WO2016013793A1 - 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물, 아카세틴 및 아피제닌의 용도 - Google Patents

감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물, 아카세틴 및 아피제닌의 용도 Download PDF

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WO2016013793A1
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WO
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extract
gamma
formula
herpes virus
infection
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PCT/KR2015/007250
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송문정
김은실
오경희
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고려대학교 산학협력단
대한민국(환경부 국립생물자원관장)
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    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae

Definitions

  • the present invention relates to the use of the locust extract, acecetin and apigenin for use in the amelioration and treatment of gamma herpesvirus infection.
  • human hospice virus is domestic 70-80% It is a representative chronic virus that shows a high infection rate above, and forms a latent infection once infected, and keeps infectious for a lifetime by repeating latent infection and reactivation in the host (see Table 1. Characteristics of human chronic virus).
  • Table 1 Human Herpes Virus Kinds Latent infection Major diseases HHV-1 Herpes simplex virus-1 Alpha Nervous system Herpes simplex, encephalitis HHV-2 Herpes simplex virus-2 Alpha Nervous system Genital herpes (STD), encephalitis HHV-3 Varicella-Zoster virus Alpha Nervous system Chickenpox, shingles HHV-4 Epstein-Barr virus gamma B lymph system Infectious mononucleosis, Bucket lymphoma, Nasopharyngeal carcinoma, B lymph tumor, Gastric cancer HHV-5 Human cytomegalovirus beta Lymphatic system Infectious mononucleosis, congenital malformations, retinitis, blindness HHV-6 Human herpesvirus-6 beta T lymph system Rash, meningitis, infectious mononucleosis, blunt hepatitis, atypical lymphocytosis HHV-7 Human herpesvirus-7 beta T lymph system HHV-8 Kaposi's s
  • Herpes viruses are a typical opportunistic infection. It causes various diseases through reactivation or congenital infection due to decreased immune function and shows fatal prognosis according to the patient's immune status. Prevention and Treatment of Varicella-Zoster Virus (VZV) There are no preventive vaccines or therapeutic vaccines for the seven human herpesviruses except for live vaccines.
  • VZV Varicella-Zoster Virus
  • gamma herpes virus among the herpes virus may be latently infected with lymph cells to cause tumors, and epithelial cells or fibrous cells are known to cause lytic infection.
  • Gamma herpes viruses include the Epstein-Barr Virus (hereinafter referred to as "EBV”) and Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (hereinafter referred to as "KSHV").
  • the herpes virus is characterized by a high infection rate, especially in the case of EBV, more than 90% of the world population including Korea is seropositive.
  • EBV is associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC), gastric carcinoma (GC), Burkitt's lymphoma BL, post-transplant B cell lymphomas and PTBL during chronic infection by latent infection. ), And Hodgkin's disease (HD), which is closely associated with the formation of multiple tumors (Roizman, 2007).
  • KSHV is the most recently discovered human infectious herpesvirus (1994), known as Kaposi's sarcoma (KS) and primary effusion lymphoma (PEL), a type of B-cell lymphoma, or multicentric Castleman's disease. Castleman's disease) (Alkan et al, 1997; Huang et al, 1995 ,; Liberman et al, 1990; Moore et al, 1994).
  • DNA polymerase DNA polymerase
  • acyclovir and its derivatives are specifically phosphorylated by thymidine kinase (hereinafter, referred to as 'TK') of the herpes virus, and then enter the viral genome, which is replicated by DNA pol.
  • 'TK' thymidine kinase
  • drugs such as forscarnet such as pyrophosphate analogue are commercially available.
  • the present invention provides a composition for improving or treating a gamma herpesvirus infection containing a redwood extract as an active ingredient, comprising administering a therapeutically effective amount of a redwood extract to a subject in need thereof.
  • the extract of the black locust tree may be prepared using conventional extraction methods known in the art.
  • the part of the locust tree used for the extraction is not particularly limited, but preferably, the above-ground part and bark of the locust tree, for example, bark, leaves, inflorescence, twigs and the like can be used.
  • the extraction method methods such as ultrasonic extraction, supercritical fluid extraction, hot water extraction and the like can be used without limitation.
  • Acacia extract refers to an extract obtained by adding a solvent. Among the components of the acacia, fibrin and the like are filtered through a purification process, and the "Acacia extract” of the present invention is a Contains minor ingredients mainly.
  • the "Acacia extract” is to use the antiviral efficacy against gamma herpes virus that is produced by the microcomponents of Acacia.
  • the locust extract may be extracted from locust using water, an organic solvent or a mixture thereof as an extraction solvent.
  • the type of organic solvent and the mixing ratio of water and organic solvent are not particularly limited, and may be prepared according to the conventional extraction method.
  • the organic solvent may be one or more solvents selected from the group consisting of lower alcohols, hexane, acetone, ethyl acetate, chloroform, and diethyl ether.
  • the lower alcohol may be an alcohol having 1 to 6 carbon atoms.
  • methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethanol or ethylene glycol may be used as the lower alcohol.
  • Organic solvents include polar solvents such as acetic acid, dimethyl-formamide (DMFO) and dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, 2,2,4-trimethylpentane, and decane.
  • polar solvents such as acetic acid, dimethyl-formamide (DMFO) and dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, 2,2,4-trimethylpentane, and decane.
  • nonpolar solvents such as benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform, dichloromethane, 1,2-dichloroethane, anneal, diethylamine, ether, carbon tetrachloride, and THF (Tetrahydrofuran).
  • the locust extract may be a lower alcohol extract of the locust tree, preferably the ethanol extract of the locust tree.
  • the locust extract may be a hexane extract of locust.
  • the term 'extract' also includes fractions that additionally fractionate the extract. That is, Acacia extract includes not only one obtained by using the above-described extraction solvent, but also one obtained by additionally applying a purification process thereto.
  • 'fraction' means a result obtained by the fractionation method of separating a specific component or a specific group from a mixture comprising various components. Solvent fractions, silica gel chromatography, prep-HPLC, etc. may be used to prepare specific fractions enriched in active material.
  • fractions obtained by passing the extract or fraction through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Fractions obtained through various purification methods which are prepared are also included in the locust extract of the present invention.
  • the locust extract may be a fraction obtained by re-fractionation of the organic solvent extract of locust tree with a second organic solvent.
  • the second organic solvent refers to an additional organic solvent different from the first organic solvent used as the extraction solvent.
  • the locust extract may be a fraction obtained by re-fractionation of the lower alcohol extract of locust tree with a second organic solvent.
  • the locust extract may be a fraction re-fractionated with hexane ethanol extract of the locust tree.
  • methanol was used as the primary extraction solvent in order to obtain an optimal yield for in vitro experiments, but it will be apparent to those skilled in the art that ethanol instead of methanol will have the same effect.
  • the fractions of the former locust extract with a second organic solvent show very good antiviral efficacy.
  • Acacia extract includes not only crude extracts or fractions thereof obtained by treating an extract solvent on acacia tree but also processed products of acacia extract or a fraction thereof.
  • locust extract or fractions thereof may be prepared in powder form by additional processes such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • locust extract exhibits antiviral efficacy against gamma herpesvirus.
  • Acacia extract can be usefully used for ameliorating or treating infections of gamma herpesviruses, in particular Epstein-Barr Virus (EBV) or Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV).
  • EBV Epstein-Barr Virus
  • KSHV Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus
  • the locust extract according to the present invention may be used for the treatment or amelioration of diseases caused by the infection of gamma herpes virus, such diseases as infectious mononucleosis, Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, B lymphoma Sheep, gastric cancer, Kaposi's sarcoma and B lymphoma.
  • diseases caused by the infection of gamma herpes virus, such diseases as infectious mononucleosis, Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, B lymphoma Sheep, gastric cancer, Kaposi's sarcoma and B lymphoma.
  • the inventors have further discovered the single components involved in the improvement or treatment of gamma herpesvirus infection of the redwood extract.
  • the present invention provides a composition for improving or treating gamma herpesvirus infection containing a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, a therapeutically effective amount of a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • a method of treating a gamma herpesvirus infection comprising administering to a subject in need thereof, a novel use of a compound of formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of an antiviral agent against gamma herpesvirus.
  • R 1 is CH 3 or H.
  • the compound of Formula 1 may be acecetin having a structure of Formula 2.
  • Acacetin (5,7-dihydroxy-4'-methoxy-flavone) is an O-methylated flavone component found primarily in Robinia pseudoacacia L. (black locust), also called acacia or locust , Turnera diffusa (damiana) and fern Asplenium normale.
  • Acecetin is a secondary metabolite synthesized by receiving a methyl group from S-adenosyl methionine by apigenin 4′-O-methyltransferase with apigenin as a skeleton.
  • Acacetin has been reported to have anti-inflammatory and analgesic effects as well as anticancer effects against various cancer cell lines (Jaganathan and Mandal, 2009).
  • Acecetin has been reported to have no antiviral efficacy against herpesviruses, adenoviruses, coronaviruses and rotaviruses in previous studies (Debiaggi et al. 1990), and HIV is latent It has been reported that it is possible to inhibit the reactivation and replication of HIV activated by stimulation in infected cells (Critchfield et al., 1996). Recently, high levels of acecetin have been reported to show antiviral efficacy against influenza viruses (Wu et al. 2010).
  • the compound of formula 1 may be apigenin having the structure of formula 3 below.
  • Apigenin apigenin, 5,7,4'-trihydroxyflavone
  • locust extract fruits such as oranges, apples, cherries and grapes, as well as in vegetables such as onions, parsley, celery, barley and tomatoes, tea and wine
  • apigenin has been reported antiviral efficacy against avian influenza virus, hepatitis C virus, HSV-1 and HIV-1 virus (Sithisarn et al. 2013, Manvar et al. 2012).
  • the compound of Formula 1 used as an active ingredient in the present invention may include all prodrug forms of the compound of Formula 1 that are converted to the compound of Formula 1 in vivo to exhibit antiviral efficacy against gamma herpesvirus.
  • prodrug may be a glycoside of the compound of formula (1).
  • the pharmaceutically or physiologically acceptable salt of the compound of Formula 1 according to the present invention may be an acid addition salt formed using an organic acid or an inorganic acid.
  • the organic acid is, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, isobutyric acid, trifluoroacetic acid, malic acid, maleic acid, malonic acid, fumaric acid, succinic acid, succinic acid monoamide, glutamic acid, tartaric acid, oxalic acid, citric acid, glycol Acids, glucuronic acid, ascorbic acid, benzoic acid, phthalic acid, salicylic acid, anthranilic acid, dichloroacetic acid, aminooxy acetic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid salts;
  • Inorganic acids include, for example, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, n
  • the compounds of formula 1 exhibit antiviral efficacy against gamma herpesvirus.
  • the compound of formula 1 may be usefully used for ameliorating or treating infections of gamma herpesviruses, in particular Epstein-Barr Virus (EBV) or Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV).
  • EBV Epstein-Barr Virus
  • KSHV Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus
  • the compound of formula 1 according to the present invention may be used for the treatment or amelioration of a disease caused by the infection of gamma herpesvirus, and such diseases include infectious mononucleosis, Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, B Lymph tumors, gastric cancer, Kaposi's sarcoma and B lymphoma.
  • the compound of formula 1 used in the present invention can be used by chemical synthesis or by separating or semisynthesizing from extracts of plants containing the compound.
  • the compound of formula 1 may be included in the composition in the form contained in an extract of the plant or a fraction thereof, or may be included in the composition as a compound isolated from the extract of the plant or a fraction thereof.
  • composition of the present invention comprising a locust extract or a compound of Formula 1 as an active ingredient may be a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of gamma herpes virus infection comprising a locust extract or a compound of Formula 1 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant may include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coatings, swelling agents, lubricants, lubricants. Agents, flavors and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient described above for administration.
  • Formulation forms of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions.
  • the active ingredient may be combined with an oral, nontoxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include but are not limited to natural and synthetic gums such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, corn sweeteners, acacia, trackercance or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium Benzoate, sodium acetate, sodium chloride and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the present invention also provides a method for the treatment of a gamma herpesvirus infection comprising administering a therapeutically effective amount of Red Oak Extract or a compound of Formula 1 to a subject in need thereof.
  • the term “subject” refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experiment, preferably human.
  • the term “therapeutically effective amount” means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as contemplated by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician, This includes amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder being treated. It will be apparent to those skilled in the art that the therapeutically effective amount and frequency of administration for the active ingredients of the invention will vary depending on the desired effect. Therefore, the optimal dosage to be administered can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health of the patient.
  • the locust extract of the present invention or the compound of formula 1 in the case of adults, it is preferable to administer the locust extract of the present invention or the compound of formula 1 at a dose of 0.01 mg / kg to 200 mg / kg once or several times a day. .
  • the composition comprising the locust extract of the present invention or the compound of formula 1 as an active ingredient is oral, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular Or via the intradermal route.
  • the present invention is a food composition for improving gamma herpesvirus infection comprising a redwood extract or a compound of formula (1), a method for improving gamma herpesvirus infection comprising administering an effective amount of the redwood extract or a compound of formula (1), Provided is the use of the Red Oak Extract or the compound of Formula 1 for the preparation of a food composition for improving gamma herpesvirus infection.
  • the food composition according to the present invention may be formulated in the same manner as the pharmaceutical composition, used as a functional food, or added to various foods.
  • examples of the food to which the composition of the present invention may be added include beverages, alcoholic beverages, confectionary, diet bars, dairy products, meat, chocolates, pizza, ramen noodles, other noodles, gums, ice creams, vitamin complexes, and health supplements. Etc.
  • the food composition of the present invention is prepared with a beverage such as a drink
  • a beverage such as a drink
  • citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, condensation, and various plant extracts may be further included.
  • the present invention provides a health functional food comprising the composition for improving the gamma herpes virus infection.
  • Health functional foods are foods prepared by adding extracts of the locust tree or fractions thereof to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confectionery, or encapsulated, powdered, suspensions, etc. Means to bring, but unlike the general medicine has the advantage that there are no side effects that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material.
  • the health functional food of the present invention thus obtained is very useful because it can be consumed on a daily basis.
  • the addition amount of the redwood extract or the fraction thereof in such a health food can not be defined uniformly depending on the kind of the health food, but what is necessary is just to add it in the range which does not impair the original taste of a food, It is usually in the range of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight. In the case of food in the form of granules, tablets or capsules, it is usually added in the range of 0.1 to 100% by weight, preferably 0.5 to 80% by weight.
  • the dietary supplement of the present invention may be in the form of a beverage.
  • the locust extract or the compound of formula 1 is effective in treating gamma herpesvirus infection disease with less side effects and toxic expression rate, biocompatible and drug resistance.
  • Figure 1 of the locust extract It is a figure which shows the result of the western blot which analyzed the suppression of viral gene expression with respect to EBV.
  • Figure 2 of the locust extract It is a figure which shows the result of quantitative analysis of the inhibition of viral gene expression with respect to EBV.
  • Figure 3 is a view showing the results of analyzing the antiviral effect on the KSHV of the locust extract.
  • 5 is a compound of Formula 1 The figure which shows the result of having analyzed the viral gene expression suppression with respect to EBV.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the antiviral action of KSHV of the compound of formula (1).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of a Western blot analyzing the inhibition of RTA protein expression of the compound of Formula 1.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of verifying the antiviral efficacy of the mouse gamma herpes virus of the compound of formula (1).
  • Figure 9 shows the results of analyzing the effect on the antiviral efficacy and expression of BZLF1 and BMRF1 genes of acetin in the B95.8 cell line, an EBV infected cell line.
  • Figure 10 shows the results of analyzing the effect on the antiviral efficacy and expression of BZLF1 and BMRF1 gene of acecetin in the Raji cell line, an EBV infected cell line.
  • FIG. 11 shows the results of analyzing the effects on the antiviral efficacy and the phosphorylation of ERK of acecetin in BC-3G and BC-3 KSHV infected cell lines.
  • Figure 13 shows the results of analyzing the effects on the antiviral efficacy of apigenin and the expression of BZLF1 and BMRF1 genes in Raji cell line, an EBV infected cell line.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of analyzing the effect on the antiviral efficacy and apoptosis of ERK in the KSHV infected cell lines BC-3G and BC-3.
  • FIG. 15 shows the results of measuring IC 50 values of acecetin and apigenin.
  • Fig. 16 shows the results of cytotoxicity analysis on Vero cell lines and DG75 cell lines of acecetin and azepinein.
  • Example I locust extract and its Fraction Confirmation of manufacturing and its antiviral efficacy
  • Prunus tree ( Robinia pseudoacacia L .; Bark parts of the black locust tree were dried after drying for 48 hours in a dryer (40 °C).
  • an ultrasonic method was used as the extraction solvent, and 1 L of solvent was added per 100 g of the sample. Extraction time was performed once a 90 minutes per sample, a total of three times, the ultrasonic frequency was 42kHz. The extraction yield of the sample was 7.28% (136.214 / 1,872g x 100).
  • Example I-1 Antiviral efficacy against human gamma-1 herpesvirus, EBV
  • the experiment group was divided into the following five groups according to the type of sample obtained through the preparation example was carried out experiment.
  • the antiviral efficacy of the Prunus cava extract and its fractions was confirmed against EBV, a human gamma herpes virus and gamma-1 herpes virus.
  • Example I-2 Antiviral efficacy against human gamma-2 herpesvirus, KSHV
  • KSHV which is a human gamma herpes virus and gamma-2 herpes virus
  • the BC-3G obtained in this laboratory is a cell line in which a gene expressing green fluorescent protein (GFP) is expressed by a PAN promoter, and is a reporter cell line expressing GFP by lytic replication of a virus expressing RTA. .
  • GFP green fluorescent protein
  • BC-3G was treated with samples 1 to 5 (10, 20, 50, 100 ug / ml) and after 1 hour TPA (20 ng / ml), which was a substance that induces virus reactivation.
  • TPA 20 ng / ml
  • the cells were reactivated in live cells with a flow cytometer (FACS) and the number of virus replicated cells was analyzed by EGFP (+) cell number, and the experiment was repeated three times.
  • FACS flow cytometer
  • A1,3,4,5 showed antiviral efficacy at 50ug / ml, 100ug / ml
  • A2 showed antiviral efficacy only at 100ug / ml.
  • Example I-3 Antiviral Efficacy on Mouse Gamma Herpes Virus, MHV-68
  • Plaque assay using MHV-68 was used to more quantitatively verify the antiviral efficacy of the Prunella paniculata extract and its fractions.
  • samples 1 through 5 were pretreated in Vero cell lines at concentrations of 10, 20, and 50 ug / ml for 3 hours, and then MHV-68 virus was used at 100 pfu / well in Vero cell lines. Infected. After virus removal, the cells were incubated for 5 days in the medium to which the sample was added at the same concentration as the pretreatment, and the number of formed plaques was measured.
  • the locust extract according to the present invention or a fraction thereof can be usefully used for the treatment and improvement of gamma herpes virus infection in which there is no clear therapeutic agent at present.
  • Prunus tree ( Robinia pseudoacacia L .; Antiviral efficacy was tested for the following seven substances including acecetin and apigenin found in the black locust tree.
  • Example II-1 Antiviral efficacy against human gamma-1 herpesvirus, EBV
  • Antiviral efficacy was confirmed against EBV, a human gamma herpesvirus and gamma-1 herpesvirus.
  • Example II-2 Antiviral efficacy against human gamma-2 herpesvirus, KSHV
  • KSHV which is a human gamma herpesvirus and gamma-2 herpesvirus
  • antiviral efficacy was confirmed against BC-3G cell line in which KSHV was latent infected.
  • BC-3G obtained in this laboratory is a reporter cell line expressing GFP by lytic replication of the virus.
  • BC-3G was treated with samples of R1 to R7 ((10, 20, 50, 100 uM) and after 1 hour TPA (20 ng / ml), a substance that induces virus reactivation. After 24 hours, flow cells The number of cells cloned with virus by virtue of reactivation in living cells and analyzed by EGFP (+) cell number was analyzed by the analyzer (FACS), and the experiment was repeated three times.
  • Taxifolin and R5 showed dose-dependent antiviral efficacy and showed cytotoxicity at high concentrations of R1 (Acacetin) and R6 (Apigenin) but strong antiviral effects at low concentrations (10 uM). Showed dose-dependent antiviral efficacy but was found to be cytotoxic.
  • Example II-3 Antiviral Efficacy on Mouse Gamma Herpes Virus
  • Antiviral efficacy of 7 species of locust-bearing single substance was tested through a plaque assay using mouse gamma herpes virus MHV-68.
  • samples of R1 to R7 were pretreated with Vero cell lines at concentrations of 20, 50, and 100 uM for 3 hours, and then MHV-68 virus was infected with Vero cell lines at 100 pfu / well. After virus removal, the cells were incubated for 5 days in the medium to which the sample was added at the same concentration as the pretreatment, and the number of formed plaques was measured.
  • R2, R3, R4, R5, R7 did not show the effect of inhibiting the replication of MHV-68, while R1, R6 has a pronounced antiviral efficacy even at low concentration of 20uM appear.
  • the antiviral efficacy of acecetin was also confirmed at the mRNA level by extracting RNA from cells after acecetin treatment, then synthesizing cDNA and performing RT-Q-PCR using primers specific for viral genes (Cho et al, Antiviral activity of angelicin against gammahepesviruses, Antiviral Res. 2013; 100 (1): 75-83). In all RT-Q-PCR, the mRNA level of the beta-actin, a cytogene, was corrected. BZLF1 is an immediate early gene that is expressed at the beginning of EBV replication and BMRF1 is an early gene that is expressed at a lower stage.
  • acecetin showed potent antiviral efficacy of dose-dependently inhibiting viral transcripts BZLF1, BMRF1 from 2uM in B95.8 and Raji cell lines (FIGS. 9B, 9C, 10B and 10C).
  • Example II-2 Antiviral efficacy was confirmed in the same manner as in Example II-2 .
  • Acecetin was treated at concentrations of 2 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, and 50 uM as previously treated in the EBV infected cell line in Example II-4-1 .
  • Figure 11 As a result, as can be seen in Figure 11 (upper figure), it was confirmed that acecetin inhibits the active infection of the virus in a dose-dependent manner by reducing the ratio of GFP positive cells and viral protein.
  • KSHV latent infected BC-3 cell lines were treated with TPA or TPA and sodium butyrate (NaB) to reactivate the virus, treated with acecetin at different concentrations, and then cells were harvested to collect antibodies and ERK against the viral proteins RTA and K8.
  • Western blot was performed using an antibody capable of detecting phosphorylated-EKR.
  • the phosphorylated-ERK Phosphorylated ERK; pERK
  • Acecetin has a concentration of 0.05 uM 0.1 uM 0.2 uM, 0.4 uM, 0.8 uM, 1.6 uM, 3.2 uM, 6.4 uM, 12.8 uM, 25.6 uM, 50.0 uM, and apigenin at 0.05 uM, 0.1 uM, 0.2 uM, 0.4
  • IC 50 values of apigenin were measured. Three samples for each concentration were used and the relative decrease in the number of plaques was measured compared to the samples treated with DMSO.
  • the IC 50 of acetin was 3.888 uM, and the IC 50 of apigenin was measured to be about 2.670 uM, confirming the high antiviral activity.
  • MTT assay was performed to determine whether the compound of Formula 1 exhibiting antiviral effect is toxic to cells.
  • the Vero cell lines used in the MHV-68 infection experiment were treated with concentrations, and the amount of living cells was measured after 24 hours. After setting the measurement value of the untreated control group to 100%, the relative cell viability of each experimental group was analyzed. As a result, as shown in Figure 16A, acecetin and apigenin was confirmed to have a CC 50 value at 98.11 uM and 42.23 uM, respectively.
  • cytotoxicity of acecetin and apigenin against B cells was confirmed by 7-AAD staining.
  • samples were treated by concentration in DG75 cell line, and the amount of living cells was measured after 24 hours. After setting the measurement value of the untreated control group to 100%, the relative cell viability of each experimental group was analyzed. As a result, as shown in Figure 16B, acecetin and apigenin was confirmed to have a CC 50 value at 225.6 uM and 181.3 uM, respectively.
  • acecetin and apigenin according to the present invention can be usefully used for the treatment and improvement of gamma herpesvirus infection in which there is no clear therapeutic agent at present.

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Abstract

본 발명은 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물, 즉 아카세틴 및 아피제닌의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물; 또는 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 부작용 및 독성 발현율이 적고 생체 친화적이고 약물내성 없이 감마 허피스바이러스 감염 질환을 개선, 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물, 아카세틴 및 아피제닌의 용도
본 발명은 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물, 아카세틴 및 아피제닌의 용도에 관한 것이다.
인체 허피스바이러스 대부분은 국내 70-80% 이상의 높은 감염률을 나타내며, 한 번 감염되면 잠복감염을 형성하고, 숙주에서 잠복감염과 재활성을 반복하여 평생 동안 감염성 유지하는 대표적인 만성바이러스이다(표 1. 인체 만성바이러스의 특징 참조).
표 1
인체허피스바이러스 종류 잠복감염 주요 질병
HHV-1 Herpes simplex virus-1 알파 신경계 단순포진, 뇌염
HHV-2 Herpes simplex virus-2 알파 신경계 생식기 포진 (STD), 뇌염
HHV-3 Varicella-Zoster virus 알파 신경계 수두, 대상포진
HHV-4 Epstein-Barr virus 감마 B림프계 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암
HHV-5 Human cytomegalovirus 베타 림프계 전염성단핵구증, 선천기형, 망막염, 실명
HHV-6 Human herpesvirus-6 베타 T림프계 돌발진, 뇌수막염, 전염성 단핵구증, 전격성 간염, 비전형적 림프구증식증
HHV-7 Human herpesvirus-7 베타 T림프계
HHV-8 Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus 감마 B림프계 카포시육종, B림프종양
허피스바이러스들은 대표적인 기회감염 (opportunistic infection)으로서 면역기능 저하에 따른 재활성이나 선천감염을 통해 다양한 질병을 유발하고 환자의 면역상태에 따라 치명적인 감염 예후를 나타낸다. VZV(Varicella-Zoster virus)의 예방 및 치료 생백신을 제외한 나머지 7종의 인체 허피스바이러스에 대해서는 예방 백신이나 치료 백신 모두 없는 실정이다.
장기이식 (organ transplant) 및 조혈모세포 이식 (Hematopoietic Stem Cell Transplant)의 증가, 인체면역결핍바이러스 (HIV-1) 감염 등, 면역 저하에 따른 재활성 허피스바이러스 감염제어가 중요한 이슈가 되고 있다.
또한, 허피스바이러스의 지속감염으로 인한 노년층 인구의 면역 저하(리뷰 논문: Koch et al, Cytomegalovirus infection: a driving force in human T cell immunosenescence, Ann N Y Acad Sci. 2007 1114:23-35)는 최고속으로 고령화 사회에 진입하고 있는 우리나라와 고령화 사회에 이미 진입한 세계 주요국가 실정에서 중요한 보건 사회적 부담으로 작용할 것이다.
한편, 허피스바이러스 가운데 감마허피스바이러스는 림프세포에 잠복 감염되어 종양을 일으킬 수 있으며, 상피세포나 섬유세포에서는 용해성 감염(lytic infection)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 감마허피스바이러스에는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, 이하, 'EBV'라고 함)와 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, 이하, 'KSHV'라고 함)가 있다.
통상 허피스바이러스는 높은 감염률을 특징으로 하는데, 특히 EBV의 경우 우리나라를 포함한 전세계 인구의 90 % 이상이 혈청 양성반응을 나타낸다. EBV는 잠복감염에 의한 만성 감염시 코인두암종(nasopharyngeal carcinoma, NPC), 위암종(gastric carcinoma, GC), 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma BL), 이식후 B 세포 림프종(post-transplant B cell lymphomas, PTBL), 및 호지킨림프종(Hodgkin's disease, HD) 등 다종의 종양들의 형성과 깊은 연관성이 있다 (Roizman, 2007).
KSHV는 가장 최근(1994년)에 발견된 인체 감염 허피스바이러스로서, 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma, KS)과, B 세포 림프종의 일종인 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma: PEL)이나 다중심성 캐슬만병(multicentric Castleman's disease)의 원인 바이러스이다 (Alkan et al, 1997; Huang et al, 1995,; Liberman et al, 1990; Moore et al, 1994).
기존 항허피스바이러스제제는 대부분 바이러스 DNA 중합효소 (DNA pol)을 타겟으로 개발되었다. 그 중, 아실클로버(acyclovir) 및 그 유도체는 허피스바이러스의 티미딘 키나아제(thymidine kinase, 이하, 'TK'라고 함)에 의해서 특이적으로 인산화 된 후 DNA pol에 의해 복제되는 바이러스 게놈으로 끼어들어 DNA 조기 종결(premature termination)을 유도하는 약물로, 개발 후 지난 40여 년 동안 가장 많이 사용되었다. 이 외에 피로인산 유사체(pyrophosphate analogue)와 같은 포스카르네트(forscarnet) 등의 약물이 상용되고 있다.
이들은 알파-허피스바이러스 감염의 치료에는 유효한 반면, 베타나 감마허피스바이러스의 초기감염증 (예: 전염성 단핵구증) 또는 재활성 감염에는 그 임상적인 역가가 제한적이다. 특히, 감마허피스바이러스의 제어에 유용하게 사용될 수 있는 항바이러스제는 존재하지 않아 주로 스테로이드 계열의 약물을 통한 대증요법에 의존하고 있는 실정이다.
또한, 최근 장기이식 및 조혈모세포이식, HIV 감염으로 인한 면역결핍환자의 경우 약물의 독성이 심하게 나타나고, 더 중요하게는 이들 환자에게서 약물내성의 돌연변이 출현이 증가하고 있다 (Danve-Szatanek C et al. 2004; Limaye AP et al. 2000; Marfori JE et al. 2007).
대부분의 약물내성 돌연변이는 TK나 바이러스 DNA pol에 대한 돌연변이로서, 새로운 타겟이나 메카니즘을 가지는 항허피스바이러스제 신약 후보 물질 개발이 매우 시급한 실정이다.
본 발명은 약물독성 및 약물내성은 없으면서 감마 허피스바이러스 감염을 효과적으로 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 성분을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이를 위해, 본 발명은 아까시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 감마 허피스바이러스 감염의 개선 또는 치료용 조성물, 치료상 유효량의 아까시나무 추출물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법, 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스제의 제조를 위한 아까시나무 추출물의 신규 용도를 제공한다.
본 명세서에서, 아까시나무(black locust tree, Robinia pseudoacacia L.)의 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출방법을 이용하여 제조할 수 있다. 추출에 사용되는 아까시나무의 부위는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 아까시나무의 지상부 및 수피, 예를 들어, 수피, 잎, 화서, 잔가지류 등을 사용할 수 있다. 또한, 추출의 방법으로는 초음파 추출, 초임계유체 추출, 열탕 추출 등의 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 “아까시나무 추출물”은 용매를 가하여 추출함으로써 얻어진 추출물을 의미하는 것으로, 아까시나무의 구성성분 중 섬유소 등은 정제 과정을 통해 걸러지고, 본 발명의 “아까시나무 추출물”은 아까시나무의 미량성분을 주로 포함하고 있다.
본 발명에 있어서 “아까시나무 추출물”은 아까시나무의 미량성분들이 복합적으로 만들어 내는 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 이용하는 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출 용매로서 이용하여 아까시나무로부터 추출된 것일 수 있다. 이 때 사용되는 유기용매의 종류나 물과 유기용매의 혼합 비율은 특별히 제한되지 않으며, 통상의 추출 방법에 따라 아까시나무 추출물을 제조할 수 있다.
예를 들어, 상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매일 수 있다. 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 6의 알코올일 수 있다. 예를 들어, 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 유기용매는 이 외에도 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등의 극성 용매, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran) 등의 비극성 용매를 사용할 수도 있다.
한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 저급 알코올 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 아까시나무의 에탄올 추출물일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 헥산 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 아까시나무 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 본 명세서에서 '분획물'은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 용매 분획, 실리카 겔 크로마토그라피(silica gel chromatography), prep-HPLC 등의 기술을 이용하여 활성물질이 농축된 특정 분획물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물이나 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 아까시나무 추출물에 포함된다.
한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 유기용매 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 여기에서, 제2의 유기용매는 추출용매로 사용된 첫번째 유기용매와는 상이한 추가의 유기용매를 말한다. 다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 저급 알코올 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물일 수 있다. 하기 실시예에서는 인 비트로 실험을 위한 최적의 수율을 얻기 위해 메탄올을 1차적인 추출 용매로 사용하였으나, 메탄올 대신 에탄올을 사용하여도 동일한 효과를 나타낼 것임은 당업자에게 명백하다. 하기 실시예에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 아까시나무 전 추출물을 제2의 유기용매로 분획한 분획물은 매우 우수한 항바이러스 효능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘아까시나무 추출물’은 아까시나무에 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물 또는 이들의 분획물뿐만 아니라 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타낸다.
아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스, 특히 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)의 감염의 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스의 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 질환으로는 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양을 포함한다.
본 발명자들은 추가의 연구를 통해 아까시나무 추출물의 감마 허피스바이러스 감염의 개선 또는 치료에 관여하는 단일성분들을 밝혔다.
이에 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 감마 허피스바이러스 감염의 개선 또는 치료용 조성물, 치료상 유효량의 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법, 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스제의 제조를 위한 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 신규 용도를 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2015007250-appb-C000001
상기 식에서,
R1은 CH3 또는 H이다.
한 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 아카세틴(acacetin)일 수 있다.
화학식 2
Figure PCTKR2015007250-appb-C000002
아카세틴 (acacetin; 5,7-dihydroxy-4'-methoxy-flavone)은 아카시아나무 또는 아까시나무라고 불리는 Robinia pseudoacacia L. (black locust)에서 주로 발견되는 O-메틸화 플라본 (O-methylated flavone) 성분으로, Turnera diffusa (damiana)와 양치류 Asplenium normale에서도 발견된다. 아카세틴은 아피제닌을 골격으로 아피제닌 4'-O-메틸트랜스퍼라제에 의해 S-아데노실 메티오닌으로부터 메틸기를 공급받아 합성되는 2차대사물질이다. 아카세틴은 항염증 및 진통작용뿐 아니라 다양한 암 세포주에 대한 항암효능이 보고된 바 있다(Jaganathan and Mandal, 2009). 아카세틴은 이전 연구에서 허피스바이러스 (herpesvirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 코로나바이러스 (coronavirus)와 로타바이러스 (rotavirus) 등에 대한 항바이러스 효능이 없는 것으로 보고되었고 (Debiaggi et al. 1990), HIV가 잠복감염 된 세포에서 자극에 의해서 활성화되는 HIV의 재활성 및 복제를 억제 할 수 있음이 보고된 바 있다 (Critchfield et al., 1996). 또 최근에는 고농도의 아카세틴에서 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능이 나타난다고 보고된 바 있다 (Wu et al. 2010).
다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 아피제닌(apigenin)일 수 있다.
화학식 3
Figure PCTKR2015007250-appb-C000003
아피제닌 (apigenin, 5,7,4’-trihydroxyflavone)은 아까시나무 추출물에서 발견될 뿐 아니라 오렌지, 사과, 체리, 포도 등의 과일과 양파, 파슬리, 샐러리, 보리, 토마토 등의 야채나 차, 와인 등의 음료에 풍부하게 존재하는 플로본 계열 화합물로서 (UmiKalsom and Harborne, 1991, Zhao et al. 2008) 항산화효과, 항염증효과 및 항암효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Tong and Pelling, 2013). 또한, 아피제닌은 조류 독감 바이러스, C형 간염 바이러스, HSV-1 및 HIV-1 바이러스에 대한 항바이러스 효능이 보고된 바 있다(Sithisarn et al. 2013, Manvar et al. 2012).
또한, 본 발명에서 유효성분으로 사용하는 화학식 1의 화합물은 생체 내에서 화학식 1의 화합물로 전환되어 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타내게 되는 화학식 1의 화합물의 프로드럭 형태를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 프로드럭은 화학식 1의 화합물의 배당체일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있다. 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 아이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며; 무기산은, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다. 상기 언급된 산 부가염은 당업계에 공지된 방법을 통하여 상기 화학식 1의 화합물로부터 제조될 수 있다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타낸다.
화학식 1의 화합물은 감마 허피스바이러스, 특히 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)의 감염의 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 감마 허피스바이러스의 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 질환으로는 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양을 포함한다.
본 발명에 사용된 화학식 1의 화합물은 화학적으로 합성하거나 상기 화합물을 함유하는 식물의 추출물로부터 분리 또는 반합성하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 화학식 1의 화합물은 식물의 추출물 또는 그의 분획물에 포함된 형태로 상기 조성물 중에 포함되거나, 식물의 추출물 또는 그의 분획물로부터 단리된 화합물로서 상기 조성물 중에 포함될 수 있다.
아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 의약 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 의약 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한 본 발명은 치료상 유효량의 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01 ㎎/kg~200 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물, 유효량의 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 개선 방법, 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물의 제조를 위한 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 같은 음료류로 제조되는 경우 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물 이외에도 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과접, 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 감마 허피스바이러스 감염의 개선용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강식품에 있어서의 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물의 첨가량은, 대상인 건강식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 음료의 형태일 수 있다.
본 발명에 따르면, 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물은 부작용 및 독성 발현율이 적고 생체 친화적이고 약물내성 없이 감마 허피스바이러스 감염 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 분석한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 정량분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 아까시나무 추출물의 KSHV에 대한 항바이러스 작용을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 아까시나무 추출물 및 그의 분획물들의 MHV-68에 대한 항바이러스 효능을 보여주는 플라그 어세이의 결과이다.
도 5는 화학식 1의 화합물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 화학식 1의 화합물의 KSHV에 대한 항바이러스 작용을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 화학식 1의 화합물의 RTA 단백질 발현 억제를 분석한 웨스턴 블롯의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 화학식 1의 화합물의 마우스 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 검증한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 EBV감염세포주인 B95.8 세포주에서의 아카세틴의 항바이러스 효능 및 BZLF1 및 BMRF1 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 EBV감염세포주인 Raji 세포주에서의 아카세틴의 항바이러스 효능 및 BZLF1 및 BMRF1 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 KSHV 감염세포주인 BC-3G와 BC-3에서의 아카세틴의 항바이러스 효능 및 ERK의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 EBV감염세포주인 B95.8세포주에서의 아피제닌의 항바이러스 효능 및 BZLF1 및 BMRF1 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 EBV감염세포주인 Raji 세포주에서의 아피제닌의 항바이러스 효능 및 BZLF1 및 BMRF1 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 KSHV 감염세포주인 BC-3G와 BC-3에서의 아피제닌의 항바이러스 효능 및 ERK의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 아카세틴과 아피제닌의 IC50 값을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 16은 아카세틴과 아제피닌의 베로 세포주 및 DG75 세포주에 대한 세포 독성 분석 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 I : 아까시나무 추출물 및 그의 분획물의 제조 및 그의 항바이러스 효능 확인
제조예: 아까시나무 추출물 및 그의 분획물의 제조
아까시나무 (Robinia pseudoacacia L.; black locust tree)의 수피 부위를 건조기(40℃)에서 48시간 건조 후 세절하였다. 추출 방법으로는 초음파법을 이용하였다. 추출 용매는 80% 메탄올을 사용하였으며, 용매의 량은 시료 100g 당 용매 1L 을 첨가하였다. 추출 시간은 시료당 1회 90분씩, 총 3회 수행하였으며, 초음파 Frequency는 42kHz 였다. 시료의 추출 수율은 7.28%(136.214/1,872g×100)을 나타내었다. 유기용매를 모두 증발시킨 아까시나무 추출물을 2차 증류수로 현탁한 후 극성이 낮은 순에서 높은 순으로 hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH의 용매를 이용하여 분획을 실시하였으며, 남은 유기용매 및 증류수 건조를 위하여 동결건조(-120℃)처리하였다. 전처리가 완료된 분획량은 hexane층, 11.65g, CHCl3층 14.03g, EtOAc층 9.92g, BuOH층 53.5g을 나타내었다.
실시예 I-1. 인체 감마-1 허피스바이러스, EBV에 대한 항바이러스 효능
실험군을 상기 제조예를 통해 얻어진 시료의 종류에 따라 하기 5 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.
실험군 1(아1): 메탄올 추출물(Total MeOH 추출물) 처리군
실험군 2(아2): 메탄올 추출물의 BuOH 분획물 처리군
실험군 3(아3): 메탄올 추출물의 CHCl3 분획물 처리군
실험군 4(아4): 메탄올 추출물의 EtOAc 분획물 처리군
실험군 5(아5): 메탄올 추출물의 헥산 분획물 처리군
인간 감마허피스바이러스이고, 감마-1 허피스바이러스인 EBV에 대해 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 확인하였다.
EBV가 잠복감염된 B95.8세포주에 시료 (10, 20, 50, 100 ug/ml)를 미리 1시간동안 처리한 후 TPA (20 ng/㎖)로 바이러스 재활성을 유도하였다. 재활성 유도 24시간 후 세포를 수거하여 DMSO 처리한 대조군과 비교하여 아1 내지 아5의 시료가 바이러스 복제에 미치는 영향을 EBV의 대표적인 활성 유전자(lytic gene)인 EA-D의 단백질 발현정도를 확인하는 웨스턴블럿(western blot)을 통해 조사하였다. 그런 다음, 대조군으로 사용된 알파-튜불린의 강도로 EA-D의 단백질의 강도를 나누어 바이러스 단백의 발현량을 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 모든 시료 처리군이 100 ug/ml에서 항바이러스 효능을 나타냈으며, 아4, 아5의 경우 탁월한 항바이러스 효능을 나타내었다. 또한, 정량적인 분석 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 처리한 시료농도에 의존적으로 바이러스 단백발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 I-2. 인체 감마-2 허피스바이러스, KSHV에 대한 항바이러스 효능
인간 감마허피스바이러스이고, 감마-2 허피스바이러스인 KSHV에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위해, KSHV가 잠복감염된 세포인 BC-3G 세포주에 대해 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 확인하였다.
본 실험실에서 확보하고 있는 BC-3G는 PAN 프로모터에 의해 녹색형광단백질(GFP)이 발현되는 유전자를 도입한 세포주로서 RTA가 발현되는 바이러스의 활성 감염(lytic replication)에 의해 GFP를 발현하는 리포터 세포주이다.
BC-3G에 아1 내지 아5의 시료(10, 20, 50, 100 ug/ml)를 처리하고 1시간 후 바이러스의 재활성을 유도하는 물질인 TPA(20ng/㎖)를 처리하였다. 24 시간 후, 유세포분석기 (FACS)로 살아있는 세포 중 재활성에 진입하여 바이러스 복제가 이루어진 세포의 수를 EGFP(+) 세포수로 분석하였으며, 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 아1,3,4,5는 50ug/ml, 100ug/ml에서 항바이러스 효능을 나타냈으며, 아2는 100ug/ml에서만 항바이러스 효능을 나타내었다.
실시예 I-3. 마우스 감마허피스바이러스, MHV-68에 대한 항바이러스 효능
마우스 감마 허피스바이러스인 MHV-68을 이용한 플라그 에세이(plaque assay)를 통해 보다 정량적으로 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 검증하였다. 먼저 베로(Vero) 세포주에 아1 내지 아5의 시료들을 10, 20, 50 ug/ml의 농도로 3시간 동안 전 처리한 후, MHV-68 바이러스를 베로(Vero) 세포주에 100 pfu/well로 감염시켰다. 바이러스 제거 후, 전처리와 같은 농도로 시료를 첨가한 배지에서 상기 세포를 5일 동안 배양하고, 형성된 플라그 수를 측정하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 저농도 (10, 20, 50 ug/ml)의 시료 처리에서 아3, 아4가 항바이러스 효능을 나타내었으며, 아5가 용량의존적인 항바이러스 효능을 나타냈다.
이상 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물은 현재로서 뚜렷한 치료제가 존재하지 않는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 및 개선을 위해 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 II : 화학식 1의 화합물의 항바이러스 효능 확인
아까시나무 (Robinia pseudoacacia L.; black locust tree)에서 발견되는 아카세틴 및 아피제닌을 포함하는 하기 7종의 물질에 대한 항바이러스 효능을 시험하였다.
Figure PCTKR2015007250-appb-I000001
본 실시예 및 도면에서, 이들 화합물은 상기 화합물명과 함께 병기된 R1 내지 R7의 약어로도 표현된다.
실시예 II-1. 인체 감마-1 허피스바이러스, EBV에 대한 항바이러스 효능
인간 감마허피스바이러스이고, 감마-1 허피스바이러스인 EBV에 대해 항바이러스 효능을 확인하였다.
EBV가 잠복감염된 B95.8세포주에 시료 (10, 20, 50uM 또는 2, 5, 10, 20, 50uM)를 미리 1시간 동안 처리한 후 TPA (20 ng/㎖)로 바이러스 재활성을 유도하였다. 재활성 유도 24시간 후 세포를 수거하여 DMSO 처리한 대조군과 비교하여 R1 내지 R7의 시료가 바이러스 복제에 미치는 영향을 EBV의 대표적인 활성 유전자(lytic gene)인 EA-D의 단백질 발현정도를 확인하는 웨스턴블럿(western blot)을 통해 조사하였다. 그런 다음, 대조군으로 사용된 알파-튜불린의 강도로 EA-D의 단백질의 강도를 나누어 바이러스 단백의 발현량을 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 모든 시료 처리군에서 용량의존적인 항바이러스 효능이 나타났으며, 그 중에서도 R1, R3, R6가 탁월한 항바이러스 효능을 나타내었다.
실시예 II-2. 인체 감마-2 허피스바이러스, KSHV에 대한 항바이러스 효능
인간 감마허피스바이러스이고, 감마-2 허피스바이러스인 KSHV에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위해, KSHV가 잠복감염된 세포인 BC-3G 세포주에 대해 항바이러스 효능을 확인하였다.
본 실험실에서 확보하고 있는 BC-3G는 바이러스의 활성 감염(lytic replication)에 의해 GFP를 발현하는 리포터 세포주이다. BC-3G에 R1 내지 R7의 시료((10, 20, 50, 100 uM)를 처리하고 1시간 후 바이러스의 재활성을 유도하는 물질인 TPA(20ng/㎖)를 처리하였다. 24 시간 후, 유세포분석기 (FACS)로 살아있는 세포 중 재활성에 진입하여 바이러스 복제가 이루어진 세포의 수를 EGFP(+) 세포수로 분석하였으며, 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, R4 (Taxifolin), R5 (Myricetin)의 화합물들은 용량 의존적인 항바이러스 효능 보이며, R1 (Acacetin), R6 (Apigenin) 고농도에서 세포독성을 보이나 저농도 (10uM)에서 강한 항바이러스 효능을 나타냈다. R3 (Fisetin)는 용량 의존적인 항바이러스 효능을 보이지만, 세포독성이 강한 것으로 파악되었다.
이를 분자생물학적 방법으로 증명하기 위해 KSHV 잠복감염 세포주인 BC-3G의 KSHV의 활성기 바이러스 복제의 극초기 유전자인 RTA 단백질 발현정도 차이를 웨스턴블럿(western blot)으로 확인하였다. BC-3G에 R1 내지 R7의 시료(20uM)를 처리하고 1시간 후 바이러스의 재활성을 유도하는 물질인 TPA(20ng/㎖)를 처리하였다. 24 시간 후, 세포를 수거하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, TPA를 처리한 DMSO 처리군의 단백질 발현양에 비해 R1, R3, R6 처리군의 경우 RTA 발현양이 줄어드는 것을 확인하였다. 즉, R1, R3, R6은 20 uM로 처리했을 때, 바이러스 단백을 감소시키는 항바이러스 효능을 나타냈다.
실시예 II-3. 마우스 감마허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능
마우스 감마 허피스바이러스인 MHV-68을 이용한 플라그 에세이(plaque assay)를 통해 아까시나무 함유 단일물질 7종의 항바이러스 효능을 시험하였다. 먼저 베로(Vero) 세포주에 R1 내지 R7의 시료들을 20, 50, 100 uM의 농도로 3시간 동안 전 처리한 후, MHV-68 바이러스를 베로(Vero) 세포주에 100 pfu/well로 감염시켰다. 바이러스 제거 후, 전처리와 같은 농도로 시료를 첨가한 배지에서 상기 세포를 5일 동안 배양하고, 형성된 플라그 수를 측정하였다. 그 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, R2, R3, R4, R5, R7는 MHV-68의 복제를 억제하는 효능을 보여주지 못한 반면, R1, R6은 20uM의 저농도에서도 뚜렷한 항바이러스 효능이 나타났다.
실시예 II-4. 아카세틴의 항바이러스 효능 및 기전 연구
1) EBV에 대한 아카세틴의 항바이러스 효능 및 기전 연구
EBV감염세포주인 B95.8과 Raji 세포주에서 아카세틴의 항바이러스 효능 검증하고 항바이러스 효능의 기전을 조사하였다. 실시예 II-1과 마찬가지로, EA-D의 단백질 발현정도를 확인하는 웨스턴블럿(western blot) 을 수행하였다. B95.8에는 TPA (20 ng/ml)를 처리하고, Raji에는 TPA (20 ng/ml)와 소듐 부티레이트(NaB)(3mM)를 처리하여 바이러스의 재활성을 유도하였다. 실시예 II-1에 따른 B95.8을 이용한 실험에서 아카세틴 10 uM 처리 시 EBV 바이러스 단백인 EA-D를 현저하게 줄여주는 결과를 확인했기 때문에 아카세틴은 그보다 낮은 농도까지 처리하여 실험을 진행하였다. 실험 결과, 도 9 및 10에서 볼 수 있는 바와 같이, B95.8과 Raji에서 모두 가장 낮은 처리농도 2 uM에서도 바이러스 단백이 줄어있는 것을 확인 했으며, 용량 의존적인 항바이러스 효능을 보였다(도 9A 및 10A).
이와 같은 아카세틴의 항바이러스 효능을 아카세틴 처리 후 세포에서 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하여 바이러스 유전자들에 대한 특이적인 프라이머들을 사용하여 RT-Q-PCR 을 수행함으로써 mRNA level에서도 확인하였다 (Cho et al, Antiviral activity of angelicin against gammahepesviruses, Antiviral Res. 2013;100(1):75-83). 모든 RT-Q-PCR에서는 세포유전자인 베타-액틴의 mRNA 레벨로 보정하여 진행하였다. BZLF1은 EBV 복제 시작과 함께 발현하는 극초기유전자 (immediate early gene)이고 BMRF1은 그 하위 단계에서 발현하는 초기유전자 (early gene)이다. 실험 결과, 아카세틴은 B95.8과 Raji 세포주에서 2uM부터 바이러스 전사물 BZLF1, BMRF1을 용량의존적으로 저해하는 강력한 항바이러스 효능을 보였다 (도 9B, 9C, 10B 및 10C).
2) KSHV에 대한 아카세틴의 항바이러스 효능 및 기전 연구
KSHV 감염세포주인 BC-3G와 BC-3에서 아카세틴의 항바이러스 효능 검증하고 항바이러스 효능의 기전을 조사하였다.
항바이러스 효능은 실시예 II-2와 동일한 방식으로 확인하였다. 앞서 실시예 II-4-1에서 EBV 감염세포주에 처리한 것과 같이 아카세틴을 2 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 50 uM의 농도로 처리하였다. 그 결과, 도 11(위쪽 도면)에서 볼 수 있는 바와 같이, 아카세틴이 용량의존적인 방식으로 바이러스의 활성감염을 억제하는 것을 GFP positive cell의 비율과 바이러스 단백의 감소로 확인하였다.
이러한 아카세틴의 항바이러스 효능의 기전을 알아보기 위해 KSHV 재활성에 중요한 신호로 알려진 ERK의 인산화를 확인하였다. KSHV 잠복 감염 BC-3 세포주에TPA 또는 TPA와 소듐 부티레이트(NaB)를 처리하여 바이러스를 재활성 시키는 한편, 아카세틴을 농도별로 함께 처리한 후 세포를 수거하여 바이러스 단백 RTA와 K8에 대한 항체와 ERK와 인산화-EKR을 감지할 수 있는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 실험 결과, 도 11(아래쪽 도면)에서 볼 수 있는 바와 같이, DMSO를 처리한 대조군과 비교했을 때 아카세틴을 처리한 경우에도 인산화-ERK(Phosphorylated ERK;pERK)가 줄지 않는 것으로 나타났다.
실시예 II-5. 아피제닌의 항바이러스 효능 및 기전 연구
1) EBV에 대한 아피제닌의 항바이러스 효능 및 기전 연구
실시예 II-4와 동일한 방법으로 아피제닌의 EBV에 대한 항바이러스 효능 및 기전을 조사하였다. 도 12 및 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 아피제닌을 2uM로 처리했을 때도 B95.8과 Raji에서 바이러스 단백이 현저하게 줄어있는 것을 확인했으며, 용량 의존적인 항바이러스 효능을 보였다 (도 12A, 13A). 또한, 아피제닌의 처리는 EBV의 극초기유전자인 BZLF1의 mRNA 양을 현격하게 줄이며, 그 하위단계인 BMRF1의 전사량을 용량 의존적으로 줄이는 결과를 보였다 (도 12B, 12C, 13A, 13B). 이를 통해 아피제닌이 바이러스 복제의 초반에 작용하여 항바이러스 효능을 가질 것을 예상할 수 있었다.
2) KSHV에 대한 아제피닌의 항바이러스 효능 및 기전 연구
실시예 II-4와 동일한 방법으로 아피제닌의 KSHV에 대한 항바이러스 효능 및 기전을 조사하였다. 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 아피제닌이 용량의존적인 방식으로 바이러스의 활성감염을 억제하는 것을 GFP positive cell의 비율과 바이러스 단백의 감소로 확인하였다(도 14의 위쪽 도면). 또한, 아피제닌을 처리한 경우 용량 의존적으로 ERK의 인산화가 억제되는 결과를 확인하였다(도 14의 아래쪽 도면). 따라서, 아피제닌은 ERK의 인산화를 억제하는 기전을 통해 바이러스의 활성 복제를 억제하는 것으로 예상되었다.
실시예 II-6. 아카세틴 및 아피제닌의 IC50 값 측정
아카세틴은 0.05 uM 0.1 uM 0.2 uM, 0.4 uM, 0.8 uM, 1.6 uM, 3.2 uM, 6.4 uM, 12.8 uM, 25.6 uM, 50.0 uM의 농도로, 아피제닌은 0.05 uM, 0.1 uM, 0.2 uM, 0.4 uM, 0.8 uM, 1.6 uM, 3.2 uM, 4.8 uM, 6.4 uM, 12.8 uM, 25.6 uM, 30.0 uM의 농도로 베로 세포에 각각 처리하여 MHV-68으로 감염시킨 후, plaque reduction assay를 통해 아카세틴과 아피제닌의 IC50값을 측정하였다. 각 농도당 3개의 샘플을 사용했고, DMSO를 처리한 샘플과 비교하여 상대적인 플라그 수의 감소를 측정하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 아카세틴의 IC50는 3.888 uM이며, 아피제닌의 IC50는 2.670 uM 정도로 측정되어 높은 항바이러스 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 II-7. 화학식 1의 화합물의 세포독성
항바이러스 효과를 보이는 화학식 1의 화합물이 세포에 독성을 미치는지 확인하기 위해 MTT 어세이를 수행하였다. MHV-68 감염 실험시 사용한 베로 세포주에 시료를 농도별로 처리하고, 24시간 후 살아있는 세포의 양을 측정하였다. 무처리 대조군의 측정치를 100%로 정한 뒤 각 실험군의 상대적인 세포생존율을 분석하였다. 그 결과 도 16A에 나타난 바와 같이, 아카세틴과 아피제닌은 각각 98.11 uM과 42.23 uM 에서 CC50 값을 갖는 것으로 확인하였다.
추가로, 아카세틴과 아피제닌의 B 세포 (DG75)에 대한 세포 독성을 7-AAD 염색을 통해 확인하였다. 앞서 MTT 어세이와 마찬가지로, DG75 세포주에 시료를 농도별로 처리하고, 24시간 후 살아있는 세포의 양을 측정하였다. 무처리 대조군의 측정치를 100%로 정한 뒤 각 실험군의 상대적인 세포생존율을 분석하였다. 그 결과, 도 16B에 나타난 바와 같이, 아카세틴과 아피제닌은 각각 각각 225.6 uM과 181.3 uM 에서 CC50 값을 갖는 것으로 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 아카세틴 및 아피제닌은 현재로서 뚜렷한 치료제가 존재하지 않는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 및 개선을 위해 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (26)

  1. 아까시나무 추출물; 또는
    화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000002
    상기 식에서,
    R1은 CH3 또는 H이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물의 추출물인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 유기용매 추출물을 추가의 유기용매로 재분획한 분획물인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 아카세틴(acacetin)인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 아피제닌(apigenin)인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 감마 허피스바이러스는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것인 감마 허스피바이러스 감염 치료용 약학적 조성물.
  11. 아까시나무 추출물; 또는
    화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000003
  12. 제11항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물의 추출물인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 유기용매 추출물을 추가의 유기용매로 재분획한 분획물인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 아카세틴(acacetin)인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 아피제닌(apigenin)인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 감마 허피스바이러스는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것인 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
  21. 치료상 유효량의 아까시나무 추출물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법.
  22. 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스제의 제조를 위한 아까시나무 추출물의 용도.
  23. 치료상 유효량의 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000004
    상기 식에서,
    R1은 CH3 또는 H이다.
  24. 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스제의 제조를 위한 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000005
    상기 식에서,
    R1은 CH3 또는 H이다.
  25. 유효량의 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 감마 허스피바이러스 감염 개선 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000006
    상기 식에서,
    R1은 CH3 또는 H이다.
  26. 감마 허스피바이러스 감염 개선용 식품 조성물의 제조를 위한 아까시나무 추출물 또는 화학식 1의 화합물의 용도.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007250-appb-I000007
    상기 식에서,
    R1은 CH3 또는 H이다.
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