WO2023177218A1 - 치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 균주 및 그 용도 - Google Patents

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periodontal disease
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류동욱
최우진
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(주)메디톡스
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

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  • Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans
  • LMT18-32 accesion number: KCTC14823BP
  • extract of the culture or lysate of the strain.
  • compositions for use in inhibiting periodontal disease-causing bacteria comprising the strain, a supernatant thereof, an extract of the culture, or a lysate of the strain.
  • Another aspect is a method of preventing or treating periodontal disease in an individual, comprising administering the strain, a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, or a lysate of the strain to the individual. provides.
  • Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans
  • LMT18-32 accesion number: KCTC14823BP
  • extract of the culture or lysate of the strain.
  • the culture may be a culture medium, a culture medium extract, or a protein extract of a microorganism or a combination thereof.
  • the extract may be a supernatant obtained by centrifuging a lysate obtained by lysing microorganisms, or a precipitate remaining after removing the supernatant.
  • the periodontal disease-causing bacteria may be Porphyromonas gingivalis .
  • the strain may be viable in a solution containing pH 2 to 4 or 0.1% or more, such as 1.5% or more, 2.0% or more, or 3.0% or more of acid, such as bile acid. Additionally, the strain may have an active oxygen scavenging ability.
  • the periodontal disease may be periodontitis or gingivitis.
  • the acid may be an organic acid, an inorganic acid, or a combination thereof.
  • the organic acid may be one that constitutes the organism or may be one that occurs during its metabolic process.
  • the organic acid may be amino acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, pentanoic acid, gluconic acid, or adipic acid.
  • the strain, its culture, the supernatant of the culture, the extract of the culture, or the lysate of the strain may be in lyophilized form.
  • the LMT18-32 (accession number: KCTC14823BP) strain, its culture, the supernatant of the culture, the extract of the culture, or the lysate of the strain are for use with other active agents having oral health improving activity. It may be.
  • the other active agents may be in non-cellular form.
  • the other active agents may include small molecules or polymers such as proteins.
  • the other active agent may be for use simultaneously with the strain, its culture, a supernatant of the culture, an extract of the culture, or a lysate of the strain, or at a different time.
  • Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans LMT18-32 accession number: KCTC14823BP
  • KCTC14823BP accession number: KCTC14823BP
  • a composition for use in inhibiting periodontal disease-causing bacteria comprising a lysate.
  • the extract may be a supernatant obtained by centrifuging a lysate obtained by lysing the strain microorganism, and a precipitate remaining after removing the supernatant.
  • the periodontal disease-causing bacteria may be Porphyromonas gingivalis .
  • the strain may be viable in a solution containing pH 2 to 4 or 0.1% or more, such as 1.5% or more, 2.0% or more, or 3.0% or more of acid, such as bile acid. Additionally, the strain may have an active oxygen scavenging ability.
  • the periodontal disease may be periodontitis or tooth decay.
  • the acid may be an organic acid, an inorganic acid, or a combination thereof.
  • the organic acid may be one that constitutes the organism or may be one that occurs during its metabolic process.
  • the organic acid may be amino acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, pentanoic acid, gluconic acid, or adipic acid.
  • the composition may be a pharmaceutical composition for use in preventing or treating periodontal disease.
  • the composition may contain the strain as an active ingredient.
  • the composition may be a food that has the activity of preventing or improving periodontal disease.
  • composition may include a foodologically or pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient.
  • the strain microorganism, its culture, a supernatant of the culture, an extract of the culture, or a lysate of the strain may be included as a “foodologically effective amount” or a “therapeutically effective amount.”
  • “therapeutically effective amount” means an amount sufficient to produce a therapeutic effect when administered to an individual in need of treatment.
  • treatment means treating a disease or medical condition, such as periodontitis, in an individual, for example a mammal, including a human, and includes: (a) preventing the occurrence of the disease or medical condition, i.e.
  • the “effective amount” can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the “effective amount” may be 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg.
  • the composition can be administered orally. Therefore, the composition may be formulated in various forms such as tablets, capsules, aqueous solutions, or suspensions.
  • excipients such as lactose and corn starch and lubricants such as magnesium stearate can usually be added.
  • lubricants such as magnesium stearate
  • capsules for oral administration lactose and/or dried corn starch may be used as diluents.
  • an aqueous suspension for oral use the active ingredient may be combined with an emulsifying and/or suspending agent. If necessary, specific sweetening and/or flavoring agents may be added.
  • the composition may be administered orally.
  • the composition may be in an oral dosage form.
  • the composition may be a freeze-dried formulation.
  • the composition includes the LMT18-32 (accession number: KCTC14823BP) strain, its culture, a supernatant of the culture, an extract of the culture, or a lysate of the strain and an active agent having other oral health improving activity. It may be for use.
  • the other active agents may be in non-cellular form.
  • the other active agents may include small molecules or polymers such as proteins.
  • the other active agents may be for use simultaneously with the composition or at different times.
  • Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans LMT18-32 accession number: KCTC14823BP
  • KCTC14823BP accession number: KCTC14823BP
  • a method for preventing or treating periodontal disease in an individual comprising administering a lysate to the individual.
  • the administration may be administering the composition described above.
  • the strain is as described above.
  • the administration may be oral or topical.
  • the administration may be oral administration or allowing the drug to remain in the oral cavity after administration.
  • the dosage varies depending on various factors such as the patient's condition, administration route, judgment of the attending physician, etc., as described above. Effective doses can be estimated from dose-response curves obtained from in vitro experiments or animal model tests.
  • the proportion and concentration of the strain of the present invention, its culture, supernatant of the culture, extract of the culture, or lysate of the strain present in the administered composition are determined by chemical characteristics, route of administration, and therapeutic dosage. It may be decided depending on the
  • the dosage may be administered to the subject in an effective amount of about 1 ⁇ g/kg to about 1 g/kg per day, or about 0.1 mg/kg to about 500 mg/kg per day.
  • the dosage may vary depending on the individual's age, weight, sensitivity, or symptoms.
  • the subject may be a mammal, including a human.
  • the subject may be, for example, a human, dog, cat, cow, pig, goat, or domestic animal such as a horse.
  • the method includes the LMT18-32 (accession number: KCTC14823BP) strain, its culture, the supernatant of the culture, the extract of the culture, or the lysate of the strain and an active agent having other oral health improving activity. It may further include an administration step.
  • the administration may be the same as or different from the administration of the composition. Additionally, the administration may be administered at the same or different time as the administration of the composition.
  • the other active agents may be in non-cellular form.
  • the other active agents may include small molecules or polymers such as proteins.
  • the strain or composition may be coated or encapsulated.
  • Said encapsulation may have the advantage of allowing controlled release, for example upon contact with water, or continuous re-release over long periods of time.
  • the composition may be protected from degradation to improve the shelf life of the product.
  • Methods for encapsulation of active ingredients are well known in the art and a large number of encapsulation materials as well as methods for applying them to compositions according to specific requirements are available.
  • strain or composition may be in the form of a solution, suspension, emulsion, tablet, granule, powder, or capsule.
  • the strain or composition may be toothpaste, tooth gel, tooth powder, tooth cleaning liquid, tooth cleaning foam, mouthwash, oral spray, dental floss, chewing gum, or lozenges.
  • Microorganism its culture, supernatant of the culture, extract of the culture, or lysate of the strain can be used to prevent or treat periodontal disease.
  • compositions according to other aspects can be used to prevent or treat periodontal disease.
  • periodontal disease can be efficiently prevented or treated.
  • Figure 1 is a diagram showing the results of electrophoresis of the products obtained as a result of RAPD PCR using the genomes of the LMT18-32 strain and the KCTC3074 T strain as templates.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of a growth inhibition test for Porphyromonas gingivalis KCTC5352 T in the LMT18-32 culture and the supernatant of the culture.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of analyzing the antioxidant activity of LMT18-32 and trolox using ABTS analysis.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the mRNA expression pattern of inflammatory cytokine (IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ ) genes of the extracted cells by autopsy of the 10-week periodontitis-induced mouse model and extracting the periodontal tissue. It is a drawing.
  • IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ inflammatory cytokine
  • Figure 5 shows the results of analyzing the mRNA expression pattern of the RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa- ⁇ ligand) gene, a protein related to osteoclast differentiation, of the extracted cells after autopsy of the 10-week periodontitis-induced mouse model. This is the drawing shown.
  • RANKL Receptor activator of nuclear factor kappa- ⁇ ligand
  • Figure 6 is a diagram showing the results of an autopsy of a 10-week periodontitis-induced mouse model, extraction of periodontal tissue, and analysis of the mRNA expression patterns of MMP3, MMP8, and MMP9 genes, which are proteins related to tissue decomposition, in the extracted cells.
  • Figure 7 is a diagram showing the distance from the cementum margin (CEJ) to the alveolar bone (ABC) (upper right tooth) after the 10th week of administration.
  • the selected lactic acid bacterium LMT18-32 was subjected to PCR using primer sets of 27F (SEQ ID NO: 2) and 1492R (SEQ ID NO: 3) and the genome of LMT18-32 as a template, and 16S rDNA amplification product was obtained.
  • the nucleotide sequence of the amplification product was confirmed through sequencing.
  • the 16S rDNA of LMT18-32 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Additionally, the nucleotide sequence of the 16S rDNA was analyzed using NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As a result of phylogenetic tree analysis, LMT18-32 was identical to Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans species. The 16S rDNA of LMT18-32 had 100.0% sequence identity with Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans species. Therefore, the LMT18-32 strain was identified as a new strain belonging to the Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans species.
  • Lactica J Bacillus paracasei subspecies Tolerans KCTC3074 T was purchased commercially from KCTC. As a result of comparing the sequences of the LMT18-32 strain and the KCTC3074 T strain, it was confirmed that the 16S rDNA sequence identity was 100.0%.
  • each strain LMT18-32 and KCTC3074 T was prepared using the primer of OPA-13 (SEQ ID NO: 4) and the genome of each strain as a template.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of electrophoresis of the products obtained as a result of RAPD PCR using the genomes of the LMT18-32 strain and the KCTC3074 T strain as templates. As shown in Figure 1, electrophoresis results showed different band patterns between the two strains.
  • Lactica J Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 and Lactica J Bacillus paracasei subspecies Tolerans KCTC3074 T indicates that the two strains have differences in genetic affinity. Therefore, it was confirmed that the LMT18-32 strain was a new strain belonging to the Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans species. Accordingly, the above strain was named Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans ( Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans ) LMT18-32 and it was transferred to the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) located at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology in December 2021. It was deposited on the 15th with deposit number KCTC14823BP.
  • Example 2 Measurement of antibacterial activity of lactic acid bacteria against periodontitis-causing strain Porphyromonas gingivalis
  • Porphyromonas gingivalis KCTC5352 T was purchased from the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. did.
  • Porphyromonas gingivalis was cultured anaerobically in TSA (Difco, USA) agar medium at 37°C for 96 hours, and then Porphyromonas gingivalis was added at 1x10 6 CFU/ml using Porphyromonas gingivalis.
  • TSA agar plate was produced.
  • Example 1 the lactic acid bacteria isolated in Example 1 were each cultured in MRS liquid medium at 37°C for 24 hours. At this time, OD600 was about 2.0. Afterwards, 10 ⁇ l of the obtained lactic acid bacteria culture was spotted on a TSA agar plate to which Porphyromonas gingivalis was added. In addition, after centrifuging the obtained lactic acid bacteria culture, the precipitate was removed, and only the remaining supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of a growth inhibition test for Porphyromonas gingivalis KCTC5352 T in the LMT18-32 culture and the supernatant of the culture.
  • the length of the inhibition ring was 23 mm and 32 mm, respectively.
  • the culture and supernatant of LMT18-32 had the best antibacterial activity against Porphyromonas gingivalis strain, which causes periodontitis.
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 which has excellent antibacterial activity against periodontitis-causing strains, was cultured on MRS plate medium and the colony morphology was observed, and the colony morphology is shown in Table 2 below.
  • LMT18-32 form circle size 0.7mm color cream color opacity opacity bump convex surface lubricity aerobic growth + anaerobic growth +
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 uses a total of 22 sugars.
  • the lactic acid bacteria LMT18-32 In order for the lactic acid bacteria LMT18-32 to exert its efficacy as a probiotic in the oral cavity, it must pass through or be maintained in a low pH environment after ingestion. For example, the strain may be maintained or grown in an acidic environment emitted by bacteria living in plaque, a bacterial film on the tooth surface, such as S. mutans . To investigate the acid resistance of Lacticajay Bacillus paracasei subspecies tolerans LMT18-32, which has excellent antibacterial activity against periodontitis-causing strains, it was inoculated into MRS liquid medium and cultured at 37°C for 24 hours.
  • a pH 2.5 MRS liquid medium adjusted to pH 2.5 was prepared using HCl (Sigma, USA), and the cultured lactic acid bacteria were inoculated into the pH 2.5 MRS liquid medium and cultured at 37°C for 2 hours.
  • the lactic acid bacteria immediately after inoculation were diluted and plated on the MRS plate medium, and the lactic acid bacteria cultured for 2 hours in MRS liquid medium at pH 2.5 were also plated on the MRS plate medium and cultured at 37°C for 24 hours. After 24 hours, the number of lactic acid bacteria colonies on the MRS plate medium was counted and the measurement results are shown in Table 4.
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 which has excellent antibacterial activity against periodontitis-causing strains, maintained a bacterial count of 3.9 ⁇ 10 9 CFU/ml and showed a high survival rate. Since the number of lactic acid bacteria was maintained at a pH lower than pH 3, which is close to the physiological pH of the stomach, the number of viable bacteria can be maintained stably even at low pH due to gastric acid secretion, and it can be expected that the rate of reaching the intestines will be high when ingested.
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 which has excellent antibacterial activity against periodontitis-causing strains, was inoculated into MRS liquid medium and cultured at 37°C for 24 hours.
  • MRS liquid medium containing 0.3% bile salt (Bile salt, Sigma, USA) was prepared, and cultured lactic acid bacteria were inoculated into the 0.3% Bile salt MRS liquid medium. and cultured at 37°C for 2 hours.
  • the lactic acid bacteria immediately after inoculation were diluted and plated on the MRS plate medium, and the lactic acid bacteria cultured for 2 hours in 0.3% Bile salt MRS liquid medium were also plated on the MRS plate medium and cultured at 37°C for 24 hours. After 24 hours, the number of lactic acid bacteria colonies on the MRS plate medium was counted and the measurement results are shown in Table 5.
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 which has excellent antibacterial activity against periodontitis-causing strains, maintained a bacterial count of 1.4 ⁇ 10 9 CFU/ml and showed a high survival rate. Therefore, considering that the concentration of bile salts in the intestine is around 0.1%, it can be expected that the survival rate in the intestine will be sufficiently high.
  • Example 5 ABTS radical scavenging activity of lactic acid bacteria
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing the antioxidant activity of LMT18-32 and trolox using ABTS analysis.
  • the 10% concentration of the supernatant of the LMT18-32 culture showed a high antioxidant activity of 82.9%. Therefore, the LMT18-32 can act as an oxygen radical inhibitor and help improve oral health, such as preventing or treating periodontal disease.
  • Lacticajay Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18- showed an effect on improving periodontitis in a mouse model of periodontitis induced by Porphyromonas gingivalis. This is to confirm whether LMT18-32 has an oral health improvement effect not only in vitro but also in the oral environment.
  • LMT18-32 strain The in vivo efficacy of LMT18-32 strain was evaluated in a mouse model of periodontitis induced by P. gingivalis strain.
  • Balb/c mice female, 8 weeks old used to prepare the periodontitis mouse model were purchased from Orient Bio Co., Ltd. and were acclimatized to the environment for 1 week before starting the experiment.
  • Porphyromonas gingivalis KCTC5352 T was purchased from the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • P. gingivalis a periodontitis-causing bacteria
  • Pg group a periodontitis-causing bacteria
  • Lactica J Bacillus paracasei subspecies Tolerans LMT18-32 was also administered at the same time as P. gingivalis at an amount of 1x10 9 CFU/animal to check whether there was a difference from the Pg group (LMT18-32 treatment group).
  • the primer set in RT-PCT used the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 18 in Table 6 below. The amplified gene level was converted into a fold change value based on the normal control value.
  • the distance from the cementoenamel border (CEJ) of the upper right tooth to the alveolar bone crest (ABC) was measured through Micro-CT imaging.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the mRNA expression pattern of inflammatory cytokine (IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ ) genes of the extracted cells by autopsy of the 10-week periodontitis-induced mouse model and extracting the periodontal tissue. It is a drawing.
  • IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ inflammatory cytokine
  • Figure 5 is a diagram showing the results of an autopsy of a 10-week periodontitis-induced mouse model, extraction of periodontal tissue, and analysis of the mRNA expression pattern of the osteoclast differentiation-related protein RANKL gene for the extracted cells.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of an autopsy of a 10-week periodontitis-induced mouse model, extraction of periodontal tissue, and analysis of the mRNA expression patterns of the tissue decomposition-related proteins MMP3, MMP8, and MMP9 genes for the extracted cells.
  • the LMT18-32 treatment group significantly decreased in all biomarkers compared to the Pg group.
  • Figure 7 is a diagram showing the distance from the cementum margin (CEJ) to the alveolar bone (ABC) (upper right tooth) after the 10th week of administration.
  • CEJ cementum margin
  • ABS alveolar bone

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Abstract

치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 균주 및 그 용도를 제공한다.

Description

치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 균주 및 그 용도
치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 균주 및 그 용도에 관한 것이다.
구강 건강에 대한 태도가 개선되었음에도 불구하고, 치주 질환은 여전히 만연한 문제로 남아 있다. 이 질환에 대한 현행 치료법은 치은하 플라크를 제거하고 치아 뿌리 표면을 매끄럽게 하여 잇몸의 재부착을 촉진하고자 하는 스케일링(scaling) 및 치근활택술(root planting)이 있다. 치료는 고통스럽고 종종 광범위한 가정 간호 준수와 후속 방문을 필요로 한다. 또한, 스케일링 및 치근활택술은 예방적 치료 옵션은 아니어서, 비용 효율성이 떨어진다. 때로 치료를 위해 항생제가 처방되지만, 이는 항생제 내성 및 인간 미생물총에 대하여 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도 여전히 새로운 치주 질환 예방 또는 치료법이 요구되고 있다.
일 양상은 치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 제공한다.
다른 양상은 상기 균주, 이의 배양물(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 포함하는, 치주 질환 유발균을 억제하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 치주 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 제공한다. 상기 배양물은 미생물 또는 그 조합의 배양액, 배양액 추출물, 또는 단백질 추출물일 수 있다. 상기 추출물은 미생물을 용균시킨 용균물을 원심분리하여 얻어진 상등액, 및 상등액을 제거하고 남은 침전물일 수 있다.
상기 치주 질환 유발균은 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)인 것일 수 있다. 상기 균주는 pH 2 내지 4 또는 0.1% 이상, 예를 들면, 1.5% 이상, 2.0% 이상, 또는 3.0% 이상의 산, 예를 들면 답즙산 함유 용액에서 생존 가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 활성 산소 제거능을 가진 것일 수 있다. 상기 치주 질환은 치주염 또는 치은염일 수 있다. 상기 산은 유기산, 무기산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 개체를 구성하는 것 또는 그 대사 과정에서 발생하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 유기산은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 젖산, 부티르산, 펜탄산, 글루콘산, 또는 아디프산일 수 있다.
상기 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)은 동결건조된 형태일 수 있다.
상기 LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)은 구강 건강 개선 활성을 갖는 다른 활성제와 함께 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 다른 활성제는 세포가 아닌 형태일 수 있다. 상기 다른 활성제는 소분자 또는 단백질과 같은 중합체를 포함할 수 있다. 상기 다른 활성제는 상기 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)과 동시 또는 다른 시간에 사용하기 위한 것일 수 있다.
다른 양상은 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 포함하는, 치주 질환 유발균을 억제하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 추출물은 상기 균주 미생물을 용균시킨 용균물을 원심분리하여 얻어진 상등액, 및 상등액을 제거하고 남은 침전물일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 치주 질환 유발균은 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)일 수 있다. 상기 균주는 pH 2 내지 4 또는 0.1% 이상, 예를 들면, 1.5% 이상, 2.0% 이상, 또는 3.0% 이상의 산, 예를 들면 답즙산 함유 용액에서 생존 가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 활성 산소 제거능을 가진 것일 수 있다. 상기 치주 질환은 치주염 또는 충치일 수 있다. 상기 산은 유기산, 무기 산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 개체를 구성하는 것 또는 그 대사 과정에서 발생하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 유기산은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 젖산, 부티르산, 펜탄산, 글루콘산, 또는 아디프산일 수 있다.
상기 조성물은 치주 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주를 유효성분으로서 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 치주 질환을 예방 또는 개선하는 활성을 가진 식품인 것일 수 있다.
상기 조성물은 식품학적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
상기 조성물 중 상기 균주 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate) 을 "식품학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유류에서 질환 또는 의학적 증상, 예를 들면 치주염을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구 투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는향미제를 가할 수 있다. 상기 조성물은 구강에 투여되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 구강 투여 제형일 수 있다.
상기 조성물은 동결건조 제형일 수 있다.
상기 조성물은 상기 LMT18-32(기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)과 다른 구강 건강 개선 활성을 갖는 활성제와 함께 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 다른 활성제는 세포가 아닌 형태일 수 있다. 상기 다른 활성제는 소분자 또는 단백질과 같은 중합체를 포함할 수 있다. 상기 다른 활성제는 상기 조성물과 동시 또는 다른 시간에 사용하기 위한 것일 수 있다.
다른 양상은 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate) 을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 치주 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 투여는 상기한 조성물을 투여하는 것일 수 있다. 상기 균주에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 당업자는 투여시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 또는 국부 투여일 수 있다. 상기 투여는 구강에 투여하는 것, 구강에 투여 후 구강에 머물게 하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate) 의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 사람을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 사람, 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 또는 말과 같은 가축일 수 있다.
상기 방법은, 상기 LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)과 다른 구강 건강 개선 활성을 갖는 활성제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 투여는 상기 조성물의 투여와 동일하거나 다른 경로로 투여되는 것일 수 있다. 또한, 상기 투여는 상기 조성물의 투여와 동일하거나 다른 시간에 투여하는 것일 수 있다. 상기 다른 활성제는 세포가 아닌 형태일 수 있다. 상기 다른 활성제는 소분자 또는 단백질과 같은 중합체를 포함할 수 있다.
본 명세서 있어서, 상기 균주 또는 조성물은 코팅되거나 캡슐화된 것일 수 있다. 상기 캡슐화는 제어된 방출을 허용하는 이점, 예를 들어 물과의 접촉시, 또는 장기간 동안의 연속적인 재방출의 이점을 가질 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 제품의 저장 수명을 개선하기 위해 분해로부터 보호되는 것일 수 있다. 활성 성분들의 캡슐화를 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 캡슐화 재료뿐만 아니라 특정 요구들에 따라 조성물에 그것들을 적용하는 방법도 이용가능하다.
또한, 상기 균주 또는 조성물은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
상기 균주 또는 조성물은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 또는 로젠지 (lozenges)일 수 있다.
일 양상에 따른 미생물 균주 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)은 치주 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물은 치주 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 치주 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 LMT18-32 균주와 KCTC3074T 균주의 게놈을 주형으로 한 RAPD PCR 결과 얻어진 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 LMT18-32 배양물 및 그 배양물의 상등액의 포르피로모나스 긴기발리스 KCTC5352T에 대한 생육저해환 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 LMT18-32 및 trolox의 항산화 활성을 ABTS 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, 및 TNF-α) 유전자의 mRNA 발현 양상 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 파골세포 분화 관련 단백질인 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-Β　ligand) 유전자의 mRNA 발현 양상 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 조직 분해 관련 단백질인 MMP3, MMP8, 및 MMP9 유전자의 mRNA 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 10주차 투여 후 백악범랑경계 (CEJ)에서 치조골정(ABC)까지의 거리 (우측 상부 치아)를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
1. 균주의 분리
균주의 분리는 가정에서 직접 담근 전통 발효 식품인 김치를 100 g 취하여 멸균수에 희석하고, 스토마커(stomacher)로 5 분간 균질화하였다. 균질화된 샘플은 단계적으로 희석하여 브로모페놀블루(Sigma, USA)를 포함하는 MRS (Difco, USA) 아가 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 2 내지 3일간 배양하였고 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하여 최종 균주를 얻었다. 이하 이를 LMT18-32이라 한다. 순수 분리된 유산균 LMT18-32는 계통을 확인하기 위하여 하기와 같이 16S rDNA 계통 분석을 실시하였다.
2. 16S rDNA 분석
선별된 유산균 LMT18-32는 27F (서열번호 2)과 1492R (서열번호 3)의 프라이머 세트와 LMT18-32의 게놈을 주형으로 하여 PCR를 수행하여, 16S rDNA 증폭 산물을 얻었다. 상기 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
그 결과 LMT18-32의 16S rDNA는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한, 상기 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열을 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였다. 계통수 분석 결과, LMT18-32는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 종과 같았다. LMT18-32의 16S rDNA는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 종과 서열 동일성이 100.0%이었다. 따라서, LMT18-32 균주는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다.
3. 선발된 LMT18-32 균주와 타입 균주의 16S DNA 서열 비교
선발된 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32 균주와 타입 균주(type strain)와의 서열 동일성을 확인하기 위해 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 KCTC3074T를 KCTC로부터 상업적으로 구입하였다. LMT18-32 균주와 KCTC3074T 균주의 서열을 비교한 결과, 16S rDNA 서열 동일성이 100.0%임을 확인하였다. 또한, 선별된 LMT18-32 균주와 타입 균주 KCTC3074T의 유전적 유연관계를 조사하기 위해 각각의 균주 LMT18-32와 KCTC3074T은 OPA-13 (서열번호 4)의 프라이머와 각각의 균주의 게놈을 주형으로 하여 다형 DNA의 랜덤 증폭 (Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) PCR을 수행하여, 증폭 산물을 얻었다. 증폭 산물은 RedSafe™ nucleic acid staining solution (iNtRON Biotechnology, Korea)이 포함된 1.2% 아가로즈 겔 에서 전기영동 한 후, ChemiDoc™ imaging system (Bio-Rad, USA)로 촬영하여 DNA 밴드 패턴을 얻었다. 도 1은 LMT18-32 균주와 KCTC3074T 균주의 게놈을 주형으로 한 RAPD PCR 결과 얻어진 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 두 균주 사이에 전기 영동 결과는 다른 밴드 패턴을 보였다.
이러한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32와 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 KCTC3074T의 DNA 밴드 패턴의 차이는 두 균주가 유전적 유연관계의 차이가 있음을 나타낸다. 따라서 LMT18-32 균주는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 종에 속하는 새로운 균주임을 확인하였다. 이에 상기 균주를 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 (Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2021년 12월 15일자로 기탁번호 KCTC14823BP로 기탁하였다.
실시예 2. 치주염 유발 균주 포르피로모나스 긴기발리스에 대한 유산균의 항균 활성 측정
상기 선발 균주의 치주염 유발 포르피로모나스 긴기발리스에 대한 항균 활성을 측정하기 위해 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 포르피로모나스 긴기발리스 KCTC5352T를 분양 받아 사용하였다. 먼저 포르피로모나스 긴기발리스를 TSA (Difco, USA) 아가 배지에서 37 ℃, 96 시간 혐기 배양한 후, 포르피로모나스 긴기발리스를 이용하여 포르피로모나스 긴기발리스가 1x106 CFU/㎖로 첨가된 TSA 아가 플레이트를 제작하였다.
다음으로 치주염을 유발하는 포르피로모나스 긴기발리스의 생육을 저해하는 유산균을 선발하기 위하여, 실시예 1에서 분리된 상기 유산균을 각각 MRS 액체 배지에서 37 ℃, 24시간 동안 배양하였다. 이때는 OD600은 약 2.0이었다. 이후 상기 얻어진 유산균 배양물 10㎕를 포르피로모나스 긴기발리스가 첨가된 TSA 아가 플레이트에 점적하였다. 또한, 얻어진 유산균 배양물을 원심분리한 후, 침전물을 제거하고 남은 상등액만을 0.22㎛ 크기 필터로 여과하였다. 여과된 상등액을 포르피로모나스 긴기발리스가 첨가된 TSA 아가 플레이트에 디스크 페이퍼에 100㎕씩 첨가한 뒤 37 ℃에서 96시간 동안 혐기 배양하였다. 96시간 배양 후, 포르피로모나스 긴기발리스의 생장을 저해하여 나타난 생육저해환을 측정하였다. 그 결과는 표 1 및 도 2에 나타내었다.
도 2는 LMT18-32 배양물 및 그 배양물의 상등액의 포르피로모나스 긴기발리스 KCTC5352T에 대한 생육저해환 실험 결과를 나타낸 사진이다.
유산균 포르피로모나스 긴기발리스 KCTC5352T 생육저해환(단위 mm)
락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32 배양물 23
배양물의 상등액 32
락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32 배양물 및 배양물의 상등액을 사용한 경우 저해환 길이는 각각 23mm 및 32mm이었다. 실험에 사용된 838종 중 LMT18-32의 배양물 및 배양물의 상등액이 치주염을 유발하는 포르피로모나스 긴기발리스 균주에 대한 항균 활성이 가장 우수하였다.
실시예 3. 균주의 형태학적 및 발효특성 조사
1. 균학적 특성분석
치주염 유발 균주에 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32를 MRS 평판 배지에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였고 콜로니 형태는 하기 표 2에 나타내었다.
LMT18-32
형태 원형
크기 0.7㎜
색 크림색
불투명도 불투명
융기 볼록
표면 매끄러움
호기적 생장 +
혐기적 생장 +
2. 선발된 유산균주의 당 발효 특성
당 발효 특성은 API 50 CHL 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 조사하였다. 치주염 유발 균주에 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32의 당 발효 특성을 하기 표 3에 나타내었다.
LMT18-32
글리세롤 -
에리트리톨 -
D-아라비노스 -
L-아라비노스 -
D-리보스 +
D-자일로스 -
L-자일로스 -
D-아도니톨 +
메틸-β D-자일로피라노사이드 -
D-갈락토스 +
D-글루코스 +
D-프럭토스 +
D-만노스 +
L-소르보스 +
L-람노스 -
둘시톨 -
이노시톨 -
만니톨 +
D-소르비톨 +
메틸 α D-만노피라노사이드 -
메틸 α D-글로코피라노사이드 -
N-아세틸글루코사민 +
아미그달린 -
아르부틴 -
에스쿨린 +
살리신 +
D-셀로비오스 +
D-말토스 +
D-락토스 -
D-멜리비오스 -
D-사카로스 +
D-트레할로스 +
이눌린 +
D-멜레지토스 +
D-라피노스 -
아미돈 -
글리코겐 -
자일리톨 -
겐티오비오스 -
D-투라노스 +
D-라익소스 +
D-타가토스 +
D-푸코스 -
L-푸코스 -
D-아라비톨 -
L-아라비톨 -
포타슘 글루코네이트 +
포타슘 2-케토글루코네이트 -
포타슘 5-케토글루코네이트 -
그 결과, 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32는 총 22개의 당을 이용하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 안정성
1. 유산균의 내산성 조사
상기 유산균 LMT18-32가 구강 내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 환경을 통과하거나 유지되어야 한다. 예를 들면, 상기 균주는 치면의 세균막인 플라크 내에 서식하는 박테리아, 예를 들면, S. mutans 등이 배출하는 산성 환경에서 유지 또는 성장할 수 있는 것일 수 있다. 치주염 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32의 내산성을 조사하기 위해서 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 MRS 액체 배지를 HCl (Sigma, USA)을 이용하여 pH 2.5로 조정된 pH 2.5 MRS 액체 배지를 준비하였고 배양된 유산균을 pH 2.5 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이때, 접종 직후의 유산균을 희석하여 MRS 평판 배지에 도말 하였고, pH 2.5 MRS 액체 배지에서 2시간 배양된 유산균도 MRS 평판 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, MRS 평판 배지 위의 유산균 집락 수를 계수하여 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.
LMT18-32 (CFU/㎖)
MRS (pH 6.8) 4.0×109
MRS (pH 2.5) 3.9×109
그 결과, 치주염 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32는 3.9×109CFU/㎖ 균 수를 유지하여 높은 생존율을 보여 주었다. 위의 생리적 pH와 가까운 pH 3보다 낮은 pH에서 유산균 수를 유지하였기 때문에 위산분비로 인한 낮은 pH에서도 안정하게 생균수가 유지 가능하며, 섭취 시 장내 도달율이 높을 것으로 예상할 수 있다.
2. 유산균의 내담즙성 조사
유산균의 내담즙을 조사하기 위해 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 치주염 유발 균주에 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32를 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여, 0.3%의 담즙산염 (Bile salt, Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지를 준비하였고 배양된 유산균을 0.3% Bile salt MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
이때, 접종 직후의 유산균을 희석하여 MRS 평판 배지에 도말 하였고, 0.3% Bile salt MRS 액체 배지에서 2시간 배양된 유산균도 MRS 평판 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, MRS 평판 배지 위의 유산균 집락 수를 계수하여 측정한 결과를 표 5에 나타내었다.
LMT18-32 (CFU/㎖)
MRS (0% Bile salt) 4.0×109
MRS (0.3% Bile salt) 1.4×109
그 결과, 치주염 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32는 1.4×109 CFU/㎖ 균 수를 유지하여 높은 생존율을 보여 주었다. 따라서 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여 장 내에서도 충분히 생존율이 높을 것으로 예상할 수 있다.
실시예 5. 유산균의 ABTS 라디칼 소거 활성
치주질환은 감염성 및 염증성 과정이 연속적으로 발생하면서 활성산소 (ROS, reactive oxidative species)가 생성되고 이 활성산소들이 치주염을 악화시킨다 (J Indian Soc Periodontol. 2013 Jul-Aug; 17(4): 411-416.). 이때 항산화제가 활성산소를 제거하여 산화 스트레스 감소를 통해 치주질환 개선에 도움을 준다.
따라서 치주염 유발 균주에 항균 활성이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32의 항산화 효능을 확인하기 위해 ABTS (2,2′ -Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 분석(assay)을 수행하였다.
이 분석은 ABTS는 포타슘 퍼설페이트에 의해 전자를 잃어 짙은 청녹색을 띄지만 항산화 물질이 존재하는 경우, 그 전자공여능으로 인하여 색이 옅어지는 바, 이 과정을 보고 항산화능을 측정하는 방법이다. 먼저 14mM ABTS (38.4㎎/10㎖; Sigma, USA)와 6mM 포타슘 (8.1096㎎/10㎖; Sigma, USA)를 1:1 비율로 섞고 상온에서 16시간 암반응하여, 양이온(ABTS+)을 형성 시켰다. 이렇게 만들어진 ABTS+ 용액은 1/10 희석하여 사용하였다. 유산균은 OD600 약 2.0으로 배양 후, 배양물을 원심분리한 후 상등액만을 0.22㎛ 크기 필터로 여과하였다. 여과한 배양물의 상등액 20㎕ 와 ABTS+ 용액 180㎕를 96 웰 플레이트에서 10분간 암반응시켰다. 이후, 반응이 끝난 시료는 마이크로플레이트 리더를 이용하여, 734nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군으로 항산화 물질인 비타민 E의 전구체 trolox (1㎎/㎖; Sigma, USA)를 사용하였다. 도 3은 LMT18-32 및 trolox의 항산화 활성을 ABTS 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, LMT18-32의 배양물의 상등액 10% 농도는 82.9%로 높은 항산화 활성을 보여주었다. 따라서, 상기 LMT18-32는 활성산소 억제제로 작용하여 치주 질환 예방 또는 치료와 같은 구강 건강 개선에 도움을 줄 수 있다.
실시예 6. LMT18-32 균주의 동물 모델에서 치주염 개선 효과
본 실시예에서는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-가 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)로 유도한 치주염의 마우스 모델에서 치주염 개선 효과를 보이는지 실험을 통하여 확인하였다. 이는 LMT18-32가 인 비트로뿐만 아니라 구강 환경에서 구강 건강 개선 효과가 있는지에 확인하기 위한 것이다.
(1) 실험 방법
P. gingivalis 균주로 유도한 치주염 마우스 모델에서 LMT18-32 균주의 인 비보 효능을 평가하였다.
치주염 마우스 모델 제조에 사용된 Balb/c 마우스(암컷, 8주령)는 ㈜오리엔트바이오에서 구입하였으며, 실험 시작 전 1 주간 환경에 적응시켰다. P. gingivalis 균주는 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 포르피로모나스 긴기발리스 KCTC5352T를 분양 받아 사용하였다.
치주염 모델을 구축하기 위해 치주염 유발균인 P. gingivalis를 마우스의 구강에 1x109 CFU/마리의 양으로 10주 간 투여한 뒤, 10주 동안 유지하여 치주염이 실제 일어나는지 평가하였다 (Pg 군). 이때 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32 역시 P.gingivalis와 동시에 1x109 CFU/마리의 양으로 투여하여 Pg군과 차이가 있는지 확인하였다 (LMT18-32 처리군).
10 주차 투여 후 개체를 부검하여 각각의 잇몸 조직을 적출하였다. 적출된 잇몸 조직 세포로부터 RNA를 추출하여 분석에 사용하였다. 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, 및 TNF-α), 파골세포 분화 관련 단백질 RANKL, 및 조직 분해 관련 단백질 MMP3, MMP8, 및 MMP9 유전자의 발현 정도를 정량적(quantitative) RT-PCR로 확인하였다. RT-PCT에서 프라이머 세트는 하기 표 6의 서열번호 5 내지 18의 뉴클레오티드 서열을 사용하였다. 증폭된 유전자 수준을 정상 대조군 값을 기준으로 배수 변화(fold change) 값으로 환산하였다.
마커 포워드 프라이머(서열번호) 리버스 프라이머 (서열번호)
IL-1β 5 6
IL-6 7 8
TNF-α 9 10
RANKL 11 12
MMP-3 13 14
MMP-8 15 16
MMP-9 17 18
또한, 10주차 투여 후 Micro-CT 촬영을 통해 우측 상부 치아의 백악법랑경계 (CEJ)에서 치조골정 (ABC)까지의 거리를 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 4는 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, 및 TNF-α) 유전자의 mRNA 발현 양상 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 파골세포 분화 관련 단백질 RANKL 유전자의 mRNA 발현 양상 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 10주차 치주염 유발 마우스 모델을 부검하여 치주 조직을 적출하고, 적출된 세포에 대하여 조직 분해 관련 단백질 MMP3, MMP8, 및 MMP9 유전자의 mRNA 발현 양상 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4 내지 6에 나타낸 바와 같이, LMT18-32 처리군은 Pg군 대비 모든 바이오 마커에서 유의미하게 감소하였다.
도 4 내지 6에서, ###p < 0.001, ####p < 0.0001 vs. Normal (t-test). ****p < 0.0001 vs. Pg (t-test).
도 7은 10주차 투여 후 백악범랑경계 (CEJ)에서 치조골정(ABC)까지의 거리 (우측 상부 치아)를 나타낸 도면이다. 도 7에서, ##p < 0.01 vs. Normal (t-test). *p < 0.05 vs. Pg (t-test).
도 7에 나타낸 바와 같이, Pg군에서는 치주염 발생에 따라 이 거리가 길어진 것에 비하여, LMT 18-32 처리군의 경우 Pg 군 대비 이 거리가 다시 짧아져서 치주염이 개선된 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스 LMT18-32 가 치주염 유발 마우스 모델에 치주염을 개선시키는 효과가 있다는 것을 나타낸다.
Figure PCTKR2023003483-appb-img-000001

Claims (8)

  1. 치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주.
  2. 치주 질환 유발균을 억제하는 활성을 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate).
  3. 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 포함하는, 치주 질환 유발균을 억제하는데 사용하기 위한 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 치주 질환 유발균은 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)인 것인 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 치주 질환은 치주염 또는 치은염인 것인 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서, 치주 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  7. 청구항 3에 있어서, 치주 질환을 예방 또는 개선하는 활성을 가진 식품인 것인 조성물.
  8. 락티카제이바실러스 파라카제이 아종 톨러란스(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans) LMT18-32 (기탁번호: KCTC14823BP) 균주, 이의 배양물, 배양물의 상등액(supernatant), 배양물의 추출물, 또는 상기 균주의 용균물(lysate)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 구강 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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