JP2023519233A - 肝機能改善または脂肪蓄積抑制の微生物、及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
ラクトバチルス属バクテリアは、ヨーグルトのような食品に含まれている。また、一部ラクトバチルス種は、抗炎症活性のような生理的活性を有する。例えば、一部ラクトバチルスは、過敏性腸症侯群(IBS:irritable bowel syndrome)に効果があると報告されている。
ただし、乳酸菌は、既存の研究を介し、免疫反応調節効果と、抗癌及び抗酸化の効果とにすぐれていると知られているが、ラクトバチルス菌株が、体内脂肪含量を低減させる効果、または脂肪関連疾患を治療する効果については、特に知られていない。
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、耐酸性を有するもの;耐胆汁酸性を有するもの;酸化を促進させる活性、脂肪合成を抑制する活性、または2つの活性をいずれも有するもの;脂肪蓄積を抑制するもの、または蓄積された脂肪を低減させるもの;SREBP-1c及びFASからなる群から選択される1以上の遺伝子の発現を抑制するもの;PPAR-1α及びCPT1からなる群から選択される1以上の遺伝子の発現を促進させるもの;AMPKのリン酸化レベルを上昇させるもの;個体に投与される場合、血中アディポネクチンレベルを上昇させるもの;個体に投与される場合、体重及び体内脂肪量からなる群から選択される1以上を低減させるもの;及び肝機能を改善させるもの;からなる群から選択される1以上でもある。前記脂肪は、トリグリセリドでもある。
前記耐胆汁酸性は、0.3%胆汁酸含有MRS培地において、37℃で2時間培養した場合、生存率が、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、75ないし90%、75ないし95%、80ないし90%、80%ないし95%、85%ないし90%、または90ないし95%であるのでもある。
前記方法において、前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。
他の態様による方法によれば、脂肪含量を効率的に減少させるか、あるいは肝機能を効率的に改善させることができる。
1.菌株の分離
菌株の分離は、家庭で直接つけた伝統発酵食品、及び乳酸菌に接していない幼児糞便を100g取り、滅菌水に希釈し、ストマッカ(stomacher)で5分間均質化して行った。均質化されたサンプルは、段階的に希釈し、ブロモフェノールブルー(Sigma、米国)を含むMRS(Difco、米国)アガール平板培地に塗抹し、37℃で2ないし3日間培養し、示されたコロニーを、形態別及び色別に区別し、さらに純粋分離し、最終2個菌株を得た。純粋分離された乳酸菌は、それぞれの系統を確認するために、下記実施例1.2.のように、16S rDNA系統分析を実施した。
選別された乳酸菌は、27F(配列番号3)と1492R(配列番号4)とのプライマーセットと、それぞれのLMT15-14及びLMT19-1のゲノムとをテンプレートにしてPCRを行い、16S rDNA増幅産物を得た。前記増幅産物のヌクレオチド配列を、シーケンシングを介して確認した。その結果、LMT15-14及びLMT19-1の16S rDNAは、それぞれ配列番号1及び2のヌクレオチド配列を有する。また、前記16S rDNAのヌクレオチド配列を、NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を使用して解析した。系統樹分析結果、LMT15-14は、ラクトバチルス・サリバリウス種のようであり、LMT19-1は、ラクトバチルス・プランタルム種のようであった。LMT15-14及びLMT19-1の16S rDNAは、それぞれラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種と配列同一性が、それぞれ99.9%及び99.9%であり、従って、LMT15-14菌株及びLMT19-1菌株は、ラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種に属する新たな菌株であると確認された。該2個菌株は、それぞれラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)LMT15-14及びラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)LMT19-1と命名し、それらを韓国生命工学研究院所在韓国細胞株銀行(KCTC:Korean Collection for Type Cultures)に、2020年2月21日付けで、寄託番号KCTC14142BP及び同KCTC14141BPで寄託した。
1.C57BL/6Jマウスの肥満誘導、及び乳酸菌処理
高脂肪食餌によって誘発された脂肪肝の抑制効能を評価するために、予防モデルと治療モデルとの2モデルにおいて、乳酸菌投与時の脂肪肝誘発様相を評価した。
全実験期間の間、毎日一定時間に、実験動物の体重を測定し、その結果を、予防モデルは、図1Aに示し、治療モデルは、図1Bに示した。図1A、図1Bは、高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、2種の選別された乳酸菌を投与した場合、経時的な体重変化を示した図面である。図1A、図1Bにおいて、横軸は、時間(週)を示し、縦軸は体重を示す。
(1)肝組織の重さ測定
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を評価した。予防モデル及び治療モデルの実験期間終了後、各群のマウスから肝組織を摘出して重さを測定し、その結果を、予防モデルは、図2Aに示し、治療モデルは、図2Bに示した。
図2A、図2Bに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝組織の重さを確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、L.サリバリウスLMT15-14は、26.6%減少し、L.プランタルムLMT19-1は、24.6%減少し、治療モデルにおいては、L.サリバリウスLMT15-14は、27.8%減少し、L.プランタルムLMT19-1は、24.9%減少した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、肝臓内中性脂肪含量を確認した。各群のマウスから得た肝組織サンプルを、5% NP-40(BioVision、米国)を利用し、100℃で5分加熱した後、常温に冷やした後、該過程を3回反復させた。反復後、上澄み液だけを取り、中性脂肪定量キット(BioVision、米国)を利用し、中性脂肪の含量を、スペクトロフォトメータを利用し、570nmにおける吸光度を測定し、その結果を、予防モデルは、図3Aに示し、治療モデルは、図3Bに示した。
AMPKは、細胞内エネルギー状態を感知するタンパク質であり、エネルギー代謝と係わる肝臓、筋肉、脂肪組織などにおいて、糖、脂肪、コレステロールの分解及び合成を調節する役割を行う。すなわち、細胞内において、糖の吸収及び脂肪の酸化を促進させる物質であり、該AMPKの活性化は、肝組織内脂質酸化を増大させ、中性脂肪数値を低減させる。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、各群のマウスから得た肝組織サンプルを利用し、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子であるPPAR-α及びCPT1と、脂肪合成関連遺伝子であるSREBP-1c及びFASとの発現差を、リアルタイム(real time)PCRを介して測定した。
(1)内臓脂肪組織の重さ測定
正常に、肝組織脂肪酸は、80%が脂肪組織の中性脂肪が脂肪酸に分解された後、循環系を介して肝組織に流入され、15%は、食事後、消化系を介して吸収された後、循環系を介して肝組織に流入され、残り5%は、肝組織の脂肪酸新生過程(de novo lipogenesis)を介して新たにされる。従って、脂肪組織からの脂肪酸流入増大は、肝組織において、過度な脂肪肝を形成するのに密接な関連性を有する。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内AMPK活性程度を確認した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例3.3と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図7Aに示し、治療モデルは、図7Bに示した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内脂肪酸化関連遺伝子であるPPAR-α及びCPT1と、脂肪合成関連遺伝子であるSREBP-1c及びFASとの発現差を、リアルタイムPCRを介して測定した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例3.4と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図8Aに示し、治療モデルは、図8Bに示した。
アディポネクチンは、脂肪組織から分泌されるホルモンであり、AMPK活性とPPARα活性とに影響を与え、脂肪調節に影響を与える。肥満患者において血液内アディポネクチン量が低減し、体脂肪低減は、アディポネクチン生産を増大させ、脂肪酸のβ-酸化を促進し、脂肪肝を抑制する役割を行う。そのようなアディポネクチンは、体脂肪が過度に蓄積された場合、発現量及び血中濃度が低減されるので、脂肪蓄積の指標として使用することができる。
1.菌学的特性分析
非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある2種の乳酸菌L.サリバリウスLMT15-14とL.プランタルムLMT19-1とを、MRS平板培地で培養し、コロニーの形態を観察し、該コロニー形態は、下記表3に示した。
糖発酵特性は、API 50 CHLキット(Biomerieux、フランス)を利用し、供給社の実験方法によって調査した。非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある2種の乳酸菌であるL.サリバリウスLMT15-14とL.プランタルムLMT19-1との糖発酵特性を下記表4に示した。
1.乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いpH上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたMRS液体培地に接種した後、37℃で18時間培養し、その次に、HClでpH2.5に調整し、滅菌されたMRS液体培地に、前記乳酸菌を接種し、37℃で2時間培養した。乳酸菌接種直後と、2時間培養後との試料を回収し、MRS液体培地に希釈し、MRS平板培地に塗抹した後、37℃で24時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表5に示した。
1.乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いpH上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたMRS液体培地に接種した後、37℃で18時間培養し、その次に、HClでpH2.5に調整し、滅菌されたMRS液体培地に、前記乳酸菌を接種し、37℃で2時間培養した。乳酸菌接種直後と、2時間培養後との試料を回収し、MRS液体培地に希釈し、MRS平板培地に塗抹した後、37℃で24時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表6に示した。
乳酸菌の耐胆汁性を調査するために、以下の方法で実験を実施した。乳酸菌は、滅菌されたMRS液体培地に接種した後、37℃で18時間培養し、腸管内胆汁酸塩濃度が0.1(w/v)%前後であることを勘案し、0.3(w/v)%の胆汁酸塩[(Bile salts(Sigma、米国)]が含有されたMRS液体培地に、前記乳酸菌を接種し、37℃で2時間それぞれ培養した。乳酸菌接種直後と、2時間培養後との試料を回収し、MRS液体培地に希釈し、MRS平板培地に塗抹した後、37℃で24時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表7に示した。
Claims (6)
- 中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・サリバリウスLMT15-14(受託番号KCTC14142BP)。
- 中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・プランタルムLMT19-1(受託番号KCTC14141BP)。
- 有効成分として、請求項1または2に記載の微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、またはそれらの混合物を含む、肝機能を改善または肥満関連疾患を予防または治療するための薬剤学的組成物。
- 前記肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪肝、2型糖尿、高脂血症、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝症侯群及び肥満からなる群から選択される1種以上である、請求項3に記載の組成物。
- 有効成分として、請求項1または2に記載の微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、またはそれらの混合物を含む、肝機能を改善または肥満関連疾患を予防または改善するための食品組成物。
- 前記肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪肝、2型糖尿、高脂血症、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝症侯群及び肥満からなる群から選択される1種以上である、請求項5に記載の組成物。
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