, or 90% to 100% reduction.
  • the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof may reduce one or more selected from the group consisting of body weight and the amount of adipose tissue in the body when administered to an individual.
  • the reduction is 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more, 10% to 100%, 20% to 100%, 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, or 90% to 100% may be reduced.
  • the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof may reduce triglyceride levels when administered to a subject.
  • the reduction is 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 45% or more by weight compared to the case in which the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof is not present.
  • % or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more, 10% to 100%, 20% to 100% , 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, or 90% to 100% may be reduced.
  • Another aspect is a microorganism selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) or a combination thereof or a culture or extract thereof as an active ingredient It provides a composition comprising.
  • the composition has acid resistance, bile acid resistance, oxidation promoting activity, fat synthesis inhibiting activity, or both, inhibiting fat accumulation or reducing accumulated fat inhibiting the expression of one or more genes selected from the group consisting of SREBP-1c and FAS, promoting the expression of one or more genes selected from the group consisting of PPAR-1 ⁇ and CPT1, increasing the phosphorylation level of AMPK , increasing blood adiponectin levels when administered to a subject, decreasing at least one selected from the group consisting of body weight and amount of body fat when administered to a subject, and improving liver function may be more than
  • the fat may be a triglyceride.
  • the composition since the composition has acid resistance and bile acid resistance, it can be used in an acidic intestine.
  • the composition promotes oxidation, inhibits fat synthesis, reduces the amount or accumulation of fat, or reduces accumulated fat, inhibits the expression of one or more genes selected from the group consisting of SREBP-1c and FAS. , PPAR-1 ⁇ and CPT1 to promote expression of one or more genes selected from the group consisting of, to increase the phosphorylation level of AMPK, administered to a subject to increase blood adiponectin levels, to improve liver function, and administered to a subject It may be used in one or more of reducing one or more selected from the group consisting of body weight and amount of fat in the body.
  • the fat may be a triglyceride.
  • Reducing the amount of fat in the body may include reducing for therapeutic purposes.
  • reducing the amount of fat in the body may be for use in the prevention or treatment of obesity-related diseases.
  • the obesity-related disease may be at least one selected from the group consisting of fatty liver, type 2 diabetes, hyperlipidemia, cardiovascular disease, arteriosclerosis, lipid-related metabolic syndrome, and obesity.
  • the fatty liver may be non-alcoholic fatty liver.
  • the subject may be an animal, including a human, that has or is likely to develop an obesity-related disease.
  • the composition may be a food or a pharmaceutical composition, that is, a pharmaceutical.
  • the composition may include a pharmaceutically or pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition may also include the microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof in the composition in a "food effective amount” or a “therapeutically effective amount".
  • therapeutically effective amount means an amount sufficient to exhibit a therapeutic effect when administered to an individual in need of treatment.
  • treatment means treating a disease or medical condition, eg, obesity, in a subject, eg, a mammal, including a human, including: (a) preventing the occurrence of the disease or medical condition; i.e., prophylactic treatment of the patient; (b) alleviating the disease or medical condition, ie, causing the elimination or recovery of the disease or medical condition in the patient; (c) inhibiting the disease or medical condition, ie, slowing or arresting the progression of the disease or medical condition in a subject; or (d) alleviating the disease or medical condition in the subject.
  • the “effective amount” can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the “effective amount” may be 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg.
  • the composition may be administered orally. Accordingly, the composition may be formulated in various forms such as tablets, capsules, aqueous solutions or suspensions.
  • excipients such as lactose and corn starch and lubricants such as magnesium stearate may be usually added.
  • capsules for oral administration lactose and/or dry corn starch may be used as diluents.
  • the active ingredient may be combined with emulsifying and/or suspending agents. If desired, certain sweetening and/or flavoring agents may be added.
  • Another aspect is a microorganism selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) or a combination thereof or a culture or extract thereof with liver or adipocytes and It provides a method of reducing the fat content in the liver or adipocytes, comprising the step of contacting.
  • the contacting may be culturing a microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof in a medium containing liver cells or adipocytes.
  • the method may be an in vitro or in vivo method.
  • Another aspect is the step of administering a microorganism selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius LMT15-14 (Accession No. KCTC14142BP) and Lactobacillus plantarum LMT19-1 (Accession No. KCTC14141BP) or a combination thereof or a culture or extract thereof to an individual It provides a method of reducing the fat content of an individual or improving liver function, including;
  • the administration may be oral or topical.
  • the dosage varies according to various factors such as the patient's condition, administration route, judgment of the attending physician, and the like, as described above.
  • An effective dosage can be estimated from a dose-response curve obtained from in vitro experiments or animal model studies.
  • the proportion and concentration of the compound of the present invention present in the composition to be administered may depend on the chemical nature, route of administration, therapeutic dosage, and the like.
  • the dosage may be administered to an individual in an effective amount of about 1 ⁇ g/kg to about 1 g/kg per day, or about 0.1 mg/kg to about 500 mg/kg per day.
  • the dose may be changed according to the age, weight, susceptibility, or symptoms of the individual.
  • the subject may be a mammal including a human.
  • a microorganism or a combination thereof or a culture or extract thereof according to an aspect may be used to reduce fat content or to improve liver function.
  • a composition according to another aspect may be used to reduce fat content or to improve liver function.
  • FIG. 1A and 1B are diagrams showing changes in body weight over time in a prophylactic model (FIG. 1A) and a treatment model (FIG. 1B) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIGS. 2A and 2B are diagrams showing changes in body weight and lipid accumulation in liver tissue in a prophylactic model ( FIG. 2A ) and a treatment model ( FIG. 2B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIGS. 3A and 3B are diagrams showing the triglyceride content in the liver tissue in a prophylactic model ( FIG. 3A ) and a treatment model ( FIG. 3B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIGS. 4A and 4B are diagrams showing the activity of AMPK in liver tissue in a prophylactic model ( FIG. 4A ) and a treatment model ( FIG. 4B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIG. 5a and 5b show the expression levels of fatty acid-related genes and liposynthesis-related genes in liver tissue in a prophylactic model (FIG. 5A) and a treatment model (FIG. 5B) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet. is the diagram shown.
  • FIG. 6A and 6B are diagrams showing changes in body weight of visceral adipose tissue in a prophylactic model ( FIG. 6A ) and a treatment model ( FIG. 6B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIGS. 7A and 7B are diagrams showing the activity of AMPK in visceral adipose tissue in a prophylactic model ( FIG. 7A ) and a treatment model ( FIG. 7B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIG. 8A and 8B show the expression levels of fatty acid-related genes and lipogenesis-related genes in visceral adipose tissue in a prophylactic model (FIG. 8A) and a treatment model (FIG. 8B) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • FIG. 8A a prophylactic model
  • FIG. 8B a treatment model
  • FIGS. 9A and 9B are diagrams showing the content of adiponectin in the blood in a prophylactic model ( FIG. 9A ) and a treatment model ( FIG. 9B ) by administering two types of lactic acid bacteria in mice induced with fatty liver on a high-fat diet.
  • Isolation of the strain was carried out by taking 100 g of traditional fermented food directly soaked at home and feces from infants and toddlers not in contact with lactic acid bacteria, diluted in sterile water, and homogenized for 5 minutes with a stomacher. The homogenized sample was diluted stepwise and spread on MRS (Difco, USA) agar plate medium containing bromophenol blue (Sigma, USA) and cultured for 2-3 days at 37°C. The final two strains were obtained by pure separation again. The purely isolated lactic acid bacteria were subjected to 16S rDNA lineage analysis as in Example 1.2. to confirm each lineage.
  • the selected lactic acid bacteria were subjected to PCR using the primer sets of 27F (SEQ ID NO: 3) and 1492R (SEQ ID NO: 4) and the genomes of each of LMT15-14 and LMT19-1 as templates to obtain 16S rDNA amplification products.
  • the nucleotide sequence of the amplification product was confirmed through sequencing.
  • the 16S rDNA of LMT15-14 and LMT19-1 has the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the nucleotide sequence of the 16S rDNA was analyzed using NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • LMT15-14 was the same as Lactobacillus salivarius
  • LMT19-1 was the same as Lactobacillus plantarum.
  • the 16S rDNAs of LMT15-14 and LMT19-1 had 99.9% and 99.9% sequence identity with Lactobacillus salivarius sp. and Lactobacillus plantarum sp., respectively, respectively. Therefore, LMT15-14 and LMT19-1 strains had LMT15-14 and LMT19-1 strains, respectively. It was identified as a novel strain belonging to Varius species and Lactobacillus plantarum species.
  • Example 2 Evaluation of the efficacy of inhibiting fatty liver by lactic acid bacteria in the C57BL/6J mouse model induced by non-alcoholic fatty liver with a high-fat diet
  • the animals used in the experiment were C57BL/6J mice, in which obesity was induced by a high-fat diet.
  • a 7-week-old mouse (male, 18-22 g) as a prophylactic model and a 4-week-old mouse (male, 13-17 g) as a treatment model were purchased from Orient Bio. Therefore, a general diet (SAFE, France) was fed for 1 week to adapt to the environment.
  • the prevention model was a high-fat diet (Research diet, USA), positive control material and each lactic acid bacteria once a day for the rest of the groups except for the normal control group, administered directly into the stomach once a day using a sonde for oral administration, and the ratio after a total of 8 weeks The patterns of alcoholic fatty liver induction were compared.
  • non-alcoholic fatty liver was induced with a high-fat diet for 8 weeks, and after 8 weeks, a high-fat diet, a positive control material and each lactic acid bacteria were administered directly into the stomach once a day using a sonde for oral administration.
  • the patterns of alcoholic fatty liver induction were compared.
  • Body weight and food amount were measured once a week, and after the experiment period was over, the animals were fasted and euthanized by inducing hypoxia and sleep with CO 2 gas. Plasma and tissue samples were stored at ⁇ 80° C. until use.
  • FIG. 1A is a diagram showing the change in body weight over time when two types of selected lactic acid bacteria are administered in fatty liver-induced mice with a high-fat diet.
  • the horizontal axis represents time (weeks), and the vertical axis represents body weight.
  • body weight was increased in the group fed with a fatty liver-induced high-fat diet in the prevention model and the treatment model.
  • L. salivarius LMT15-14 and L. plantarum LMT19-1 decreased by 7.5% and 12.1% in the prophylactic model compared to the control group, and in the treatment model, L. salivarius decreased by 12.1%.
  • LMT15-14 decreased by 7.9% and L. plantarum LMT19-1 decreased by 5.6%.
  • liver tissue was extracted from the mice in each group and the weight was measured.
  • L. salivarius LMT15-14 was 26.6%, L. plantarum LMT19- in the prophylactic model compared to the control group. 1 decreased by 24.6%, and in the treatment model, L. salivarius LMT15-14 decreased by 27.8% and L. plantarum LMT19-1 decreased by 24.9%.
  • triglyceride content in the liver was checked to confirm the effect of administering lactic acid bacteria to improve fatty liver.
  • Liver tissue samples obtained from mice in each group were heated at 100° C. for 5 minutes using 5% NP-40 (BioVision, USA), cooled at room temperature, and then this process was repeated 3 times. After repeating, only the supernatant was obtained and the triglyceride content was measured using a spectrophotometer using a triglyceride quantification kit (BioVision, USA) to measure the absorbance at 570 nm. shown in
  • the group administered with lactic acid bacteria had a significantly lower triglyceride content in the liver tissue compared to the control group, which was expected to improve the non-alcoholic fatty liver by promoting the decomposition and inhibiting the synthesis of triglycerides in the liver.
  • AMPK is a protein that detects the state of energy in cells and plays a role in regulating the breakdown and synthesis of sugar, fat, and cholesterol in the liver, muscle, and adipose tissue related to energy metabolism. That is, as a substance that promotes the absorption of sugar and oxidation of fat in cells, activation of AMPK increases lipid oxidation in liver tissue and reduces triglyceride levels.
  • liver tissue samples obtained from mice in each group were protein-acquired using PRO-PRE-P (Intron, Korea), which is a protein extraction solution.
  • the extracted protein was quantified by Bradford assay (Bio-Rad, USA) and then separated by electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel (Invitrogen, USA) and transferred to a PVDF membrane (poly vinylidene difluoride membrane, Bio-Rad, USA).
  • the protein-transferred PVDF membrane was blocked with a TBST 0.1% (Tris buffered saline with 0.1% Tween 20) solution containing 5% BSA at room temperature for 1 hour, and then the primary antibodies anti-p-AMPK, anti-AMPK and It was reacted with anti- ⁇ -actin antibody (1:1,000, Cell Signaling, USA) at 4°C for 18 hours. After the reaction was completed, it was washed with a 0.1% solution of TBST, followed by reaction with a secondary antibody anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (1:2,000, Cell Signaling, USA) at room temperature for 1 hour, followed by washing with TBST 0.1%.
  • TBST 0.1% Tris buffered saline with 0.1% Tween 20
  • liver tissue samples obtained from mice in each group were used to determine the fatty acidation-related genes PPAR- ⁇ and CPT1 and fat in the liver tissue.
  • the expression levels of PPAR- ⁇ and CPT1, which are fatty acidation-related genes, in the liver tissue in the case of the group orally administered with a high-fat diet and lactic acid bacteria, were confirmed in the L. salivarius LMT15- in the prophylactic model compared to the control group. 14 increased by 131.3%, 438.1%, and L. plantarum LMT19-1 by 163.6% and 494.9%, and in the treatment model, L. salivarius LMT15-14 by 43.5%, 102.2%, and L. plantarum LMT19-1 increased by 44.2% and 69.2%.
  • liver tissue Normally, 80% of fatty acids in liver tissue enters the liver through the circulatory system after the triglycerides in the adipose tissue are decomposed into fatty acids, 15% is absorbed through the digestive system after a meal, and then into the liver tissue through the circulation, and the remaining 5 % is newly created through de novo lipogenesis of fatty acids in liver tissue. Therefore, an increase in the influx of fatty acids from adipose tissue is closely related to the formation of excessive fatty liver in the liver tissue.
  • the effect of inhibiting visceral adipose tissue by administering lactic acid bacteria was evaluated in a non-alcoholic fatty liver induction model using a high-fat diet.
  • the visceral adipose tissue that is, the fat present in the abdominal cavity on the ventral side, from the mice in each group was extracted and weighted by extracting the fat organically present between the intestines except for the subcutaneous fat.
  • the results of the prevention model are shown in Figure 6a, and the treatment model is shown in Figure 6b.
  • the lactic acid bacteria can suppress the fatty liver by inhibiting the synthesis of triglycerides through the increase in fatty acid oxidation of adipose tissue and the inhibition of liposynthesis upon administration, thereby reducing the inflow of fatty acids into the liver.
  • Adiponectin is a hormone secreted from adipose tissue and affects fat regulation by affecting AMPK activity and PPAR ⁇ activity.
  • AMPK activity and PPAR ⁇ activity In obese patients, the amount of adiponectin in the blood decreases, and the reduction of body fat increases the production of adiponectin and promotes ⁇ -oxidation of fatty acids, thereby inhibiting fatty liver.
  • Such adiponectin can be used as an indicator of fat accumulation because the expression level and blood concentration of adiponectin are reduced when body fat is excessively accumulated.
  • adiponectin a hormone that affects fatty acid activation
  • blood samples collected from mice in each group were collected in a tube, and serum was separated by centrifugation.
  • the isolated serum was measured for adiponectin content using an Adiponectin (mouse) ELISA kit (Adipogen Inc, Korea), and the results are shown in FIG. 9A for the prevention model and FIG. 9B for the treatment model.
  • LMT15-14 LMT19-1 form circle circle size 1.5mm 1mm color cream color cream color Opacity opacity opacity bump convex convex surface lubricity lubricity aerobic growth + + anaerobic growth + +
  • lactic acid bacteria In order for lactic acid bacteria to exert their efficacy as probiotics in the intestine, they must pass through the stomach at a low pH after ingestion. In order to investigate the acid resistance of lactic acid bacteria, after inoculation in a sterile MRS liquid medium, inoculated at 37°C for 18 hours, and then adjusted to pH 2.5 with HCl to inoculate the lactic acid bacteria in the sterilized MRS liquid medium and cultured at 37°C for 2 hours. did. Samples immediately after inoculation of lactic acid bacteria and after 2 hours of incubation were collected, diluted in MRS liquid medium, spread on MRS plate medium, incubated at 37°C for 24 hours, and the number of lactic acid bacteria was measured by counting the number of colonies on the plate medium. 5 is shown.
  • Lactobacillus (CFU/ml) LMT15-14 LMT19-1 MRS (pH 6.8) 3.2X10 9 4.6X10 9 MRS (pH 2.5) 2.7X10 9 4.5X10 9
  • lactic acid bacteria In order for lactic acid bacteria to exert their efficacy as probiotics in the intestine, they must pass through the stomach at a low pH after ingestion. In order to investigate the acid resistance of lactic acid bacteria, after inoculation in a sterile MRS liquid medium, inoculated at 37°C for 18 hours, and then adjusted to pH 2.5 with HCl to inoculate the lactic acid bacteria in the sterilized MRS liquid medium and cultured at 37°C for 2 hours. did. Samples immediately after inoculation of lactic acid bacteria and after 2 hours of incubation were collected, diluted in MRS liquid medium, spread on MRS plate medium, incubated at 37°C for 24 hours, and the number of lactic acid bacteria was measured by counting the number of colonies on the plate medium. 6 is shown.
  • Lactobacillus (CFU/ml) LMT15-14 LMT19-1 MRS (pH 6.8) 3.2X10 9 4.6X10 9 MRS (pH 2.5) 2.7X10 9 4.5X10 9
  • lactic acid bacteria L. salivarius LMT15-14, which are effective in inhibiting non-alcoholic fatty liver, were 84.4% and L. plantarum LMT19-1 was 97.8%, confirming a high survival rate against acid at pH 2.5. .
  • the characteristic of these lactic acid bacteria is that they maintain an appropriate number of lactic acid bacteria by 50% or more at a pH lower than pH 3, which is close to the physiological pH of the stomach. can do.
  • Lactic acid bacteria were cultured for 18 hours at 37°C after inoculation in sterile MRS liquid medium. Considering that the intestinal bile salt concentration is around 0.1(w/v)%, 0.3(w/v)% of bile salts [(Bile salts) (Sigma, USA)] was inoculated with the lactic acid bacteria in MRS liquid medium and incubated for 2 hours at 37° C. Samples immediately after lactic acid bacteria inoculation and after 2 hours of incubation were collected, diluted in MRS liquid medium, and placed in MRS plate medium. After plating and culturing at 37° C. for 24 hours, the number of colonies on the plate medium was counted to measure the number of lactic acid bacteria, and are shown in Table 7 below.
  • Lactobacillus (CFU/ml) LMT15-14 LMT19-1 MRS 3.2X10 9 4.6X10 9 MRS (0.3% Bile salt) 2.7X10 7 3.4X10 9

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Abstract

락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물, 및 그의 용도를 제공한다.

Description

간기능 개선 또는 지방축적 억제 미생물 및 그의 용도
락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
락토바실러스 속 박테리아는 그람-양성, 선택적 혐기성(facultative anaerobic) 또는 미세호기성(microaerophilic), 막대-모양, 포자를 형성하지 않는 박테리아의 속(genus)이다. 락토바실러스는 유산균 그룹의 주요 부분이다. 사람에 있어서, 락토바실러스는 소화계, 비뇨계, 및 생식기계와 같은 많은 신체 부위에서 미생물군집(microbiota)의 주요 성분이다.
락토바실러스 속 박테리아는 요거트와 같은 식품에 포함되어 있다. 또한, 일부 락토바실러스 종은 항염증 활성과 같은 생리적 활성을 갖는다. 예를 들면, 일부 락토바실러스는 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
한편, 비만은 체내에 지방이 과도하게 축적되는 것을 나타낸다. 비만은 지방간, 고지혈증, 고혈당, 동맥경화, 당뇨병과 같은 질병의 원인으로 알려져 있다. 비만은 지방분화 (adipogenesis)의 결과로 지방세포의 수가 증가하고 지방세포의 지질 함량이 증가함에 따라 나타난다. 지방세포 (adipocyte)는 초과된 칼로리를 중성지방 (triglycerides)으로 합성하고 저장하는데 주요 역할을 하며, 지방분화의 결과로 지방세포의 크기와 숫자가 증가하고 세포 내 지질 축적이 가속화된다.
지방간(fatty liver)은 간 내 과도한 지방이 쌓여서 발생되는데 일반적으로 간 무게의 5% 이상의 지방이 쌓이게 되면 지방간으로 진단한다. 이러한 지방간은 과음으로 인한 알콜성 지방간과 술과 관계없이 발생되는 비알콜성 지방간으로 나눌 수 있다. 비알콜성 지방간 질환은 한 가지 병 이라기 보다 가벼운 지방간에서부터 만성 간염, 간경변증에 이르는 다양한 병을 포함한다. 비알콜성 지방간은 비만, 성인형 당뇨병, 고지혈증 등의 대사증후군과 연관되어 나타나는데 과도한 열량을 계속 섭취하게 되면 체내 지방세포 및 간에 지방이 축적되고 증가된 지방에서 간에 해로운 여러가지 물질 예를 들면, 사이토카인이 분비되어 지방간염과 간경변증으로 진행한다.
락토바실러스 속 박테리아는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래 전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안전수준(Bio-safety Level) 1'로 분류되어 있다.
다만, 유산균은 기존의 연구를 통해 면역반응 조절효과와 항암 및 항산화 효과가 우수하다고 알려져 있으나, 락토바실러스 균주가 체내 지방 함량을 감소시키는 효과 또는 지방 관련 질환을 치료하는 효과에 대하여는 많이 알려지지 않았다.
일 목적은 중성지방 억제, 지방 산화 촉진 및 지방 합성 억제 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합을 제공하는 것이다.
다른 목적은 유효성분으로 상기 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는, 간기능 개선 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 목적은 유효성분으로 상기 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는, 간기능 개선 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 중성지방 억제, 지방 산화 촉진 및 지방 합성 억제 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합을 제공한다.
다른 양상은 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합의 배양물 또는 추출물을 제공한다. 상기 추출물은 미생물 또는 그 조합의 단백질 추출물일 수 있다. 상기 추출물은 미생물 또는 그 조합을 용균시킨 용균물, 또는 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 남은 상등액일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물에 있어서, 상기 조합은 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)이 중량 기준으로 임의의 비율로 혼합된 것일 수 있다. 상기 혼합 비율은 예를 들면, 1:0.3 내지 3.0일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은, 내산성을 갖는 것, 내담즙산성을 갖는 것, 산화를 촉진하는 활성, 지방 합성을 억제하는 활성, 또는 두 활성 모두를 가진 것, 지방의 축적을 억제하는 것 또는 축적된 지방을 감소시키는 것, SREBP-1c 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것, PPAR-1α 및 CPT1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 것, AMPK의 인산화 수준을 증가시키는 것, 개체에 투여되는 경우 혈중 아디포넥틴 수준을 증가시키는 것, 개체에 투여되는 경우 체중 및 체내의 지방의 양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 감소시키는 것, 및 간기능을 개선시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 지방은 트리글리세리드일 수 있다.
상기 내산성은 MRS 배지에서 pH 2.5 및 37℃에서 2시간 동안 배양한 경우 생존율이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 80 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 또는 90 내지 95%인 것일 수 있다.
상기 내담즙산성은 0.3% 담즙산 함유 MRS 배지에서 37℃에서 2시간 배양한 경우 생존율이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 75 내지 90%, 75 내지 95%, 80 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 또는 90 내지 95%인 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 PPAR-1α 및 CPT1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 상기 촉진은 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, PPAR-1α 및 CPT1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 증가시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 SREBP-1c 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 상기 억제는 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, SREBP-1c 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 감소시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 지방의 양 또는 그 축적을 억제하는 것일 수 있다. 상기 억제는 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, 지방의 양 또는 그 축적을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 감소시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 개체에 투여되는 경우 체중 및 체내의 지방 조직의 양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 감소는 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 감소시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 개체에 투여되는 경우 트리글리세리드 수준을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 감소는 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, 중량 기준으로 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 감소시키는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 내산성을 갖는 것, 내담즙산성을 갖는 것, 산화를 촉진하는 활성, 지방 합성을 억제하는 활성, 또는 두 활성 모두를 가진 것, 지방의 축적을 억제하는 것 또는 축적된 지방을 감소시키는 것, SREBP-1c 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것, PPAR-1α 및 CPT1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 것, AMPK의 인산화 수준을 증가시키는 것, 개체에 투여되는 경우 혈중 아디포넥틴 수준을 증가시키는 것, 개체에 투여되는 경우 체중 및 체내의 지방의 양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 감소시키는 것, 및 간기능을 개선시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 지방은 트리글리세리드일 수 있다.
따라서, 상기 조성물은 내산성 및 내담즙산성을 갖는 것이므로 산성을 띠는 장 내에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 산화를 촉진하는데, 지방 합성을 억제하는데, 지방의 양 또는 축적을 감소시키는데 또는 축적된 지방을 감소시키는데, SREBP-1c 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는데, PPAR-1α 및 CPT1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는데, AMPK의 인산화 수준을 증가시키는데, 개체에 투여되어 혈중 아디포넥틴 수준을 증가시키는데, 간기능을 개선시키는데, 및 개체에 투여되어 체중 및 체내의 지방의 양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 감소시키는데 중 하나 이상에 사용될 수 있다. 상기 지방은 트리글리세리드일 수 있다.
체내의 지방의 양을 감소시키는 것은 치료 목적으로 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 체내의 지방의 양을 감소시키는 것은 비만 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 비만 관련 질환은 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증, 지질 관련 대사증후군 및 비만으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 상기 지방간은 비알콜성 지방간일 수 있다. 상기 개체는 비만 관련 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 사람을 포함한 동물일 수 있다.
상기 조성물은 식품, 또는 약제학적 조성물 즉, 의약품일 수 있다. 상기 조성물은 식품학적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 또한 상기 조성물 중 상기 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 "식품학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유류에서 질환 또는 의학적 증상, 예를 들면 비만 질병을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.
다른 양상은 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 간 또는 지방 세포와 접촉시키는 단계;를 포함하는, 간 또는 지방 세포 중 지방 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 간 세포 또는 지방 세포를 함유하는 배지 중에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 방법은 인 비트로 또는 인 비보 방법일 수 있다.
다른 양상은 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP) 및 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 개체의 지방 함량을 감소시키거나 간기능을 개선시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 당업자는 투여 시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 또는 국부 투여일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 사람을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 따른 미생물 또는 그 조합 또는 그 배양물 또는 추출물은 지방 함량을 감소시키는데 또는 간기능을 개선시키는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물은 지방 함량을 감소시키는데 또는 간기능을 개선시키는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 지방 함량을 효율적으로 감소시키거나 또는 간기능을 효율적으로 개선시킬 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 1a) 및 치료 모델(도 1b)에서 시간에 따른 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 2a) 및 치료 모델(도 2b)에서 간 조직의 체중 변화 및 지질 축적 변화를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 3a) 및 치료 모델(도 3b)에서 간 조직 내 중성지방 함량을 나타낸 도이다.
도 4a 및 도 4b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 4a) 및 치료 모델(도 4b)에서 간 조직 내 AMPK의 활성을 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 5a) 및 치료 모델(도 5b)에서 간 조직 내 지방산화 관련 유전자 및 지방합성 관련 유전자의 발현량을 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 6a) 및 치료 모델(도 6b)에서 내장지방 조직의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 7a) 및 치료 모델(도 7b)에서 내장지방 조직 내 AMPK의 활성을 나타낸 도이다.
도 8a 및 도 8b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 8a) 및 치료 모델(도 8b)에서 내장지방 조직 내 지방산화 관련 유전자 및 지방합성 관련 유전자의 발현량을 나타낸 도이다.
도 9a 및 도 9b는 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종 유산균을 투여하여 예방 모델(도 9a) 및 치료 모델(도 9b)에서 혈액 내 아디포넥틴의 함량을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
1. 균주의 분리
균주의 분리는 가정에서 직접 담근 전통 발효 식품 및 유산균을 접하지 않은 영유아 분변을 100 g 취하여 멸균수에 희석하고, 스토마커(stomacher)로 5 분간 균질화하여 수행하였다. 균질화된 샘플은 단계적으로 희석하여 브로모페놀블루(Sigma, USA)를 포함하는 MRS (Difco, USA) 아가 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 2 내지 3일간 배양하였고 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하여 최종 2개 균주를 얻었다. 순수 분리된 유산균은 각각의 계통을 확인하기 위하여 하기 실시예 1.2.와 같이 16S rDNA 계통 분석을 실시하였다.
2. 16S rDNA 분석
선별된 유산균은 27F (서열번호 3)과 1492R (서열번호 4)의 프라이머 세트와 각각의 LMT15-14 및 LMT19-1의 게놈을 주형으로 하여 PCR를 수행하여, 16S rDNA 증폭 산물을 얻었다. 상기 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 그 결과, LMT15-14 및 LMT19-1의 16S rDNA는 각각 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한, 상기 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열을 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였다. 계통수 분석 결과, LMT15-14는 락토바실러스 살리바리우스 종과 같았으며, LMT19-1은 락토바실러스 플란타룸 종과 같았다. LMT15-14 및 LMT19-1의 16S rDNA는 각각 락토바실러스 살리바리우스 종 및 락토바실러스 플란타룸 종과 서열 동일성이 각각 99.9% 및 99.9% 이었으며, 따라서, LMT15-14 및 LMT19-1 균주는 락토바실러스 살리바리우스 종 및 락토바실러스 플란타룸 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다. 이 2개 균주는 각각 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) LMT15-14 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMT19-1로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 2월 21일자로 기탁번호 KCTC 14142BP 및 KCTC 14141BP로 기탁하였다.
실시예 2. 고지방 식이로 비알콜성 지방간이 유도된 C57BL/6J 마우스 모델에서의 유산균에 의한 지방간 억제 효능 평가
1. C57BL/6J 마우스의 비만 유도 및 유산균 처리
고지방 식이로 유발된 지방간 억제 효능을 평가하기 위해 예방 모델과 치료 모델 두 가지 모델에서 유산균 투여 시 지방간 유발 양상을 평가하였다.
실험에 사용된 동물은 고지방 식이로 비만이 유발되는 C57BL/6J 마우스로 예방 모델은 7주령 마우스(수컷, 18~22g)와 치료 모델은 4주령 마우스(수컷, 13~17g)를 오리엔트 바이오로부터 구입하여 1주간 일반식이(SAFE, France)를 급여하여 환경에 적응시켰다. 이후에 예방 모델은 정상 대조군을 제외한 나머지 군은 고지방 식이(Research diet, USA)와 8주간 양성 대조 물질 및 각각의 유산균을 하루에 한번 경구 투여용 존데를 이용해 위 내 직접 투여하여 총 8주 후의 비알콜성 지방간 유발 양상을 비교하였다. 치료 모델은 고지방 식이로 8주간 비알콜성 지방간을 유도하였고, 8주 후 부터는 고지방 식이와 양성 대조 물질 및 각각의 유산균을 하루에 한번 경구 투여용 존데를 이용해 위 내 직접 투여하여 총 16주 후의 비알콜성 지방간 유발 양상을 비교하였다. 군 (n=10)은 총 8군으로 하기 표 1과 같이 구성하였다.
군 식이 투여물질 농도
정상 대조군 정상 식이 PBS N/A
음성 대조군 고지방 식이 PBS N/A
양성 대조군 고지방 식이 밀크씨슬 100 mg/kg/day
양성 대조군 고지방 식이 L. rhamnosus GG KCTC 5033 1X109 CFU/day
실험군 고지방 식이 L. salivarius LMT15-14 1X109 CFU/day
실험군 고지방 식이 L. plantarum LMT19-1 1X109 CFU/day
체중 및 식이량은 주 1회 측정하였으며 실험 기간이 종료된 후 실험동물은 절식시키고, CO2 가스로 저산소증 및 수면 유도하여 안락사하였다. 혈장 및 조직 샘플은 사용시까지 영하 80℃에서 보관하였다.
2. 고지방 식이로 비알콜성 지방간이 유도된 C57BL/6J 마우스 모델에서의 체중 변화 측정
전 실험기간 동안 매일 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였고, 그 결과를 예방 모델은 도 1a, 치료 모델은 도 1b에 나타내었다. 도 1은 고지방 식이로 지방간 유도된 마우스에서 2종의 선별된 유산균을 투여한 경우 시간에 따른 체중 변화를 나타낸 도면이다. 도 1에서 가로축은 시간 (주)이며, 세로축은 체중을 나타낸다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 예방 모델 및 치료 모델에서 지방간 유도 고지방 식이 급여한 군에서 체중이 증가였다. 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 7.5%, L. 플란타룸 LMT19-1은 12.1% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 7.9%, L. 플란타룸 LMT19-1은 5.6% 감소하였다.
3. 고지방 식이로 비알콜성 지방간이 유도된 C57BL/6J 마우스 모델에서의 간 조직 변화 분석
(1) 간 조직의 무게 측정
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 평가하였다. 예방 모델 및 치료 모델의 실험 기간 종료 후, 각 군의 마우스로부터 간 조직을 적출하여 무게를 측정하였고 그 결과를 예방 모델은 도 2a, 치료 모델은 도 2b에 나타내었다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 간 조직의 무게를 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 26.6%, L. 플란타룸 LMT19-1은 24.6% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 27.8%, L. 플란타룸 LMT19-1은 24.9% 감소하였다.
(2) 간 조직 내의 중성지방 함량 확인
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여 간 내 중성지방 함량을 확인하였다. 각 군의 마우스로부터 얻은 간 조직 샘플을 5% NP-40 (BioVision, USA)를 이용하여 100℃에서 5분 가열 후, 상온에서 식힌 다음 이 과정을 3번 반복하였다. 반복 후, 상등액만을 취득하여 중성지방 정량 Kit (BioVision, USA)를 이용해 중성지방의 함량을 스펙트로포토미터를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 예방 모델은 도 3a, 치료 모델은 도 3b에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 간내 중성지방 함량을 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 65.4%, L. 플란타룸 LMT19-1은 68.7% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 54.4%, L. 플란타룸 LMT19-1은 55.5% 감소하였다. 유산균을 투여한 군은 대조군에 비해서 간 조직 내 중성지방 함량이 뚜렷하게 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 유산균이 간 내 중성지방의 분해를 촉진 및 합성을 억제하여 비알콜성 지방간을 개선하였을 것으로 예상하였다.
(3) 간 조직 내의 AMPK(AMP-activated protein kinase) 활성화 확인
AMPK는 세포 내 에너지 상태를 감지하는 단백질로 에너지 대사와 관련된 간, 근육, 지방조직 등에서 당, 지방, 콜레스테롤의 분해 및 합성을 조절하는 역할을 한다. 즉 세포 내에서 당의 흡수 및 지방의 산화를 촉진하는 물질로 AMPK의 활성화는, 간조직 내 지질 산화를 증가시키고 중성지방 수치를 감소시킨다.
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여 간 조직 내 AMPK 활성 정도를 확인하였다. 즉, 각 군의 마우스로부터 얻은 간 조직 샘플을, 단백질 추출 용액인 PRO-PRE-P (Intron, Korea)을 이용하여 단백질을 획득하였다. 추출된 단백질은 Bradford assay (Bio-Rad, USA)를 통해 정량 후, SDS-폴리아크릴 아미드 겔(Invitrogen, USA)에서 전기영동으로 분리하여 PVDF 멤브레인(poly vinylidene difluoride membrane, Bio-Rad, USA)에 옮겼다. 단백질이 전이된 PVDF 멤브레인은 상온에서 1시간 동안 5% BSA를 함유한 TBST 0.1% (Tris buffered saline with 0.1% Tween 20) 용액으로 차단한 후, 1차 항체 항-p-AMPK, 항-AMPK 및 항-β-actin 항체 (1:1,000, Cell Signaling, USA)와 4℃에서 18시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, TBST 0.1% 용액으로 세척하고 2차 항체 항-토끼 IgG HRP-연결 항체 (1:2,000, Cell Signaling, USA)로 상온에서 1시간 동안 반응한 후 TBST 0.1%로 세척하였다. 세척 후, ECL solution (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 반응시키고 Chemi-doc (Bio-Rad, USA)으로 측정하였다. 그 결과를 예방 모델은 도 4a, 치료 모델은 도 4b에 나타내었다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 간 조직 내 AMPK 활성화를 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 39.7%, L. 플란타룸 LMT19-1은 42.1% AMPK의 인산화가 증가하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 45.4%, L. 플란타룸 LMT19-1은 66.0% 증가하였다. 이는 인산화된 AMPK가 증가함에 따라 간 내 지방산화 활성화가 증가하여 지방 합성을 조절하여 비알콜성 지방간을 억제할 수 있음을 시사한다.
(4) 간 조직의 지방산화와 지방합성 관련 바이오마커 유전자 발현의 유의적 차이 확인
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여 각 군의 마우스로부터 얻은 간 조직 샘플을 이용하여 간 조직 내 지방산화 관련 유전자인 PPAR-α 및 CPT1과 지방합성 관련 유전자인 SREBP-1c 및 FAS의 발현 차이를 리얼타임(Real time) PCR을 통해 측정하였다.
즉, 각 군의 마우스로부터 얻은 간 조직 샘플을 RNA 추출 키트인 AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 이후, RocketScript Cycle RT Premix (Bioneer, South Korea)를 이용하여 RNA에 상보적인 DNA를 얻은 후, SYBR green (Takara, Japan) 및 하기의 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하여 지방산화 관련 유전자 (PPAR-α 및 CPT1) 및 지방합성 관련 유전자 (SREBP-1c 및 FAS)의 발현을 확인하였다. 그 결과를 예방 모델은 도 5a, 치료 모델은 도 5b에 나타내었다.
번호 종 유전자 프라이머 서열번호
1 생쥐 PPAR-α 포워드 5
리버스 6
2 CPT1 포워드 7
리버스 8
3 SREBP-1c 포워드 9
리버스 10
4 FAS 포워드 11
리버스 12
5 GAPDH 포워드 13
리버스 14
도 5에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 간 조직 내 지방산화 관련 유전자인 PPAR-α 및 CPT1의 발현량을 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 131.3%, 438.1%, L. 플란타룸 LMT19-1은 163.6%, 494.9% 증가하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 43.5%, 102.2 %, L. 플란타룸 LMT19-1은 44.2%, 69.2% 증가하였다. 또한 간 조직 내 지방합성 관련 유전자인 SREBP-1c 및 FAS의 발현량을 확인한 결과 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 58.0%, 65.8%, L. 플란타룸 LMT19-1은 39.2%, 57.7% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 69.1%, 60.1%, L. 플란타룸 LMT19-1은 65.7%, 60.1% 감소하였다. 따라서 상기 유산균 투여 시간 내 지방산화 증가 및 지방합성 억제를 통해 지방간을 억제할 수 있다.
4. 고지방 식이로 비알콜성 지방간이 유도된 C57BL/6J 마우스 모델에서의 내장지방 조직 변화 분석
(1) 내장지방 조직의 무게 측정
정상적으로 간 조직 지방산은 80%가 지방조직의 중성지방이 지방산으로 분해된 후 순환계를 통하여 간 조직으로 유입되고, 15%는 식사 후 소화계를 통해 흡수된 후 순환계를 통하여 간 조직으로 유입되며, 나머지 5%는 간 조직의 지방산 신생과정(de novo lipogenesis)을 통해 새롭게 만들어진다. 따라서 지방 조직으로부터의 지방산 유입 증가는 간 조직에서 과도한 지방간을 형성하는데 밀접한 연관성을 갖는다.
이에 고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 내장지방 조직 억제 효과를 평가하였다. 예방 모델 및 치료 모델의 실험 기간 종료 후, 각 군의 마우스로부터 내장지방 조직 즉, 복부쪽 복강 내 존재하는 지방으로 피하지방을 제외한 장과 장 사이에 유기적으로 존재하는 지방을 적출하여 무게를 측정하여 그 결과를 예방 모델은 도 6a, 치료 모델은 도 6b에 나타내었다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 내장지방 조직의 무게를 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 27.1%, L. 플란타룸 LMT19-1은 33.9% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 33.7%, L. 플란타룸 LMT19-1은 24.6% 감소하였다.
(2) 내장지방 조직 내의 AMPK 활성화 확인
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여 내장지방 조직 내 AMPK 활성 정도를 확인하였다. 각 군의 마우스로부터 얻은 내장지방 조직 샘플을 이용하여 상기 실시예 3.3과 동일한 방법으로 진행하였고 그 결과를 예방 모델은 도 7a, 치료 모델은 도 7b에 나타내었다.
도 7에서 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 내장지방 조직 내 AMPK 활성화를 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 73.0%, L. 플란타룸 LMT19-1은 80.8% AMPK의 인산화가 증가하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 44.8%, L. 플란타룸 LMT19-1은 44.9% 증가하였다. 이는 인산화된 AMPK가 증가함에 따라 지방세포 내 지방산화 활성화가 증가하여 지방 합성을 조절하고 간으로의 지방산 유입을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
(3) 내장지방 조직의 지방산화와 지방합성 관련 바이오마커 유전자 발현의 유의적 차이 확인
고지방 식이를 이용한 비알콜성 지방간 유도 모델에서 유산균을 투여함에 따른 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여 내장지방 조직 내 지방산화 관련 유전자인 PPAR-α 및 CPT1과 지방합성 관련 유전자인 SREBP-1c 및 FAS의 발현 차이를 리얼타임 PCR을 통해 측정하였다. 각 군의 마우스로부터 얻은 내장지방 조직 샘플을 이용하여 상기 실시예 3.4와 동일한 방법으로 진행하였고 그 결과를 예방 모델은 도 8a, 치료 모델은 도 8b에 나타내었다.
도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 내장지방 조직 내 지방산화 관련 유전자인 PPAR-α 및 CPT1의 발현량을 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 78.8%, 86.8%, L. 플란타룸 LMT19-1은 76.6%, 83.0% 증가하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 36.9%, 112.3%, L. 플란타룸 LMT19-1은 41.7%, 117.5% 증가하였다. 또한 내장지방 조직 내 지방합성 관련 유전자인 SREBP-1c 및 FAS의 발현량을 확인한 결과 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 65.5%, 59.1%, L. 플란타룸 LMT19-1은 80.7%, 67.1% 감소하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 53.4%, 53.7%, L. 플란타룸 LMT19-1은 59.3%, 71.1% 감소하였다. 따라서 상기 유산균은 투여 시 지방조직의 지방산화 증가 및 지방합성 억제를 통해 중성지방의 합성을 억제하여 간 내 지방산의 유입을 감소시켜 지방간을 억제할 수 있다.
5. 고지방 식이로 비알콜성 지방간이 유도된 C57BL/6J 마우스 모델에서의 아디포넥틴 확인
아디포넥틴은 지방조직에서 분비되는 호르몬으로 AMPK 활성과 PPARα 활성에 영향을 주어 지방조절에 영향을 준다. 비만인 환자에서 혈액 내 아디포넥틴 양이 감소하며 체지방 감소는 아디포넥틴 생산을 증가시켜 지방산의 β-산화를 촉진하여 지방간을 억제하는 역할을 한다. 이러한 아디포넥틴은 체지방이 과도하게 축적된 경우 발현량 및 혈중 농도가 감소되므로 지방 축적의 지표로 사용할 수 있다.
이러한 지방산화 활성화에 영향을 주는 호르몬인 아디포넥틴의 함량을 측정하기 위해 각 군의 마우스로부터 채취한 혈액 샘플을 튜브에 수집하였고, 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 Adiponectin (mouse) ELISA kit (Adipogen Inc, Korea)를 사용하여 아디포넥틴 함량을 측정하였으며, 그 결과를 예방 모델은 도 9a, 치료 모델은 도 9b에 나타내었다.
도 9a 및 도 9b에서 나타낸 바와 같이, 고지방 식이 및 유산균을 경구 투여한 군의 경우 혈중 아디포넥틴 함량을 확인한 결과, 대조군 대비하여 예방 모델에서 L. 살리바리우스 LMT15-14는 22.4%, L. 플란타룸 LMT19-1은 26.7% 아디포넥틴이 증가하였으며, 치료 모델에서는 L. 살리바리우스 LMT15-14는 25.6%, L. 플란타룸 LMT19-1은 26.3% 증가하였다. 따라서 아디포넥틴이 증가함에 따라 지방산의 β-산화에 관련이 있는 AMPK의 활성화를 증가시켜 지방간 생성을 억제하는 것이 가능하다.
실시예 3. 균주의 형태학적 및 발효특성 조사
1. 균학적 특성분석
비알콜성 지방간 억제에 효과가 있는 2종의 유산균 L. 살리바리우스 LMT15-14와 L.플란타룸 LMT19-1을 MRS 평판 배지에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였고 콜로니 형태는 하기 표 3에 나타내었다.
LMT15-14 LMT19-1
형태 원형 원형
크기 1.5㎜ 1㎜
색 크림색 크림색
불투명도 불투명 불투명
융기 볼록 볼록
표면 매끄러움 매끄러움
호기적 생장 + +
혐기적 생장 + +
2. 선발된 유산균주의 당 발효 특성
당 발효 특성은 API 50 CHL 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 조사하였다. 비알콜성 지방간 억제에 효과가 있는 2종의 유산균 L. 살리바리우스 LMT15-14와 L.플란타룸 LMT19-1의 당 발효 특성을 하기 표 4에 나타내었다.
LMT15-14 LMT19-1
Glycerol - -
Erythritol - -
D-Arabinose - -
L-Arabinose - +
D-Ribose - +
D-Xylose - -
L-Xylose - -
D-Adonitol - -
Methyl- β D-Xylopyranoside - -
D-Galactose + +
D-Glucose + +
D-Fructose + +
D-Mannose + +
L-Sorbose - -
L-Rhamnose - -
Dulcitol - -
Inositol - -
Mannitol + +
D-Sorbitol + +
Methyl αD-mannopyranoside - +
Methyl α D-glucopyranoside - -
N-Acetylglucosamine + +
Amygdalin - +
Arbutin - +
Esculin + +
Salicin - +
D-Cellobiose - +
D-Maltose + +
D-Lactose + +
D-Melibiose + +
D-Saccharose + +
D-Trehalose - +
Inulin - -
D-Melezitose - +
D-Raffinose + +
Amidon - -
Glycogen - -
Xylitol - -
Gentiobiose - +
D-Turanose - +
D-Lyxose - -
D-Tagatose - -
D-Fucose - -
L-Fucose - -
D-Arabitol - -
L-Arabitol - -
Potassium Gluconate - +
Potassium 2-Ketogluconate - -
Potassium 5-Ketogluconate - -
실시예 7. 안정성
1. 유산균의 내산성 조사
유산균이 장내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 위를 통과해야 한다. 유산균들의 내산성을 조사하기 위해서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고 그 다음 HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에 상기 유산균을 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 유산균 접종 직후와 2시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 유산균 수를 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
유산균 (CFU/ml)
LMT15-14 LMT19-1
MRS (pH 6.8) 3.2X109 4.6X109
MRS (pH 2.5) 2.7X109 4.5X109
실시예 7. 안정성
1. 유산균의 내산성 조사
유산균이 장내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 위를 통과해야 한다. 유산균들의 내산성을 조사하기 위해서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고 그 다음 HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에 상기 유산균을 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 유산균 접종 직후와 2시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 유산균 수를 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
유산균 (CFU/ml)
LMT15-14 LMT19-1
MRS (pH 6.8) 3.2X109 4.6X109
MRS (pH 2.5) 2.7X109 4.5X109
그 결과, 비알콜성 지방간 억제에 효과가 있는 2종 유산균 L. 살리바리우스 LMT15-14은 84.4%, L.플란타룸 LMT19-1은 97.8%로 pH 2.5에서 산성에 대해 높은 생존률을 확인할 수 있었다. 이러한 유산균들의 특징은 위의 생리적 pH와 가까운 pH 3보다 낮은 pH에서 50% 이상의 적정 유산균 수를 유지하였기 때문에 위산 분비로 인한 낮은 pH에서도 안정하게 생균수가 유지 가능하며 섭취 시 장내 도달율이 매우 높을 것으로 예상할 수 있다.
2. 유산균의 내담즙성 조사
유산균들의 내담즙성을 조사하기 위해 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 유산균은 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고 장관 내 담즙산염 농도가 0.1(w/v)% 내외임을 감안하여, 0.3(w/v)%의 담즙산염[(Bile salts (Sigma, USA)]이 함유된 MRS 액체 배지에 상기 유산균을 접종하여 37℃에서 2시간 동안 각각 배양하였다. 유산균 접종 직후와 2시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말 한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 유산균 수를 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.
유산균 (CFU/ml)
LMT15-14 LMT19-1
MRS 3.2X109 4.6X109
MRS (0.3% Bile salt) 2.7X107 3.4X109
그 결과, 비알콜성 지방간 억제에 효과가 있는 2종 유산균 L. 살리바리우스 LMT15-14은 0.8%, L.플란타룸 LMT19-1은 73.9%로 특히 L.플란타룸 LMT19-1은 장내 실제 농도와 유사한 0.1% 보다 더 높은 0.3%에서도 50%이상의 적정 유산균 수를 유지하였다. 따라서 인체나 동물의 장 내에서도 충분히 생존할 수 있고 장내 도달율이 매우 높을 것으로 예상할 수 있는 근거가 될 수 있다.
Figure PCTKR2020016195-appb-I000001
Figure PCTKR2020016195-appb-I000002

Claims (6)

  1. 중성지방 억제, 지방 산화 촉진 및 지방 합성 억제 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 LMT15-14(수탁번호 KCTC14142BP).
  2. 중성지방 억제, 지방 산화 촉진 및 지방 합성 억제 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 LMT19-1(수탁번호 KCTC14141BP).
  3. 유효성분으로 청구항 1 또는 2의 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는, 간기능 개선 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 비만 관련 질환은 비알콜성 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증, 지질 관련 대사증후군 및 비만으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  5. 유효성분으로 청구항 1 또는 2의 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는, 간기능 개선 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 비만 관련 질환은 비알콜성 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증, 지질 관련 대사증후군 및 비만으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
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