WO2023022523A1 - 구아바(Psidiuma guajava) 잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 수득한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

구아바(Psidiuma guajava) 잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 수득한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이바울
초효문
박은진
최영기
김은하
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충북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention is a composition for the prevention or treatment of novel coronavirus (SARS-CoV-2) infection comprising a leaf extract of Psidium guajava or a fraction thereof or a sesquiterpenoid-based compound isolated and purified therefrom as an active ingredient It relates to, and more particularly, to a composition of natural origin for the prevention, improvement and treatment of novel coronavirus infection, which is prepared by mixing constituent compounds obtained from guava to exhibit a synergistic effect.
  • SARS-CoV-2 novel coronavirus
  • Coronaviruses are RNA viruses belonging to the family Coronaviridae , and are named because when viewed under an electron microscope, the spikes protrude from the surface, reminiscent of the crown or solar corona (Englund et al., 2019). ).
  • Coronaviridae There are two subfamilies in the Coronaviridae, Coronavirinae and Torovirinae , and coronaviruses belong to the former.
  • the coronavirus subfamily is further divided into four genera: Alphacoronavirus , Betacoronavirus , Gammacoronavirus , and Deltacoronavirus . Of these, the former two genera, alpha and beta-coronaviruses, are known to infect humans and animals, and gamma and delta viruses to infect animals.
  • SARS-CoV-2 and MERS-CoV belong to the beta-coronavirus family.
  • the coronavirus also infects animals such as pigs, dogs, cats, bats, and horses.
  • coronavirus infection crisis SARS (acute respiratory syndrome) and MERS (Middle East respiratory syndrome) in the 20 years since 2000, and now, Corona 19, which originated in Wuhan, China in December 2019 (COVID-19) is experiencing a pandemic infection crisis. All of these coronaviruses belong to the genus beta-coronavirus, but each has different transmission power and fatality rate.
  • Guava Psidium guajava
  • Antioxidant activity, prebiotic activity, and immunity enhancement are known as the effects of guava known so far, and in particular, antidiabetic activity, hyperlipidemia, risk reduction of vascular disease and liver cirrhosis through the PI3K/Akt signaling pathway have been proven through animal experiments. (Jiao, Y., et al., 2017; Vijaya Anand, A., et al., 2020;).
  • guava Chemical components reported from guava include flavonoids, benzophenones, tannins, and psidium meroterpenoids and sesquiterpenoids (Okuda, T ., et al., 1987; Prabu, G.R., et al., 2006; Ukwueze, S.E., et al., 2015).
  • sesquiterpenoid-based compounds are known as essential oil components of guava leaves as a major component of guava leaves, but have not been confirmed for treatment or prevention of novel coronavirus.
  • Korean Patent Registration No. 102169476 discloses a composition for preventing or treating type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious disease, and includes zafirlukast, an asthma treatment agent, and It was reported that sulfinpyrazone, a gout treatment, has inhibitory ability against SARS-CoV-2.
  • Korean Patent Application No. 1020200053057 discloses a preventive and therapeutic agent for coronavirus, and proposes a mixture of 14 substances such as calcium, phosphoric acid, folic acid, and quercetin as a preventive and therapeutic agent for the new corona virus.
  • Korean Patent Application No. 102169476 discloses a composition for preventing or treating type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious disease, and includes zafirlukast, an asthma treatment agent, and It was reported that sulfinpyrazone, a gout treatment, has inhibitory ability against SARS-CoV-2.
  • Korean Patent Application No. 1020200053057 discloses a preventive and
  • 1020200131784 discloses a composition for the prevention or treatment of type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious disease, and zafilukast and zafilukast from about 2,700 FDA-approved drugs through an AI deep learning algorithm.
  • Candidate drugs including sulfinpyrazone and allopurinol were derived. However, all of these are different from the configuration of the present invention.
  • Korean Patent No. 101491493 describes the anti-inflammatory effect of a composition containing guava
  • Korean Patent No. 101072905 describes the antidiabetic effect of a composition containing guava
  • Korean Patent No. 101320946 describes the treatment effect of guava for prostate cancer
  • the above technologies are not technologies for the antiviral effect against the new corona virus
  • Korean Patent Application No. 1020210019447 discloses that meroterpenoid-based compounds of guava are effective against new corona virus infection.
  • the preventive or therapeutic effect is described, it is different from the configuration of the present invention, which shows the preventive, ameliorative, or therapeutic effect of the new corona virus infection of the sesquiterpenoid-based compound isolated from guava.
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention, improvement or treatment of novel coronavirus infection comprising a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or an organic solvent fraction thereof or a sesquiterpenoid-based compound isolated therefrom as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention, improvement or treatment of novel coronavirus infection comprising a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or an organic solvent fraction thereof or a single compound isolated therefrom and a mixture according to a combination thereof there is.
  • guava Psidium guajava
  • An object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving new corona virus infection comprising, as an active ingredient, a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or an organic solvent fraction thereof, a single compound isolated therefrom, or a mixture according to a combination thereof, To provide a disinfectant for preventing infection, a feed additive for preventing or improving infection, or an animal drug for preventing or treating infection.
  • a health functional food for preventing or improving new corona virus infection comprising, as an active ingredient, a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or an organic solvent fraction thereof, a single compound isolated therefrom, or a mixture according to a combination thereof.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of novel coronavirus infection comprising a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or an organic solvent fraction thereof or a sesquiterpenoid-based compound isolated therefrom as an active ingredient.
  • guava Psidium guajava
  • the guava ( Psidium guajava ) leaf extract or its organic solvent fraction may contain at least one selected from the group consisting of sesquiterpenoid compounds, and pheophytin a of porphyrin (pheophytin a) , pheophytin a', pheophytin b', pheophytin b' (pheophytin b') compound or jeju guabon A in combination with the prevention and treatment of new corona virus infection rise effect can be shown.
  • the sesquiterpenoid-based compound is beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ), alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), (-)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) may include one or more compounds selected from the group consisting of.
  • the guava ( Psidium guajava ) leaf extract may be obtained by extracting guava leaves with any one solvent selected from the group consisting of water, C1 to C4 lower alcohol, hexane, acetone, methylene chloride, ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the guava leaf extract is an extract obtained by extracting guava leaves with 50-100% C1 to C4 lower alcohol aqueous solution or lower alcohol or acetone, or after suspending the extract in water, n -hexane, ethyl acetate, butanol It may be an organic solvent fraction obtained by sequentially fractionating at least one selected from n -hexane, ethyl acetate, or n -butanol, or a fraction obtained by pheophytinizing each of these fractions.
  • the guava leaf extract was extracted three times by stirring for 2 hours using 50-90% ethanol aqueous solution on guava leaves, concentrated under reduced pressure at 40 ° C, and then the extract was mixed with 0.5 N aqueous hydrochloric acid solution or 1% [w / v ] It can be prepared by concentrating the n -hexane fraction obtained by solvent extraction with n -hexane from the suspension in an aqueous solution of citric acid, and then suspending the extract in water, storing it at 60 ° C. for one day or more, and then using n -hexane as a solvent.
  • a pheophytinized fraction may be prepared by concentrating the extracted n -hexane fraction under reduced pressure.
  • Pheophytin a, pheophytin a', pheophytin b, and pheophytin b' of the porphyrins are It can be manufactured under similar conditions in all plants produced, and the content may be higher in dry leaves dried through hot air drying than in fresh leaves of guava. In addition, by pheophytinizing these extracts and the n -hexane fraction, an n -hexane fraction with increased pheophytin content can be obtained.
  • the porphyrin-based compound contained in the guava leaf can be obtained by separating the extract and the n -hexane fraction obtained by extracting the guava leaf with 50-100% C1 to C4 lower alcohol aqueous solution or lower alcohol or acetone, preferably 50 to 100%. It can be obtained by chromatographic separation of an extract extracted with 100% aqueous ethanol solution or an n -hexane fraction obtained by pheophytinizing the extract.
  • the chromatography is normal phase column chromatography, reversed phase column chromatography, Diaion HP-20 column chromatography, RP-18 column chromatography ( RP-18 column chromatography, LH-20 column chromatography, preparative reversed-phase high performance liquid chromatography, medium pressure liquid chromatography, High-performance liquid chromatography (HPLC) or the like may be used.
  • the guava leaf extract is an extract concentrate obtained by extracting guava leaves with at least one solvent selected from the group consisting of water, C1 to C4 lower alcohol, n -hexane, acetone, methylene chloride, ethyl acetate, and mixed solvents thereof. After suspending in distilled water, it may be a fraction obtained by sequentially fractionating n -hexane, ethyl acetate, and butanol, which are organic solvents.
  • the present invention guava ( Psidium guajava ) leaf extract or its pheophytinized fraction, or a sesquiterpenoid-based isolated therefrom, and a porphyrin-based compound or Jeju Guabon A, as active ingredients, to provide a composition for preventing or treating novel coronavirus infection do.
  • the pheophytinized fraction of the leaf extract of the present invention is 0.05 to 10% (w / v) of the guava leaf extract After suspending in an aqueous solution of citric acid, it may be extracted with any one solvent selected from the group consisting of n -hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the pheophytinized fraction of the guava ( Psidium guajava ) leaf extract of the present invention is obtained by suspending the guava leaf extract in a 0.5 to 1.0 N aqueous hydrochloric acid solution or a 0.05 to 10% (w / v) aqueous citric acid solution, or by suspending it in water. What was left at 60 °C for 30 minutes to 48 hours may be extracted with any one solvent selected from the group consisting of n -hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the guava leaf extract is beta-caryophyllene (compound 1 ), alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), (-)-guaiol ((-) -guaiol, compound 3 ) may include one or more compounds selected from the group consisting of.
  • the guava ( Psidium guajava ) leaf extract is from the group consisting of pheophytin a (Compound 4 ) and pheophytin b (Pheophytin b, Compound 5 ) of the porphyrin class of Formula 2 below It may include one or more selected species, preferably one or more species selected from the group consisting of pheophytin a (Compound 4 ) and pheophytin b (Compound 5 ).
  • guava Psidium guajava leaf extract
  • Jeju guajavone A of Formula 3 may include Jeju guajavone A of Formula 3 below.
  • Jeju Guabon A can be obtained as a pure material from the n -hexane fraction of guava extract by chromatography.
  • the guava of the present invention ( Psidium guajava ) extract of Formula 1 above is beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ), alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), (-)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) or pheophytin a (compound 4 ), pheophytin b (compound 5 ) of porphyrins of formula 2 or Jeju guajavone A of formula 3 It can be prepared by including one or more selected from the group consisting of, and can exhibit a synergistic antiviral effect through a combination of constituent compounds obtained from the guava.
  • the present invention is the [Formula 1] and [Formula 2] beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ): pheophytin a (compound 4): pheophytin b (pheophytin b, compound 5)
  • pheophytin a compound 4
  • pheophytin b pheophytin b, compound 5
  • Health functional food for preventing or improving new coronavirus infection, disinfectant for preventing infection, feed additive for preventing or improving infection, or animal for preventing or treating infection, characterized in that the mixing ratio of 0.04 to 4: 3: 1 is included provide medication.
  • the present invention is a mixture of Jeju guajavone A: pheophytin a (Compound 4): pheophytin b (Compound 5) of [Formula 2] and [Formula 3] Health functional food for preventing or improving new coronavirus infection, disinfectant for preventing infection, feed additive for preventing or improving infection, or animal drug for preventing or treating infection, characterized in that the ratio is 0.04 to 4: 3: 1 to provide.
  • the compound of the present invention may be isolated from nature or prepared by synthesis according to a conventional method in the art.
  • composition is selected from the group consisting of guava leaf extract and its n -hexane fraction or pheophytinized fraction or compounds 1 to 5, which are sesquiterpenoids and porphyrin compounds separated therefrom, and Jeju Guabon A It may include one or more compounds and pharmaceutically acceptable carriers.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, and cellulose. , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the guava leaf extract, hexane fraction and pheophytinated n -hexane fraction of the present invention or sesqui separated therefrom. It is prepared by mixing terpenoid-based and porphyrin-based compounds with at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • a base for the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the dosage of the composition will vary depending on the age, sex, and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Determination of dosage based on these factors is within the level of those skilled in the art, and generally dosages range from 0.01 mg/kg/day to approximately 2000 mg/kg/day. A more preferred dosage is 0.1 mg/kg/day to 500 mg/kg/day. Administration may be administered once a day or divided into several times. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, livestock, and humans through various routes. All modes of administration are contemplated, eg oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine mucosal or intracerebrovascular injection.
  • the guava leaf extract of the present invention the n -hexane fraction or pheophytinized fraction obtained therefrom, or the sesquiterpenoid or porphyrin-based compound isolated therefrom have little toxicity and side effects, so even when taken for a long period of time for preventive purposes. It is a drug that is safe to use.
  • the present invention is a guava ( Psidium guajava ) leaf extract or its n -hexane fraction or pheophytinized fraction or a sesquiterpenoid-based or porphyrin-based compound isolated therefrom as an active ingredient for prevention or prevention of novel coronavirus infection Provide health functional food for improvement.
  • guava Psidium guajava
  • the health functional food is at least one compound selected from the group consisting of guava leaf extract, n -hexane fraction, pheophytinized fraction thereof, or compounds 1 to 5 which are sesquiterpenoid-based or porphyrin-based compounds separated therefrom and food additives acceptable in food science.
  • At least one compound selected from the group consisting of Compounds 1 to 5, which is the guava leaf extract or the n -hexane fraction, the pheophytinized fraction thereof, or a sesquiterpenoid-based or porphyrin-based compound isolated therefrom, is It may be included as 0.001 to 100% by weight based on the total weight of the health functional food.
  • the health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and includes the guava leaf extract or the n -hexane fraction or the pheophytinized fraction thereof or the sesquiterpenoids separated therefrom.
  • a food to which one or more compounds selected from the group consisting of compounds 1 to 5 , which are porphyrin compounds can be added, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, etc. there is.
  • the present invention relates to at least one compound selected from the group consisting of Compounds 1 to 5, which are sesquiterpenoid-based or porphyrin-based compounds separated from the guava leaf extract, n -hexane fraction, or pheophytinated fraction thereof, Provides a disinfectant for preventing new coronavirus infection, a feed additive for preventing or improving infection, or an animal drug for preventing or treating infection.
  • the type of animal feed is not particularly limited, and feeds commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meal or grain by-products; Animal feed such as proteins, inorganic materials, oils, mineral oils, oils, single cell proteins, zooplankton, or food may be mentioned. These may be used alone or in combination of one or more.
  • the present invention also relates to a method for isolating compounds 1 to 3 , wherein guava leaves are mixed with water, C1 to C4 lower alcohols, hexane, acetone, methylene chloride, ethyl acetate and mixtures thereof selected from the group consisting of Step 1 of obtaining a guava extract extracted by using at least one solvent as a solvent; A second step of suspending the guava extract of step 1 in distilled water and then fractionating with an organic solvent to obtain fractions; And the fractions of the second step were added to column chromatography to obtain beta-caryophyllene (compound 1 ), alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), (-)-guaiol ( (-)-guaiol, compound 3 ); 3 steps of isolating at least one compound selected from the group consisting of;
  • the organic solvent in the second step may be C1-4 lower alcohol, ethyl acetate, hexane, and acetone.
  • the C1-4 lower alcohol may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, or butanol.
  • they are n -hexane and ethyl acetate, More preferably, they are n -hexane.
  • the second-step fraction is most preferably an n -hexane fraction obtained by suspending the concentrated extract of the first step in distilled water and then fractionating it with n -hexane.
  • Guava according to the present invention Psidium guajava ) leaf extract and its fractions, or medicines for preventing, improving or treating new corona infection, containing as active ingredients a sesquiterpenoid-based compound isolated therefrom, and health functional food for preventing or improving new corona virus infection
  • Infection-preventive disinfectants, infection-preventing or improving feed additives, or infection-preventing or treating animal drugs include safe natural product-derived compositions and are expected to contribute to the prevention and treatment of novel coronavirus infections for which there is no appropriate treatment yet.
  • Figure 1 is a graph showing the cytopathic recovery ability of guava leaf extract and each fraction against novel coronavirus (SARS-CoV-2) infection.
  • Figure 2 shows the 1 H and 13 C-NMR spectrum of ⁇ -caryophyllene (Compound 1 ) obtained from Psidium guajava .
  • Figure 4 shows the 1 H and 13 C-NMR spectrum of (-)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) obtained from guava Psidium guajava .
  • Figure 5 is a guava ( Psidium guajava ) leaf extract, an n -hexane fraction obtained therefrom, and n -hexane fraction obtained from five small fractions obtained from thin layer chromatography (TLC) showing the presence or absence of compounds 1 , 2 , 4 , and 5 . This is the result.
  • Figure 6 is a chromatogram showing the presence or absence and relative content of sesquiterpenoid-based compounds in the guava ( Psidium guajava ) leaf extract and the n -hexane fraction obtained therefrom.
  • guava Psidium guajava ) It is a graph showing the virus inhibitory ability according to the combination of a single compound and a porphyrin-based compound.
  • Figure 8 is a new corona virus (SARS-CoV-2, NMC-nCoV02) attack inoculated golden Syrian hamster animal model in guava ( Psidium guajava )-derived beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ), Jeju guar capital A, pheophytin a + b (Compound 4 + 5 ) and a combination thereof were administered, and on the 2nd, 4th and 6th days, respectively, (A) nasal tissue and (B) lung tissue are graphs confirming the virus titers.
  • SARS-CoV-2, NMC-nCoV02 corona virus
  • SARS-CoV-2 S clade (NMC-nCoVo2), alpha mutant virus (NMC-nCoV06, B.1.1.7 mutant), beta mutant virus (NMC-nCoV07, B.
  • Figure 10 is a result of measuring the virus prevention effect of guava compounds and combinations thereof in Vero cells according to pretreatment with a single compound derived from guava and a combination of a porphyrin-based compound.
  • the present inventors while conducting research on guava to discover candidates with antiviral activity against the new corona virus, began to confirm that guava leaf extract has an excellent antiviral effect, and started with an activity-based fractionation and separation method ( Bioactivity-guided fractionation and isolation) was developed. Through this, the active material was discovered, and the present invention was completed by increasing the content thereof and preparing to exhibit a synergistic effect between constituent compounds through mixing of the active material.
  • Guava ( Psidium guajava ) dried leaves of the present invention were purchased from Jungeom Farm in Jungeom-ri, Aewol-eup, Jeju-si, Korea. After crushing 100 g of guava dried leaves, 50 l of 95% [v/v] ethanol was added, extracted three times with an ultrasonic extractor for 99 minutes, and concentrated under reduced pressure to obtain 9.8 g of 95% ethanol extract.
  • each fraction, including the extract, was dried through a lyophilizer, and then dissolved in DMSO to make 10 mg/mL, which was used in an antiviral activity evaluation experiment.
  • Example 1-3 Preparation of pheophytinized fraction from guava extract
  • Example 1-1 The extract obtained in Example 1-1 was suspended in 0.5 to 1.0 N aqueous hydrochloric acid solution (inorganic acid solution) or 0.05 to 10% (w/v) citric acid aqueous solution (organic acid solution) and reacted, or After allowing to stand for 48 hours, solvent fractionation was performed with n -hexane and washed with water to prepare a pheophytinized n -hexane fraction.
  • CPE cytopathic effect
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, NMC-CoV-02 strain
  • Chungbuk National University Cheongju, Korea
  • BSL-3 Biological Safety Level-3
  • SARS-CoV-2 virus was inoculated into mono-layered Vero cells, and after 3 days, an aliquot of the virus culture supernatant was collected, and the virus was inoculated into Vero cells cultured and maintained in DMEM medium containing 10% [v/v] FBS. and used for the measurement of antiviral activity.
  • Vero cells were dispensed in a 96-well plate at a density of 2 ⁇ 10 4 cells/well and supplemented with 10% [v/v] FBS (fetal bovine serum) and 1% [v/v] PS (penicillin+streptomycin). and L-glutamine (L-glutamine, 2 ml based on 500 ml medium) was grown for one day in a DMEM culture medium, and then the culture medium was washed with a PBS solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • PS penicillin+streptomycin
  • the n -hexane fraction of the guava leaf extract had higher antiviral activity against the SARS-CoV-2 virus than the other fractions.
  • the pheophytinized fraction showed a high antiviral activity comparable to that of the n -hexane fraction obtained by treating the 95% ethanol fraction through the pheophytinization reaction.
  • n -hexane fraction A portion (1.1 g) of the n -hexane fraction, which was confirmed to have the strongest antiviral activity against the novel coronavirus in Example 2, was prepared at the concentration of n -hexane:ethyl acetate (1:0 ⁇ 0:1 [v:v]) Five fractions were obtained by performing normal phase column chromatography under gradient elution conditions (F.1 - 5).
  • the F.1 fraction (53.9 mg) was subjected to normal phase column chromatography under a concentration gradient of n -hexane:ethylacetate (1:0 ⁇ 9:1 [v:v]) to obtain compound 1 (15.0 mg). ) was obtained.
  • Fraction F.2 (18.3 mg) was subjected to normal phase column chromatography under a concentration gradient of n -hexane:ethylacetate (1:0 ⁇ 9:1 [v:v]) to obtain Compound 2 (5.3 mg).
  • F.3 fraction (273.5 mg) was subjected to normal phase column chromatography under a concentration gradient of n -hexane:ethylacetate (19:1 ⁇ 7:3 [v:v]) to obtain 8 small fractions. (F.3-1 - 3-8), and reverse phase MPLC was performed with methanol:distilled water (0.1% formic acid) (8:2 ⁇ 0:1 [v/v]) concentration gradient conditions for F.3-6 6 sub-fractions were obtained again (F.3-6-1 - 3-6-6).
  • n -hexane fraction obtained in Example 3 and Thin-layer chromatography was performed on compounds 1 , 2 , 4 , and 5 .
  • Compound 1 in the n -hexane fraction , 2 , 4 the presence of 5 was confirmed, and the results are shown in FIG. 5 .
  • HPLC analysis was performed to confirm in detail the presence or absence of sesquiterpenoid compounds 1 to 3 in the 95% ethanol extract of guava and the n -hexane fraction.
  • the 95% ethanol extract of guava dried leaves and the n -hexane fraction were dissolved in methanol to prepare concentrations of 10 mg/mL and 5 mg/mL, respectively.
  • the compounds 1-3 isolated in Example 3 were prepared at a concentration of 0.5 mg/mL.
  • HPLC analysis was performed using a Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000 system equipped with a DAD-Diode Array Detector 3000, and a YMC-Triart C18 (4.6 ⁇ 250.0 mm, 5 ⁇ m ) column was used.
  • the mobile phase of the liquid chromatography was flowed at a flow rate of 1.0 ml / min using distilled water (mobile phase A) and acetonitrile (mobile phase B) containing 0.1% [v / v] formic acid, column temperature 25 °C, Analysis was performed at a sample temperature of 10 ° C, and each sample was injected in 20 ⁇ l.
  • the chromatogram was observed at 210 nm, and the mobile phase conditions were as follows. 0-10.0 min 60-75% mobile phase B gradient, 10.0-15.0 min 75-85% mobile phase B gradient, 15.0-25.0 min 85-95% mobile phase B gradient, 25.0-30.0 min 95% mobile phase B flowed in a concentration gradient.
  • the retention time and ultraviolet absorption pattern of the sesquiterpenoid compounds 1-3 isolated in Example 3 The presence or absence of compounds included in each sample was confirmed, and the results are shown in FIG. 6 . As shown in FIG. 6, it was found that the compounds of sesquiterpenoid compounds 1 to 3 were efficiently extracted by observing an increase in concentration in the n -hexane fraction.
  • treatment group CPE inhibitory concentration ( ⁇ M) Beta-Caryophyllene (1) 2.5 alpha-humulen (2) 10 (-)-Guaiol (3) 10 Jeju Guajabon A 2.5
  • Example 6-1 Synergistic antiviral effect by the combination of beta-caryophyllene, Jeju guabon A and pheophytin compounds
  • the corona virus is a virus with a very large genetic size, and the occurrence of various mutant viruses is causing difficulties in coping with active vaccines.
  • an approach that can maintain the inhibitory activity against SARS-CoV-2 by acting on multiple targets by multiple components multi-components and multi-targets, MCMT
  • This MCMT approach can more effectively deal with the mutating SARS-CoV-2 virus than the use of inhibitors against single protein targets.
  • the research team of this research team used the compounds in combination to discover compounds with increased inhibitory activity against SARS-CoV-2, and for the combined administration of the compounds according to the present invention. It was confirmed that the inhibitory effect of the SARS-CoV-2 virus increased.
  • chlorophyll a and b which are widely present in green plants, exist in a ratio of 3:1, and pheophytin a and b, each derivative of chlorophyll a and b, are produced from the quantitatively corresponding chlorophyll in stomach acid, so this experiment
  • compounds 4 + 5 were prepared at a weight ratio of 3:1 and the antiviral activity was evaluated.
  • sesquiterpenoid-based compounds 1 to 3 whose antiviral activity was confirmed in Example 5
  • Compound 1 confirmed to be contained in a large amount in guava meroterpenoid-based compound Jeju Guajavone A (jejuguajavone A, Patent Application No.
  • the ratio of pheophytin a + b (3:1): beta-caryophyllene or Jeju guabon A was 1: 1, 1:0.2, 1:0.1, 1:
  • the combination of pheophytin a + b and beta-caryophyllene was pheophytin a + b or beta-caryophyllene alone at a mixing ratio of 1:1 to 1:0.01 It showed a synergistic antiviral effect than the treatment, which showed a synergistic antiviral effect better than the single treatment even at a blending ratio of pheophytin a + b and Jeju Guabon A of 1: 1 to 1: 0.01.
  • Example 6-2 EC of beta-caryophyllene, Jeju guabon A and pheophytin-based compounds and their combinations 50 value determination
  • the EC 50 value (effective dose) was determined.
  • the treatment group of each compound alone and the selected optimal ratio combination treatment group were treated at concentrations (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, and 0.15625 ⁇ M) to prevent new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • EC 50 values for cytotoxicity and SARS-CoV-2 replication in 50% infected Vero cells were measured and the results are shown in Table 3 and FIG. 7 .
  • the EC 50 values of pheophytin a, pheophytin b, beta-caryophyllene, and Jejuguazabon A were 9.20 ⁇ 1.36, 5.50 ⁇ 0.13, 3.23 ⁇ 0.12, and 3.22 ⁇ 0.14 ⁇ M , respectively.
  • the mixture of pheophytin a + b (3:1) had an EC 50 of 3.82 ⁇ 0.19 ⁇ M , and showed stronger activity than when pheophytin a and b were treated alone.
  • pheophytin a + b (3:1): beta-caryophyllene 1:0.2
  • pheophytin a + b (3:1): Jeju Guabon A 1:0.1 according to the optimal ratio selected above.
  • the EC 50 values were 1.27 ⁇ 0.03 ⁇ M and 2.45 ⁇ 0.05 ⁇ M , respectively.
  • remdesivir which was developed as a treatment for Ebola virus and approved as an antiviral agent for SARS-CoV-2, was used as a control group.
  • the antiviral activity was greatly increased when pheophytin a + b (3:1), beta-caryophyllene or Jeju guabon A was treated alone, and the antiviral activity was greatly increased when pheophytin-based compounds and beta-caryophyllene or A strong synergistic effect was confirmed by the combination of Jeju Guabon A.
  • beta-caryophyllene isolated from guava exhibited strong inhibitory activity in Example 5 and at the same time a synergistic effect was confirmed in combination with porphyrin compounds in Example 6, in order to confirm its efficacy in animal models
  • Sigma Beta-caryophyllene (purity ⁇ 80%) was purchased from Aldrich and further purified. About 10 g of beta-caryophyllene (purity ⁇ 80%) was subjected to normal phase column chromatography under n -hexane elution conditions to obtain highly pure beta-caryophyllene (purity ⁇ 95%, 8.05 g). was obtained.
  • the G1 control group in nasal turbinate showed a titer of 5.4 log 10 TCID 50 /g on the second day, similar to the challenge inoculated virus (10 5.5 TCID 50 ), and on the 4th day (4.4 Up to log 10 TCID 50 /g), the virus titer continued without a significant drop.
  • the single treatment group, G2-G4 showed a similar viral titer to the G1 control group on the 2nd day, but on the 4th day, the virus titer decreased compared to the G1 control group.
  • the combination treatment group, G5 and G6, showed a significant decrease in virus titer compared to the G1 control group on day 2 ( p ⁇ 0.05).
  • the virus titer decreased significantly ( p ⁇ 0.01) on the 4th day, especially in the G5 pheophytin a + b and beta-caryophyllene combination (1:0.2) treatment group, the virus titer was almost half that of the G1 control group. confirmed that it had fallen.
  • the single treatment group, G2-G4 showed virus titers that were not significantly different from the G1 control group on the 2nd and 4th days, but the combined treatment groups, G5 and G6, showed higher viral titers than the G1 control group on the 2nd day. It showed a tendency to drop, and it was confirmed that the virus titer decreased significantly on the 4th day ( p ⁇ 0.05).
  • mutant viruses in which D614G was substituted in the gene encoding the spike protein began to appear, among which B.1.1.7 was an alpha mutant virus from England and B.1.351 from South Africa. It is a beta mutant virus.
  • SARS-CoV-2 NMC-nCoV02, S clade
  • alpha mutant virus NMC-nCoV06, B.1.1.7 mutant
  • pheophytin a, b and beta-caryophyllene in SARS-CoV-2 infected hACE2 TG mouse animal experiments shows that pheophytin a, b has high accessibility as it can be easily obtained from all green plants containing chlorophyll derivatives.
  • Beta-caryophyllene is a spice component of green plants and is contained in large quantities in many plants, so it is possible to respond immediately to SARS-CoV-2 response.
  • mice For hACE TG mice, the compound was orally administered once a day (every 24 hours) at the same time every day for 5 days from the day of challenge, and weight loss and survival rate were observed daily until day 14.
  • 3 mice in each group were euthanized on the 3rd, 5th and 7th days, and the virus titer in lung tissue was measured by TCID 50 in Vero cells. The results of the virus titer in each group is shown in Figure 9.
  • the G1 control mice lost weight every day, dropping to about 25% of the initial weight on the 6th day, and all of the G1 control mice lost weight at 7 days. died on day one. However, in G2 and G3, the weight decreased until the 8th day after virus challenge, and a weight loss of about 20% was confirmed.
  • the G3) pheophytin a + b and beta-caryophyllene combination administration group showed a lower viral titer than the G2) pheophytin a + b administration group and showed an increased antiviral effect.
  • mice died on the 7th day, but G2) pheophytin a + b administration group and G3) pheophytin a + b and beta-caryophyllene administration group
  • the weight decreased to about 25% of the initial weight, and then increased again, and on the 14th day, the survival rate was 20% and 60%, respectively.
  • the virus titer in the lung tissue on the 3rd, 5th and 7th days, it was confirmed that all the G1 control mice died on the 7th day, whereas the virus titer in the G2 and G3 mice dropped by almost half compared to the first challenge.
  • mice challenged with beta mutant virus NMC-nCoV07, B.1.351 mutant
  • the experiment was conducted in the same manner as in the previous experiment.
  • G1 control mice showed more rapid weight loss than mice inoculated with S clade and alpha mutant virus. All mice died on day 5.
  • mice in all groups showed the highest virus titers on the 5th day, and G3) the group administered with the combination of pheophytin a + b and beta-caryophyllene showed a statistically lower virus titer compared to G1) control mice.
  • the group administered with the combination of pheophytin a + b and beta-caryophyllene showed a statistically lower virus titer compared to G1) control mice.
  • the beta mutant virus NMC-nCoV07, B.1.351 mutation
  • the compounds identified in the present invention are SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade), alpha mutant virus (NMC-nCoV06, B.1.1.7 mutant) and beta mutant virus (NMC-nCoV07, B. 1.351 mutation), it was confirmed that it had antiviral activity against all tested SARS-CoV-2 infections, and it was confirmed that it could be applied to mutations, and at the same time, the combination of porphyrins and beta-caryophyllene showed the It was confirmed that the synergistic effect was very excellent.
  • SARS-CoV-2 NMC-nCoV02, S clade
  • alpha-mutant virus NMC-nCoV06, B.1.1.7 mutation
  • beta-mutant virus NMC-nCoV07, B.1.351 mutation
  • pheophytin a, pheophytin b, beta-caryophyllene and Jejuguazabon A it was hypothesized that these compounds would inhibit virus entry into cells during viral infection, and this was tested.
  • the compounds of each group were mixed with SARS-CoV-2 100 TCID 50 and incubated at 37° C. for 1 hour, and Vero cells were infected with each mixture and left for 1 hour.
  • G1 pheophytin a Among the single compounds treated, G1) pheophytin a, G3) beta-caryophyllene, G4) Jeju Guabon A, and G8) remdesivir, a positive control, were 20 ⁇ M . did not inhibit the virus. However, the single treatment group, G2) pheophytin b, showed an EC 50 value of 11.2 ⁇ 2.0 ⁇ M .
  • Beta-caryophyllene, pheophytin a and b are compounds readily found in edible plant extracts that are commonly consumed by humans. Through this result, the preventive effect of corona virus can be expected from ingesting plants containing these compounds, and if used together with wearing a mask and vaccination, the corona preventive effect can be expected as a way to reduce the risk of corona infection. .
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) 200 mg each was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch and 32 g of colloidal silicic acid.
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) 100 mg, 0.6 g of sodium chloride and 0.1 g of ascorbic acid were dissolved in distilled water to make 100 ml. This solution was placed in a bottle and sterilized by heating at 20 °C for 30 minutes.
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) 20 g was added to wheat flour at 0.1% by weight, and bread, cakes, cookies, crackers and noodles were prepared using this mixture to prepare food for health promotion.
  • Jejuguajavone A Jejuguajavone A
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) 20 g was added to broth at 0.1% by weight to prepare soup and broth for health promotion.
  • ⁇ -caryophyllene, compound 1 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) 20 g was added to milk at 0.1% by weight, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared using the milk.
  • Guava extract of the present invention (or pheophytinized fraction or n -hexane fraction) 20 g or beta-caryophyllene ( ⁇ -caryophyllene, compound 1 ) 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3 ) ⁇ and pheophytin a (compound 4 ) + pheophytin b (pheophytin b, compound 5 ) or Jejuguajavone A (Jejuguajavone A) was added to 1,000 ml of tomato juice or carrot juice, respectively, to prepare vegetable juice for health promotion.
  • ⁇ -caryophyllene, compound 1 200 mg ⁇ or alpha-humulene ( ⁇ -humulene, compound 2 ), ( -)-guaiol ((-)-guaiol, compound 3

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Abstract

본 발명은 구아바 (Psidiuma guajava) 잎 추출물 및 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 및 폴피린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구아바 잎 추출물로부터 유래하는 활성 성분의 함량을 높이고, 분리된 활성 화합물 간의 조합을 통하여 항바이러스 활성의 상승작용을 통하여 특히 사람의 신종코로나 바이러스 감염의 치료와 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

구아바(Psidiuma guajava) 잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 수득한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 구아바 (Psidium guajava)의 잎 추출물 또는 이의 분획물 또는 이로부터 분리 정제한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종 코로나 바이러스(SARS-CoV-2) 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 구아바로부터 획득한 구성 화합물을 상승효과를 나타내도록 혼합제조한 신종 코로나 바이러스 감염의 예방, 개선 및 치료용 천연 유래한 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스는 코로나바이러스과 (Coronaviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 전자현미경으로 보았을 때 표면에 스파이크 (spikes) 모양이 튀어나와 있어 왕관 또는 태양의 코로나를 연상시킴으로 인하여 그 이름이 붙여졌다 (Englund et al., 2019). 코로나바이러스과에는 2개의 아과인 코로나바이러스 아과 (Coronavirinae)와 토로바이러스 아과 (Torovirinae)가 있으며 코로나바이러스는 전자에 속해있다. 코로나바이러스 아과는 다시 4개의 속 (genus)인 알파-코로나바이러스 (Alphacoronavirus), 베타-코로나바이러스 (Betacoronavirus), 감마-코로나바이러스 (Gammacoronavirus), 델타-코로나바이러스 (Deltacoronavirus)로 나뉘어진다. 이 중 전자의 두 속인 알파와 베타-코로나바이러스는 사람과 동물에게 감염을 일으키고, 감마와 델타는 동물에게 감염을 일으킨다고 알려져 있다. 인간 코로나바이러스는 1960년대 중반에 처음 발견되었고, 현재까지 사람을 감염시키는 것으로 7종이 확인되었으며 이중 HCoV-229E, HCoV-NL63는 알파-코로나바이러스에, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV는 베타-코로나바이러스에 속해있다. 상기 코로나바이러스는 돼지, 개, 고양이, 박쥐, 말 등 동물도 감염시킨다.
전 세계는 2000년 이후 20년 동안 두 번의 코로나바이러스인 사스 (SARS, 급성호흡기증후군)와 메르스 (MERS, 중동호흡기증후군) 감염위기를 겪었고, 현재는 2019년 12월 중국 우한에서 발원한 코로나19 (COVID-19)의 대유행 감염위기를 겪고 있다. 이들 코로나 바이러스는 모두 베타-코로나바이러스 속에 속해있지만 각기 다른 전파력과 치명률을 나타내었다. 사스의 경우, SARS-CoV를 병원체로 하여 2003년 2월에 중국에서 발생하였으며, 2020년 03월 03일 발표된 WHO의 통계자료(WHO, Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report - 43, 2019)에 따르면 전 세계적으로 26개 국가가 감염되었으며 8,096명의 확진자, 774명의 사망자를 초래하여 9.6%의 치명률을 보였다. 메르스의 경우, MERS-CoV를 병원체로 하여 2012년 중동지역 아라비아에서 발생하였으며, 동일 통계자료에 의하면 전 세계적으로 27개 국가가 감염되었으며 2,494명의 확진자, 858명의 사망자를 초래하여 전파력은 낮지만 34-35%의 높은 치명률을 보였다. 2019년 12월에 중국에서 발생하여 현재까지도 지속되고 있는 COVID-19의 경우, 2021년 5월 18일 기준 221개 국가가 감염되었으며, 1억 6441만명의 확진자, 340만명의 사망자를 발생시켜 높은 전파력과 함께 상대적으로 다른 코로나 바이러스 질환인 사스나 메르스에 비하여 낮은 2.1%의 치명률을 보이고 있다. 그러나, 다른 바이러스에 비하여 COVID-19 원인 바이러스는 증상이 발현되기 전에도 바이러스를 전파할 수 있는 가능성으로 인하여 국가적인 대응을 어렵게 하고 있다. 전 세계 모든 국가들은 현 상황을 타개하기 위하여 다국적 제약회사를 중심으로 한 백신의 개발과 승인을 서두르고 있는 상황이다 (Park, 2020).
현재까지 COVID-19를 해결하기 위해 개발된 치료제는 없는 상황이며 다국적 제약회사가 중심이 되어 백신을 개발하여 대응에 나서고 있다. 그러나, 비록 백신이 효과적으로 작용한다 하더라도 코로나바이러스는 증식과정에서 돌연변이 및 빈번한 유전자 재조합현상이 일어나기 때문에, 백신의 효용성이 오래가지 못할 가능성이 높다. 또한, 기존에 개발된 백신이 듣지 않는 새로운 변이주 코로나 바이러스가 발생할 확률도 항상 존재한다.
전 세계 다국적 제약회사는 짧은 시간 동안 효과적인 치료제를 개발하는 것이 어려운 상황이기 때문에 약물 재창출 (Drug Repositioning)을 활용하여 이미 허가된 약물 또는 허가되지 않았으나 임상시험 데이터가 존재하는 약물을 대상으로 코비드-19 치료제를 찾고자 노력하고 있고, 이에 대한 긴급 사용승인을 받고 있다. 비록 약물 재창출을 통하여 개발하는 것이 비용과 시간 면에서 큰 장점이 있지만, 특허 및 허가와 관련된 여러 문제가 있다. 또한 본질적으로 이들 단일물질 또한 내성바이러스의 출현으로 그 효용성이 오래가지 않을 수 있다. 이러한 이유로 백신과 신약개발뿐만 아니라 이와 동시에 우리의 가까이에 있으며 쉽게 이용하여 음식으로 섭취할 수 있는 식물의 COVID-19에 대한 보호효과를 과학적으로 명확히 증명하고, 사람들이 활용할 수 있게 하는 것도 COVID-19를 극복을 위해 필요한 전략이라 할 수 있다.
구아바 (Psidium guajava)는 도금양목 도금양과의 소교목으로 열대과일로 사람들에게 잘 알려져 있으며 열매뿐만 아니라 잎, 나무껍질 및 뿌리에 이르기까지 다양하게 약용으로 이용되고 있다. 현재까지 알려진 구아바의 효능으로는 항산화 활성, 프리바이오틱 활성, 면역력 증진이 알려져 있으며 특히 PI3K/Akt 신호 전달 경로를 통한 항당뇨, 고지혈증, 혈관 질환 및 간경변의 위험 감소 등이 동물실험을 통하여 입증되었다 (Jiao, Y., et al., 2017; Vijaya Anand, A., et al., 2020;).
구아바로부터 보고된 화학성분으로는 플라보노이드 (flavonoid), 벤조페논 (benzophenone), 탄닌 (tannin) 및 프지디움 메로테르페노이드 (psidium meroterpenoid), 세스퀴테르페노이드 (sesquiterpenoid) 등이 있다 (Okuda, T., et al., 1987; Prabu, G.R., et al., 2006; Ukwueze, S.E., et al., 2015). 이 중, 세스퀴테르페노이드계 화합물은 구아바 잎의 주요성분으로서 구아바 잎의 정유 성분으로 알려져 있으나, 신종 코로나바이러스의 치료 또는 예방에 관하여는 확인된 바 없다.
신종 코로나바이러스와 관련된 선행기술 문헌으로, 한국등록특허 제102169476호는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 천식치료제인 자피를루카스트 (zafirlukast)와 통풍치료제인 설핀파이라존 (sulfinpyrazone)의 SARS-CoV-2에 대한 억제능을 나타내는 점을 보고하였다. 한국출원특허 제1020200053057호는 코로나바이러스 예방 및 치료제를 개시하고 있으며, 칼슘, 인산, 엽산, 퀘세틴 등 14종 물질의 혼합물을 신종코로나 바이러스의 예방 및 치료제로 제시하고 있다. 한국출원특허 제1020200131784호는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고, AI 딥러닝 알고리즘을 통해 2,700여개의 FDA 승인약물로부터 자피를루카스트 (zafirlukast)와 설핀파이라존 (sulfinpyrazone), 알로푸리놀 (allopurinol) 등을 포함한 후보약물을 도출하였다. 그러나 이들 모두 본 발명의 구성과는 차이점이 있다.
구아바와 관련된 선행기술 문헌으로, 한국등록특허 제101491493호는 구아바를 포함하는 조성물의 항염증 효과를, 한국등록특허 제101072905호는 구아바를 포함하는 조성물의 항당뇨 효과를, 한국등록특허 제101320946호는 구아바의 전립선암 치료 효과를 기재하고 있으나, 상기 기술들은 신종코로나 바이러스에 대한 항바이러스 효과에 대한 기술이 아니며, 한국출원특허 제1020210019447호에는 구아바의 메로테르페노이드계 화합물이 신종코로나 바이러스 감염에 예방 또는 치료효과가 기재되어 있으나, 구아바로부터 분리된 세스퀴테르페노이드계 화합물의 신종코로나 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 본 발명의 구성과 상이하다.
본 발명의 목적은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물 또는 이로부터 분리한 단일화합물 및 이들 간의 조합에 따른 혼합물을 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물 또는 이로부터 분리한 단일화합물 및 이들 간의 조합에 따른 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 감염 예방용 소독제, 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 감염 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공하는 데 있다.
본 발명은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물은 세스퀴테르페노이드계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 폴피린 (porphyrin) 류의 페오피틴 a (pheophytin a), 페오피틴 a’ (pheophytin a’), 페오피틴 b (pheophytin b), 페오피틴 b’ (pheophytin b’) 화합물 또는 제주구아자본 A와 혼합하여 신종코로나 바이러스 감염의 예방 및 치료의 상승효과를 나타낼 수 있다.
상기 세스퀴테르페노이드계 화합물은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
상기 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물은 구아바 잎을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 구아바 잎 추출물은 구아바 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액 또는 저급 알코올 또는 아세톤으로 추출한 추출물이거나, 또는, 이들의 추출물을 물로 현탁시킨 후 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물 또는 이들 분획물 각각을 페오피틴화한 분획물일 수 있다.
상기 구아바 잎 추출물은 구아바 잎에 50~90% 에탄올 수용액을 사용하여 2시간 동안 교반하여 3회에 걸쳐 추출한 뒤 40 ℃에서 감압 농축한 다음, 그 추출물을 0.5 N 염산수용액 또는 1% [w/v] 구연산수용액으로 현탁시킨 것을 n-헥산으로 용매 추출하여 획득한 n-헥산 분획물을 감압 농축하여 제조할 수 있으며, 상기 추출물을 물에 현탁한 후 60 ℃에서 하루 이상 보관한 후 n-헥산으로 용매 추출한 n-헥산 분획물을 감압 농축하여 페오피틴화한 분획물을 제조할 수 있다.
상기 폴피린 (porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a), 페오피틴 a’(pheophytin a’), 페오피틴 b (pheophytin b), 페오피틴 b’(pheophytin b’)는 엽록소를 생산하는 모든 식물에서 비슷한 조건으로 제조될 수 있으며, 구아바의 생잎보다 열풍 건조를 통해 건조된 건잎에서 함량이 높을 수 있다. 또한, 이들의 추출물 및 n-헥산 분획물을 페오피틴화하여 페오피틴 함량이 증가한 n-헥산 분획물을 획득할 수 있다.
상기 구아바 잎에 포함되는 폴피린계 화합물은 구아바 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액 또는 저급 알코올 또는 아세톤으로 추출한 추출물 및 n-헥산 분획물을 분리하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 50~100% 에탄올 수용액으로 추출한 추출물 또는 상기 추출물을 페오피틴화한 n-헥산 분획물을 크로마토그래피로 분리하여 얻을 수 있다. 상기 크로마토그래피는 순상 컬럼 크로마토그래피 (normal phase column chromatography), 역상 컬럼 크로마토그래피 (reversed phase column chromatography), 디아이온 HP-20 컬럼 크로마토그래피 (Diaion HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피 (RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피 (LH-20 column chromatography), 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (preparative reversed-phase high performance chromatography), 중압 액체 크로마토그래피 (medium pressure liquid chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 구아바 잎 추출물은 구아바 잎을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, n-헥산, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물 농축액을 증류수로 현탁한 후, 유기용매인 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올의 순서대로 분획하여 얻은 분획물일 수 있다.
본 발명은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계와, 폴피린계 화합물 또는 제주구아자본 A을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물의 페오피틴화 분획물은 구아바 잎 추출물을 0.05 ~ 10 %(w/v) 의 구연산수용액에 현탁시킨 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다.
또한 본 발명의 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물의 페오피틴화 분획물은 구아바 잎 추출물을 0.5 ~ 1.0 N의 염산수용액 또는 0.05 ~ 10% (w/v) 의 구연산수용액에 현탁시키거나, 물에 현탁시켜 60 ℃에서 30분 ~ 48시간 방치한 것을, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다.
보다 자세하게는, 상기 구아바 잎 추출물은 하기 화학식 1의 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000001
또한, 상기 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물은 하기의 화학식 2의 폴피린(porphyrin) 류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000002
또한, 상기 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물은 하기 화학식 3의 제주구아자본 A(Jejuguajavone A)을 포함할 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000003
상기 제주구아자본 A는 구아바 추출물의 n-헥산 분획물로부터 크로마토그래피에 의하여 순수 물질로 수득할 수 있다.
본 발명의 상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 상기 화학식 1의 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3) 또는 상기의 화학식 2의 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 상기 화학식 3의 제주구아자본 A (Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하여 제조할 수 있으며, 상기 구아바로부터 획득한 구성 화합물 간의 조합을 통해 항바이러스 상승효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 [화학식 1] 및 [화학식 2]의 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) : 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) : 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 감염 예방용 소독제, 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 감염 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 [화학식 2] 및 [화학식 3]의 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) : 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 감염 예방용 소독제, 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 감염 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공한다.
한편, 본 발명의 화합물은 천연에서 분리하거나 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 합성하여 제조될 수도 있다.
상기 조성물은 구아바 잎 추출물 및 이의 n-헥산 분획물 또는 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리된 세스퀴테르페노이드 및 폴피린 (porphyrin) 류 화합물인 화합물 1~5 및 제주구아자본 A 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 및 n-헥산 분획물 또는 페오피틴화 n-헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 세스퀴테르페노이드계 및 폴피린(porphyrin)계 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함 되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 구아바 잎 추출물, 헥산분획물 및 페오피틴화 n-헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 세스퀴테르페노이드계 및 폴피린계 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 내지 대략 2000 ㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1 ㎎/㎏/일 내지 500 ㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상 될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 구아바 잎 추출물, 이로부터 얻은 n-헥산 분획물 또는 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드 또는 폴피린계 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 또는 이의 n-헥산 분획물 또는 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 또는 폴피린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 구아바 잎 추출물 또는 n-헥산 분획물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 또는 폴피린계 화합물인 화합물 1~5로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 구아바 잎 추출물 또는 n-헥산 분획물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 또는 폴피린계 화합물인 화합물 1~5로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물은 본 발명의 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.001~100 중량%로 하여 포함될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 구아바 잎 추출물 또는 n-헥산 분획물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드 계 또는 폴피린계 화합물인 화합물 1~5로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 상기 구아바 잎 추출물 또는 n-헥산 분획물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 또는 폴피린계 화합물인 화합물 1~5로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방용 소독제, 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 감염 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공한다.
상기 동물 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비 제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 화합물 1~3을 분리하는 방법에 관한 것으로, 구아바를 잎을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 추출한 구아바 추출물을 수득하는 1단계; 상기 1단계의 구아바 추출물을 증류수로 현탁시킨 후 유기용매로 분획하여 분획물을 확보하는 2단계; 및 상기 2단계의 분획물을 컬럼 크로마토그래피에 가하여 하기 화학식 1의 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 3단계;로 이루어질 수 있다.
상기 2단계의 유기용매는 C1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 및 아세톤 등일 수 있다. 상기 C1~4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다. 바람직하게는 n-헥산, 에틸아세테이트이고, 더 바람직하게는 n-헥산이다.
상기 2단계의 분획물은 상기 1단계의 농축한 추출물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산으로 분획한 n-헥산 분획물이 가장 바람직하다.
상기 3단계의 컬럼 크로마토그래피는 순상 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 디아이온 HP-20 컬럼 크로마토그래피, RP-18 컬럼 크로마토그래피, LH-20 컬럼 크로마토그래피, 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피, 중압 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 등에서 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 및 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나의 감염의 예방, 개선 또는 치료용 의약품, 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 감염 예방용 소독제, 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 감염 예방 또는 치료용 동물 약품은 안전한 천연물 유래 조성물을 포함하며 아직 적절한 치료제가 없는 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방과 치료에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 구아바의 잎 추출물 및 각 분획물의 신종 코로나 바이러스(SARS-CoV-2) 감염에 대한 세포병변 회복능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 구아바 (Psidium guajava)로부터 얻은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 3은 구아바 (Psidium guajava)로부터 얻은 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 4는 구아바 Psidium guajava)로부터 얻은 (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 5는 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물, 이로부터 얻은 n-헥산 분획물 및 n-헥산분획물로부터 수득한 5개의 소분획에서 화합물 1, 2, 4, 5의 존재 유무를 보여주는 박층크로마토그래피(TLC) 결과이다.
도 6은 구아바 (Psidium guajava) 잎 추출물 및 이로부터 얻은 n-헥산 분획물에서의 세스퀴테르페노이드계 화합물의 존재 유무와 상대적 함유 여부를 보여주는 크로마토그램이다.
도 7은 구아바 (Psidium guajava) 유래 단일 화합물 및 폴피린계 화합물의 조합에 따른 바이러스 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 신종코로나 바이러스(SARS-CoV-2, NMC-nCoV02)를 공격접종한 골든시리안햄스터 동물모델에서 구아바 (Psidium guajava) 유래 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 제주구아자본 A, 페오피틴 a + b (화합물 4 + 5) 및 이들의 조합을 투여하고 2일째, 4일째 및 6일째에 (A) 비강조직 및 (B) 폐조직의 바이러스 역가를 각각 확인한 그래프이다.
도 9는 사스-코르나바이러스 (SARS-CoV-2) 감염 후의 체중변화와 생존률 및 각 장기에서의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다. (A) 사스-코르나바이러스 (SARS-CoV-2) 중 S clade (NMC-nCoVo2), 알파 변이바이러스 (NMC-nCoV06, B.1.1.7 변이), 베타 변이바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 공격접종한 hACE2 TG 마우스 동물모델에서 구아바 (Psidium guajava) 유래 페오피틴 a + b (화합물 4 + 5) 및 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 과 페오피틴 a + b (화합물 4 + 5)의 조합군을 투여하고 나타난 14일간 체중변화 및 생존률 (B) 폐조직에서 3일째, 5일째 및 7일째의 바이러스 역가. 베타 변이바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 공격접종한 hACE2 TG 마우스 동물모델에서 각 처리군에 따른 뇌조직(C)에서 3일째, 5일째 및 7일째의 바이러스 역가.
도 10은 구아바 (Psidium guajava) 유래 단일 화합물 및 폴피린계 화합물과의 조합의 전처리에 따른 Vero 세포에서 구아바 화합물 및 그 조합물의 바이러스 예방효과를 측정한 결과이다.
본 발명자는 구아바를 대상으로 신종코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 후보 물질을 발굴하기 위해 연구하는 중, 구아바 잎 추출물이 뛰어난 항바이러스 효과가 있음을 확인함을 시작으로 하여 활성기반 분획 및 분리법 (Bioactivity-guided fractionation and isolation)을 개발하였다. 이를 통하여 활성 물질을 발굴하였고 이의 함량을 증가시키며 또한, 활성 물질의 혼합을 통하여 구성 화합물 간의 상승효과를 나타내도록 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 구아바 추출물 및 분획물의 제조>
실시예 1-1. 구아바 추출물 제조
본 발명의 구아바 (Psidium guajava) 건잎은 대한민국 제주시 애월읍 중엄리에 있는 중엄 농장에서 구매한 것을 이용하였다. 구아바 건잎 100 g을 잘게 부순 후 95% [v/v] 에탄올 50ℓ를 가한 후 99분 동안 초음파 추출기로 3회에 걸쳐 추출하고, 이를 감압 농축하여, 95% 에탄올 추출물 9.8 g을 수득하였다.
최종적으로 추출물을 비롯한 각 분획물을 동결건조기를 통하여 말린 후, DMSO에 녹여 10 mg/mL로 만들어 항바이러스 활성평가 실험에 사용하였다.
실시예 1-2. 구아바 추출물로부터 분획물 제조
상기 실시예 1-1에서 수득한 구아바 추출물을 증류수 1.0ℓ에 현탁한 후 극성에 따른 용매분획을 통하여 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물의 순서대로 추출하여 분획물을 얻었다. 또한 실시예 1-1에서 수득한 구아바 추출물을 0.5 N의 염산수용액을 사용하여 현탁시켜 반응시키고 n-헥산으로 용매분획 하였다. 이후, 동일 부피의 물로 2-3회 수세하여 산도를 낮추고 최종적으로 페오피틴화 n-헥산 분획물을 수득하였다. 이후, 활성기반 분획 및 분리법 (Bioactivity-guided fractionation and isolation)을 통한 활성물질을 규명하기 위해 각 분획물의 항바이러스 활성 평가를 실시하였다.
실시예 1-3. 구아바 추출물로부터 페오피틴화 분획물 제조
상기 실시예 1-1에서 수득한 추출물을 0.5 ~ 1.0 N의 염산수용액(무기산 용액) 또는 0.05 ~ 10 % (w/v) 의 구연산수용액(유기산 용액)에 현탁시켜 반응시키거나, 60 ℃에서 30분 ~ 48시간 방치한 다음 n-헥산으로 용매분획하고 물로 수세하여 페오피틴화 n-헥산 분획물을 제조하였다.
<실시예 2. 신종코로나 바이러스에 대한 구아바 분획물의 억제능 확인>
본 발명의 구아바 잎 추출물 및 분획물이 코로나 바이러스의 증식에 미치는 영향을 확인하고자 세포변성효능 (Cytopathic effect, CPE)) 어세이를 실시하였다.
실시예 2-1. 코로나 바이러스의 준비
SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, NMC-CoV-02 strain)는 생물안전등급 3등급 (Biological Safety Level-3, BSL-3) 시설을 완비한 충북대학교(청주, 한국)에서 Vero 세포를 호스트(host)로 하여 배양한 후 사용하였다. SARS-CoV-2 바이러스를 mono-layered Vero 세포에 접종하고 3일 후 바이러스 배양 상층액 분액을 채취하고, 바이러스를 10%[v/v] FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양 유지된 Vero 세포에 접종하여 항바이러스 활성측정에 사용하였다.
실시예 2-2. CPE 어세이
상기 실시예 2-1에서 준비된 SARS-CoV-2 바이러스를 Vero 세포에 감염시킨 후, 상기 실시예 1에서 제조한 추출물 및 분획물을 처리하여 CPE 어세이를 실시하고, 이를 도 1에 나타내었다. 96-웰 (well) 플레이트에 2×104 세포/웰의 밀도로 Vero 세포를 분주하여 10% [v/v] FBS (fetal bovine serum), 1% [v/v] PS (penicillin+streptomycin) 및 L-글루타민 (L-glutamine, 500㎖ 배지 기준 2㎖ 첨가)을 포함한 DMEM 배양액에서 하루 동안 증식시킨 뒤 배양액을 PBS 용액으로 세척하였다. 상기 세척된 Vero 세포에 SARS-CoV-2 바이러스가 100 TCID50의 농도로 포함된 감염 배지 (infection media : DMEM + 1㎍/㎖ trypsin) 50㎕를 넣어, 2시간 동안 감염시킨 후 배양액을 PBS 용액으로 세척하였다. 이후, 본 발명의 추출물 및 분획물을 농도별로 각각 포함한 DMEM 배양액(infection media : DMEM + 0.2㎍/㎖ trypsin)에서 3일 동안 배양하고, 바이러스에 대한 효과를 측정하였다. 배양 3일 후, CPE 어세이를 실시하여 Vero 세포의 생존여부를 측정하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 구아바 잎 추출물의 n-헥산 분획물이 타 분획물보다 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 높았다. 또한 페오피틴화 분획물은 95% 에탄올 분획물을 페오피틴화 반응으로 처리한 것으로 분획한 n-헥산 분획물에 버금가는 높은 항바이러스 활성을 나타냈다.
<실시예 3. 활성분획물로부터 단일화합물의 분리>
상기 실시예 2에서 신종코로나 바이러스에 대한 가장 강한 항바이러스 활성이 확인된 n-헥산 분획물 일부 (1.1 g)를 n-헥산:에틸아세테이트 (1:0 → 0:1 [v:v])의 농도구배 용출 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피 (normal phase column chromatography)를 실시하여 5개의 분획을 얻었다 (F.1 - 5).
이 중 상기 F.1 분획물 (53.9 mg)에 대하여 n-헥산:에틸아세테이트 (1:0 → 9:1 [v:v])의 농도 구배 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 1 (15.0 mg)을 얻었다. 상기 F.2 분획물 (18.3 mg)에 대하여 n-헥산:에틸아세테이트 (1:0 → 9:1 [v:v])의 농도 구배 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 2 (5.3 mg)을 얻었으며, F.3 분획물 (273.5 mg)에 대하여 n-헥산:에틸아세테이트 (19:1 → 7:3 [v:v])의 농도 구배 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획을 얻었고 (F.3-1 - 3-8), F.3-6 에 대하여 메탄올:증류수 (0.1% 폼산) (8:2 → 0:1 [v/v]) 농도 구배 조건으로 역상 MPLC를 실시하여 다시 6개의 소분획을 얻었다 (F.3-6-1 - 3-6-6). 상기 F.3-6-3에 대하여 아세토니트릴:증류수 (0.1% 폼산) (70:30 → 83:17 [v/v])을 이동상으로 HPLC [컬럼:YMC Triart C18 column 10 × 250 mm; 입자크기:5 μm; 유속:2.0 mL/min; UV detection: 210 nm]를 실시하여 화합물 3 (3.5 mg, t R = 23.0 min)을 얻었다. 상기 F.4 (186.8 mg) 에 대하여 n-헥산:아세톤 (1:0 → 7:3 [v:v])의 농도 구배 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 3개의 소분획을 얻었으며, 각 소분획 대하여 고성능액체크로마토그래피 (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)를 실시하여 다음의 조건 (용매: A-MeOH/H2O, B-EA; 컬럼: YMC triart C18 10 x 250; 유속: 3 ml/mL; 검출파장: 450, 654 nm; 기울기용리: 0-25 min 50/50 (A/B) (F.4-2), 0-26 min 54/46 (A/B) (F.4-3))으로 분리를 진행하였고 그 결과, 각각 페오피틴 b (화합물 4, 13 mg)와 페오피틴 a (화합물 5, 25 mg)를 획득하였다.
실시예 3-1. 베타-카리오필렌 (화합물 1)
β-caryophyllene;
무색 오일성 액체;
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000004
= -26.9 (c 1.0, 클로로포름)
HRESIMS m/z 205.1957 [M + H]+ (calcd for C15H25, 205.1956);
IR (KBr) v max : 2926, 2858, 1633, 1448, 1383, 1367, 1277, 1182, 886 cm-1
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ H 5.31 (1H, dd, J = 10.0, 4.5 Hz), 4.94 (1H, s), 4.82 (1H, d, J = 1.0 Hz), 2.32 (1H, q, J = 9.0 Hz), 1.66 (1H, m), 1.61 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.97 (3H, s)
13C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ C 154.8, 135.7, 124.5, 111.8, 53.7, 48.6, 40.5, 40.1, 34.9, 33.1, 30.2, 29.5, 28.5, 22.8, 16.4.
도 2에 구아바 (Psidium guajava)로부터 얻은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타내었다.
실시예 3-2. 알파-후물렌 (화합물 2)
α-humulene;
무색 오일성 액체;
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000005
= -2.3 (c 1.0, 클로로포름)
HRESIMS m/z 205.1951 [M + H]+ (calcd for C15H25, 205.1956);
IR (KBr) v max : 2956, 2925, 2851, 1446, 1385, 1361, 966, 843, 822 cm-1
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ H 5.59 (1H, dt, J = 16.0, 7.5 Hz), 5.16 (1H, d, J = 16.0 Hz), 4.95 (1H, dd, J = 7.5, 6.0 Hz), 4.87 (1H, td, J = 7.5, 1.0 Hz), 2.51 (2H, d, J = 7.0 Hz), 2.12-2.07 (4H, m), 1.91 (2H, d, J = 7.5 Hz), 1.64 (3H, d, J = 1.5 Hz), 1.43 (3H, t, J = 0.5 Hz), 1.06 (6H, s).
13C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ C 141.1, 139.4, 133.3, 127.9, 126.0, 125.1, 42.1, 40.5, 39.9, 37.5, 23.5, 18.1, 15.2.
도 3에 구아바 (Psidium guajava)로부터 얻은 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타내었다.
실시예 3-3. (-)-구아이올 (화합물 3)
(-)-guaiol;
무색 침상 고체;
Figure PCTKR2022012302-appb-img-000006
= -30.1 (c 1.0, 클로로포름)
HRESIMS m/z 223.2061 [M + H]+ (calcd for C15H27O1, 223.2062);
Melting point: 91-93 ℃;
IR (KBr) v max : 3332, 2958, 2927, 2860, 2842, 2825, 1445, 1363, 1311, 1141, 912, 678 cm-1
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ H 2.54-2.50 (1Η, m), 2.44-2.36 (1H, m), 2.30-2.27 (1H, m), 2.25-2.19 (1H, m), 2.06-1.86 (2H, m), 1.81-1.72 (2H, m), 1.64-1.49 (2H, m), 1.43-1.25 (3H, m), 1.15 (6H, s), 1.00 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.96 (3H, d, J = 6.8 Hz).
13C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ C 140.2, 139.0, 73.7, 49.8, 46.4, 35.5, 33.9, 33.8, 31.1, 28.0, 27.6, 27.5, 26.1, 20.1, 19.9.
도 4에 구아바 Psidium guajava)로부터 얻은 (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)의 1H 및 13C-NMR spectrum을 나타내었다.
실시예 3-4. 페오피틴 a (화합물 4)
Pheophytin a;
암청색 파우더;
ESIMS m/z 871.6 [M + H]+;
1H-NMR (CDCl3, 800 MHz): δ H 3.22 (1H, s, H-2a), 7.98 (1H, dd, J = 17.6, 11.2 Hz, H-3a), 6.16 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-3b), 6.27 (1H, d, J = 18.4 Hz, H-3b), 9.37 (1H, s, H-5), 3.38 (3H, s, H-7a), 3.67 (2H, m, H-8a), 1.68 (3H, t, J = 8.0 Hz, H-8b), 9.50 (1H, s, H-10), 3.67 (3H, s, H-12a), 6.24 (1H, s, H-13b), 3.86 (3H, s, H-13d), 4.44 (1H, m, H-17), 4.47 (1H, m, H-18), 1.78 (3H, d, J = 7.2, H-18a), 8.54 (1H, s, H-20).
13C NMR (CDCl3, 200 MHz): δ C 142.0 (C-1), 131.8 (C-2), 12.1 (C-2a), 129.1 (C-3a), 136.3 (C-3b), 136.2 (C-4), 97.5 (C-5), 155.7 (C-6), 136.2 (C-7), 11.3 (C-7a), 145.2 (C-8), 19.5 (C-8a), 17.4 (C-8b), 151.0 (C-9), 104.4 (C-10), 137.9 (C-11), 129.1 (C-12), 12.1 (C-12a), 129.0 (C-13), 189.6 (C-13a), 64.7 (C-13b), 172.2 (C-13c), 51.1 (C-13d), 149.6 (C-14), 105.2 (C-15), 161.2 (C-16), 52.8 (C-17), 29.8 (C-17a), 172.9 (C-17c), 50.1 (C-18), 23.1 (C-18a), 169.6 (C-19), 93.1 (C-20).
실시예 3-5. 페오피틴 b (화합물 5)
Pheophytin b;
갈색 파우더;
ESIMS m/z 885.5 [M + H]+;
1H-NMR (CDCl3, 800 MHz): δ H 3.38 (1H, s, H-2a), 7.99 (1H, dd, J = 17.7, 10.4 Hz, H-3a), 6.23 (1H, dd, J = 12.6, 1.7 Hz, H-3b), 6.37 (1H, br d, J = 18.0 Hz, H-3b), 10.35 (1H, s, H-5), 11.13 (3H, s, H-7a), 9.63 (1H, s, H-10), 3.68 (3H, s, H-12a), 6.24 (1H, s, H-13b), 3.91 (3H, s, H-13d), 4.20 (1H, br d, J = 8.8 Hz, H-17), 4.40-4.60 (1H, m, H-18), 8.54 (1H, s, H-20).
<실시예 4. 박층크로마토그래피 및 HPLC를 통한 구아바 추출물 및 n -헥산 분획물에서 화합물 1, 2, 4, 5의 확인>
상기 실시예 3에서 수득한 n-헥산 분획물과 화합물 1, 2, 4, 5를 대상으로 박층크로마토그래피를 실시하였다. 각 화합물을 박층크로마토그래피에 점적하고 n-hexane/acetone = 7/3 조건으로 전개시킨 후, 365 nm 및 20% H2SO4 발색 후 365 nm에서 각각 관찰한 결과, n-헥산 분획물에서 화합물 1, 2, 4, 5의 존재를 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
또한 세스퀴테르페노이드계 화합물 1-3의 구아바 95% 에탄올 추출물 및 n-헥산 분획물에 존재유무를 상세하게 확인하기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 구아바 건잎의 95% 에탄올 추출물, n-헥산 분획물을 각각 메탄올에 용해시켜 10 mg/mL, 5 mg/mL의 농도로 준비하였다. 그리고 상기 실시예 3에서 분리한 화합물 1-3은 0.5 mg/mL의 농도로 준비하였다. HPLC 분석은 DAD-Diode Array Detector 3000이 장착된 Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000 시스템을 통해 실시하였고, 컬럼은 YMC-Triart C18 (4.6 × 250.0 ㎜, 5μm)을 사용하였다. 분석 조건은, 액체크로마토그래피의 이동상은 0.1% [v/v] 포름산을 포함하는 증류수 (이동상 A)와 아세토니트릴 (이동상 B)을 사용하여 유속 1.0㎖/분으로 흘려주었고, 컬럼 온도 25 ℃, 시료 온도 10 ℃에서 분석을 시행하였으며 각 시료는 20㎕씩 주입하였다. 크로마토그램은 210 nm에서 관찰하였으며, 이동상의 조건은 다음과 같다. 0~10.0분 60~75% 이동상 B 농도구배로, 10.0~15.0분 75~85% 이동상 B 농도구배로, 15.0~25.0분 85~95% 이동상 B 농도구배로, 25.0~30.0분 95% 이동상 B 농도구배로 흘려주었다. 상기 실시예 3에서 분리한 세스퀴테르페노이드계 화합물 1-3의 머무름 시간 및 자외선 흡광 패턴을 통하여 각 시료에 포함된 화합물들의 존재 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 세스퀴테르페노이드계 화합물 1-3의 화합물들은 n-헥산 분획물에서 농도가 증가하는 것을 관찰하여 효율적으로 추출되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5. 구아바 유래 단일화합물의 항바이러스 활성 측정>
상기 실시예 3에서 수득한 화합물 1-3과 대조화합물로 구아바로부터 분리된 메로테르페노이드 화합물인 제주구아자본 A (Jejuguajavone A, 특허출원번호 제1020210019447호, 하기 화학식 3)의 SARS-CoV-2에 대한 저해능을 측정하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
처리군 CPE 저해농도 (μM)
베타-카리오필렌 (1) 2.5
알파-후물렌 (2) 10
(-)-구아이올 (3) 10
제주구아자본 A 2.5
표 1에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 3의 구아바 유래 세스퀴테르페노이드계 화합물 1-3 과 대조군으로 제주구아자본 A 화합물을 처리한 결과, 화합물들은 10μM 농도 이하에서 항바이러스 활성이 확인되었다. 특히나, 화합물 1의 경우는 제주구아자본 A와 비슷한 농도인 2.5μM 농도에서 항바이러스 효과를 보였다. 상기와 같은 활성 결과를 통해 세스퀴테르페노이드 화합물이 항바이러스 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 아울러, 상기 실시예 3 및 실시예 4에서 박층크로마토그래피 및 HPLC 분석을 통해 확인한 바와 같이 세스퀴테르페노이드계 화합물인 화합물 1과 2가 구아바 잎의 n-헥산 분획에서 다량으로 함유된 것을 고려하면 본 발명의 구아파 잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 수윽한 세스퀴테르페노이드계 회합물이 산업적으로 이용가능성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 화합물 1 (CAS number, 87-44-5)은 미국 식품의약품안전청(FDA) 및 유럽에서 식품첨가물로 허용되고 있다.
< 실시예 6. 구아바 유래 화합물 및 페오피틴계 화합물의 세포병변억제 효과 및 조합에 의한 저해활성 증가>
실시예 6-1. 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A와 페오피틴계 화합물의 병용에 의한 항바이러스 상승효과
구아바 유래 화합물인 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A의 SARS-CoV-2에 대한 저해활성을 확인하였으며 또한 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A의 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스 효능은 플피린계 화합물과 병용하였을 시 상승효과가 있는 것을 확인하였다. 폴피린계 화합물 4와 5는 광합성 작용을 하는 녹색식물에 광범위하게 함유되어 (ubiquitous) 있는 화합물로, 화합물 4와 5는 각각의 전구체인 클로로필 a와 b로부터 마그네슘 이온이 제거되는 과정에서 만들어지는 화합물이다.
한편, 코로나 바이러스는 유전자 크기가 매우 큰 바이러스이며 다양한 변이 바이러스 발생은 적극적 백신 대처에 어려움을 야기하고 있다. 최근 다중성분에 의한 다중표적에 작용 (multi-components and multi-targets, MCMT)하여 SARS-CoV-2에 대한 저해활성을 유지할 수 있는 접근방법이 제시되고 있다. 이러한 MCMT 접근방법은 단일 단백질 표적에 대한 저해약물의 사용보다 변이하는 SARS-CoV-2 바이러스에 보다 효과적인 대처가 가능하다. 본 연구팀은 내성균주의 발현과 상관없이 광범위하게 작용하는 화합물 창출을 목적으로, 화합물들을 병용하여 SARS-CoV-2에 대한 저해활성이 증가하는 화합물을 발굴하는 과정에서 본 발명에 따른 화합물들의 복합투여에 의하여 SARS-CoV-2 바이러스의 저해효과가 증가함을 확인하였다.
일반적으로 녹색식물에 광범위하게 존재하는 클로로필 a 와 b는 3:1의 비율로 존재하며, 클로로필 a 와 b 각각의 유도체인 페오피틴 a 와 b는 위산에서 정량적으로 상응하는 클로로필에서 생산되므로 본 실험에서는 화합물 4 + 5를 3:1의 중량비로 준비하여 항바이러스 활성을 평가하였다. 상기 실시예 5에서 항바이러스 활성이 확인된 세스퀴테르페노이드계 화합물 1-3 중 구아바 내에 다량 함유된 것으로 확인된 화합물 1과 메로테르페노이드계 화합물인 제주구아자본 A (jejuguajavone A, 특허출원번호 제1020210019447호), 그리고 화합물 4 + 5 (3:1) 및 이들의 조합에 따른 항바이러스 상승효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 세포 병변 억제 효과 어세이 실험을 수행하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
표 2에서 보는 바와 같이, 페오피틴 a + b (3:1) : 베타-카리오필렌 또는 제주구아자본 A (mol:mol)의 비율을 1:1, 1:0.2, 1:0.1, 1:0.05 및 0.01의 비율로 준비하여 항바이러스 활성평가 결과, 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합은 1:1 내지 1:0.01의 배합비율에서 페오피틴 a + b 또는 베타-카리오필렌 단독처리보다 상승적인 항바이러스 효과를 보여주었으며, 이는 페오피틴 a + b와 제주구아자본 A의 1:1 내지 1:0.01의 배합비율에서도 단독처리보다 상승적인 항바이러스 효과를 잘 보여주었다. 페오피틴 a + b (3:1) : 베타-카리오필렌 또는 제주구아자본 A (mol:mol)의 비율이 1:0.05 일때에 페오피틴 a + b 단독처리군 대비 CPE 억제 농도는 1/2로 감소하였으며, 비율을 1:0.01 로 혼합한 혼합물은 페오피틴 a + b 단독처리군 대비 CPE 억제 농도는 여전히 페오피틴 a + b 단독처리군 보다 낮은 CPE 억제 농도를 보여주었다.
처리군 CPE 저해농도
(μM) 		단독처리군 대비 CPE 억제 농도의 감소비
A B C
단독처리군
Pheophytin a:b (A) 5.0 - - -
β-caryophyllene (B) 2.5 - - -
Jejuguajavone A (C) 2.5 - - -
A:B 조합처리군 (비율)
1:1 1.25 4 2 2
1:0.2 1.25 4 2 2
1:0.1 2.5 2 1 1
1:0.05 2.5 2 1 1
A:C 조합처리군 (비율)
1:1 0.625 8 4 4
1:0.2 1.25 4 2 2
1:0.1 1.25 4 2 2
1:0.05 2.5 2 1 1
실시예 6-2. 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A와 페오피틴계 화합물 및 이들 조합의 EC 50 값 결정
상기 실시예 6-1에 의하여 결정된 최적 비율의 SARS-CoV-2에 대한 저해활성을 평가하기 위하여 EC50 값 (effective dose)을 결정하였다. 각 화합물의 단독 처리군 및 선정된 최적비율 조합 처리군을 농도별 (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 μM)로 처리하여 신종코로나 바이러스 (SARS-CoV-2)가 50% 감염된 Vero 세포에서의 세포독성 및 SARS-CoV-2 복제에 대한 EC50 값을 측정하고 그 결과를 표 3 및 도 7에 나타내었다.
그룹 화합물 EC 50 (μM) 세포독성 (μM)
G1 Pheophytin a 9.20 ± 1.36 N.D.
G2 Pheophytin b 5.50 ± 0.13 N.D.
G3 β-caryophyllene 3.23 ± 0.12 N.D.
G4 Jejuguajavone A 3.22 ± 0.14 10
G5 Pheophytin a + b (3:1) 3.82 ± 0.19 N.D.
G6 G5 + β-caryophyllene (1:0.2) 1.27 ± 0.03 N.D.
G7 G5 + Jejuguajavone A (1:0.1) 2.45 ± 0.05 N.D.
G8 Remdesivir (대조군) 0.45 ± 0.09 N.D.
페오피틴 a , 페오피틴 b, 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A 의 EC50 값은 각각 9.20 ± 1.36, 5.50 ± 0.13, 3.23 ± 0.12 및 3.22 ± 0.14 μM이었다. 페오피틴 a + b (3:1)의 혼합물은 EC50이 3.82 ± 0.19μM 값을 가지며, 페오피틴 a와 b를 단독으로 처리했을 때보다 강한 활성을 나타냈다. 또한 상기 선정된 최적비율에 따라 페오피틴 a + b (3:1):베타-카리오필렌 = 1:0.2 및 페오피틴 a + b (3:1):제주구아자본 A = 1:0.1를 처리한 결과 각각 EC50값이 1.27 ± 0.03μM와 2.45 ± 0.05μM 값으로 나타났다. 실험에서는 대조군으로 에볼라 바이러스 치료제로 개발되어 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스제로 허가를 받은 렘데시비르 (remdesivir)를 사용하였다. 렘데시비르는 페오피틴 a + b (3:1):베타-카리오필렌 = 1:0.2 및 페오피틴 a + b (3:1):제주구아자본 A = 1:0.1보다 본 실험조건에서 상대적으로 강한 0.45 ± 0.09μM의 EC50값을 보여주었다. 렘데시비르는 치료를 위하여 정맥주사를 하여 사용하는 약물로 녹색식물로부터 광범위하게 얻을 수 있으며 식품으로 사용되는 화합물 1, 4, 5 및 제주구아자본 A를 병용하여 항바이러스 효과를 갖는 본 특허와는 다르다. 또한, 페오피틴 a + b (3:1), 베타-카리오필렌 또는 제주구아자본 A를 단독으로 처리하였을 때보다 병용시 항바이러스 활성이 크게 증가하였으며, 페오피틴계 화합물과 베타-카리오필렌 또는 제주구아자본 A의 조합에 따른 강력한 상승작용을 확인하였다.
<실시예 7. 동물실험을 위한 베타-카리오필렌의 대량분리>
구아바로부터 분리한 베타-카리오필렌이 상기 실시예 5 에서 강한 저해능을 나타냄과 동시에 실시예 6에서 폴피린류 화합물과의 조합에 따른 상승작용이 확인됨에 따라, 이를 동물 모델에서 효능을 확인하기 위하여 Sigma-Aldrich로부터 베타-카리오필렌 (순도≥ 80%) 을 구입하여 추가 정제하였다. 약 10g의 베타-카리오필렌 (순도 ≥ 80%)을 n-헥산을 이용한 용출 조건으로 순상 컬럼 크로마토그래피 (normal phase column chromatography)를 실시하여 순도 높은 베타-카리오필렌 (순도 ≥ 95%, 8.05 g)을 수득하였다.
<실시예 8. 동물실험을 위한 페오피틴 a 및 b의 대량분리>
상기 실시예 5 및 실시예 6의 결과를 바탕으로 동물 모델에서 효능을 확인하기 위하여 페오피틴 a와 b의 대량분리를 위한 실험을 진행하였다. 대량의 물질을 분리하기 위해 클로로필 a와 b가 많이 함유되어 있는 것으로 보고되고 있는 시금치로부터 단일 물질을 분리하였다. 5.0 kg의 시금치를 클로로필 a와 b의 손실을 최소화하기 위하여 아세톤을 사용하여 교반하여 3회 추출한 후, 0.5 N 염산수용액에 현탁시킨 후 n-헥산을 이용한 분획을 3회 실시하여 페오피틴화 분획 73 g을 확보하였으며, 페오피틴화 분획물을 대상으로 다음의 조건 (순상컬럼크로마토그래피, 입자크기: 43-60 μm ; n-hexane:acetone = 3:1)으로 페오피틴 a와 b를 각각 1.95 g, 0.76 g 을 분리하였다.
<실시예 9. 동물 모델에서 구아바로부터 분리한 활성화합물 및 이들 조합에 따른 신종코로나 바이러스 억제능 평가>
본 실험을 진행하기 위하여 100 g의 체중을 가지는 골든 시리안 햄스터 (golden Syrian hamster)를 군당 9마리씩 준비하였으며, 1주간의 적응기간을 가진 후, 12시간 간격의 낮 (오전 7시~오후 17시)과 밤의 주기에 따라 관리하였다. 군은 G1) 대조군 (DMSO:EtOH:PEG400:DW = 5:5:50:40 용액), G2) 페오피틴 a + b (3:1) 투여군 (25 mg/kg/day), G3) 베타-카리오필렌 투여군 (1.25 mg/kg/day), G4) 제주구아자본 A 투여군 (1.25 mg/kg/day), G5) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 (1:0.2, mol:mol) 투여군 (25 mg/kg/day + 1.25 mg/kg/day), G6) 페오피틴 a + b와 제주구아자본 A 조합 (1:0.1, mol:mol) 투여군 (25 mg/kg/day + 1.25 mg/kg/day)으로 총 6개 군 (G1-G6)으로 나누어 실시하였다.
모든 그룹의 햄스터에 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02) 바이러스를 비강을 통하여 수당 105. 5TCID50/mL으로 공격접종한 후 공격접종일부터 5일 동안 매일 동일한 시간에 1회씩 (24시간마다) 각 화합물을 경구 투여하였다. 공격 접종 2일째, 4일째 및 6일째에 각 그룹당 햄스터 3마리씩 안락사시킨 후 이의 비강조직과 폐 조직에서 바이러스 역가를 측정하였다. 각 조직에서의 바이러스 역가 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 비강조직(Nasal turbinate)에서 G1 대조군은 공격 접종한 바이러스 (105.5TCID50)와 유사하게 2일째에도 5.4 log10TCID50/g의 역가를 보였으며, 4일째 (4.4 log10TCID50/g)까지 바이러스 역가가 크게 떨어지지 않고 지속되었다. 단독처리군인 G2-G4는 2일째에 G1 대조군과 유사한 바이러스 역가를 보이다가 4일째에 G1 대조군보다 바이러스 역가가 감소하였다. 조합처리군인 G5 및 G6는 2일째 (p < 0.05)에 G1 대조군에 비해 바이러스 역가가 유의하게 감소하였다. 이들 조합처리군은 4일째에 바이러스 역가가 현저하게 더 감소하였으며 (p < 0.01), 특히 G5 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 (1:0.2) 투여군에서 G1 대조군보다 절반 가까이 바이러스 역가가 떨어진 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단독처리시보다 조합으로 처리하였을 때 현저한 바이러스 저해능의 상승을 나타낸다.
폐(Lung) 조직의 경우, 단독처리군인 G2-G4는 2일째 및 4일째에 G1 대조군과 크게 다르지 않은 바이러스 역가를 보였으나, 조합처리군인 G5 및 G6는 2일째에 G1 대조군에 비해 바이러스 역가가 떨어지는 경향을 보였고, 4일째에는 유의하게 바이러스 역가가 감소한 것을 확인하였다 (p < 0.05). 이러한 결과는 화합물을 단독으로 처리했을 때보다 페오피틴 a 및 b와 세스퀴테르페노이드계 또는 메로테르페노이드계 화합물을 조합하여 처리하였을 때 시너지 효과를 일으켜 상승된 항바이러스 활성을 갖는 것임을 확인할 수 있다.
<실시예 10. 변이 바이러스를 hACE2 TG 마우스 동물모델에서 페오피틴 및 베타-카리오필린과의 조합에 따른 신종코로나 바이러스 억제능 평가>
2020년 1월 말 또는 2월 초에 스파이크 단백질을 암호화하는 유전자에 D614G가 치환된 변이 바이러스들이 등장하기 시작했고, 그 중 B.1.1.7은 영국 발 알파 변이 바이러스, B.1.351은 남아프리카공화국 발 베타변이바이러스이다. 변이 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 입증하기 위해 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade) 및 알파 변이 바이러스 (NMC-nCoV06, B.1.1.7 변이)를 각각 비강을 통하여 수당 104.0TCID50/mL으로, 베타변이 바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 수당 103.5TCID50/mL으로 공격접종한 hACE2 TG 마우스를 군당 15마리씩 준비하였으며, 군은, G1) 대조군 (DMSO:EtOH:PEG400:DW = 5:5:50:40 용액) 및 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02) 바이러스를 공격 접종한 골든 시리안 햄스터 (gloden Syrian hamster) 동물모델에서 높은 바이러스 저해능을 나타낸 G2) 페오피틴 a + b (25 mg/kg/day) 투여군과 G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 (1:0.2, mol:mol) 투여군 (25 mg/kg/day + 1.25 mg/kg/day) 투여군, 총 3개 군으로 나뉘어 실시하였다. 페오피틴 a, b 및 베타-카리오필렌을 SARS-CoV-2 감염 hACE2 TG 마우스 동물실험에 사용한 것은 페오피틴 a, b는 클로로필 유도체를 함유하는 모든 녹색식물로부터 쉽게 얻을 수 있어 높은 접근성을 가지고, 베타-카리오필렌은 녹색식물의 향신료 성분으로 다수의 식물에 다량 함유되어 있으므로 SARS-CoV-2 대응에 즉각적으로 대응이 가능하기 때문이다. 또한, 다양한 식품에 함유되어 있는 물질로써 독성문제에 대하여 상대적으로 안전하다.
hACE TG 마우스에 대하여 공격접종일부터 5일 동안 매일 동일한 시간에 1회씩 (24시간마다) 화합물을 경구 투여하였으며, 체중 감소 및 생존률을 14일까지 매일 관찰하였다. 항바이러스 효능을 비교하기 위해 각 군의 마우스 3마리에 대하여 3일째, 5일째 및 7일째에 안락사시킨 후, 폐 조직의 바이러스 역가를 Vero 세포에서 TCID50 으로 측정하였으며, 각 그룹에서의 바이러스 역가 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade) 감염 후 G1 대조군 마우스는 매일 체중이 감소하여 6일째에는 최초 체중보다 약 25% 까지 떨어졌고, G1 대조군 마우스가 모두 7일째에 사망하였다. 그러나 G2와 G3에서는 바이러스 공격접종후 8일째까지 체중이 감소하여 약 20%의 체중감소가 확인되었으나, 이후 14일째까지 체중이 점차적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 14일째에는 G2) 페오피틴 a + b 투여군은 40%, G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 80%의 생존률을 보였다. 또한 3일째, 5일째 및 7일째에 폐조직에서 측정한 바이러스 역가는 G2, G3 모두 G1 대조군에 비하여 낮은 바이러스 역가를 보였으며, 특히 7일째에는 G1 대조군 마우스는 모두 사망하였으나 G2, G3 마우스는 최초 공격접종시보다 절반 이상 바이러스 역가가 떨어진 것을 확인하였다. 또한 G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 G2) 페오피틴 a + b 투여군 보다 더 낮은 바이러스 역가를 나타내며 상승된 항바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
알파 변이바이러스 (NMC-nCoV06, B.1.1.7 변이)를 공격접종한 hACE TG 마우스에 대하여 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade) 감염군과 동일하게 실험을 진행하였으며, 그 결과는 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade) 감염군에서와 유사하였다. G1 대조군 마우스가 G2, G3 군에 비해 급격한 체중 감소세를 보이다 모든 마우스가 7일째에 사망하였으나, G2) 페오피틴 a + b 투여군 및 G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 8일째까지 체중이 최초 체중보다 약 25% 까지 감소하다가 다시 상승세를 보였으며 14일째에 생존율은 각각 20%, 60%로 관찰되었다. 폐조직의 바이러스 역가를 3일째, 5일째 및 7일째에 측정한 결과, 7일째에 G1 대조군 마우스는 모두 사망한 반면 G2, G3 마우스는 최초 공격접종시보다 절반 가까이 바이러스 역가가 떨어진 것을 확인하였다. 또한 앞선 결과와 마찬가지로 G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군이 G2) 페오피틴 a + b 투여군보다 더 강한 항바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
베타 변이바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 공격접종한 hACE TG 마우스에 대하여 앞선 실험과 동일하게 진행하였다. G1 대조군 마우스가 S clade 및 알파변이 바이러스를 접종한 마우스에서보다 더 급격한 체중 감소세를 보이다 모든 마우스가 5일째에 사망하였고, G2) 페오피틴 a + b 투여군 및 G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 7일째까지 체중이 최초 체중보다 약 25% 까지 감소하다가 다시 상승세를 보였으며 14일째에 생존율은 각각 20%, 60%로 관찰되었다. 폐조직의 바이러스 역가를 3일째, 5일째 및 7일째에 측정한 결과, 5일째에 모든 그룹의 마우스가 가장 높은 바이러스 역가를 나타내었으며, G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 G1) 대조군 마우스에 비해 통계적으로 낮은 바이러스 역가를 나타냈다. 특히 베타 변이바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 공격접종한 hACE TG 마우스에서 또한 뇌조직의 바이러스 역가를 확인해보았을 때 G1) 사망한 대조군 마우스는 5일차에 가장 높은 바이러스 역가를 보였다. 7일째에 생존한 G2) 페오피틴 a + b 투여군을 대상으로 뇌조직의 바이러스 역가를 확인해보았을 때, 상대적으로 높은 수준의 바이러스 역가가 지속되었으나, G3) 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합 투여군은 5일째의 G1) 대조군 마우스와 7일째의 G2) 페오피틴 a + b 투여군보다 현저히 낮은 바이러스 역가를 보였다. 이러한 결과는 페오피틴 a + b와 베타-카리오필렌 조합이 페오피틴 a + b 조합보다 더 강한 항바이러스 효과를 가지는 것을 나타낸다.
상기 결과로부터, 본 발명에서 확인한 화합물이 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade), 알파 변이바이러스 (NMC-nCoV06, B.1.1.7 변이) 및 베타 변이바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)를 포함하여 시험한 모든 SARS-CoV-2 감염에 대해 항바이러스 활성을 가짐을 확인하여 변이에도 적용할 수 있음을 확인하였으며 동시에 폴피린류와 베타-카리오필렌의 조합은 항바이러스 활성의 상승 효과가 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
<실시예 11. 페오피틴, 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A 와 이들 조합의 전처리에 따른 Vero 세포에서의 항바이러스 활성>
SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, S clade) 뿐만 아니라 알파 변이 바이러스 (NMC-nCoV06, B.1.1.7 변이) 및 베타 변이 바이러스 (NMC-nCoV07, B.1.351 변이)에도 항바이러스 활성을 보인 페오피틴 a , 페오피틴 b, 베타-카리오필렌 및 제주구아자본 A 에 대하여, 이들 화합물이 바이러스 감염이 진행되는 동안 바이러스의 세포내로 진입을 억제할 것이라는 가설을 세우고 이를 검증하고자 하였다. 각 그룹의 화합물을 SARS-CoV-2 100TCID50과 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양하고, 각 혼합물을 Vero 세포에 감염시킨 후 1시간 동안 방치하였다. 이후 세포를 차가운 PBS로 3회 반복하여 세척한 후, 화합물이 처리되지 않은 깨끗한 배양액을 첨가하였다. 48시간 이후, 감염세포의 CPE 및 EC50 값을 평가하여 DMSO 처리군과 비교하였으며 그 결과는 표 4 및 도 10에 나타내었다.
그룹 화합물 EC 50 ( μ M)
G1 Pheophytin a N.A.
G2 Pheophytin b 11.1 ± 2.0
G3 β-caryophyllene N.A.
G4 Jejuguajavone A N.A.
G5 Pheophytin a + b (3:1) 6.5 ± 0.5
G6 G5 + β-caryophyllene (1:0.2) 5.7 ± 0.9
G7 G5 + Jejuguajavone A (1:0.1) 5.8 ± 0.7
G8 Remdesivir (대조군) N.A.
처리한 단일화합물 중 G2) 페오피틴 b를 제외한 나머지 화합물인 G1) 페오피틴 a, G3) 베타-카리오필렌, G4) 제주구아자본 A 및 양성대조군인 G8) 렘데시비르는 20μM 농도에서 바이러스를 억제하지 못하였다. 그러나 단독 처리군인 G2) 페오피틴 b가 11.2 ± 2.0 μM의 EC50 값을 나타냈다. 특히, G5) 페오피틴 a + b, G6) 페오피틴 a + b (3:1):베타-카리오필렌 = 1:0.2 조합 처리군 및 G7) 페오피틴 a + b (3:1):제주구아자본 A = 1:0.1 조합 처리군은 SARS-CoV-2에 대해 각각 6.5 ± 0.5, 5.7 ± 0.9, 및 5.8 ± 0.7μM의 EC50 값을 가지며 단일화합물보다 매우 높은 항바이러스 활성을 나타냈다. 이와 달리 렘데시비르의 전처리는 바이러스 역가 감소에 영향을 미치지 않았다. 이를 통해 구아바 유래 화합물의 전처리가 바이러스의 세포내 감염 저해 및 감염세포의 사멸을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
베타-카리오필렌, 페오피틴 a 및 b는 일반적으로 사람들이 많이 섭취하는 식용 식물 추출물로부터 쉽게 발견되는 화합물이다. 이 결과를 통해 이들 화합물을 함유한 식물을 섭취하는 것으로부터 코로나 바이러스의 예방효과를 기대할 수 있으며, 마스크 착용과 백신 접종과 함께 사용한다면 코로나 감염위험을 감소시킬수 있는 방법으로 코로나 예방 효과를 기대할 수 있다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) 200 mg을 각각 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A)을 100 mg, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) 20 g 을 밀가루에 0.1중량% 로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-2. 스프 및 육즙 (gravies)의 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) 20 g 을 육즙에 0.1중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-3. 유제품 (dairy products)의 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) 20 g 을 우유에 0.1중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-4. 야채주스 제조
본 발명의 구아바 추출물(또는 페오피틴화 분획물 또는 n-헥산 분획물) 20 g 또는 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1) 200 mg {또는 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3)} 및 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4) + 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5) 또는 제주구아자본 A (Jejuguajavone A)을 각각 토마토주스 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

Claims (20)

  1. 구아바 (Psidium guajava) 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액으로 추출한 농축물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물로서 세스퀴테르페노이드계 또는 페오피틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 하기 화학식 1 내지 화학식 3의 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3), 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5), 제주구아자본 A(Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022012302-appb-img-000007
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022012302-appb-img-000008
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022012302-appb-img-000009
  3. 제2항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물은, 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물은, 제주구아자본 A (Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 구아바 (Psidium guajava) 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액으로 추출한 농축물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물로서 세스퀴테르페노이드계 또는 페오피틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3), 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5), 제주구아자본 A (Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품은, 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품은, 제주구아자본 A(Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 구아바 (Psidium guajava) 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액으로 추출한 농축물을 농축물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물로서 세스퀴테르페노이드계 또는 페오피틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염 예방용 소독제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3), 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5), 제주구아자본 A(Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방용 소독제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방용 소독제는, 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방용 소독제.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염의 예방용 소독제는, 제주구아자본 A(Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방용 소독제.
  13. 구아바 (Psidium guajava) 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액으로 추출한 농축물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물로서 세스퀴테르페노이드계 또는 페오피틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3), 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5), 제주구아자본 A(Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제는, 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제는, 제주구아자본 A(Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  17. 구아바 (Psidium guajava) 잎을 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액으로 추출한 농축물을 증류수로 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 n-부탄올 중에서 1종 이상 선택된 유기용매 분획물로서 세스퀴테르페노이드계 또는 페오피틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 구아바 (Psidium guajava) 추출물은 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene, 화합물 1), 알파-후물렌 (α-humulene, 화합물 2), (-)-구아이올 ((-)-guaiol, 화합물 3), 폴피린(porphyrin)류의 페오피틴 a (pheophytin a, 화합물 4), 페오피틴 b (pheophytin b, 화합물 5), 제주구아자본 A(Jejuguajavone A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품은, 베타-카리오필렌 (β-caryophyllene) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품은, 제주구아자본 A(Jejuguajavone A) : 페오피틴 a (pheophytin a) : 페오피틴 b (pheophytin b)의 혼합 비율이 0.04~4 : 3 : 1로 포함된 것을 특징으로 하는 신종코로나 바이러스 감염 예방 또는 치료용 동물 약품.
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