KR20200012978A

KR20200012978A - 가르시놀의 항-비만 가능성

Info

Publication number: KR20200012978A
Application number: KR1020197038979A
Authority: KR
Inventors: 무하메드 마지드; 칼야남 나가브후스하남; 락슈미 문드쿠르
Original assignee: 새미 랩스 리미티드
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2020-02-05
Also published as: JP2021185156A; WO2018231923A1; BR112019026824A2; EP3638226A4; KR102289324B1; JP2020523373A; EP3638226A1; MX2019014841A; JP2022097521A; AU2018284354A1; CA3066446A1

Abstract

비만의 치료학적 관리를 위한 가르시놀을 함유하는 조성물이 개시된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 a) 포유동물 지방세포 시스템 (adipose cellular system)에서 에너지 균형의 유지; b) 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)의 관리; 및 c) 포유동물에서 체중 증가의 감소;를 위한 가르시놀의 용도에 관한 것이다. 또한, 가르시놀에 의한 장내 미생물총(gut microbiota)의 변형 및 유익한 미생물 (beneficial microbe)인 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila )의 증가가 개시된다.

Description

가르시놀의 항-비만 가능성

관련 특허출원의 상호참조

본 발명은 2017년 6월 15일자 미국 가출원 제62519949호 및 2017년 6월 22일자 미국 가출원 제62523611호를 우선권으로 주장하는 PCT 출원이다.

기술분야

본 발명은 대체로, 체중 관리를 위한 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비만 및 고콜레스테롤혈증의 관리 및 장내 미생물총의 변형을 위한 가르시놀을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

비만은 고혈압, 제2형 당뇨병, 심장병, 뇌졸중, 골관절염(osteoarthritis), 및 정신질환(mental illness)과 같은 다양한 질환의 발달에 대한 주요 위험인자로 고려된다. 전 세계적으로, 10명 중 1명을 초과하는 개체가 비만이고, 미국 성인의 약 36%가 비만이다 (https://www.medicalnewstoday.com/articles/319902.php, 2018년 3월 10일에 접속함). 비만은 섭취한 음식의 에너지 함량과 생명을 유지하고 육체노동(physical work)을 수행하기 위해 신체에서 소비된 에너지 사이의 불균형으로 인해 야기된다. 이러한 에너지 균형 체계는 체중의 조절을 연구하기 위한 잠재적으로 강력한 도구이다.

백색 지방조직을 갈색 또는 베이지색(beige)/브라이트(brite)로 전환하는 것은 지나친 에너지 과다를 이용하고 에너지 소비를 증가시키는 효과적인 메커니즘으로 보고된다. 갈색 지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 역할은 다음의 선행기술에 잘 기재되어 있다:

1. Elattar.S 및 Satyanarayana, "Can Brown Fat Win the Battle against White Fat?", J Cell Physiol. 2015 Oct; 230910):2311-7;

2. Zafrir B, "Brown adipose tissue: research milestones of a potential player in human energy balance and obesity", Horm Metab Res. 2013 Oct;45(11):774-85); 및

3. Giralt M, Villarrova F "White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions? Endocrinology. 2013 Sep; 154(9):2992-3000.

백색 지방세포를 갈색 지방세포로 전환하는 것을 용이하게 하는 약물 및/또는 천연분자는 비만에 관련된 질환의 치료/관리에 효과적이다. 그러나, 비만과 같은 질환의 자연병력(natural history)을 설명하고, 치료학적 개입(therapeutic intervention)의 규모 및 잠재적 성공을 추정하기 위해, 에너지 소비에 관련된 구성 및 다양한 시간 척도(time scale)에 대한 이들의 상호작용에 대해서 보다 나은 이해가 필요하다 (Kevin D. Hall, Steven B. Heymsfield, Joseph W. Kemnitz, Samuel Klein, Dale A. Schoeller, 및 John R. Speakman, Energy balance and its components: implications for body weight regulation, Am J Clin Nutr. 2012 Apr; 95(4): 989-994).

최근, 비만 및 제II형 당뇨병과 같은 질환에서 장내 미생물총이 변형되었다는 것이 관찰되었다. 비만 개체에게 프로바이오틱스를 투여하는 것은 효과적인 체중 감소를 야기했다. 한 특정한 장내 미생물인, 아커만시아 무시니필 라(Akkermansia muciniphila )는 비만, 당뇨병, 심장 대사 질병(cardio metabolic disease) 및 저-등급 염증(low-grade inflammation)과 역의 관계에 있었다(inversely associated) (Cani 외, Next-Generation Beneficial Microbes: The Case of　Akkermansia muciniphila , Front. Microbiol., 22 September 2017, https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01765). 근거는 프리바이오틱스의 소화 후에, 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila)의 상대수도(relative abundance)가 100배 넘게 증가했다는 것을 나타낸다 (Everard 외, 2014 Microbiome of prebiotic-treated mice reveals novel targets involved in host response during obesity. ISME J. 8, 2116-2130. doi: 10.1038/ismej2014.45). 또한, 연구는 아커 만시아 무시니필라의 수가 비만 및 제2형 당뇨병 마우스에서 더 낮아지고, 항-당뇨 치료(antidiabetic treatment)와 함께 증가되는 것으로 밝혀졌다는 것을 나타냈다 (Cani 외, Next-Generation Beneficial Microbes: The Case of　Akkermansia muciniphila, Front. Microbiol., 22 September 2017, https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01765). 또 다른 연구는 아커만시아 무시니 필라 치료가 고지방 식단에 의해 유도된 대사 질환 - 체지방량 증가(fat-mass gain), 대사성 내독소혈증(metabolic endotoxemia), 지방조직 염증(adipose tissue inflammation), 및 인슐린 저항성(insulin resistance)을 포함 - 을 반전시켰다는 것을 관찰했다 (Amandine Everard, Clara Belzer, Lucie Geurts, Janneke P. Ouwerkerk,

Druart, Laure B. Bindels, Yves Guiot, Muriel Derrien, Giulio G. Muccioli, Nathalie M. Delzenne, Willem M. de Vos 및 Patrice D. Cani, Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity, PNAS May 28, 2013. 110 (22) 9066-9071). 따라서, 아커만시아 무시니필라의 생균수를 증가시키는 것은 비만, 당뇨병, 및 기타 대사 질환의 관리를 위한 효과적인 요법이 될 수 있다. 아커만시아 무시니필라의 프로바이오틱 효과 및 유익한 효과는 다음의 선행기술 문헌에 잘 기재되어 있다:

1. Cani 외, Next-Generation Beneficial Microbes: The Case of　Akkermansia muciniphila , Front. Microbiol., 22 September 2017, https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01765; 및

2.

외, Akkermansia muciniphila: a novel functional microbe with probiotic properties, Beneficial Microbes, 2016; 7(4): 571 -584.

천연분자는 비만 및 관련 질환의 관리에 대해서 현재 광범위하게 평가되고 있다. 가르시니아 캄보지아 ( Garcinia cambogia )의 추출물은 체중 감소 가능성을 갖는 것으로 보고되었다. US 제7063861호는 가르시놀과 히드록시 시트르산(hydroxycitric acid, HCA) 및 임의적으로, 안토시아닌(anthocyanin)을 함유하는 체중 감소 조성물을 개시한다. 또한, US 제8329743호는 가르시놀, 프테로스틸벤(pterostilbene) 및 안토시아닌을 함유하는 체중 감소 제제를 개시한다. US 제7063861호는 가르시놀 및 HCA 병용물이 항-비만 효과를 초래하는 HCA의 생체이용률(bioavailability)을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 가르시놀의 항-비만 효과 그 자체는 선행기술 문헌에서 보고되지 않았고, 또한 이로부터 예측될 수 없다. 더욱이, Heo 외(Gut microbiota Modulated by Probiotics and Garcinia cambogia Extract Correlate with Weight Gain and Adipocyte Sizes in High Fat-Fed Mice Sci Rep.　2016;6:33566)는 가르시놀에 대한 특정한 언급 없이, 가르시니아 캄보지아 추출물에 의한 장내 미생물총의 변형 및 아커만시아 무시니필라의 증가를 보고한다. 본 발명은 가르시놀에 의한 항-비만 효과 및 장내 마이크로바이옴(gut microbiome)을 변형시키는 능력을 개시함으로써 상기 기재된 문제점을 해결한다.

본 발명의 주된 목적은 체중 감소 및 에너지 균형을 초래함으로써 가르시놀의 항-비만 효과를 개시하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장내 마이크로바이옴을 변형시키고 프로바이오틱 박테리아인 아커만시아 무시니필라의 생균수를 증가시키는 가르시놀의 능력을 개시하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가르시놀의 저지질혈증 효과(hypolipidemic effect)를 개시하는 것이다.

본 발명은 상기 기재된 이러한 목적을 충족하고, 추가의 관련 이점을 제시한다.

본 발명은 비만 관리를 위한 가르시놀 조성물에 관련된 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 a) 포유동물 지방세포 시스템 (adipose cellular system)에서 에너지 균형의 유지; b) 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)의 관리; 및 c) 포유동물에서 체중 증가의 감소;를 위한 가르시놀의 용도에 관한 것이다. 또한, 가르시놀에 의한 장내 미생물총의 변형 및 유익한 미생물(beneficial microbe)인 아커만시아 무시니필라의 증가가 개시된다.

도 1a는 가르시놀에 의한 지방세포에서의 지방 축적에서, 용량 의존적 감소를 나타내는 지방세포의 오일레드-O 염색(oil-O-red staining)이다.
도 1b는 가르시놀에 의한 지방세포 생성의 억제 백분율에 대한 그래프이다.
도 2는 가르시놀 처리군에서 지방세포 생성에 관련된 유전자 발현의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 3은 가르시놀 처리군에서의 갈색지방 전환에 관련된 유전자 발현의 증가 및 지방 이용을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 4개월의 기간 동안에 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 중량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 120일의 기간 동안에 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 최종 중량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 마우스 신체에서 상이한 지방 패드 영역(fat pad region)을 나타내는 대표 이미지이다.
도 6은 상이한 농도의 가르시놀이 처리된 복막 지방조직(peritoneal fat tissue), 장간막 지방조직(mesenteric fat tissue), 및 생식선 주위 지방조직(perigonadal fat tissue)의 중량변화를 나타낸다.
도 7은 용량 의존적 방식으로, 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물에서 내장지방의 감소 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 지방조직에서 지방세포 생성에 관련된 유전자 발현의 감소 나타내는 그래프이다.
도 9는 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 지방조직에서, 지방 이용 및 갈색지방 전환에 관련된 유전자 발현의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 혈청 중 전체 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 10b는 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 혈청 중 LDL 및 VLDL의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 10c는 상이한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 혈청 중 HDL 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11은 HFD에 의해 유도된 비만 마우스에서 가르시놀을 이용한 항-비만 연구에 대한 실험 설계를 나타낸다.
도 12는 C57BL/6 마우스에서 HFD에 의해 유도된 비만에 대한 가르시놀의 효과를 나타내는 대표 이미지이다. 이미지 A는 13주 차의 종료에서 각 군의 마우스에 대한 대표 사진이다. 이미지 B는 생식선 주위 지방 조직(perigonadal adipose tissue)의 사진을 나타내고, 이미지 C는 간의 사진을 나타낸다.
도 13은 다양한 농도의 가르시놀이 투여된 동물의 체중에 대한 그래프이다. 체중을 매주 모니터링했고, 각 군의 평균 체중을 평균 ± SE로 표현했으며, p < 0.05이고; a, b, c, 및 d는 각 군 사이에서 유의하게 상이했다.
도 14a는 가르시놀이 투여된 동물의 생식선 주위 지방조직, 후복막 지방조직(retroperitoneal adipose tissue), 및 장간막 지방조직의 사진을 나타낸다.
도 14b는 가르시놀이 투여된 동물의 지방조직의 중량에 대한 그래프이다.
도 15a는 생식선 주위 지방조직에서 H&E 염색에 의한 병리학적 평가에 대한 각 연구군의 대표 이미지를 나타낸다.
도 15b는 가르시놀이 처리된 동물에 대한 지방세포 크기의 빈도 백분율 나타내는 그래프이다. 지방세포 크기는 대표적인 절편(representative section)으로부터 현미경하에서 정량화되었다.
도 16a 및 도 16b는 가르시놀이 투여된 동물에서, 콜로니 박테리아 군집(colonic bacterial community)의 분류학적 구성(taxonomic composition)의 변화를 나타낸다. 도 16a는 분변 미생물총(fecal microbiota)의 문 (phylum)의 변화를 나타내고, 도 16b는 속 상대수도(genus relative abundance)를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 모든 샘플의 정규화된 상대수도를 나타내는 주좌표 분석(Principal Coordinate Analysis, PCoA) 플롯을 도시한다. (A): 문. (B): 속.
도 17c는 HFD가 급식된 마우스(HFD-fed mice)에서 가르시놀에 의해 유의하게 변화된, 50 조작 분류 단위(operational taxonomic unit, OTU)의 존재비(abundance)를 나타내는 히트맵(Heatmap)을 도시한다.
도 18a는 HFD가 급식된 C57BL/6 마우스 생식선 주위 지방조직에서 지방세포-특이적 인자의 단백질 발현 및 AMPK 신호전달에 대한 가르시놀의 효과를 나타낸다. p-AMPK (Thr172), AMPK, Pref-1, SREBP-1 및 PPARγ의 단백질 수준은 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 측정되었다. β-액틴(β-actin)을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 18b는 HFD가 급식된 C57BL/6 마우스 생식선 주위 지방조직에서 지방세포-특이적 인자의 단백질 발현의 수준 및 AMPK 신호전달의 그래프이다. 값은 β-액틴에 대해서 정규화된 단백질 밴드의 상대적인 밀도를 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.005; HFD 단독 처리와 비교됨.
도 19a는 다양한 농도의 가르시놀 및 가르시놀 배합물(garcinol blend)이 투여된 동물의 체중에 대한 그래프이다.
도 19b는 연구 기간의 종료에서, 마우스의 각 군에 대한 대표 사진이다.
도 20a는 상이한 농도의 가르시놀 및 가르시놀 배합물이 투여된 동물의 생식선 주위 지방 중량의 그래프이다.
도 20b는 상이한 농도의 가르시놀 및 가르시놀 배합물이 투여된 동물의 후복막 지방 중량에 대한 그래프이다.
도 20c는 상이한 농도의 가르시놀 및 가르시놀 배합물이 투여된 동물의 장간막 지방 중량에 대한 그래프이다.

가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 비만을 치료학적으로 관리하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 가르시놀(garcinol)을 함유하는 조성물의 유효농도를 상기 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물에서 a) 지방세포 생성(adipogenesis)의 억제; 및 b) 체중 및 내장지방(visceral fat)의 감소;를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 지방세포 생성의 억제는 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ), CCAAT/인핸서 결합 단백질 알파(CCAAT/enhancer binding protein alpha, cEBPα), 제1 세포예정사 신호(first apoptotic signal, FAS), 지방세포 단백질 2(adipocyte protein 2, AP2), 레지스틴(resistin) 및 렙틴(leptin)으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아닌 유전자의 하향조절(down regulation)에 의해 초래된다. 관련 양태에서, 지방세포 생성의 억제는 포스포-아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 키나아제(phospho-adenosine monophosphate-activated protein kinase, p-AMPK), AMP-활성화 단백질 키나아제(AMP-activated protein kinase, AMPK) 및 지방 전구세포 인자 1(Preadipocyte factor 1, PREF-1)로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아닌 유전자의 상향조절(up regulation)에 의해 초래된다. 다른 관련 양태에서, 상기 내장지방은 장간막 지방(mesenteric fat), 복막 지방(peritoneal fat) 및 생식선 주위 지방(perigonadal fat)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관련 양태에서, 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물 지방 세포 시스템(mammalian adipose cellular system)에서 에너지 균형(energy balance)을 달성하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 포유동물 지방 전구세포 (pre-adipocyte) 및/또는 지방세포(adipocyte)에 대해서 표적된 유효량의 가르시놀을 함유하는 조성물을 투여해, (a) 지방세포 생성의 증가된 억제; 및 (b) 개별적으로 또는 함께 작용하여 갈색 지방세포(brown adipocyte) 또는 갈색-유사(brown like) [베이지색(beige) 또는 브라이트(brite)] 지방세포를 특이적으로 리쿠르트하는(recruiting) 인자들의 증가된 발현;의 효과를 달성하고, (c) 백색 지방세포 축적부위 (white adipocyte depot)에서 갈색-유사 표현형(brown like phenotype) (베이지색 또는 브라이트(brite))을 유도해, 상기 포유동물에서 지방 이용(fat utilization) 및 에너지 균형의 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 인자들은 막관통 단백질인 미토콘드리아 언-커플링 단백질-1(mitochondrial uncoupling protein-1, mitochondrial UCP-1); 전사 공동-조절자(transcription co-regulator)인 PR 도메인 함유 단백질 16(PR domain containing protein 16, PRDM16); 에너지 대사에 관여하는 유전자를 조절하는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마 공동 활성인자 1-알파(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PGC-1α); 및 에너지 소비를 조절하는 분비형 단백질인 골형성 단백질 7(bone morphogenic protein 7, BMP7);을 포함한다. 관련 양태에서, 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 장내 미생물총(gut microbiota)을 변형시키는 방법을 개시하고, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효량을 상기 포유동물에 투여하여 상기 장내 미생물총의 변화를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 장내 미생물총은 디페리박테레스 문(Phylum Deferribacteres ), 프로테오박테리아 문(Phylum Proteobacteria ), 박테로이데테스 문 (Phylum Bacteroidetes ), 베루코미크로비아 문(Phylum Verrucomicrobia) 및 피르미쿠테스 문(Phylum Firmicutes )으로부터 선택된다. 다른 관련 양태에서, 상기 장내 미생물총은 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 부티리비브리오 속(genus Butyrivibrio ), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 언에어로브란카 속(genus Anaerobranca ), 디스고노모나스 속(genus Dysgonomonas ), 존스넬라 속(genus Johnsonella ), 루미노코커스 속(genus Ruminococcus ), 박테로이 데스 속(genus Bacteroides ), 오실로스피라 속(genus Oscillospira ), 파라박터로이 데스 속(genus Parabacterroides ), 아커마니사 속(genus Akkermanisa ), 및 블라우 티아 속(genus Blautia )으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로는, 상기 장내 미생물총은 파라박테로이데스 골드스테이니 ( Parabacteroides goldsteinii ), 박테로이데스 칵카에(Bacteroides caccae ), 존스넬라 이그나바 ( Johnsonella ignava ), 블라우티아 웩슬러래(Blautia wexlerae ), 디스고노모나스 윔펜나이 ( Dysgonomonas wimpennyi ), 블라우티아 한센니 ( Blautia hansenni ), 언에어로브란카 자바르진니 ( Anaerobranca zavarzinni), 오실로스피라 족( Oscillospira eae ), 무시스피릴루스 스카에들러리 (Mucispirillus schaedleri ), 블라우티아 콕코이데스 ( Blautia coccoides ), 언에어로트런쿠스 콜리호미니스 ( Anaerotruncus colihominis ), 부티리비브로 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibro proteoclasticus ), 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila), 라크노스포라 펙티노스키자 ( Lachnospora pectinoschiza ), 페도박터 광양제네시스(Pedobacter kwangyangensis ), 알칼리필루스 크로토나톡시단스 (Alkaliphilus crotonatoxidans ), 락토바실러스 살리바리우스 (lactobacillus salivarius), 언에어리비브리아 리폴리티쿠스 ( Anaerivibria lipolyticus ), 로도써머스 클라루스 ( Rhodothermus clarus ), 박테로이데스 스테르코리로소리 스(Bacteroides stercorirosoris ), 루미노코코커스 플라베파시엔스 ( Ruminocococcus flavefaciens), 박테로이데스 자일라니솔벤스 ( Bacteroides xylanisolvens ), 루미노코커스 그나부스 ( Ruminococcus gnavus ), 클로스트리듐 테르미티디스 (Clostridium termitidis), 클로스트리듐 알칼리셀룰로시 (Clostridium alkalicellulosi ), 엠티시시아 올리고라피카 ( Emticicia oligoraphica ), 슈도부티리비브로 자일라니보란스 (Pseudobutyrivibro xylanivorans ), 액티노마이세스 나투라 ( Actinomyces naturae), 펩토니필루스 콕시 ( Peptoniphilus coxii ), 및 돌리코스페르뭄 쿠르 붐(Dolichospermum curvum )으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관련 양태에서, 장내 미생물총의 변형은 비만(obesity), 심혈관 합병증(cardiovascular complication), 염증성 장 질병(Inflammatory bowel disease), 크론병, 셀리악병(Celiac disease), 대사증후군(metabolic syndrome), 간 질병(liver disease) 및 신경계 질환(neurological disorder)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료학적 관리에 효과적이다. 관련 양태에서, 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물의 장(gut)에서 아커만시아 무 시니필라(Akkermansia muciniphila )의 생균수를 증가시키는 방법을 개시하고, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효량을 포유동물에 투여하여 아커만시아 무시니필라의 콜로니의 증가를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 아커만시아 무시니필라의 콜로니 수의 증가는 엔도카나비노이드 방출 (endocannabinoid release)을 야기함으로써 AMPK 신호전달 경로(AMPK signaling pathway)를 통해 체중을 감소시킨다. 관련 양태에서, 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 고지혈증(hyperlipidemia)을 치료학적으로 관리하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효농도를 투여하여, 상기 포유동물의 혈액에서 (i) 전혈 콜레스테롤 수준(total blood cholesterol level)의 양을 감소시키고; (ii) 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL) 및 초저밀도 지질단백질(very low density lipoprotein, VLDL)의 농도를 감소시키며; (iii) 고밀도 지질단백질(high density lipoprotein, HDL)의 농도를 증가시키고; (iv) 혈청 트리글리세리드(serum triglyceride)의 농도를 감소시키는; 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 고지혈증의 의학적 원인은 비만이다. 관련 양태에서, 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 프리바이오틱 제제(prebiotic agent)로 이용하기 위한, 가르시놀을 함유하는 조성물을 개시한다.

가장 바람직한 양태를 명확히 진술하는 특정한 실례적인 실시예가 본원의 아래에 포함된다.

[ 실시예 1: 가르시놀의 항-비만 효과 - 인도, 방갈로르 소재의 새미랩스 리미티드; 및 인도, 티루치라팔리 소재의 스리마드 안다반 아츠 & 사이언스 컬리지;에서 수행된 연구]

배양된 3T3L1 및 동물 조직에서의 가르시놀에 의한 지방세포 생성 억제 및 갈색지방 특이적 유전자 발현

방법론

저장용액의 제조

10 mg/ml의 가르시놀 (20%) 저장용액을 DMSO 중에 제조하였고, 0.2 미크론 주사기 필터를 통과시켜 여과했다. 저장용액을 DMEM 중에 1000배 희석시켜, 10 μg/ml의 최종 농도를 수득했고, 연속 희석시켰다. 인슐린 (Hi Media)을 20 mg/ml 농도의 용액으로 구매했다. 이를 DMEM 중 1 μg/ml로 희석시켰다. 5mM의 IBMX (Sigma) 저장용액을 DMEM 중에 제조했고, 최종농도 0.5mM로 이용하기 위해 10배 희석시켰다. 10 μM의 덱사메타손 (Dexamethasone) (Sigma) 저장용액을 DMEM 중에 제조했고, 40배 희석시켜 최종농도 0.25 μM를 수득했다.

세포배양

마우스 3T3-L1 지방 전구세포를, 10%의 가열-불활성화 우태아 혈청(heat-inactivated fetal calf serum) 및 항생제와 함께 25 mM의 포도당을 함유하는 DMEM 중에, 37°C 및 5% CO₂에서 배양시켰다. 세포가 70-80% 밀집된(confluent) 경우에, 이 세포를 트립신으로 처리했고(trypsinizing), 세척하였으며, 웰 당 2x10⁶ 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 씨딩했다(seeding). 1μg/mL의 인슐린, 0.25μM의 덱사메타손, 0.5mM의 1-메틸-3-이소부틸-잔틴(1-methyl-3-isobutyl-xanthine, IBMX) 및 상이한 농도의 가르시놀 (20%)과 함께, 10%의 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 함유한 DMEM 배지를 보충함으로써, 세포가 컨플루언스(confluence)에 도달한 후에(0일차), 2d로 분화되도록 유도했다. 3일차 내지 7일차까지, 1μg/mL의 인슐린 및 상이한 농도의 가르시놀(20%)이 보충된 진행 배지(progression media) 중에 세포를 유지시켰다. FCS 배지중에서 성장된 비-처리 세포 및 비-분화 세포를 실험을 위한 지방세포 생성 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 수득했다. 지방세포에 축적된 트리글리세리드의 양에 대한 정량을 오일레드-O 염색(Oil red O staining)에 의해 수행했다.

RNA 추출

7일차에서 두번째 진행 후에, 세포를 수확했고, 트리졸법(Trizol method)을 이용하여 전체 RNA를 추출했다. 추출된 RNA를 DNA 분해효소 I로 처리하여 임의의 오염 DNA를 제거했고, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 추출 (24:25:1)을 이용해 재차 추출했다. RNA의 품질을 나노드랍(Nanodrop) (Thermo)을 이용해 260/280 nm에서 흡광도를 확인함으로써 측정했다.

마우스 지방 패드(fat pad)에서의 유전자 발현 연구

처리 및 비-처리된 동물로부터 수득된, 동결된 지방 패드를 RNA로 수집한 후에, 동결시켰다. 약 100mg의 조직을 얼음중에서 균질화시켰고(homogenizing), 이전에 기재된 바와 같이, 1 ml의 트리아졸로 추출했다.

정량적 실시간 PCR

수퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 합성 시스템(SuperScript III First-Strand Synthesis System) (Life Technologies)을 이용하여, 2μg의 전체 RNA를 cDNA로 합성시켰다. SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green master mix) (Thermo Scientific)를 이용해, 로슈 라이트 사이클러 96(Roche Light cycler 96)에서 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여 갈색지방 특이적 유전자의 발현을 측정했다. β-액틴을 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)로 이용했다. BAT 유전자의 상대적인 RNA 존재비(abundance)를 하우스키핑 β-액틴 유전자에 대해서 정규화했고, 델타 델타 CT(delta delta CT)로 표현했다 (Log₂에 의해 변환된 배수 변화에 등가임).

프라이머 서열: 갈색지방 특이적 유전자 및 지방세포 생성에 관련된 유전자의 발현을 측정하는데 이용되는 프라이머를 하기의 표 1에 제시한다.

[표 1: BAT 및 지방세포 생성 특이적 유전자 발현의 분석에 이용되는 프라이머 ]

결과

지방세포에 축적된 지질을 오일레드 O 염색에 의해 정량했다. 가르시놀은 지방세포에서, 지질 축적의 용량 의존적 감소를 보였는데 (도 1), 5 μg/ml의 가르시놀은 지질 축적에서 47.8%의 최고 억제를 보였고, 10 μg/ml의 가르시놀은 지질 축적에서 47.2%의 최고 억제를 보였다 (도 1b).

지방세포 생성에 관여하는 유전자에 대해서, PPARγ는 지방세포 생성의 핵심 조절자(master regulator)일 것으로 고려된다. PPARγ 발현의 감소는 다른 지방세포 생성 특이적 유전자의 발현을 감소시킬 것이다. 본 연구에서, 가르시놀은 PPARγ 발현; 및 cEBPα, FAS 및 AP2와 같은 지방세포 생성 및 지방산 합성에 관련된 유전자 발현의 용량 소비적 감소 (dose expended reduction)를 보였는데(도 2), 이는 가르시놀이 용량 의존적 방식으로 지방세포 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.

또한, 가르시놀은 갈색지방 조직 특이적 유전자를 유의하게 증가시켰다. UCP1, PRDM16, PGC1α 및 BMP7의 발현은 가르시놀에 의해 용량 의존적 방식으로 증가되었고(도 3), 이는 가르시놀이 백색 지방조직 축적부위를 갈색 또는 베이지색/브라이트 지방조직으로 전환하는 것에 효과적이므로, 지방 이용 및 지방분해(lipolysis)에 의한 에너지 소비를 증가시킨다는 것을 시사한다.

C57 마우스에서 고지방 식단에 의해 유도된 비만에 대한 가르시놀의 효과

방법론

동물

그룹 당 6-8 주령의 C57/BL6 마우스 8마리(4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)를 연구에 이용했다. 동물을 표준 실험실 조건하에서 사육했고, 상기 표준 실험실 조건은 충분한 신선한 급기(fresh air supply)로 에어컨이 조절되고 (시간 당 12 - 15회의 공기 교체), 실온이 20.2 - 23.5°C이며, 상대습도가 58-64%이고, 12시간 형광등을 켜고 12시간 어둡게 하는 사이클을 갖는다. 온도 및 상대습도를 일일 일회 기록했다.

급식 (feeding)

순응(acclimatization) 및 실험기간에 걸쳐, 정상 식단 (9kcal/일) 및 고지방 식단(50kcal/일)을 동물에 급식했다.

순응 및 실험기간에 걸쳐, 물을 고지방 식단과 함께 동물에 제공했다. 물 필터 겸 정수기(water filter cum purifier)로부터 수득한 물을 스테인리스 스틸 시퍼 튜브(stainless steel sipper tube)가 장착된 동물 급식 바틀(animal feeding bottle)에 제공했다.

모든 연구는 위원회로부터 필수적인 승인을 획득한 후에, CPCSEA의 윤리 가이드라인에 따라 수행했다 (승인번호: 790/03/ac/CPCSEA).

a. 동물실험의 제어 및 감독의 목적을 위한 위원회(Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animal, CPCSEA)의 권고에 따라서, 실험실 동물 시설에 대한 가이드라인이 1998년 12월 15일, 인도의 관보(gazette)에 공개되었다.

b. 본 연구 (항-비만 활성)에 대한 CPCSEA 승인번호는 SAC/IAEC/BC/2017/IP.-001이다.

연구군의 설계가 표 2에 기재된다.

[표 2: 연구 설계 (16주)]

실험기간의 모든 일자에서 동물의 체중을 기록했다. 실험기간의 종료에서, 동물을 경추탈골(cervical dislocation)에 의해 희생시켰다. 혈액을 수집하여, 원심분리에 의해 혈청을 분리했고, 생화학적 파라미터의 분석에 이용했다. 간, 신장, 비장 및 췌장과 같은 기관 및 지방 조직(후복막, 생식선 주위, 및 장간막)을 절개하였고, 포스페이트 완충 식염수로 세척했다.

효능 측정

하기 파라미터를 상기 기재된 군에서 측정했다:

체중의 측정;

기관 중량의 측정;

콜레스테롤의 추정 (Zak 외, (2009) A new method for the determination of serum cholesterol. J Clin Endocrinol Metab., 94(7), 2215-2220);

트리글리세리드의 추정 (Foster L.B 및 Dunn R.T. (1973) Stable reagents for determination of serum triglycerides by a colorimetric Hantzsch condensation method. Clin Chem, 196, 338-340);

HDL 콜레스테롤의 추정 (Burstein 외, (1970). Determination of HDL cholesterol. J.lipid Res., 11, 583); 및

LDL 및 VLDL의 측정 (Friedewald 외, (1972) Estimation of the concentration of Low Density Lipoprotein cholesterol in plasma without use of preparative centrifuge. J.Clin Chem.; 18:499).

결과

체중

결과는 가르시놀이 120일의 기간 동안에 고지방 식단을 제공받은 동물에서, 체중 증가를 용량 의존적 방식으로 억제했다는 것을 나타냈다(도 4a 및 도 4b). 중량의 변화 백분율은 아래 표에 기재된다.

[표 3: 연구 동물의 중량 변화]

지방 침착(fat deposit)의 감소

마우스의 상이한 지방 패드 영역(fat pad region)의 지방 감소(도 5)를 또한 평가했다. 120일 동안의 가르시놀 투여 후, 후복막, 생식선 주위 및 장간막 지방 침착의 중량을 아래에 표로 나타낸다.

[표 4: HFD에 의해 유도된 마우스의 지방 중량에 대한 가르시놀의 효과]

가르시놀 처리는 상이한 지방 패드 영역에서 지방 축적을 유의하게 감소시켰다 (도 6). 최대 효과를 보이는, 체중 1kg 당 용량 10 mg의 가르시놀 처리에 의해, 내장지방의 백분율이 감소되었다 (도 7).

기관 중량

가르시놀 투여는 기관의 중량에 부정적으로 영향을 끼치지 않았는데, 이는 가르시놀 용량이 주요 장기에서 임의의 부작용을 유도하지 않는다는 것을 시사한다 (표 5).

[표 5: 가르시놀이 처리된 동물에서 신장, 비장 및 췌장의 중량]

유전자 발현

가르시놀이 처리된 동물의 지방 패드에서 지방세포 생성에 관련된 유전자 발현의 감소가 관찰되었다. 마우스 3T3-L1 세포주와 유사하게, 가르시놀 투여는 지방패드 영역에서 PPARγ, AP2, FAS, 레지스틴 및 렙틴의 발현을 유의하게 감소시켰다 (도 8a 및 8b). 마찬가지로, 가르시놀 투여는 마우스 지방 패드 영역에서 갈색지방 특이적 유전자의 발현을 효과적으로 증가시켰다 (도 9).

지질 프로필(Lipid profile)

고지방 식단은 연구 동물의 혈청 중 전체 콜레스테롤, LDL, VLDL 및 트리글리세리드의 수준을 증가시켰다. 가르시놀과 공동-투여된 고지방 식단은 혈청 중 전체 콜레스테롤과 트리글리세리드의 수준 (도 10a); 및 LDL과 VLDL의 수준 (도 10b)을 유의하게 감소시켰고, HDL 수준을 증가시켰다 (도 10c).

결론

가르시놀 처리는 시험관내에서 지방세포 생성의 용량 의존적인 억제를 보였고, 백색 지방조직이 갈색 또는 브라이트/베이지색으로 전환되는 것을 유도했으므로, 지방 이용 및 에너지 대사를 증가시켰다. 생체내 결과는 가르시놀이 10 mg/kg에서 체중 및 내장 지방 축적을 유의하게 감소시키는 데 효과적이었고, 지방세포 생성 특이적 유전자 발현을 감소시켰으며, 마우스 지방 패드에서 지방 패드의 갈색 지방조직에 특이적인 유전자를 증가시켰다는 것을 나타냈다. 또한, 가르시놀 투여는 내장지방 및 기관 중량의 감소를 야기했는데, 이는 가르시놀이 지방분해 및 에너지 대사를 촉진한다는 것을 나타낸다. 전체적으로, 가르시놀은 체중 감소를 유도하고, 내장지방을 감소시키며, 주요 장기의 건강을 유지한다.

[ 실시예 2: 가르시놀의 항-비만 효과 - 타이완, 타이페이 소재의 국립 타이완 대학교에서 수행된 연구]

방법론

시약 및 항체

AMPK 및 p-AMPK (Thr172) 항체를 Cell Signaling Technology (미국, 매사추세츠 주, 베벌리 소재)로부터 구입했다. SREBP-1 항체를 Santa Cruz Biotechnology (미국, 캘리포니아 주, 산타 크루즈 소재)로부터 구입했다. PPARγ 및 Pref-1 항체를 abcam (영국, 캐임브리지 소재)으로부터 구입했다. 마우스 β-액틴 단일클론 항체를 Sigma Chemical Co (미국, 미주리 주, 세인트 루이스 소재)로부터 입수했다. 바이오-라드 단백질 검정 염색 시약(Bio-Rad protein assay dye reagent)을 Bio-Rad Laboratories (독일, 뮌헨 소재)로부터 구매했다. 자일렌과 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E) 염색을 Surgipath (영국, 피터버러 소재)로부터 입수했다. 동물 식단의 일부로 이용된 콜레스테롤을 Acros Organics (미국, 뉴저지 주, 브릿지워터 소재)로부터 입수했다. 가르시놀은 사빈사 코포레이션(미국, 뉴저지 주, 이스트 윈져 소재)으로부터 입수했다. 가르시놀의 순도는 고-성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)에 의해 99%를 초과하는 것으로 측정되었다.

동물관리 및 실험설계

5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 BioLASCO Experimental Animal Center(타이완, 타이페이 소재의 Taiwan Co., Ltd)로부터 구입하여, 12시간의 명/암 사이클의 제어된 분위기(50%의 상대습도에서, 25±1°C)에서 사육했다. 일주일의 순응 후에, 동물을 13주 동안의 정상 식단(ND, 15%의 에너지를 지방으로); HFD (50%의 에너지를 지방으로); 및 0.1% 또는 0.5%의 가르시놀과 병용된 HFD 군;으로, 각 군 당 8마리의 마우스를 무작위로 분배했다. 실험설계는 도 11에 요약된다. 실험 식단을 Purina 5001 diet (미국, 미주리 주, 세인트 루이스 소재, LabDiet, PMI Nutrition International)로부터 변형했다. 동물은 음식과 물에 대해, 자유식(ad libitum)으로 접근할 수 있었다. 음식 컵을 매일 신선한 식단으로 다시 채웠다. 본 연구에서 이용된 모든 동물실험 프로토콜은 국립 타이완 대학교의 동물실험 윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of the National Taiwan University, IACUC; NTU)에 의해 승인되었다. 본 연구의 종결에서, 동물들을 이산화탄소 질식(CO₂ asphyxiation)에 의해 희생시켰고, 해부했으며, 이들의 전체 신체의 중량을 측정했고, 간, 신장, 비장, 지방조직(생식선 주위, 후복막 및 장간막 지방)을 포함한 선택된 조직 및 혈청을 즉시 수집하였고, 중량을 측정했으며, 사진을 촬영했다.

조직병리학 검사( Histopathological examination)

생식선 주위 지방의 부분 및 간의 정중엽(median lobe)을 절개하여, 10%의 완충 포르말린(buffered formalin) 중에 고정시켰고, 일련의 에탄올 용액으로 탈수시켰으며, 처리하여 파라핀 중에 포매했다(embedding). 두께가 35 μm인 절편(section)을 절제했고, 탈-파라핀화시켰으며(deparaffinizing), 재-수화하였고(rehydrating), H&E로 염색하여, 광학 현미경 평가(photomicroscopic assessment)를 수행했다. 지방세포 크기를 Image J 소프트웨어 (미국, 메릴랜드 주, 베서스다 소재의 Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health)를 이용하여 측정했다.

생화학적 분석

전신마취(anesthesia) 하에서, 혈액 샘플을 좌심실(left ventricle)로부터 수집하였다. 샘플을 10 μL의 헤파린 소듐(heparin sodium) 중에 혼합하였고, 3500 rpm에서, 4 °C에서 10분 동안 원심분리시켰다. 그런 다음에, 혈장을 이용하기 전까지 -80 °C에 저장했다. 글루타믹-피루빅 아미노기 전이효소(Glutamic-pyruvic transaminase, GPT), 전체 콜레스테롤(total cholesterol, TC), TG, 고밀도 지질단백질(high-density lipoprotein, HDL), 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein, LDL) 수준을 국립 실험동물 센터 (National Laboratory Animal Center, NLAC) (타이완, 타이페이 소재)에서, 7080 Biochemical Analyzer (일본, 도교, 소재, Hitachi) 상에서 제조사의 설명서에 따라 분석했다.

16S rDNA 유전자 시퀀싱 및 분석

전체 DNA를 신선한 분변 샘플(fresh fecal sample)로부터 추출했다. 정제된 DNA를 innuSPEED Stool DNA 키트 (독일, 예나 소재, Analytik Jena AG)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 용출했다. Caporaso 외로부터의 PCR 프라이머 서열 (Caporaso, J. G., Lauber, C. L., Walters, W. A., Berg-Lyons, D. 외, Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc . Natl . Acad . Sci U.S A 2011, 108 Suppl 1, 4516-4522)을 이용하여 16S rRNA 가변 영역의 증폭에 이용했고; Tung 외 (Tung, Y. C., Lin, Y. H., Chen, H. J., Chou, S. C. 외, Piceatannol Exerts Anti-Obesity Effects in C57BL/6 Mice through Modulating Adipogenic Proteins and Gut Microbiota. Molecules. 2016, 21) 및 Chou 외 (Chou, Y. C., Suh, J. H., Wang, Y., Pahwa, M. 외, Boswellia serrata resin extract alleviates azoxymethane (AOM)/dextran sodium sulfate (DSS)-induced colon tumorigenesis. Mol . Nutr Food Res. 2017, 61)에 기재된 대로, PCR 조건을 수행했다. 이어서, Illumina DNA Library Preparation 키트 (미국, 캘리포니아 주, 샌디에고 소재, Illumina)를 이용한 인덱스-표지 라이브러리(index-labeled library)의 제작에 증폭산물을 이용했다. Illumina MiniSeq NGS 시스템 (Illumina)을 100,000개가 넘는 리드(read)의 분석에, 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing) (2 Х 150 bp)으로 이용했고, 메타지노믹스 워크플로우(metagenomics workflow)는 16S rRNA 데이터의 데이터베이스를 이용하여 증폭산물로부터 유기체를 분류했다(classifying). 분류는 Greengenes 데이터베이스 (https://greengenes.lbl.gov/)에 기초했다. 상기 워크플로우의 결과는 몇몇 분류학적 수준에서의 리드의 분류였다: 계(kingdom), 문(Phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus), 및 종(species).

단백질 제조 및 웨스턴 블랏

얼음 위에서, 1 Protease Inhibitor Cocktail Tablet (미국, 인디애나 주, 인디애나 폴리스 소재, Roche)을 함유하는 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(ice-cold lysis buffer) [10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, 1 mM Na₄P₂O₇, 20 mM 트리스 버퍼 (pH7.9), 100 μM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 137 mM NaCl, 및 5 mM EDTA] 중에서 조직을 1시간 동안 균질화시킨 후에, 17,500g에서 30분 동안 4°C에서 원심분리시켰다. Bio-Rad protein assay (미국, 캘리포니아 주, 에르쿨레스 소재, Bio-Rad Laboratories, Inc.)로 단백질 농도를 측정했다.

통계학적 분석

마우스 군 간의 차이의 유의성에 대한 통계학적 평가(Statistical evaluation)를 스튜던트 t-검정(Student t-test)을 이용하여 평가했다. 다중군(multiple group)을 비교하는 실험에 대해서, 일원 (one-way) 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 및 던컨의 사후검정(Duncan's post-hoc test)을 수행함으로써 차이를 분석했다. 데이터는 명시된 수의 독립적으로 수행된 실험에 대해서 평균 ±SE로 제시되고, p 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 감안했다. 주성분 분석(Principal component analysis, PCA)을 수행하여 샘플간의 차이를 가시화했다.

결과

체중 증가

결과는 13주 동안의 HFD 급식이, 생식선 주위, 후복막, 및 장간막 지방 축적과 함께, 체중 및 간 중량의 유의한 증가를 초래했다는 것을 나타냈다. 0.1% 및 0.5%의 가르시놀이 보충된 식단은 체중을 용량 의존적 방식으로 감소시켰다. 고용량의 가르시놀(0.5%)과 HFD 식단의 공동-처리(Co-treatment)는 체중 증가를 억제했으므로, HFD + 0.5% 가르시놀과 ND 군 사이의 차이는 존재하지 않았다 (도 12 및 도 13).

백색 지방조직 지방세포 크기 및 간 항상성(liver homeostasis)에 대한 효과

HFD 군에 비해서, 0.5% 농도의 가르시놀은 3종의 백색 지방 모두의 지방 중량을 극적으로 감소시켰고, 생식선 주위에 대해서 중량을 85.1%, 후복막에 대해서 중량을 92.4%, 장간막에 대해서 중량을 77.7% 감소시켰다 (도 14a 및 14b).

생식선 주위 지방조직 내 평균 지방세포의 크기를 H&E 염색에 의해 평가했고, 결과는 ND 마우스의 지방세포에 비해서, HFD가 급식된 마우스에서 지방세포가 확장되었다는 것을 드러냈다. 증가된 지방세포 크기는 가르시놀이 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었다 (도 15). 가르시놀(0.5%)은 HFD에 의해 유도된 지방세포의 확장 - 2000 μm² 크기의 지방세포 분포를 만드는 - 을 예방할 수 있었다. 중요한 것은, 지방세포 크기가 가르시놀에 의해 용량 의존적 방식으로 예방될 수 있거나, 또는 억제될 수 있다는 것이다 (표 6).

[표 6: 지방세포 크기에 대한 가르시놀의 효과]

4개 군 간의 차이의 유의성을 일원 ANOVA 및 던컨의 다중-범위 검정(Duncan's multiple-range test)에 의해 분석했다. 상이한 문자를 갖는 값은 각 군 사이에서 유의하게 상이한 것(p<0.05) 이다.

지질 프로필

혈장 지질 프로필을 또한 분석했고, 이를 표 7에 제시한다.

[표 7: 가르시놀이 투여된 마우스에서의 지질 프로필]

데이터를 평균 ± SE로 나타냈다. 4개 군 간 차이의 유의성을 일원 ANOVA 및 던컨의 다중-범위 검정에 의해 분석했다. 동일한 행(row)에 존재하는 동일한 첨자를 공유하지 않는 값은 군 사이에서 유의하게 상이하다. p< 0.05; a, b, c, 및 d는 각 군 사이에서 유의하게 상이하다.

0.1% 및 0.5%의 가르시놀이 투여된 마우스는 TC와 TG 모두의 혈청 수준을 유의하게 축소시켰다. LDL 및 HDL에 대해서, 가르시놀 (0.1 및 0.5%)은 HFD에 의해 유도된 LDL 수준을 용량 의존적 방식으로 감소시킬 수 있었다. TC가 HFD에 의해 초래됨에 따라, HFD 군은 LDL 수준을 증가시킬뿐 아니라, HDL 수준도 또한 증가시킨다. 따라서, LDL/HDL 비율을 이용하여, 이 변화를 표현했다. 고-투여량 및 저-투여량의 가르시놀은 HFD 군에 비해서, LDL/HDL 비율을 유의하게 축소시킬 수 있다.

가르시놀은 HFD에 의해 유도된 장내 미생물 불균형 (gut dysbiosis )을 역전시켰다

상이한 군에서 박테리아 군집의 전반적인 구성을, 속 수준(genus level)에서 메타지놈 샘플들(metagenomic sample) 사이의 박테리아의 분류학적 유사성(bacterial taxonomic similarity)의 정도를 분석함으로써 평가했다. 박테리아 군집을 PCA를 이용하여 클러스터링했고(clustering), HFD 식단/ 가르시놀 처리에 기초하여, 미생물 군집을 구별했다. 비만 인간 및 HFD가 급식된 마우스의 장내 미생물총을 증가된 피르미쿠테스 대(vs) 박테로이데테스 비율 (Firmicutes-to-Bacteroidetes ratio, F/B ratio)에 의해 특성화했다 (Brun, P., Castagliuolo, I., Di, L., V, Buda, A. 외, Increased intestinal permeability in obese mice: new evidence in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Am.J Physiol Gastrointest .Liver Physiol 2007, 292, G518-G525). 결과는 문 수준(phylum level)의 HFD 군이 ND 군에 비해서 더 높은 F/B 비율을 가진다는 것을 나타냈다 (도 16a). 흥미롭게도, 가르시놀 처리는 박테로이데스 군집을 매우 상승시킴으로써 F/B 비율을 감소시켰다. 또한, 가르시놀 처리는 베루코미크로비아 군집의 수가 증가되도록 했다 (도 16b). 군집 구조의 UniFrac-기반 쌍대비교(UniFrac-based pairwise comparison)의 PCA는 4개 마우스 군 사이의 미생물 군집의 분포를 개시했다. PCA의 주요 발견은 상이한 식단이 다양한 장내 미생물 군집의 발달을 촉진시켰다는 것이었다. HFD가 급식된 마우스는 ND 군 마우스와 별개인 클러스터를 형성했고, HFD가 급식된 마우스는 또한, 가르시놀 처리 마우스와 별개였다 (도 17a, 17 b 및 17 c). 그러나, 고용량의 가르시놀(0.5%)이 처리된 마우스의 미생물 군집은 ND 마우스의 미생물 군집과 가깝게 클러스터링 되었는데, 이는 가르시놀이 장내 미생물 군집 구성에 대한 주목할 만한 효과를 가지며, 또한 HFD에 의해 유도된 장내 미생물 불균형을 반전시겼다는 것을 나타낸다.

장내 미생물 군집의 구성에 대한 가르시놀 투여의 효과

장내 미생물총의 변화가 가르시놀 보충에 의해 유도되었는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 속 수준의 장내 미생물총을 결정했고, 히트맵(heatmap)을 이용하여, HFD가 급식된 마우스에서 가르시놀에 의해 유의하게 변한 50 OTU의 존재비(abundance)를 표현했다 (도 18). 결과는 HFD가 급식된 마우스가 고용량의 가르시놀 처리군과 저용량의 가르시놀 처리군에서 급격히 감소된, 블라우티아 군집을 증가시켰다는 것을 입증했다. 본 연구는 블라우티아 종(Blautia spp.)과 엔테로박터 종(Enterobacter spp.)이 마우스 모델에서 비만을 야기하는 HFD에 관련 있다는 것을 제시했다 (Becker, N., Kunath, J., Loh, G., 및 Blaut, M. Human intestinal microbiota: characterization of a simplified and stable gnotobiotic rat model. Gut Microbes. 2011, 2, 25-33; Fei, N. and Zhao, L. An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice. ISME .J 2013, 7, 880-884). 흥미롭게도, 가르시놀이 급식된 마우스에서, 파라박테로이데스, 박테로이데스, 및 아커만시아 속의 수가 급격히 증가되었다. 파라박테로이데스 및 박테로이데스는 박테로이데테스 문에 속하고, 아커만시아는 베루코미크로비아 문에 속하는데, 이는 왜 F/B 비율이 - 이전에 그랬던 것과 같이 - 가르시놀 처리에 의한 유도를 따라 행동했는지를 설명한다. 히트맵에서, 언에어로브란카 자바 르지니 , 블라우티아 콕코이데스, 및 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 군집의 수가 HFD 급식 후에 증가했으나, 가르시놀 투여는 이들 박테리아를 감소시켰을뿐 아니라, 오실로스피라 족, 무시스피릴룸 스카에들러리 ( Mucispirillum schaedleri), 언에어로트런쿠스 콜리호미니스, 및 라크노스피라 펙티노스키자를 감소시켰다는 것을 관찰했다. 또한, 가르시놀은 ND 및 HFD 군에서 축소된 아커만시아 무시니필라, 박테로이데스 스테르코리로소리스, 및 박테로이데스 자일라니솔벤스의 수를 증가시켰다.

언에어로브란카 자바르지니, 블라우티아 콕코이데스, 및 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스는 피르미쿠테스 문에 속하고; 언에어로브란카 자바르지니는 IBD 환자와 양의 상관관계에 있으며, 블라우티아 콕코이데스는 HFD에 의해 유도된 마우스 모델에서 증가되었다. 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스는 불포화 지방산의 독성 효과에 대해서 극도로 민감했고, 비만과 관련 있었다. 반면, 박테로이데스 스테르코리로소리스 및 박테로이데스 자일라니솔벤스는 박테로이데테스 문에 속했고, 아커만시아 무시니필라는 베루코미크로비아 문에 속한다. Andoh 외 (Andoh, A., Nishida, A., Takahashi, K., Inatomi, O. 외, Comparison of the gut microbial community between obese and lean peoples using 16S gene sequencing in a Japanese population. J Clin . Biochem . Nutr 2016, 59, 65-70)는 비만 및 마른 (lean) 일본인 개체군(Japanese population)의 장내 미생물총 프로필의 16S rRNA 시퀀싱 분석을 수행했고, 이들은 박테로이데스 스테르코리로소리스가 마른 일본인에 존재한다는 것을 발견했다. Liu 외 (Liu, R., Hong, J., Xu, X., Feng, Q. 외, Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention. Nat. Med 2017, 23, 859-868)는 전장-메타지놈 연관분석 연구 (metagenome-wide association study) 및 혈청 대사체학 프로파일링(serum metabolomics profiling)을 마르고 젊은 중국인 개체 및 비만인 젊은 중국인 개체에서 수행했다. 이들은 소장 미생물총(intestinal microbiota) 변형을 순환 아미노산 및 비만과 관련지었고, 박테로이데스 자일라니솔벤스가 마른 대조군에서 유의하게 풍부했다는 것을 나타냈다.

몇몇 연구들은 당뇨병 환자 또는 동물의 점막보다, 건강한 대상체의 점막에서 더욱 풍부한, 뮤신-분해 박테리움(mucin-degrading bacterium)인 아커만시아 무시니필라의 효과를 강조했다 (Liou, A. P., Paziuk, M., Luevano, J. M., Jr., Machineni, S. 외, Conserved shifts in the gut microbiota due to gastric bypass reduce host weight and adiposity. Sci Transl . Med 2013, 5, 178ra41). 많은 연구들은 아커만시아 무시니필라의 식이 효과(dietary effect) 및 아커만시아 무시니필라가 비만을 또한 어떻게 억제하는지를 입증했다. 포도 폴리페놀(grape polyphenol)과 병용된 HFD의 식이 보충(Dietary supplementation)은, F/B 비율 및 아커만시아 무시니필라의 대증식(bloom)의 감소를 비롯한, 장내 미생물 군집 구조의 극적인 변화를 야기했다 (Roopchand, D. E., Carmody, R. N., Kuhn, P., Moskal, K. 외, Dietary Polyphenols Promote Growth of the Gut Bacterium Akkermansia muciniphila and Attenuate High-Fat Diet-Induced Metabolic Syndrome. Diabetes 2015, 64, 2847-2858). 이러한 연구 모두는, 아커만시아 무시니필라가 항-비만 효과를 갖는 프로바이오틱으로서 잠재적인 역할을 가진다는 제안을 지지하므로, 본 발명의 발명자들은 가르시놀이 프리바이오틱 역할을 보인다는 것을 제안한다.

가르시놀 처리는 아커만시아 족의 수를 증가시켰고, 엔도카나비노이드 발현을 유도함으로써 AMPK 신호전달 경로에 영향을 끼쳤다.

가르시놀이 항-비만 효과를 발휘하는 분자 메커니즘을 추가로 조사했다. HFD가 급식된 C57BL/6 마우스에서의 AMPK, p-AMPK, PPARγ, 지방 전구세포 인자 1 (Preadipocyte factor 1, PREF-1), 및 SREBP-1의 단백질 수준이 도 19에 제시된다. HFD의 급식은 ND 군의 AMPK에 비해서, 감소된 AMPK를 야기했으나, 이는 백색지방 조직에서 저용량의 가르시놀(0.1%)의 투여에 의해 증가되었다. 흥미롭게도, 고용량의 가르시놀 (0.5%)은 AMPK 단백질 또는 p-AMPK 단백질 수준을 상승시키지 않았다. 이는 아커만시아 족과 관련된 것일 수도 있다고 예측되었다. HFD에 의해 유도된 비만 마우스에 A. 무시니필라를 4주 동안 투여하는 것은 2-AG, 2-PG, 및 2-OG를 비롯한 엔도카나비노이드 함량을 개선시켰다 (Everard, A., Belzer, C., Geurts, L., Ouwerkerk, J. P. 외, Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc.Natl.Acad.Sci U.S A 2013, 110, 9066-9071). 소장 조직내에서, 2-AG의 증가는 술잔세포(goblet cell) 및 조절 T 세포 집단(Treg population)을 증가시킴으로써 대사성 내독소혈증(metabolic endotoxemia) 및 전신성 염증을 감소시킨다. 그러나, 생식선 주위 지방조직에서, 2-AG의 증가는 지방 전구세포 분화를 자극하고(지방세포 PPARγ 수준의 상향조절을 통해); 디 노보 지방산 합성(de novo fatty acid synthesis)을 강화시키며[지질단백질 지질분해효소(lipoprotein lipase)의 자극 및 FAS 수준 및 포도당 흡수의 상향조절을 통해]; 지방산 산화를 약화시키고(AMPK의 억제를 통해); 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 축적을 강화시킴으로써(지방분해의 억제를 통해); 지방조직의 저장 용량(storing capacity)을 또한 강화시켰다. 2-AG는 아라키돈산 사슬(arachidonic acid chain)을 화학 구조에 함유하는 포스포리피드-유래 지질(phospholipid-derived lipid)이다. 또한, 2-AG는 트리아실글리세롤 및 포스포리피드 대사에서 중간체이므로, HFD로 처리된 마우스는 2-AG 생성을 위한 기질을 용이하게 공급할 수 있다. Pref-1은 지방 전구세포에서 고도로 발현되고, 분화하는 동안에 사라지는 지방세포 분화의 억제자로서 밝혀진다. 가르시놀 처리는 부고환 지방세포 조직(epididymal adipose tissue)에서 Pref-1의 증가된 단백질 수준을 야기했는데, 이는 가르시놀이 HFD가 급식된 마우스에서 지방 전구세포 상태의 유지에 기능할 수 있다는 것을 시사한다.

결론

이러한 결과는 가르시놀 처리가 HFD를 수여한 마우스에서 장내 미생물총 구성의 예상 밖의 변화 - 근본적인 분자 메커니즘에 영향을 끼칠 수 있는 - 를 초래했다는 것을 드러냈다. 더욱이, 이러한 발견은 아커만시아 개체군을 증가시키는 목표의 장내 미생물 군집의 변화가 HFD에 의해 유도된 비만을 예방할 수 있다는 개념을 보강한다.

[ 실시예 3: 체중 감소에 대한 가르시놀 및 가르시놀 , 프테로스틸벤 (pterostilbene) 및 안토시아닌( anthocyanin )을 함유하는 조성물의 비교 평가(Comparative evaluation)]

본 발명은 가르시놀, 프테로스틸벤(pterostilbene) 및 안토시아닌(anthocyanin)을 포함하는 조성물 [포유동물에서의 가르시놀 배합물 (GB)]에 비교되는, 가르시놀의 항-비만 효과를 연구했다. 본 연구는 5주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 대해, 생체내에서 수행했다. 총 42마리의 마우스를 본 연구에 참여시켰고, 6개의 그룹에, 각 그룹당 7마리의 마우스가 배정되었다. 이들 그룹을 표 8과 같이 분배했다.

고지방 식단(HFD) 군에 45%의 고지방 식단을 16주 동안 급식하여, 비만을 유도했고, 이와 동시에, 표 8에 명시한 대로 테스트 물질을 투여했다. 정상군은 정상 식단을 16주 동안 투여받았다.

[표 8: 연구군]

체중을 매주 모니터링했고, 각 군(n=7)의 평균 체중을 평균 ± SE로 표현했다. 6개 군 간 차이의 유의성을 일원 ANOVA 및 던컨의 다중 범위 검정에 의해 분석했다. p < 0.05였고, a, b, 및 c는 각 그룹 사이에서 유의하게 상이하다.

결과는 HFD + 0.5 % 가르시놀이 급식된 마우스 군이 HFD가 급식된 군 및 HFD + GB 군에 비해서, 가장 유의하게 감소된 체중을 보였고, 체중 증가를 예방했다는 것을 나타냈다 (도 19a 및 19b). HFD+ 0.5 % 가르시놀이 투여된 마우스는 다른 군들에 비해서 최소의 체중 증가를 보였는데(표 9), 이는 예상 밖의 발견이며, 통상의 기술자에 의해 예측될 수 없는 것이다.

또한, 생식선 주위, 후복막 및 장간막 지방조직 중량의 감소에 대한 가르시놀 및 가르시놀 배합물의 효과를 평가했다. 결과는 가르시놀 배합물에 비해서, 0.5% 가르시놀이 생식선 주위, 후복막 및 장간막 지방조직의 중량을 유의하게 감소시켰다는 것을 나타냈다 (도 20a, 20b, 및 20c).

[표 9: 가르시놀 및 가르시놀 배합물이 투여된 연구 동물의 체중]

각 그룹(n=7)의 평균 체중이 평균 ± SE로 표현된다. 6개 군 간 차이의 유의성을 일원 ANOVA 및 던컨의 다중 범위 검정에 의해 분석했다. 동일한 행에서 동일한 첨자를 공유하지 않는 값은 군 사이에서 유의하게 상이한 것이다. p < 0.05이고, a, b, 및 c는 각 그룹 사이에서 유의하게 상이하다.

결론

HFD + 0.5% 가르시놀이 급식된 마우스는 가르시놀 배합물에 비해서 중량의 유의한 감소를 나타냈다. 이는 예상 밖의 발견이고, 통상의 기술자에 의해 예측될 수 없는 것이다.

상기 기재된 실시예로부터, 프테로스틸벤 및 안토시아닌을 함유하는 가르시놀 배합물에 비해서, 가르시놀이 지방세포 생성의 억제를 초래하고, 용량 의존적 방식으로 체중 감소를 촉진시킨다는 것은 명백하다. 또한, 가르시놀은 장내 미생물총을 변형시키고, 유익한 미생물인 아커만시아 무시니필라의 생 콜로니(viable colony)를 증가시킴으로써, 일반건강(general health) 및 웰빙(well being)을 유지 및 개선시킨다. 본 발명은 가르시놀이 효과적인 항-비만 분자이고, 독립형(stand alone)으로서 또는 비만 및 관련 질환의 관리를 위한 기타 체중 감소 성분과 병용되어 효과적으로 투여될 수 있다는 것을 확인한다.

본 발명은 바람직한 양태를 참고하여 기재되었으나, 통상의 기술자는 본 발명이 이에 한정되지 않는다는 것을 명백히 이해할 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 연계되어서만 해석되는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Majeed, Muhammed Nagabhushanam, Kalyanam Mundkur, Lakshmi <120> ANTI-OBESITY POTENTIAL OF GARCINOL <130> File Reference: GARCINOL-OBESITY <140> PCT/US2018/037242 <141> 2018-06-13 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of mUCP1 <400> 1 aggcttccag taccattagg t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of mUCP1 <400> 2 ctgagtgagg caaagctgat tt 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of mpgc1a <400> 3 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of mpgc1a <400> 4 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of mprdm16 <400> 5 tcccaccaga cttcgagcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of mprdm16 <400> 6 atctcccatc caaagtcggc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of mBMP7 <400> 7 gagggctggt tggtgtttga t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of mBMP7 <400> 8 gttgcttgtt ctggggtcca t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of m beta-actin <400> 9 gaagtccctc accctcccaa 20 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of m beta-actin <400> 10 ggcatggacg cgacca 16 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of m PPAR g <400> 11 tcgctgatgc actgcctatg 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of m PPAR g <400> 12 gagaggtcca cagagctgat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of m c EBP a <400> 13 caagaacagc aacgagtacc g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of m c EBP a <400> 14 gtcactggtc aactccagca c 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of m FAS <400> 15 ctgagatccc agcacttctt ga 22 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of m FAS <400> 16 gcctccgaag ccaaatgag 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised forward primer of m AP2 <400> 17 catggccaag cccaacat 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesised reverse primer of m AP2 <400> 18 cgcccagttt gaaggaaatc 20

Claims

포유동물에서 비만을 치료학적으로 관리하는 방법으로서, 상기 방법은 가르시놀(garcinol)을 함유하는 조성물의 유효농도를 상기 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물에서 a) 지방세포 생성(adipogenesis)의 억제; 및 b) 체중 및 내장지방(visceral fat)의 감소;를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
지방세포 생성의 억제는 PPARγ, cEBPα, FAS, AP2, 레지스틴(resistin) 및 렙틴(leptin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 하향조절(down regulation)에 의해 초래되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
지방세포 생성의 억제는 p-AMPK, AMPK 및 PREF-1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 상향조절(up regulation)에 의해 초래되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 내장지방은 장간막 지방(mesenteric fat), 복막 지방(peritoneal fat) 및 생식선 주위 지방(perigonadal fat)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
포유동물 지방 세포 시스템(mammalian adipose cellular system)에서 에너지 균형(energy balance)을 달성하는 방법으로서, 상기 방법은 포유동물 지방 전구세포 (pre-adipocyte) 및/또는 지방세포(adipocyte)에 대해서 표적된 유효량의 가르시놀을 함유하는 조성물을 투여해, (a) 지방세포 생성의 증가된 억제; 및 (b) 개별적으로 또는 함께 작용하여 갈색 지방세포(brown adipocyte) 또는 갈색-유사(brown like) [베이지색(beige) 또는 브라이트(brite)] 지방세포를 특이적으로 리쿠르트하는(recruiting) 분비 인자들(secretory factor)의 증가된 발현;의 효과를 달성하고, (c) 백색 지방세포 축적부위 (white adipocyte depot)에서 갈색-유사 표현형(brown like phenotype) (베이지색 또는 브라이트 지방세포)을 유도해, 상기 포유동물에서 지방 이용(fat utilization) 및 에너지 균형의 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제5항에 있어서,
상기 분비 인자들은 미토콘드리아 UCP-1, PRDM16, PGC-1α 및 BMP7을 포함하는 것인, 방법.
포유동물에서 장내 미생물총(gut microbiota)을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효량을 상기 포유동물에 투여하여 상기 장내 미생물총의 변화를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 장내 미생물총은 디페리박테레스 문(Phylum Deferribacteres ), 프로테오박테리아 문(Phylum Proteobacteria ), 박테로이데테스 문 (Phylum Bacteroidetes), 베루코미크로비아 문(Phylum Verrucomicrobia ) 및 피르미쿠테스 문(Phylum Firmicutes)으로부터 선택되는 것인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 장내 미생물총은 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 부티리비브리오 속(genus Butyrivibrio ), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 언에어로브란카 속(genus Anaerobranca ), 디스고노모나스 속(genus Dysgonomonas ), 존스넬라 속(genus Johnsonella ), 루미노코커스 속(genus Ruminococcus ), 박테로이데스 속(genus Bacteroides ), 오실로스피라 속(genus Oscillospira ), 파라박터로이데스 속(genus Parabacterroides ), 아커마니사 속(genus Akkermanisa ), 및 블라우티아 속(genus Blautia)으로부터 선택되는 것인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 장내 미생물총은 파라박테로이데스 골드스테이니 ( Parabacteroides goldsteinii), 박테로이데스 칵카에 ( Bacteroides caccae ), 존스넬라 이그나바 (Johnsonella ignava ), 블라우티아 웩슬러래 ( Blautia wexlerae ), 디스고노모나스 윔펜나이(Dysgonomonas wimpennyi ), 블라우티아 한센니 ( Blautia hansenni ), 언에어 로브란카 자바르진니 ( Anaerobranca zavarzinni ), 오실로스피라 족( Oscillospira eae), 무시스피릴루스 스카에들러리 ( Mucispirillus schaedleri ), 블라우티아 콕코이데스 (Blautia coccoides ), 언에어로트런쿠스 콜리호미니스 ( Anaerotruncus colihominis), 부티리비브로 프로테오클라스티쿠스 ( Butyrivibro proteoclasticus ), 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila ), 라크노스포라 펙티노스키 자(Lachnospora pectinoschiza ), 페도박터 광양제네시스 ( Pedobacter kwangyangensis), 알칼리필루스 크로토나톡시단스 ( Alkaliphilus crotonatoxidans ), 락토바실러스 살리바리우스 (lactobacillus salivarius ), 언에어리비브리아 리폴리티쿠스 (Anaerivibria lipolyticus ), 로도써머스 클라루스 ( Rhodothermus clarus ), 박테로이데스 스테르코리로소리스 ( Bacteroides stercorirosoris ), 루미노코코커스 플라베파시엔스(Ruminocococcus flavefaciens ), 박테로이데스 자일라니솔벤스 (Bacteroides xylanisolvens ), 루미노코커스 그나부스 ( Ruminococcus gnavus ), 클로스트리듐 테르미티디스 (Clostridium termitidis ), 클로스트리듐 알칼리셀룰로 시(Clostridium alkalicellulosi ), 엠티시시아 올리고라피카 ( Emticicia oligoraphica), 슈도부티리비브로 자일라니보란스 ( Pseudobutyrivibro xylanivorans), 액티노마이세스 나투라 ( Actinomyces naturae ), 펩토니필루스 콕시(Peptoniphilus coxii ), 및 돌리코스페르뭄 쿠르붐(Dolichospermum curvum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제7항에 있어서,
장내 미생물총의 변형은 비만(obesity), 심혈관 합병증(cardiovascular complication), 염증성 장 질병(Inflammatory bowel disease), 크론병, 셀리악병(Celiac disease), 대사증후군(metabolic syndrome), 간 질병(liver disease) 및 신경계 질환(neurological disorder)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료학적 관리에 효과적인 것인, 방법.
포유동물의 장(gut)에서 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila )의 생균수를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효량을 포유동물에 투여하여 아커만시아 무시니필라의 콜로니의 증가를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
아커만시아 무시니필라의 콜로니 수의 증가는 엔도카나비노이드 방출 (endocannabinoid release)을 야기함으로써 AMPK 신호전달 경로(AMPK signaling pathway)를 통해 체중을 감소시키는 것인, 방법.
포유동물에서 고지혈증(hyperlipidemia)을 치료학적으로 관리하는 방법으로서, 상기 방법은 가르시놀을 함유하는 조성물의 유효농도를 투여하여, 상기 포유동물의 혈액에서 (i) 전혈 콜레스테롤 수준(total blood cholesterol level)의 양을 감소시키고; (ii) 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL) 및 초저밀도 지질단백질(very low density lipoprotein, VLDL)의 농도를 감소시키며; (iii) 고밀도 지질단백질(high density lipoprotein, HDL)의 농도를 증가시키고; (iv) 혈청 트리글리세리드(serum triglyceride)의 농도를 감소시키는; 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제14항에 있어서,
고지혈증의 의학적 원인은 비만인 것인, 방법.
프리바이오틱 제제(prebiotic agent)로 이용하기 위한, 가르시놀을 함유하는 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로/영양의학적으로 허용가능한 부형제, 아쥬반트, 희석제 또는 담체와 함께 제형화되고, 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구 투여되는 것인, 방법.