BR122020023381B1 - Composição de vacina e kit para reduzir o crescimento de metanogênio ou a produção de metano em um ruminante - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a componentes de células microbianas que são úteis para a produção de anticorpo, incluindo peptídeos, polipeptídeos que compreendem esses peptídeos, polinucleotídeos que codificam esses peptídeos ou polipeptídeos e anticorpos direcionados contra esses peptídeos, polipeptídeos ou polinucleotídeos. a invenção também refere-se a vetores de expressão e células hospedeiras para produção desses peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos e anticorpos. a invenção também refere-se a métodos e composições, especialmente composições de vacina, para detecção, direcionamento e inibição de células microbianas, especialmente células metanogênicas, usando um ou mais dos peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos, anticorpos, vetores de expressão e células hospedeiras.

Description

Dividido do PI0817299-4, depositado em 25.09.2008 PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. N° 60/975.104, depositado em 25 de Setembro de 2007, Pedido U.S. N° 60/989.840, depositado em 22 de Novembro de 2007 e Pedido U.S. N° 60/989.841, depositado em 22 de Novembro de 2007, cujos conteúdos estão aqui incorporados pela referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a componentes de células microbianas que são úteis para a produção de anticorpos, incluindo peptídeos, polipeptídeos que compreendem esses peptídeos, polinu- cleotídeos que codificam esses peptídeos ou polipeptídeos e anticorpos dirigidos contra esses peptídeos, polipeptídeos ou polinucleotí- deos. A invenção refere-se também a vetores de expressão e células hospedeiras para a produção desses peptídeos, polipeptídeos, polinu- cleotídeos e anticorpos. A invenção refere-se ainda a métodos e a composições, especialmente composições de vacina, para a detecção, direcionamento e inibição de células microbianas, especialmente células metanógenas, usando um ou mais dos peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos, anticorpos, vetores de expressão e células hospedeiras descritos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Na Nova Zelândia, a atividade agrícola é responsável pela maior parte das emissões de gases de efeito estufa. Portanto, a redução das emissões agrícolas de gases de efeito estufa é importante para o cumprimento das obrigações da Nova Zelândia sob o Protocolo de Kyoto. O Protocolo requer uma redução dos gases de efeito estufa aos níveis de 1990 até o final do primeiro período do compromisso (20082012). Para essa finalidade, grupos do setor agrícola e o governo da Nova Zelândia estabeleceram o Pastoral Greenhouse Gas Research Consortium (PGGRC) para identificar meios para a redução das emissões agrícolas de gás de efeito estufa da Nova Zelândia.

[004] Uma parte importante das atividades de PGGRC tem sido a pesquisa na redução das emissões de metano pelos ruminantes de pasto da Nova Zelândia. Diminuir as emissões de metano pelos ruminantesé de interesse comercial por duas razões. Primeiro, a falha no cumprimento das metas do Protocolo de Kyoto forçará o governo a adquirir créditos de carbono. Isso está atualmente avaliado custar $350 milhões. Segundo, a produção de metano resulta na perda de 8 a 12% da energia bruta produzida no rume. Essa energia poderia ser usada, por exemplo, para aperfeiçoar a produtividade do ruminante.

[005] O metano é produzido no rume pelos micróbios chamados de metanogênicos que são parte do filo Euyarchaeota dentro do reino Archaea. A maioria dos metanogênicos cresce com CO2 e H2 como suas únicas fontes de energia, mas alguns podem usar compostos de acetato ou de metila para o crescimento. Vários gêneros diferentes de archaea metanogênicos existem no rume, mas espécies do gênero Methanobrevibacter, especialmente M.ruminantium e M. smithiisão considerados ser os metanogênicos predominantes nos ruminantes da Nova Zelândia. M. ruminantiumé atualmente o objeto de estudo de um projeto de sequenciamento genômico fundado pelo PGGRC. O projeto é o primeiro sequenciamento de um metanogênico de ruminante e objetiva construir uma compreensão melhor da biologia de Methanobre- vibacter, para descobrir alvos para a inibição da formação de metano.

[006] A redução da produção de metano no rume requer a inibi ção de metanógenos ou a inativação de sua via de metanogênese. Um meio para inibir a produção de metano é identificar as moléculas específicas que inibem as células metanogênicas. Isso pode ser obtido, por exemplo, pelo uso de agentes que atingem os metanogênicos. Em uma abordagem, as vacinas podem ser preparadas para atingir células microbianas. Portanto, pode ser útil identificar os componentes, especialmente componentes da superfície celular de células microbianas, incluindo peptídeos e polipeptídeos e polinucleotídeos e anticorpos relacionados, que podem ser usados em vacinas antimicrobianas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção apresenta peptídeos, polipeptídeos e polinucle- otídeos isolados de M. ruminantium, particularmente componentes da superfície celular de M. ruminantium, assim como vetores de expressão, células hospedeiras e anticorpos e métodos para uso dos mesmos, como descrito aqui em detalhes.

[008] A invenção apresenta especificamente um peptídeo isolado que compreende, por exemplo, pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em um aspecto particular, o peptídeo compreende pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto adicional, o peptídeo compreende pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17. Em outro aspecto, o peptídeo é um fragmento, por exemplo que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que abrange um domínio ex- tracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332-702.

[009] A invenção apresenta especificamente um polipeptídeo iso lado que compreende, por exemplo, pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em um aspecto particular, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17. Em outro aspecto, o polipep- tídeo é um fragmento, por exemplo que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que abrange um domínio extracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332-702.

[0010] Além disso, a invenção apresenta um polinucleotídeo isola do que compreende uma sequência codificadora para pelo menos um peptídeo. Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em um aspecto particular, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17. Em outro aspecto, o polinucleotídeo compreende um fragmento de uma sequência que codifique, por exemplo, pelo menos uma sequência de aminoácidos que abrange um domínio extracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332-702.

[0011] A invenção apresenta adicionalmente um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que codifica pelo menos um polipeptídeo. Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em um aspecto particular, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora para pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17. Em outro aspecto, o polinucleotídeo compreende um fragmento de uma sequência que co- difique, por exemplo, pelo menos uma sequência de aminoácidos que abrange um domínio extracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10- 17, 45-260 e 332-702.

[0012] Em um aspecto adicional, a invenção apresenta um polinu- cleotídeo isolado que compreende, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:703- 1395. Em um aspecto particular, o polinucleotídeo compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:703-710. Em outro aspecto, o polinucleotídeo é um fragmento ou um oligonucleotídeo que compreende, por exemplo, a sequência de ácido nucleico que abrange um domínio extracelular como codificado por qualquer umas das SEQ ID NO:703-710, 737-931 e 1003-1395. Além disso, a invenção abrange um polinucleotídeo isolado ou seu fragmento do mesmo, que hibridiza com qualquer uma das sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:703-1395. A invenção abrange ainda um polinucleotídeo isolado que compreende o complemento, o complemento reverso, a sequência reversa ou seus fragmentos dos mesmos de qualquer uma das sequências de ácido nucleico.

[0013] A invenção apresenta um vetor de expressão que compre ende um polinucleotídeo da invenção. Em um aspecto, o vetor de expressão compreende uma sequência que codifique pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em um aspecto particular, o vetor de expressão compreende uma sequência que codifica pelo menos uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto adicional, o vetor de expressão compreende uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO:10-17. Em outro aspecto, o vetor de expressão compreende uma sequência que codifica pelo menos uma sequência de aminoáci- dos que abrange um domínio extracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332-702.

[0014] A invenção também apresenta uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira microbiana que compreende pelo menos um vetor de expressão.

[0015] A invenção apresenta especificamente um anticorpo direci onado para um peptídeo, polipeptídeo ou polinucleotídeo como descritos aqui. Em certos aspectos, o anticorpo é direcionado contra uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702. Em aspectos alternativos, o anticorpo é dirigido para pelo menos um fragmento de uma sequência de polipeptídeos selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332702. Em um aspecto particular, o anticorpo se liga a pelo menos um fragmento da sequência de peptídeo de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17. Em um aspecto adicional, o anticorpo se liga a pelo menos um fragmento de uma sequência de polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NO:45-260 e 332-702. Em um aspecto alternativo, o anticorpo se liga a pelo menos um fragmento de peptídeo ou de polipeptídeo que abrange um domínio extracelular de qualquer uma das SEQ ID NO:10-17, 45-260 e 332-702. Em outro aspecto, o anticorpo inclui uma ou mais fusões ou conjugados com pelo menos um inibidor celular, por exemplo, compostos antimetanogênicos (por exemplo, ácido bromoe- tanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucleicos de peptídeo, peptídeos antimicrobianos e outros antibióticos como descrita aqui em detalhes.

[0016] A invenção apresenta, adicionalmente, peptídeos e polipep- tídeos modificados, por exemplo, por pelo menos uma das SEQ ID NO:1-702, incluindo alterações biologicamente ativas, fragmentos, variantes ou derivados descritos aqui. Também são apresentados poli- nucleotídeos que codificam esses peptídeos e polipeptídeos modificados, assim como alterações, fragmentos, variantes e derivados dos polinucleotídeos descritos; anticorpo surgidos usando esses peptí- deos, polipeptídeos ou polinucleotídeos modificados; vetores de expressão que compreendem esses polinucleotídeos; e células hospedeiras que compreendem esses vetores. São apresentados ainda anticorpos modificados, incluindo alterações biologicamente ativas, fragmentos, variantes ou derivados descritos aqui. Em certos aspectos, as composições e métodos da invenção empregam esses peptídeos, po- lipeptídeos, polinucleotídeos, anticorpos modificados ou os vetores de expressão ou células hospedeiras correspondentes.

[0017] A invenção apresenta uma composição que compreende um peptídeo ou polipeptídeo isolados, por exemplo, de pelo menos uma das SEQ ID NO:1-702. Também é apresentada uma composição que compreende um polinucleotídeo isolado, por exemplo, de pelo menos uma das SEQ ID NO:703-1395. A invenção apresenta adicionalmente uma composição que compreende um anticorpo, por exemplo, direcionado para um peptídeo, polipeptídeo ou sequência de poli- nucleotídeo aqui descritos. Ainda é apresentada uma composição que inclui um vetor de expressão ou uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão de acordo com a invenção. A composição pode incluir qualquer uma das alterações biologicamente ativas, fragmentos, variantes e derivados aqui descritos. As composições podem incluir pelo menos um inibidor celular (por exemplo, como uma fusão ou conjugado) e podem ser formuladas, por exemplo, como composições farmacêuticas, em particular composições de vacina.

[0018] A invenção também apresenta uma composição da inven ção como parte de um kit para atingir e/ou inibir células microbianas, especialmente células metanogênicas, de acordo com os métodos descritos. O kit compreende: a) pelo menos uma composição como descrita aqui e b) opcionalmente, instruções para o uso, por exemplo no direcionamento para células ou na inibição do crescimento celular ou replicação de metanogênicos ou outros micróbios.

[0019] A invenção também apresenta um métodos de produção de um peptídeo ou o polipeptídeo, por exemplo, de pelo menos qualquer um dos fragmentos de SEQ ID NO:1-702, o método compreendendo: a) cultivar um vetor de expressão ou célula hospedeira que compreenda um vetor de expressão, que compreende pelo menos parte de uma sequência codificadora para pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo sob condições adequadas para a expressão do peptídeo ou polipeptí- deo; e b) recuperar o peptídeo ou polipeptídeo da cultura. Em aspectos particulares, o peptídeo ou polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou sequências modificadas do mesmo.

[0020] A invenção também apresenta um método para a produção de um anticorpo, por exemplo, direcionado a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702, o método compreendendo: a) cultivar um vetor de expressão ou uma célula hospedeira que compreenda um vetor de expressão, que compreende pelo menos uma sequência codificadora para pelo menos um anticorpo ou o fragmento de anticorpo sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou fragmento de anticorpo; e b) recuperar a sequência de aminoácido da cultura. Em aspectos particulares, o anticorpo ou fragmento de anticorpoé direcionado para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou sequências modificadas dos mesmos. Em um aspecto alternativo, o anticorpo é produzido pela administração a um animal hospedeiro, como descrito aqui em detalhes.

[0021] A invenção apresenta adicionalmente um método para a produção de um anticorpo, por exemplo, direcionado a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702, que compreende uma fusão ou um conjugado com pelo menos um inibidor celular. Tal método compreende: a) cultivar um vetor de expressão ou célula hospedeira que compreenda um vetor de expressão, que compreende pelo menos uma sequência codificadora para pelo menos um anticorpo ou um fragmento de anticorpo sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou do fragmento de anticorpo; b) formar uma fusão ou conjugado com o anticorpo ou o fragmento de anticorpo (por exemplo, pela expressão da sequência fundida ou conjugação química ao inibidor celular); e c) recuperar a fusão ou o conjugado.

[0022] Em aspectos particulares, o anticorpo é direcionado a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702 ou sequências modificadas das mesmas. Em aspectos adicionais, o inibidor é selecionado a partir de compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, peptídeos antimicrobianos e outros antibióticos como descritos aqui em detalhes. Em um aspecto alternativo, o anticorpo é produzido pela administração a um animal hospedeiro e depois conjugado como descrito aqui em detalhes.

[0023] Além disso, a invenção apresenta um método de inibição (por exemplo, inibição do crescimento ou da replicação) de uma célula microbiana, em particular, uma célula metanogênica compreendendo: contatar a célula com um anticorpo ou fragmento de anticorpo, por exemplo, direcionado a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702 ou fusão ou conjugado de anticorpo ou qualquer anticorpo modificado.

[0024] Em outro método, a célula é inibida pela administração de uma composição de vacina como descrito aqui em detalhes.

[0025] A invenção ainda apresenta um método para a inibição (por exemplo, inibição do crescimento ou da replicação) de uma célula microbiana, em particular, uma célula metanogênica compreendendo: a) produzir ou isolar, opcionalmente, pelo menos um anticorpo aqui des- crito; e b) contatar a célula com o anticorpo. Em um aspecto particular, o anticorpo é direcionado a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702 ou sequências modificadas das mesmas. Em certos aspectos, o anticorpo compreende ainda pelo menos um inibidor celular, acoplado, por exemplo, como uma fusão ou conjugado. Em outros aspectos, o anticorpo é administrado a um indivíduo como uma composição, por exemplo uma composição de vacina.

[0026] Além disso, a invenção ainda apresenta um método para a inibição (por exemplo, inibição do crescimento ou da replica- ção) de uma célula microbiana, em particular, uma célula metano- gênica compreendendo: a) produzir ou isolar, opcionalmente, pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo como descrito aqui; e b) administrar o peptídeo ou polipeptídeo a um indivíduo para induzir uma resposta imune a isso. Em um aspecto particular, o peptídeo ou polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou sequências modificadas das mesmas. Em outros aspectos, o peptídeo ou polipeptí- deo é administrado a um indivíduo como uma composição, por exemplo, uma composição de vacina.

[0027] A invenção apresenta posteriormente um método de detec ção e/ou de medição dos níveis de um polipeptídeo, em particular um polipeptídeo da superfície celular, ou peptídeos ou polinucleotídeos correspondentes, compreendendo: 1) contatar uma amostra de um indivíduo com um anticorpo direcionado para o polipeptídeo (por exemplo, pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO:1-702 ou uma sequência modificada das mesmas) ou um peptídeo ou polinucleotídeo correspondentes (por exemplo, pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO: 703-1395 ou uma sequência modificada das mesmas); e 2) determinar a presença ou os níveis do complexo de anticorpo formado com o polipeptídeo, peptídeo ou polinucleotídeo correspondentes na amostra. Tais métodos podem ser usados também para detectar e/ou medir os níveis de uma célula microbiana, em particular uma célula metanogênica.

[0028] A invenção também apresenta um método de detecção e/ou de medição dos níveis de um polinucleotídeo, em particular um polinucleotídeo que codifique um componente da superfície celular compreendendo: 1) contatar uma amostra do indivíduo com um poli- nucleotídeo complementar (por exemplo, uma sequência complementar a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO: 7031395 ou uma sequência modificada das mesmas); e 2) determinar a presença ou os níveis do complexo de hibridização formado com o po- linucleotídeo na amostra. Tais métodos também podem ser usados para detectar e/ou medir os níveis de uma célula microbiana, em particular uma célula metanogênica.

[0029] A invenção também apresenta um método de detecção e/ou de medição dos níveis de um polinucleotídeo, em particular um polinucleotídeo que codifique um componente da superfície celular compreendendo: 1) contatar uma amostra do indivíduo com um poli- nucleotídeo complementar (por exemplo, uma sequência complementar a pelo menos um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO: 7031373 ou sequências modificadas das mesmas); e 2) determinar a presença ou os níveis do complexo de hibridização formado com o poli- nucleotídeo na amostra. Tais métodos também podem ser usados para detectar e/ou medir os níveis de uma célula microbiana, em particular uma célula metanogênica.

[0030] Em aspectos particulares, os métodos da invenção utilizam a expressão de componentes in vivo ou in vitro. Em outros aspectos, os métodos empregam peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos ou anticorpos produzidos por meios recombinantes, sintéticos ou semis- sintéticos ou por meios endógenos.

[0031] Outros aspectos e modalidades da invenção são como descritos abaixo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

[0032] Essa invenção é descrita com relação às suas modalidades específicas e com relação às figuras.

[0033] Figuras 1A-1C: Comparação de genomas de Metanobacté- rias (figura 1A); estatísticas do genoma de M. ruminantium (figura 1B); Genes preditos estarem envolvidos na metanogênese em espécies de Metanobactérias (figura 1C).

[0034] Figura 2 Protocolo de vacinação.

[0035] Figura 3 Respostas de anticorpo de ovelha a vacinação com uma preparação de parede celular de M. ruminantium e peptídeos designados contra M. ruminantium mtr e proteínas da superfície celular.

[0036] Figura 4 Sequências de peptídeo usadas para a produção de anticorpos.

[0037] Figura 5A-5B ORFs selecionadas para a produção de anti corpo: Sequências de nucleotídeos (figura 5A); Sequências de amino- ácidos (Figura 5B).

[0038] Figura 6A-6C ORFs que codificam as enzimas da via de metanogênese identificada em M. ruminantium: Anotação (figura 6A); Sequências de nucleotídeos (Figura 6B); Sequências de aminoácidos (figura 6C).

[0039] Figuras 7 A-7C ORFs das proteínas da superfície celular identificadas de M. ruminantium: Anotação (figura 7A); Sequências de nucleotídeos (figura 7B); Sequências de aminoácidos (figura 7C).

[0040] Figuras 8A-8C ORFs que codificam a biossíntese de exopo- lissacarídeos identificados de M. ruminantium: Anotação (figura 8A); Sequências de nucleotídeos (figura 8B); Sequências de aminoácidos (figura 8C).

[0041] Figuras 9A-9C ORFs que compreendem os domínios abrangentes de membrana identificados de M. ruminantium:Anotação (figura 9A); Sequências de nucleotídeos (figura 9B); Sequências de aminoácidos (figura 9C).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0042] A expressão "anticorpo" deve ser compreendida no seu sentido mais amplo possível e pretende incluir anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais intactos. Também pretende cobrir fragmentos e derivados de anticorpos desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Anticorpos abrangem moléculas de imunoglobulinas e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulinas (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente (imunorreage com) a um antígeno. Esses incluem, mas não são limitados a fragmentos policlonal, monoclonal, quimérico, cadeia simples, Fc, Fab, Fab'e Fab2 e uma biblioteca de expressão de Fab.

[0043] Moléculas de anticorpo referem-se a qualquer uma das classes de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem uma da outra pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Essas também incluem subclasses, tais como IgG1, IgG2 e outras. A cadeia leve pode ser uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda. A referência a anticorpos aqui inclui uma referência a todas as classes, subclasses e tipos. Também estão incluídos os anticorpos quiméricos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos que são específicos para mais do que uma fonte, por exemplo, uma ou mais sequências de camundongo, humano ou ruminante. Estão adicionalmente incluídos os anticorpos de camelídio ou nanocorpos. Será compreendido que cada referência a "anticorpos" ou qualquer expressão semelhante in- clui aqui anticorpos intactos, assim como quaisquer fragmentos, alterações, derivados ou variantes dos mesmos.

[0044] Sequências de ácido nucleico "alteradas" que codificam peptídeos, polipeptídeos ou anticorpos, como usado aqui, incluem aquelas com deleções, inserções ou substituições de diferentes nucle- otídeos que resultam em um polinucleotídeo que codifica a mesma sequência ou uma funcionalmente equivalente. O peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo codificados também podem ser "alterados" e conter dele- ções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma sequência funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, desde que a atividade biológica (por exemplo, associação à célula,associação à membrana) ou a atividade imunogênica/imunológica sejam retidas. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados podem incluir ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados podem incluir lisina e arginina; e aminoácidos com grupos polares não-carregados que têm valores de hidrofilicidade similares podem incluir leucina, isoleucina e valina, glicina e alanina, asparagina e glutamina, serina e treonina e fenilalanina e tirosina.

[0045] "Sequência de aminoácidos", como usada aqui, refere-se a uma sequência de um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína ou anticorpo, ou qualquer fragmento dos mesmos e a quaisquer moléculas que ocorrem naturalmente, recombinantes, sintéticas ou semis- sintéticas. As sequências da invenção compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 aminoácidos, preferivelmente pelo menos 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200, ou 200 a 250 aminoácidos. As sequênciasmantêm a atividade biológica (por exemplo, efeito sobre o cresci- mento e/ou proliferação celular) ou a atividade imunogêni- ca/imunológica da sequência de aminoácidos. "Sequência de aminoá- cidos" ou expressões similares não estão limitadas a sequência de aminoácidos completa, nativa associada com a molécula de extensão completa, mas incluem também quaisquer fragmentos, alterações, derivados ou variantes dos mesmos.

[0046] "Amplificação", como usada aqui, refere-se à produção de cópias adicionais de uma sequência de ácido nucleico e é geralmente realizada usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), tecnologia bem conhecida na técnica (Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

[0047] As expressões "biologicamente ativo" ou "funcional", como usadas aqui, referem-se a um peptídeo ou polipeptídeo que retém uma ou mais funções estrutural, imunogênica ou bioquímica (por exemplo, associação a célula, associação à membrana) de uma sequência que ocorre naturalmente.

[0048] As expressões "inibidor celular" ou "inibidor", como usadas aqui, referem-se a agentes que diminuem ou bloqueiam o crescimento ou a replicação de células microbianas, especialmente células meta- nogênicas. Um inibidor celular pode atuar diminuindo ou bloqueando, por exemplo, a divisão celular. Um inibidor pode diminuir ou bloquear, por exemplo, a síntese de DNA, a síntese de RNA, a síntese de proteína ou as modificações pós-traducionais. Um inibidor também pode diminuir ou bloquear a atividade de enzimas envolvidas na via da me- tanogênese. Um inibidor também pode direcionar uma célula para o reconhecimento por componentes do sistema imune. A inibição de uma célula inclui a destruição celular e a morte celular, por exemplo, por lise, apoptose, necrose, etc. Inibidores úteis incluem, mas não são limitados a compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoe- tanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, peptídeos antimicrobianos e outros antibióticos como descrito aqui em detalhes.

[0049] As expressões "complementares" ou "complementaridade", como usadas aqui, referem-se à ligação natural de polinucleotídeos sob condições permissivas de sal e temperatura pelo pareamento de base. Para a sequência A-G-T, a sequência complementar é T-C-A, o complemento reverso é A-C-T e a sequência reversa é T-G-A. A complementaridade entre duas moléculas de fita simples pode ser parcial, na qual apenas alguns dos ácidos nucleicos se ligam ou ela pode ser completa quando existe complementaridade total entre as moléculas de fita simples. O grau de complementaridade entre fitas de ácido nu- cleico tem efeitos significativos sobre a eficiência e a força de hibridi- zação entre fitas de ácido nucleico. Isso é de particular importância em reações de amplificação, que dependem da ligação entre fitas de ácido nucleico e no planejamento e uso de moléculas de PNA.

[0050] A expressão "derivado", como usada aqui, refere-se à mo dificação química de um ácido nucleico que codifica um peptídeo, poli- peptídeo ou anticorpo ou um ácido nucleico complementar a isso. Tais modificações incluem, por exemplo, a substituição de hidrogênio por um grupo alquila, acila ou amino. Em aspectos preferidos, um derivado de ácido nucleico codifica um peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo que retém a atividade biológica ou a atividade imunogênica/imunológica da molécula natural. Um derivado de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo é aquele que é modificado por glicosilação, peguilação ou qualquer processo similar que retenha uma ou mais funções biológicas (por exemplo, associação a célula, associação à membrana) ou a atividade imunogênica/imunológica da sequência da qual é derivado.

[0051] A expressão "homologia", como usada aqui, refere-se ao grau de complementaridade. Pode haver homologia parcial (isto é, menos do que 100% de identidade) ou homologia completa (isto é, 100% de identidade) Uma sequência parcialmente complementar que inibe pelo menos parcialmente a hibridização uma sequência idêntica a um ácido nucleico-alvo é referida usando a expressão funcional "substancialmente homóloga". A inibição da hibridização da sequência totalmente complementar à sequência-alvo pode ser examinada usando um ensaio de hibridização (por exemplo, Southern ou Northern blot, solução de hibridização e similares) sob condições de baixa estringên- cia. Uma sequência substancialmente homóloga ou sonda de hibridi- zação competirá e inibirá a ligação de uma sequência totalmente complementarà sequência-alvo sob condições de baixa estringência. Isso não quer dizer que condições de baixa estringência são aquelas em que a ligação não específica é permitida; as condições de baixa es- tringência requerem que a ligação de duas sequências uma com a ou-tra tenha uma interação específica (isto é, seletiva).

[0052] A expressão "hibridização", como usada aqui, refere-se a qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se liga a uma fita complementar através do pareamento de bases.

[0053] Uma "inserção"ou "adição", como usada aqui, refere-se a uma alteração em uma sequência aminoácido ou de nucleotídeo que resulta na adição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou nucleotí- deos, respectivamente, quando comparada com a molécula que ocorre naturalmente.

[0054] Um "metanogênico", como usado aqui, refere-se a micró bios que produzem gás metano, o que inclui Methanobrevibacter, Me- thanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, e Metha- nosarcina. Metanogênicos específicos incluem, mas não são limitados a Methanobrevibacter ruminantium (isto é, cepa M1 ou cepa DSM1093), Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididu- rans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Metha- nobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Metha- nothermobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicro- bium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Metha- nococcoides burtonii, e Methanolobus taylorii. Todos os gêneros e espécies de metanogênicos estão abrangidos por essa expressão.

[0055] Células "microbianas", como usado aqui, refere-se células microbianas que ocorrem naturalmente ou geneticamente modificadas, que incluem arquibactérias tais como metanogênicos, halófilos, e ter- moacidófilos e eubactérias, tais como cianobactérias, espiroquetas, proteobactérias, assim como bactérias Gram-positivas e Gram- negativas.

[0056] A expressão "modificado" refere-se a sequências alteradas e a fragmentos de sequência, variantes e derivados, como descrito aqui.

[0057] "Sequência de ácido nucleico" ou "sequência de nucleotí- deos", como usado aqui, refere-se a uma sequência de um polinucleo- tídeo, oligonucleotídeo ou fragmentos dos mesmos e a DNA ou RNA de origem natural, recombinante, sintética ou semissintética, que podem ser de fita simples ou dupla e podem representar uma fita senso ou antissenso ou regiões codificadoras ou não-codificadoras. As sequências da invenção, preferivelmente, compreendem pelo menos 12, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 nucleotí- deos, preferivelmente pelo menos 15 a 30, 30 a 60, 60 a 90, 90 a 120, 120 a 150, 150 a 300, 300 a 450, 450 a 600 ou 600 a 750 nucleotídeos ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pelo menos 1500 nucleotídeos. Deverá ser compreendido que cada referência a uma "sequência de ácido nucleico" ou "sequência de nucleotídeo" incluirá, aqui, a sequência nativa, de extensão completa assim como quaisquer complemen-tos, fragmentos, alterações, derivados ou variantes das mesmas.

[0058] A expressão "oligonucleotídeo"refere-se a uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30 ou 36 nucleotídeos ou pelo menos 12 a 36 nucleotídeos ou pelo menos 15 a 30 nucleotídeos, que pode ser usada na amplificação por PCR, sequenciamento ou ensaios de hibridização. Como usado aqui, oligonucleotídeo é substancialmente equivalente às expressões "am- plímeros", "iniciadores", "oligômeros"e "sondas", como comumente definidos na técnica.

[0059] A expressão "polinucleotídeo"quando usada no singular ou no plural, geralmente refere-se a qualquer sequência de ácido nuclei- co, por exemplo, qualquer poliribonucleotídeo ou polidesoxiribonucleo- tídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNA modificado. Isso inclui, sem limitação, DNA de fita simples e dupla, DNA que inclui regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que inclui regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou incluem regiões de fita simples ou dupla. Também estão incluídas regiões de fita tripla que compreen-dem RNA ou DNA ou ambos, RNA e DNA. Estão incluídos especificamente mRNAs, cDNAs e DNAs genômicos e quaisquer fragmentos dos mesmos. A expressão inclui DNAs e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas, tais como bases tritiadas ou bases incomuns, tais como inosina. Os polinucleotídeos da invenção podem abranger sequências codificadoras ou não-codificadoras ou sequências de senso ou antissenso ou iRNAs tais como siRNAs. Deverá ser compreendido que cada referência a um "polinucleotídeo"ou expressão semelhanteincluirá, aqui, as sequências de extensão completa assim como quaisquer complementos, fragmentos, alterações, derivados ou variantes das mesmas.

[0060] Um "peptídeo"e "polipeptídeo", como usados aqui, refe rem-se a peptídeos ou polipeptídeos isolados da invenção obtidos a partir de qualquer espécie, preferivelmente microbiana, a partir de qualquer fonte seja natural, sintética ou semissintética. Especificamente, um peptídeo ou polipeptídeo da invenção podem ser obtidos de célulasmetanogênicas, tais como células de Methanobrevibacter, em particular, células de M. ruminantium ou M. smithii. Para a produção recombinante, um peptídeo ou polipeptídeo da invenção podem ser obtidos de células microbianas ou células eucarióticas, por exemplo, Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, levedura, células de insetos, tais como Drosophila, células de animais tais como células COS ou CHO ou células de planta. Será compreendido que cada referência a um "peptídeo"ou "polipeptídeo", incluirá a sequência de extensão completa, assim como quaisquer fragmentos, alterações, derivados ou variantes dos mesmos.

[0061] "Ácido nucleico peptídico"ou "PNA", como usado aqui refe re-se a uma molécula antissenso ou um agente antigene que compreende bases ligadas através de um arcabouço peptídico.

[0062] A expressão "ruminante", como usada aqui, refere-se a animais que têm um rume como um tipo especial de órgão digestivo. Ruminantes incluem, mas não são limitados a gado, ovelhas, cabras, búfalo, alce, antílope, caribu e veado.

[0063] As expressões "condições estringentes" ou "estringência", como usadas aqui, referem-se a condições para hibridização como definidas pelo ácido nucleico, sal e temperatura. Essas condições são bem conhecidas na técnica e podem ser alteradas a fim de identificar ou detectar sequências de polinucleotídeos idênticas ou relacionadas. Vide, por exemplo, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, e Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Numerosas condições equivalentes que compreendem tanto baixa quanto alta estringência, dependem de fatores tais como extensão e natureza da sequência (DNA, RNA, composição de base), natureza do alvo (DNA, RNA, composição de base), meio (em solução ou imobilizado sobre um substrato sólido), concentração de sais ou outros componentes (por exemplo, formamida, sulfato de dextran e/ou polietileno glicol) e temperatura das reações (por exemplo, dentro de uma faixa entre cerca de 5°C abaixo da temperatura de fusão da sonda até cerca de 20°C a 25°C abaixo da temperatura de fusão). Um ou mais fatores podem ser variados para gerar condições tanto de baixa quanto de alta estringência diferentes, mas equivalentes às condições listadas acima.

[0064] A expressão "indivíduo"inclui humanos e animais não- humanos. Animais não-humanos incluem, mas não são limitados a pássaros e mamíferos, tais como ruminantes e, em particular, camundongos, coelhos, gatos, cães, porcos, ovelhas, cabras, vacas e cavalos.

[0065] As expressões "substancialmente purificado" ou "isolado" como usadas aqui, referem-se a sequências de ácido nucleico ou ami- noácidos que são removidos de seu ambiente celular, recombinante ou sintético, e são pelo menos 60%, preferivelmente 75% e o mais preferivelmente pelo menos 90% ou pelo menos 99% livres de outros componentes com os quais eles estão associados em seu ambiente. Polinucleotídeos e polipeptídeos "isolados" foram identificados e separados de pelo menos uma molécula contaminante com a qual eles estão associados em seu estado natural. Consequentemente, será compreendido que polinucleotídeos e polipeptídeos isolados estão em uma forma que difere da forma ou arranjo nos quais eles são encontardos na natureza. Será considerado ainda que "isolado"não reflete necessariamente a extensão exata (por exemplo, uma percentagem específica) na qual a sequência foi purificada.

[0066] "Transformação", como definida aqui, descreve um proces so pelo qual o DNA exógeno entra e altera uma célula receptora. Ela pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode valer-se de qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácido nucleico estranhas em uma célula hospedeira procariótica ou eucarió- tica. O método é selecionado com base no tipo da célula hospedeira a ser transformada e pode incluir, mas não está limitada a infecção viral, eletroporação, choque térmico, lipofecção e bombardeio de partículas. Tais células "transformadas" incluem células estavelmente transformadas nas quais o DNA inserido é capaz de replicação tanto como um plasmídeo replicante autonomicamente quanto como parte do cromossomo hospedeiro. Elas também incluem células que expressam transi-toriamente o DNA ou RNA inseridos por períodos limitados de tempo.

[0067] "Vacinas", como usadas aqui, incluem todos os componen tes e composições que estimulam a resposta imune em um indivíduo. Particularmente úteis nesse contexto são as vacinas de subunidades, incluindo vacinas de peptídeo e também vacinas de vetores, vacinas de ácido nucleico e vacinas comestíveis. As vacinas podem ser usadas para estabelecer ou fortalecer uma resposta imune a um antígeno, particularmente um antígeno microbiano. Em aspectos particulares, as vacinas compreendem antígenos que evocam reações protetoras do hospedeiro, por exemplo, formação de anticorpo, respostas de célula T auxiliar e T. As vacinas também podem compreender anticorpos, por exemplo, para imunização passiva.

[0068] Uma "variante" de um peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo, como usado aqui, refere-se a uma sequência de aminoácidos que está alterada por um ou mais aminoácidos. Uma variante de um polinucleo- tídeo está alterada por um ou mais nucleotídeos. Uma variante pode resultar em alterações "conservativas", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, substituição de leucina por isoleucina. Mais raramente, uma variante pode resultar em alterações "não-conservativas", por exemplo a substituição de glicina por triptofano. Variações análogas menores também podem incluir deleções ou inserções de aminoácidos ou ambas. Uma orientação na determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade biológica ou imunogênica/imunológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o programa LASERGENE (DNASTAR).

[0069] A invenção também abrange variantes que retêm pelo me nos uma atividade biológica (por exemplo, associação a célula, associação a membrana) ou atividade imunogênica/imunológica. Uma variante preferida é aquela que tem substancialmente a mesma ou uma sequência funcionalmente equivalente, por exemplo, que tenha pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência descrita. Uma variante mais preferida é aquela que tem pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 98% de pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência aqui descrita. O percentual de identidade é determinado pelo alinhamento de duas sequências a serem comparadas como descrito abaixo, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo esse número pelo número total de resíduos na sequência inventiva (questionada) e multiplicando o resultado por 100. Um programa de alinhamento útil é AlignX (Vector NTI).

Descrição da Invenção

[0070] O metano é produzido no intestino anterior de ruminantes por metanogênicos que agem redutores terminais de carbono no sistema do rume. A via de metanogênese de múltiplas etapas está bem elucidada, principalmente a partir do estudo de metanógenos de não- ruminantes, mas as adaptações que permitem que os metanogênicos cresçam e persistam no rume não são bem compreendidas. O Metha- nobrevibacter ruminantiumé um metanogênico principal nos ruminantes da Nova Zelândia. Como descrito aqui, o genoma de M. ruminan- tium foi sequenciado e mostrou aproximadamente 3,0 Mb de tamanho com um conteúdo de GC de 33,68%. Todos os componentes da via da metanogênese foram identificados e a comparação dessas sequências de gene com aquelas de Methanobacterium thermoautotrophicum e Methanosphaera stadtmanae indica que a organização do gene da metanogênese está conservada dentro dos Methanobacteriales (figura 1C). O genoma contém proteínas de superfície muito grandes com características que indicam que elas podem mediar a associação com outros micróbios do rume. Em vários aspectos da invenção, os polinu- cleotídeos e polipeptídeos podem ser usados como um meio para a inibição de metanogênicos e/ou da metanogênese no rume e para esclarecer o papel de M. ruminantium na formação de metano. São particularmenteúteis os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos, identificados como componentes envolvidos na metanogênese (FIGS.6A- 6C), como componentes da superfície da célula (FIGS.7A-7C), como componentes envolvidos na biosíntese de exopolissacarídeo (FIGS.8A-8C), como componentes com domínios que transpõem a membrana (FIGS.9A-9C), assim como os polinucleotídeos e polipeptí- deos usados para a produção de anticorpo (FIGS.5A-5B).

Peptídeos, Polipeptídeos e Polinucleotídeos

[0071] A invenção abrange peptídeos e polipeptídeos, incluindo aqueles que compreendem pelo menos uma das SEQ ID NO:1-702 e seus fragmentos, variantes e derivados dos mesmos. Os peptídeos e polipeptídeos da presente invenção podem ser expressos e usados em vários ensaios para determinar sua atividade biológica. Os peptí- deos e polipeptídeos podem ser usados para a síntese em grande escala e protocolos de isolamento, por exemplo, para produção comercial. Tais peptídeos e polipeptídeos podem ser usados para fazer surgir anticorpos, para isolar sequências de aminoácidos correspondentes e para determinar quantitativamente os níveis das sequências de ami- noácidos. Os peptídeos e polipeptídeos podem ser usados como vacinas para atingir e inibir células microbianas, especialmente células me- tanogênicas. Os peptídeos e polipeptídeos também podem ser usados para preparar anticorpos para inibir o crescimento ou a replicação de tais células. Os peptídeos e polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados como composições, por exemplo, composições farmacêuticas, especialmente como composições de vacina. Em aspectos particulares, dispositivos ruminais de liberação lenta podem ser usados em conjunto com os peptídeos, polipeptídeos, anticorpos e composições (por exemplo, composições farmacêuticas, especialmen-tecomposições de vacina) da invenção.

[0072] Os peptídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) pep- tídeos que compreendem pelo menos um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou seus fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos; (b) peptídeos que compreendem um domínio funcional de pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou seus fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos; e (c) peptídeos que compreendem pelo menos um número especificado de resíduos contíguos de pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou suas variantes ou derivados das mesmas. Em uma modalidade, a invenção abrange um peptídeo isolado que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO:1-9. Todas essas sequências estão coletivamente referidas aqui como peptídeos da invenção.

[0073] Os polipeptídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) po- lipeptídeos que compreendem pelo menos uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou seus fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos; (b) polipeptí- deos que compreendem um domínio funcional de pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou seus fragmentos e variantes dos mesmos; e (c) poli- peptídeos que compreendem pelo menos um número especificado de resíduos contíguos de pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702, ou suas variantes ou derivados da mesma. Em uma modalidade, a invenção abrange um polipeptídeo isolado que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NO:1-9. Todas essas sequências estão coletivamente referidas aqui como peptídeos da invenção.

[0074] A invenção também abrange um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo ou polipeptídeo de SEQ ID NO:1-702. Os polinucleotídeos isolados da presente invenção têm utilidade no mapeamento do genoma, no mapeamento físico e na clonagem de genes de componentes da superfície celular mais ou menos relacionados. As sondas projetadas usando os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença e examinar os padrões de expressão de genes em qualquer organismo que tenha sequências de DNA e RNA suficientemente homólogas em suas células, usando técnicas que são bem conhecidas, tais como técnicas de "slot blot" ou análise de microarranjo. Os iniciadores projetados usando os polinu- cleotídeos da presente invenção podem ser usados para o sequenci- amento e amplificações por PCR. Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para a preparação de vetores de expressão e células hospedeiras para vacinas para atingir e inibir células microbianas, es- pecialmente células metanogênicas. A invenção abrange ainda o uso dos polinucleotídeos para a produção de anticorpos para inibir o crescimento e a replicação de tais células. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser usados como composições, por exemplo, composições farmacêuticas, especialmente composições de vacina. Em aspectos particulares, dispositivos ruminais de liberação lenta podem ser usados em conjunto com os polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras e composições (por exemplo, composições farmacêuticas, especialmentecomposições de vacina) da invenção.

[0075] Os polinucleotídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) sequências que compreendem uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou seus fragmentos ou variantes dos mesmos; (b) complementos, sequências reversas e complementos reversos de uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou seus fragmentos ou variantes dos mesmos; (c) fases de leitura abertas contidas na sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou seus fragmentos ou variantes; (d) domínios funcionais de uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou fragmentos ou variantes; e (e) sequências que compreendem pelo menos um número de resíduos contíguos especificados de uma sequência codificadora para pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-702 ou suas variantes das mesmas; e (f) sequências que compreendem pelo menos um número de resíduos contíguos especificados de qualquer uma das SEQ ID NO:703-1395. Sondas e iniciadores de oligonu- cleotídeo e suas variantes também são fornecidos. Todos esses poli- nucleotídeos e sondas e iniciadores de oligonucleotídeo são coletivamente referidos aqui como polinucleotídeos da invenção.

[0076] Será considerado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degeneração do código genético, uma multiplicidade de sequências de nucleotídeos que codificam os peptídeos ou poli- peptídeos da invenção, alguns guardando homologia mínima com as sequências de nucleotídeos de qualquer gene conhecido ou de ocorrência natural, pode ser produzida. Portanto, a invenção considera cada uma e todas as variações possíveis de sequência de nucleotídeos que podem ser feitas pelas combinações selecionadas baseadas nas escolhas de códon possíveis. Essas combinações são feitas de acordo com o código genético triplo padronizado, como aplicado a sequências de aminoácidos que ocorrem naturalmente e todas tais variações devem ser consideradas como sendo especificamente descritas.

[0077] As sequências de nucleotídeos que codificam os peptídeos ou polipeptídeos ou seus fragmentos ou variantes, são preferivelmente capazes de hibridizar com a sequência de nucleotídeos da sequência que ocorre naturalmente sob condições apropriadamente selecionadas de peptídeo ou estringência. Entretanto, pode ser vantajoso produzir sequências de nucleotídeos que codificam um peptídeo ou polipeptí- deo ou seu fragmento ou derivado, que possua uma utilização de có- don substancialmente diferente. Os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa na qual a expressão do peptídeo ou polipeptídeo ocorre em um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular, de acordo com a frequência na qual os códons em particular são utilizados pelo hospedeiro. Outras razões para alterar substancialmente a sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou polipeptídeo ou seu derivado sem alterar as sequências de aminoácidos codificadas incluem a produção de transcritos de RNA que têm propriedades mais desejáveis, tais como uma meia-vida maior do que os transcritos produzidos a partir da sequência que ocorre naturalmente.

[0078] A invenção também abrange a produção de sequências de DNA ou seus fragmentos do mesmo, que codificam os peptídeos ou polipeptídeos ou seus fragmentos ou variantes, totalmente pela sínte-sequímica. Depois da produção, a sequência sintética pode ser inserida em qualquer um de vários vetores de expressão disponíveis e sistemas celulares que usam reagentes bem conhecidos na técnica. Além disso, a química sintética pode ser usada para introduzir mutações na sequência que codifica um peptídeo ou polipeptídeo ou quaisquer variantes ou fragmentos dos mesmos. Também são abrangidas pela invenção as sequências de polinucleotídeos que são capazes de hibridizar com as sequências de nucleotídeos reivindicadas e, em particular, com aquelas mostradas nas SEQ ID NO:703-1395, sob várias condições de estringência como as preconizadas em Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) e Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

[0079] Os métodos para o sequenciamento de DNA são bem co nhecidos e comumente disponíveis na técnica e podem ser usados para praticar qualquer uma das modalidades da invenção. Os métodos podem empregar enzimas tais como o fragmento de Klenow da DNA polimerase I, SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq polimerase (Perkin Elmer), T7 polimerase termoestável da Amers- ham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), ou combinações de polime- rases e exonucleases corrigidas tais como aquelas encontradas no ELONGASE Amplification System comercializado por Life Technologies (Gaithersburg, MD). Preferivelmente, o processo é automatizado com instrumentos tais como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA), ABI Catalyst e 373 e 377 DNA Sequencers (Perkin Elmer), ou o Genome Sequencer 20® (Roche Diagnostics).

[0080] As sequências de ácido nucleico que codificam os peptí- deos ou polipeptídeos podem ser estendidas utilizando uma sequência de nucleotídeos parcial e empregando vários métodos conhecidos na técnica para detectar sequências à montante tais como promotores e elementos regulatórios. Por exemplo, um método que pode ser empregado, PCR com "sítio de restrição", usa iniciadores universais para reposicionar uma sequência adjacente desconhecida em um lócus conhecido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). Em particular, o DNA genômico é amplificado primeiro na presença de um iniciador a uma sequência ligante e a um iniciador específico para a região conhecida. As sequências amplificadas são submetidas depois a uma segunda rodada de PCR com o mesmo iniciador ligante e outro iniciador interno específico para o primeiro. Os produtos de cada rodada de PCR são transcritos com uma RNA polimerase apropriada e se- quenciados usando a transcriptase reversa.

[0081] Os sistemas de eletroforese capilar que estão comercial mentedisponíveis podem ser usados para analisar o tamanho e confirmar a sequência de nucleotídeos do sequenciamento ou dos produtos de PCR. Em particular, o sequenciamento capilar pode empregar polímeros flutuantes para separação eletroforética, quatro corantes fluorescentes diferentes (um para cada nucleotídeo) que são ativados por laser e a detecção dos comprimentos de onda emitidos por uma câmera com um dispositivo de carga acoplado. A intensidade da emis- são/luz pode ser convertida para um sinal elétrico usando um programa apropriado (por exemplo, GENOTYPER e Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) e o processo completo de carregamento de amostras para análise por computador e apresentação eletrônica de dados pode ser controlado por computador. A eletroforese capilar é especialmente preferível para o sequenciamento de pequenos pedaços de DNA que podem estar presentes em quantidades limitadas em uma amostra em particular.

[0082] Em outras modalidades da invenção, os polinucleotídeos ou fragmentos dos mesmos que codificam peptídeos ou polipeptídeos podem ser usados em moléculas de DNA recombinante para direcionar a expressão dos peptídeos ou polipeptídeos ou seus fragmentos ou variantes dos mesmos, em células hospedeiras apropriadas. Devido a degeneração inerente do código genético, outras sequências de DNA que codificam substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente podem ser produzidas e essassequências podem ser usadas para clonar e expressar peptídeos ou polipeptídeos. As sequencias de nucleotídeos da presente invenção podem ser manipuladas usando métodos comumente conhecidos na técnica a fim de alterar as sequências que codificam os aminoácidos por uma variedade de razões, incluindo, mas não limitadas a alterações que modificam a clonagem, o processamento e/ou a expressão do produto de gene. O embaralhamento de DNA por fragmentação aleatória e reunião por PCR de fragmentos de gene e oligonucleotí- deos sintéticos podem ser usados para manipular as sequências de nucleotídeos. Por exemplo, a mutagênese direcionada ao sítio pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de gli- cosilação, alterar a preferência de códon, introduzir mutações e etc.

[0083] Em uma modalidade da invenção, sequências de ácido nu- cleico naturais, modificadas ou recombinantes que codificam peptí- deos ou polipeptídeos podem ser ligadas a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, pode ser útil codificar uma sequência quimérica que pode ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser manipulada para conter um sítio de clivagem localizado entre o peptídeo ou polipeptídeo da invenção e a sequência de proteína hete- róloga, tal que o peptídeo ou polipeptídeo possa ser clivado e purificado a partir da porção heteróloga.

[0084] Em outra modalidade, as sequências que codificam os pep- tídeos ou polipeptídeos podem ser sintetizadas, no todo ou em parte, usando métodos químicos conhecidos na técnica (vide Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). Alternativamente, o própriopolipeptídeo pode ser produzido usando métodos químicos que sintetizam a sequência de aminoácidos ou seu fragmento. Por exemplo, a síntese de polipeptídeos pode ser realizada usando várias técnicas em fase sólida (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) e a síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Vários fragmentos de peptídeos ou poli- peptídeos podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos para produzir a molécula de extensão completa.

[0085] O peptídeo ou polipeptídeo recém-sintetizado pode ser iso lado por cromatografia líquida de alto desempenho preparatório (por exemplo, Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY). A composição dos pep- tídeos ou polipeptídeos sintéticos pode ser confirmada pela análise dos aminoácidos ou sequenciamento (por exemplo, procedimento de degradação de Edman; Creighton, supra). Adicionalmente, a sequência de aminoácidos do peptídeo ou polipeptídeo ou qualquer parte da mesma pode ser alterada durante a síntese direta e/ou combinada usando métodos químicos com sequências de outras proteínas ou qualquer parte da mesma, para produzir uma molécula variante.

[0086] A fim de expressar peptídeos ou polipeptídeos biologica mente ativos, as sequências de nucleotídeos que codificam as se- quências ou os equivalentes funcionais podem ser inseridas em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementosnecessários para a transcrição e tradução da sequência codificadora inserida. Métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências que codificam o peptídeo ou polipeptídeo e elementos de controle transcricional e traducional apropriados. Esses métodos incluem as técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e a recombinação genética in vivo. Tais técnicas estão descritas em Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY.

[0087] Uma variedade de vetores de expressão/sistemas de hos pedeiros pode ser utilizada para conter e expressar as sequências que codificam os peptídeos ou polipeptídeos da invenção. Esses incluem, mas não são limitados a microorganismos tais como bactérias transformadas com fago recombinante, plasmídeo ou vetores de expressão de cosmídeo de DNA; levedura transformada com vetores de expressão em levedura; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão virais (por exemplo, baculovírus); sistemas de células de planta transformadas com vetores de expressão virais (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV); ou sistemas de células de animal. Para bactérias, os plasmídeos úteis incluem pET, pRSET, pTrcHis2 e pBAD da Invitro- gen, plasmídeos pET e pCDF da Novagen e os plasmídeos Director® da Sigma-Aldrich. Para os metanogênicos, os plasmídeos úteis incluem, mas não se limitam a pME2001, pMV15 e pMP1. Essa invenção não está limitada pelo vetor de expressão ou célula hospedeira empregados.

[0088] Os "elementos de controle" ou "sequências regulatórias" são aquelas regiões não traduzidas do vetor -intensificadores, promo-tores,regiões 5' e 3'não traduzidas - que interagem com as proteínas da célula hospedeira para realizar a transcrição e a tradução. Tais elementos podem variar em sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, pode ser usado. Por exemplo, quando clonar em sistemas bacterianos, os promotores induzíveis tais como o promotor híbrido lacZ do fagomídeo BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, CA) ou o plas- mídeo pSPORT1 (Life Technologies) e similares podem ser usados. O promotor de poliedrina de baculovírus pode ser usado em células de inseto. Promotores ou intensificadores derivados de genomas de células de planta (por exemplo, choque térmico, RUBISCO e genes de armazenamento de proteína) ou de vírus de planta (por exemplo, promotores virais ou sequências-líder) podem ser clonados no vetor.

[0089] Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão po dem ser selecionados dependendo do uso pretendido para o peptídeo ou polipeptídeo. Por exemplo, quando grandes quantidades de peptí- deo ou polipeptídeo são necessárias, vetores que dirigem um alto nível de expressão de proteínas de fusão que são prontamente purificados podem ser usados. Tais vetores incluem, mas não são limitados aos vetores de clonagem e expressão multifuncionais em E.coli, tais como BLUESCRIPT (Stratagene), nos quais a sequência que codifica um polipeptídeo pode ser ligada ao vetor "in-frame" com sequências para Meta amino-terminal e os 7 resíduos subsequentes de β- galactosidase, tal que um híbrido de proteína é produzido; vetores pIN (Van Heeke G. e S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); e similares.

[0090] Os vetores pGEX (Promega, Madison, WI) também podem ser usados para expressar peptídeos ou polipeptídeos como proteínas de fusão e podem ser facilmente purificados a partir de células lisadas pela adsorção a esferas de glutationa-agarose seguida pela eluição na presença de glutationa livre. As proteínas feitas em tais sistemas podem ser planejadas para incluir heparina, trombina ou sítios de clivagem da protease Xa tal que o peptídeo ou polipeptídeo clonados de interesse podem ser liberados a partir da porção GST à vontade. Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, vários vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH podem ser usados. Para revisão, vide Ausubel et al. (supra) e Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

[0091] Sinais específicos de iniciação também podem ser usados para obter uma tradução mais eficiente das sequências que codificam os peptídeos ou polipeptídeos da invenção. Tais sinais incluem o có- don de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos onde as sequências codificam um peptídeo ou polipeptídeo, seu códon de iniciação e as sequências à montante são inseridos no vetor de expressão apropriado e sinais adicionais transcricionais ou traducionais podemnão ser necessários. Entretanto, nos casos onde apenas a sequência codificadora ou seu fragmento é inserida, sinais de controle da tradução exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser fornecidos.Além disso, o códon de iniciação deve estar na fase de leitura correta para assegurar a tradução do inserto completo. Elementos tra- ducionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode ser aperfeiçoada pela inclusão de intensificadores que são apropriados para o sistema celular que é usado em particular, tais como aqueles descritos na literatura (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).

[0092] Além disso, uma linhagem de célula hospedeira pode ser escolhida por sua habilidade para modular a expressão das sequências inseridas ou para processar o peptídeo ou polipeptídeo expresso da forma desejada. Tais modificações da sequência incluem, mas não são limitadas a acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipi- dação e acilação. O processamento pós-traducional que cliva uma forma "prepro" do peptídeo ou polipeptídeo também pode ser usado para facilitar a inserção, enovelamento e/ou função corretos. Células hospedeiras diferentes que possuem um maquinário celular específico e mecanismos característicos para atividades pós-traducionais são disponibilizadas pela American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) e podem ser escolhidas para garantir a modificação e o processamento corretos da sequência. Células hospedeiras específicas incluem, mas não são limitadas a células metanogênicas tais como células de Methanobrevibacter, em particular, M. ruminantium, ou células de M. smithii. Células hospedeiras de interesse incluem, por exemplo, Rhodotorula, Aureobasidium, Saccharomyces, Sporobo- lomyces, Pseudomonas, Erwinia e Flavobacterium; ou outros organismos tais como Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Streptomyces, e similares. Células hospedeiras específicas incluem Escherichia coli, que é particularmente adequada para uso com a presente invenção, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, e similares.

[0093] Existem várias técnicas para a introdução de ácidos nuclei- cos em células eucarióticas cultivadas in vitro. Essas incluem métodos químicos (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992); and Farhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994)), uso de protoplastos (Bothwell, supra) ou pulsos elé- tricos (Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al., supra; and Ausubel et al., supra), uso de vírus atenuados (Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); and Bothwell et al., supra), assim como métodos físicos (Fynan et al., Int J Immunophar- macol. 1995 Feb;17(2):79-83; Johnston et al., Meth. Cell Biol., 43(Pt A):353 365 (1994); Bothwell et al., supra; and Ausubel et al., supra).

[0094] A liberação bem sucedida de ácidos nucleicos em um teci do animal pode ser obtida com lipossomas catiônicos ((Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)), injeção direta de DNA nu ou RNA no tecido muscular do indivíduo (Robinson et al., Vacc., 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 13971400), e embriões (Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); and Burdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)), injeção intramuscular de vacinas autorreplicantes de RNA (Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617) ou injeção intradérmica de DNA usando a tecnologia de "gene gun" (Johnston et al., supra).

[0095] Uma variedade de protocolos para a detecção e medida da expressão dos peptídeos e polipeptídeos da invenção, usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para proteína são conhecidos na técnica. Exemplos incluem o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radio-imunoensaio (RIA) e seleção celular ativada por fluorescência (FACS). Um imunoensaio em dois sítios baseado em anticorpo monoclonal pode ser usado com anticorpos monoclonais re- ativos para dois epítopos não-interferentes sobre o peptídeo ou poli- peptídeo, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser usado. Esses e outros ensaios estão descritos, entre outros lugares, em Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory manual, APS Press, St. Paul, MN) e Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).

[0096] Uma grande variedade de marcadores e técnicas de conju gação é conhecida por aqueles versados na técnica e pode ser usada em vários ensaios com ácido nucleico e aminoácidos. Meios para a produção de sondas de hibridização ou de PCR marcadas para a detecção de sequencias relacionadas a polinucleotídeos incluem a marcação de oligos, nick translation, marcação terminal ou amplificação por PCR usando um nucleotídeo marcado. Alternativamente, as sequências que codificam os peptídeos ou polipeptídeos ou quaisquer fragmentos ou variantes dos mesmos, podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro pela adição de uma RNA polimerase apropriada, tal como T7, T3 ou SP6 e nucleotídeos marcados. Esses procedimentos podem ser conduzidos usando uma variedade de kits comercialmente disponibilizados por Amersham Pharma- cia Biotech, Promega e US Biochemical. Moléculas ou marcadores repórteres adequados, que podem ser usados para facilitar a detecção, incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiolumi- nescentes ou cromogênicos assim como substratos, cofatores, inibido-res,partículas magnéticas e similares.

[0097] Vetores de expressão ou células hospedeiras transforma das com vetores de expressão podem ser cultivados sob condições adequadas para a expressão e recuperação do peptídeo ou polipeptí- deo da cultura. A cultura pode compreender componentes para a ex- pressão in vitro ou in vivo. Os componentes para expressão in vitro incluem aqueles de lisados de reticulócitos de coelho, lisados de E. coli e extratos de germe de trigo, por exemplo, sistemas Expressway® ou RiPs da Invitrogen, sistemas Genelator® da iNtRON Biotechnology, sistemas EcoPro® ou STP3® da Novagen, sistemas TNT®Quick Coupled da Promega e sistemas EasyXpress da Qiagen. O peptídeo ou polipeptídeo produzido a partir da cultura podem ser secretados ou contidos intracelularmente dependendo da sequência e/ou vetor usados. Em aspectos particulares, os vetores de expressão que codificam peptídeo ou polipeptídeo podem ser projetados para conter sequências de sinal que direcionam a secreção do peptídeo ou polipeptídeo através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica.

[0098] Outras construções podem incluir um domínio de aminoáci- do que facilitará a purificação do peptídeo ou polipeptídeo. tais domínios incluem, mas não são limitados a domínios de quelação de metal tais como módulos de histidina-triptofano (por exemplo, 6X-HIS (SEQ ID NO:1396)) que permitem a purificação sobre metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobu- lina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação por ex- tensão/afinidade FLAG® (Immunex Corp. Seattle, WA). Marcadores de epítopos úteis incluem 3XFLAG®, HA, VSV-G, V5, HSV, GST, GFP, MBP, GAL4 e β-galactosidase. Plasmídeos úteis incluem aqueles que compreendem um marcador de biotina (por exemplo, plasmídeos PinPoint da Promega), proteína de ligação a calmodulina (por exemplo, plasmídeos pCAL da Stratagene), peptídeo que se liga a estreptavidi- na (por exemplo, plasmídeos InterPlay da Stratagene) um marcador c- myc ou FLAG® (por exemplo, plasmídeos para imunoprecipitação de Sigma-Aldrich) ou um marcador de histidina (por exemplo, plasmídeos QIAExpress da QIAGEN).

[0099] Para facilitar a purificação, os vetores de expressão podem incluir sequências ligantes cliváveis como aquelas específicas para o fator Xa ou enteroquinase (Invitrogen, San Diego, CA). Por exemplo, o vetor pode incluir um ou mais ligantes entre o domínio de purificação e o peptídeo ou polipeptídeo. Tal vetor de expressão fornece a expressão de uma proteína de fusão que compreende um peptídeo ou poli- peptídeo da invenção e um ácido nucleico que codifica 6 resíduos de histidina (SEQ ID NO:1396)precedendo um sítio de clivagem de tiore- doxina ou uma enteroquinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificaçãopor IMAC (cromatografia por afinidade com íon de metal imobilizado como descrita por Porath, J. et al. (1992) Pro. Exp. Purif. 3:263281) enquanto que o sítio de clivagem de enteroquinase fornece um meio para a purificação do peptídeo ou polipeptídeo a partir da proteína de fusão. Uma discussão sobre vetores que contêm proteínas de fusão é fornecida em Kroll, D.J. et al. (1993: DNA Cell Biol. 12:441453).

Anticorpos e Vacinas

[00100] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos usando métodos que são comumente conhecidos na técnica. Em particular, peptídeos, polipeptídeos ou polinucleotídeos podem ser usados para produzir anticorpos de acordo com métodos conhecidos. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a anticorpos policlonais, mo- noclonais, quiméricos e de cadeia simples, fragmentos Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab. Anticorpos neutralizantes (isto é, aqueles que inibem a função) são especialmente preferidos para uso em vacinas.

[00101] Para a produção de anticorpos, vários hospedeiros incluindo cabras, coelhos, ratos, camundongos, humanos e outros podem ser imunizados pela injeção de um peptídeo, polipeptídeo ou polinucleotí- deo ou qualquer fragmento dos mesmos que tenha propriedade imu- nogênica. Dependendo da espécie do hospedeiro, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a adjuvante de Freund, géis minerais tais como hidróxido de alumínio e substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poli-ânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina de keyhole limpet e dinitrofenol. Entre os adjuvantes usados em humanos BCG (bacilos de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvumsão especialmente preferidos.

[00102] É preferido que os peptídeos, polipeptídeos ou fragmentos usados para induzir anticorpos tenham uma sequência de aminoácidos que compreenda pelo menos cinco aminoácidos e mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos. Também é preferido que elas sejam idênticas a uma porção da sequência de aminoácidos da proteína natural e que elas possam conter a sequência de aminoácidos de uma molécula pequena que ocorre naturalmente. Fitas curtas de aminoáci- dos podem ser fundidas com aquelas de outra proteína tais como a hemocianina de keyhole limpet e o anticorpo produzido contra a moléculaquimérica.

[00103] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura. Essas incluem, mas não são limitadas a técnica do hibridoma, a técnica do hibridoma de célula B humana e a técnica do hibridoma de EBV (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120).

[00104] Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", por exemplo, a combinação de genes de anticorpo de camundongo e genes de anticorpo humano para obter uma molécula com a especificidade antigênica e atividade biológica apropriadas, podem ser usadas (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S. et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454). Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas, usando métodos conhecidos na técnica, para produzir anticorpos de cadeia simples específicos. Anticorpos com especificidade relacionada, mas com composição idiotípi- ca distinta, podem ser gerados pelo embaralhamento aleatório de cadeias de bibliotecas combinatórias aleatórias de imunoglobulina (Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3).

[00105] Aqueles versados na técnica a qual a invenção se refere considerarão as expressões diacorpos e "triabodies". Essas são moléculas que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado com um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante peptídico curto que é curto o suficiente para permitir o pareamento dos dois domínios sobre a mesma cadeia. Isso promove o pareamento com domínios complementares de uma ou mais outras cadeias e induz a formação de moléculas diméricas ou triméricas com dois ou mais sítios de ligação a antígeno funcionais. As moléculas de anticorpo resultantes podem ser mono-específicas ou multiespecíficas (por exemplo,biespecíficas no caso de diacorpos). Tais moléculas de anticorpo podem ser criadas a partir de dois ou mais anticorpos usando metodologia padronizada na técnica a qual essa invenção se refere; por exemplo, como descrito por Todorovska et al. (Design and application of diacorpos, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66).

[00106] Anticorpos também podem ser produzidos pela indução da produção in vivo na população de linfócitos ou pelo rastreamento de bibliotecas de imunoglobulina ou painéis de reagentes altamente específicos como descrito na literatura (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293- 299).

[00107] Fragmentos de anticorpo que contêm sítios de ligação específicos também podem ser gerados. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não são limitados a fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos pela digestão por pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes de dissulfeto dos fragmentos F(ab')2. Alternativamente, bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação fácil e rápida de fragmentos de Fab monoclonal com a especificidade desejada (Huse, W.D. et al. (1989) Science 254:1275-1281).

[00108] Vários imunoensaios podem ser usados para rastreamento para identificar os anticorpos que têm especificidade de ligação. Numerosos protocolos para ligação competitiva ou ensaios imunorradio- métricos que usam tanto anticorpos policlonais quanto monoclonais com especificidades estabelecidas são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação de complexo entre um peptídeo, polipeptídeo ou polinucleotídeo e seu anticorpo específico. Um imuno-ensaio de dois sítios baseado em anticorpo monoclonal que utiliza anticorpos monoclonais reativos para dois epítopos não-interferentes é preferido, mas um ensaio de competição de ligação também pode ser empregado (Maddox, supra).

[00109] Os anticorpos aqui descritos têm a habilidade de atingir e/ou inibir as células e também são úteis como moléculas transportadoras para a liberação de moléculas inibitórias adicionais nas células microbianas. A química para o acoplamento de compostos a aminoá- cidos está bem desenvolvida e vários tipos de moléculas diferentes podem ser ligadas aos anticorpos. Os métodos de acoplamento mais comuns contam com a presença de grupos amino (alfa-amino ou Lys), sulfidrila (Cys) ou carboxílicos (Asp, Glu ou alfa-carboxila) livres. Os métodos de acoplamento podem ser usados para ligar o anticorpo ao inibidor celular através do resíduo carboxi- ou amino-terminal. Em alguns casos, uma sequência inclui resíduos múltiplos que podem reagir com o químico escolhido. Isso pode ser usado para produzir multíme- ros, que compreendem mais do que um inibidor celular. Alternativamente, o anticorpo pode ser encurtado ou escolhido tal que os resíduos reativos estejam localizados tanto na terminação amino quanto na terminação carboxila da sequência.

[00110] Por exemplo, uma molécula repórter, tal como a fluoresceí- na, pode ser incorporada especificamente no resíduo de lisina (Ono et al., 1997) usando ^41 -Fmoc-M □- 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclo-hex-1- ilideno-3-metilbutil)-L-lisina durante a síntese do polipeptídeo. Depois da síntese, ésteres sucnimidil de 5- e 6-carboxifluoresceína podem ser acoplados depois que 4,4-dimetil-2,6-dioxociclo-hex-1-ilideno é removido pelo tratamento com hidrazina. Portanto, o acoplamento de uma molécula inibitória ao anticorpo pode ser obtido pela inclusão de um resíduo de lisina na sequência de polipeptídeo, depois da reação com um inibidor celular derivatizado adequado.

[00111] EDC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi- imida) ou o método de acoplamento a carbodi-imida também podem ser usados. As carbodi-imidas podem ativar os grupos carboxílicos da cadeia lateral de ácido aspártico e glutâmico assim como o grupo car- boxila terminal para fazer sítios reativos para o acoplamento com aminas primárias. O anticorpo ativado é misturado com o inibidor celular para produzir o conjugado final. Se o inibidor celular é ativado primeiro, o método EDC acoplará o inibidor celular através da alfa-amina N terminal e possivelmente através da amina na cadeia lateral de Lys, se presente na sequência.

[00112] O éster de n-Maleimiobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) é um reagente hetero-bifuncional que pode ser usado para ligar um anticorpo a inibidores celulares através de cisteínas. O acoplamento ocor- re com o grupo tiol de resíduos de cisteína. Se a sequência escolhida não contém Cys, é comum colocar um resíduo de Cys na terminação N ou C para obter uma ligação altamente controlada do anticorpo com o inibidor celular. Para os propósitos de síntese, pode ser proveitoso para a cisteína ser colocada na terminação N do anticorpo. MBS é particularmente adequado para uso na presente invenção.

[00113] O glutaraldeído pode ser usado como reagente de acoplamento bifuncional que liga dois compostos através de seus grupos amino. O glutaraldeído fornece um espaçador altamente flexível entre o anticorpo e o inibidor celular para uma apresentação favorável. O glutaraldeído é um composto muito reativo e reagirá com Cys, Tyr e His em um grau limitado. O método de acoplamento com glutaraldeído é particularmente útil quando um polipeptídeo contém apenas um único grupo amino livre na sua terminação amino. Se o anticorpo contiver mais do que um grupo amino livre, grandes complexos multiméricos podem ser formados.

[00114] Em um aspecto, os anticorpos da invenção podem ser fundidos (por exemplo, por clonagem "in-frame") ou ligados (por exemplo, por acoplamento químico) a inibidores celulares tais como agentes an- timicrobianos. Incluídos entre esses, estão os peptídeos antimicrobia- nos, por exemplo, proteína bactericida que aumenta a permeabilidade, proteínas antimicrobianas catiônicas, lisozimas, lactoferrinas e catelidi- cinas (por exemplo, de neutrófilos; vide, por exemplo, Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323; Ganz and Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:53-58; Hancock et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135-175). Peptídeos antimicrobianos ainda incluem defensinas (por exemplo, de células epiteliais ou neutrófilos) e proteínas microbiocidas de plaquetas (vide, por exemplo, Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323). Peptí- deos antimicrobianos adicionais incluem, mas não são limitados a gramicidina S, bacitracina, polimixina B, taquiplesina, bactenecina (por exemplo, bactenecina do gado), ranalexina, cecropina A, indolicidina (por exemplo, indolicidina do gado), e nisina (por exemplo, nisina bac- teriana).

[00115] Também estão incluídos como agentes antimicrobianos os ionóforos, que facilitam a transmissão de um íon (tal como sódio) através de uma barreira lipídica tal como a membrana celular. Dois compostosionóforos particularmente adequados para essa invenção são o RUMENSIN® (Eli Lilly) e Lasalocid (Hoffman LaRoche). Outros ionófo- ros incluem, mas não são limitados a salinomicina, avoparcina, aridci- na e actaplanina. Outros agentes antimicrobianos incluem, Monensin® e azitromicina, metronidazol, estreptomicina, canamicina e penicilina, assim como, β-lactamas, aminoglicosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, novobiocina, rifampicina e fluorquinolonas (vide, por exemplo, Horn et al., 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74-83; Eckburg et al., 2003, Infection Immunity 71:591-596; Gijzen et al., 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630-1634; Bonelo et al., 1984, FEMS Microbiol. Lett. 21:341-345; Huser et al., 1982, Arch. Microbiol. 132:1-9; Hilpert et al., 1981, Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21-31).

[00116] São inibidores particularmente úteis os compostos que bloqueiam ou interferem com a metanogênese, incluindo o ácido bromoe- tanossulfônico, por exemplo, o ácido 2-bromoetanossulfônico (BES) ou um sal do mesmo, por exemplo um sal de sódio. O molibdato (Mo) de sódio é um outro inibidor da redução do sulfato e pode ser usado com o ácido bromoetanossulfônico. Outros compostos antimetanogênese incluem, mas não são limitados a nitrato, formato, fluoreto de metila, clorofórmio, hidrato de cloral, sulfito de sódio, etileno e hidrocarbone- tos insaturados, acetileno, ácidos graxos tais como ácido linoleico e cis-oleico, ácidos graxos saturados tais como ácido beênico e esteárico e, também, lumazina (por exemplo, 2,4-pteridinadiona). Compostos adicionais incluem 3-bromopropano sulfonato (BPS), ácido propinoico e 2-butinoato de etila.

[00117] Ainda incluídos como agentes antimicrobianos estão as en-zimaslíticas, incluindo lisozima de fago, endolisina, lisozima, lisina, lisina de fago, muralisina, muramidase e virolisina. Enzimas úteis exibem a habilidade de hidrolisar ligações específicas na parede celular bacteriana. Enzimas líticas particulares incluem, mas não são limitadas a glicosaminidases, que hidrolisam as ligações glicosídicas entre amino açúcares (por exemplo, ácido N-acetilmurâmico e N- acetilglicosamina) do peptídeoglicano, amidases que clivam a ligação amida de N-acetilmuramoil-L-alanina entre a fita de glicano e o peptí- deo reticulado, e as endopeptidases, que hidrolisam a ligação inter- peptídica (por exemplo, cisteína endopeptidases) e endoisopeptidases que atacam a pseudomureína de metanogênicos da família Metha- nobacteriaceae.

[00118] Além disso, PNAs estão incluídos como agentes antimicro- bianos. PNAs são híbridos de peptídeo-ácido nucleico nos quais o arcabouço de fosfato foi substituído por um arcabouço aquiral e neutro feito de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina (vide, por exemplo,Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003). As bases A, G, T, C estão acopladas ao nitrogênio da amina sobre o arcabouço através de ligações de metilenocarbonila (P.E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568). PNAs se ligam a sequencias complementares com alta especificidade e afinidade maior em relação ao DNA ou RNA análogo (M. Egholm et al., supra). Híbridos de PNA/DNA ou PNA/RNA também exibem estabilidade térmica maior comparados com os dúple- xes de DNA/DNA e DNA/RNA correspondentes(M. Egholm et al., supra). PNAs também possuem grande estabilidade química e biológica, devida ao arcabouço de amida não-natural que não é reconhecido pelas nucleases ou proteases (V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994, 48:1310-1313). Tipicamente, PNAs têm pelo menos 5 bases de extensão e incluem uma lisina terminal. PNAs podem ser peguilados para prolongar sua expectativa de vida (Nielsen, P.E. et al., (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

[00119] Em um aspecto particular, os anticorpos da invenção podem ser fundidos ou ligados a outros anticorpos e seus fragmentos dos mesmos. Os anticorpos e fragmentos de anticorpo adicionados podem ser direcionados para células microbianas ou, particularmente, para células metanogênicas ou um ou mais componentes celulares. Por exemplo, proteínas da superfície celular, por exemplo, receptores extracelulares podem ser atingidos. Em certos aspectos, os anticorpos e fragmentos de anticorpo podem ser manipulados com sequências que são expressas especificamente em indivíduos, por exemplo, sequências de humanos ou ruminantes. Também estão incluídos os anticorposquiméricos, por exemplo anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos que são específicos para mais do que uma fonte, por exemplo, uma ou mais sequências de camundongo, humano ou ruminante. Ainda estão incluídos os anticorpos camelizados ou nanocor- pos.

[00120] Os anticorpos da invenção encontram uso particular em atingir uma célula microbiana, em particular, uma célula metanogênica. Em certos aspectos, os anticorpos podem ser usados para se associar ou se ligar a parede ou membrana celular e/ou inibir o crescimento ou a replicação da células. Como tal, os anticorpos podem ser usados para o acoplamento transitório ou prolongado à célula ou para mediar o sequestro ou engolfamento da célula e/ou a lise. Para atingir o alvo, a célula microbiana pode ser contatada com um anticorpo isolado de um organismo hospedeiro ou produzido pelos vetores de expressão e/ou células hospedeiras ou química sintética ou semissintética como descrito aqui em detalhes. Alternativamente, os anticorpos podem ser produzidos pelo próprio organismo hospedeiro em resposta a administração dos peptídeos, polipeptídeos ou polinucleotídeos aqui descritos. Entende-se que os anticorpos da invenção, assim como os polinucleo- tídeos, vetores de expressão, células hospedeiras, peptídeos e poli- peptídeos correspondentes podem ser usados para atingir vários micróbios, por exemplo, Methanobrevibacter ruminantium, que é o meta- nogênico primário dos ruminantes e Methanobrevibacter smithii, que é o metanogênico primário dos humanos. Em aspectos particulares, os anticorpos, polinucleotídeos, vetores de expressão, células hospedeiras,peptídeos e polipeptídeos correspondentes são liberados para os indivíduos como uma composição descrita aqui em detalhes, por exemplo, através do uso de um dispositivo de liberação lenta ruminal.

[00121] Em vários aspectos, os agentes da invenção (por exemplo, um ou mais peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos e anticorpos) podem ser incluídos em uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica e, especialmente, uma composição de vacina. A composição compreende, por exemplo: a) um peptídeo isolado ou uma alteração, fragmento, variante ou derivado do mesmo; b) um polipeptí- deo isolado ou uma alteração, fragmento, variante ou derivado do mesmo; c) um polinucleotídeo isolado ou uma alteração, fragmento, variante ou derivado do mesmo; d) um vetor de expressão compreendendo esse polinucleotídeo; e) uma célula hospedeira compreendendo esse vetor de expressão; ou f) um anticorpo ou uma alteração, fragmento, variante ou derivado do mesmo. As composições da invenção podem ser especialmente embaladas como parte de kits para direcionar e/ou inibir células microbianas, especialmente células metanogêni- cas, de acordo com os métodos descritos. Os kits compreendem pelo menos uma composição como descrita aqui e instruções para uso no direcionamento ou na inibição do crescimento ou replicação celular para metanogênicos ou outros micróbios.

[00122] Para as vacinas, podem ser usadas várias abordagens para aumentar a imunogenicidade antigênica, por exemplo, pelo uso de partículas de antígeno; polímeros de antígeno e polimerização; agentes emulsificantes; microencapsulação de antígenos; bactérias mortas e produtos bacterianos; adjuvantes químicos e citocinas; e agentes para atingir antígenos para células que apresentam antígeno (revisto em Paul, Fundamental Immunology, 1999, Lippincott-Raven Publishers, New York, NY, p. 1392-1405).

[00123] Para se obter antígenos particulados, pode ser usada a precipitação em alume. Com o uso do hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, o antígeno em questão torna-se incorporado em um precipitado semelhante a um gel, insolúvel ou é ligado de outra maneira a um gel pré-formado por interações eletrostáticas. Os antígenos podem ser submetidos a agregação com aquecimento moderado. Os antíge- nos que exibem autoagregação também podem ser usados. Liposso- mas, virossomas e complexos para imunocoloração (ISCOMs) também são úteis para formar particulados.

[00124] Para promover a polimerização, blocos de copolímeros não-iônicos podem ser usados como aditivos para adjuvantes, por exemplo, polímeros de polioxipropileno e polioxietileno, com os quais o antígeno pode estar associado. Esses são encontrados como componentes de formulações de complexo adjuvante da Syntex (SAF-1, Syn- tex Adjuvant Formulation-1) e Ribi Chemical Co. Polímeros de carboidrato de manose (por exemplo, manana) ou de β 1-3 glicose (por exemplo, glicano) podem ser usados de modo similar (Okawa Y, Howard CR, Steward MW. Production of anti-peptide antibody in mice following immunization of mice with peptides conjugated to mannan. J Immunol Methods 1992;142:127-131; Ohta M, Kido N, Hasegawa T, et al. Contribution of the mannan side chains to the adjuvant action of lip-opolysaccharides. Immunology 1987;60:503-507).

[00125] Vários agentes podem ser usados para emulsificação, in-cluindoemulsões de água em óleo, tais como adjuvantes de Freund (por exemplo, adjuvante incompleto de Freund) ou outras misturas que compreendem gotículas de água estabilizadas por um tensoativo tal como mono-oleato de manida em fase contínua de óleo mineral ou outrosóleos, tais como esqualano. Uma abordagem alternativa é usar emulsões de óleo em água, tais como MF5963 (Chiron) ou outras misturas que compreendam gotículas de óleo de esqualeno e uma mistura de agentes emulsificantes TWEEN80 e SPAN85, e imunomoduladores químicos, tais como derivados do dipeptídeo de muramila, por exemplo,tripeptídeo de muramila-fosfatidil etanolamina (MTP-PE) (Valensi J-PM, Carlson JR, Van Nest GA. Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized with trivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advanced adjuvants. J Immunol 1994;153:4029- 4039). Pequenas quantidades de polisorbato 80 e mono-oleato de sor- bitana também podem ser usadas nas misturas. Como outro exemplo, SAF-165 (Syntex) pode ser usado ou outras misturas de óleo em água que compreendam Pluronic L121, esqualeno e TWEEN80.

[00126] Microcápsulas, em particular, microcápsulas biodegradáveis, podem ser usadas para preparar vacinas de liberação controlada (Chang TMS. Biodegradable, semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones, vaccines and other biologicals. J Bioeng 1976;1:25-32; Langer R. Polymers for the sustained release of macromolecules: their use in a single step method of immunization. Methods Enzymol 1981;73:57-75). Cianoacrilatos são outra forma de polímeros biodegradáveis. Por exemplo, poli(butil-2-cianoacrilato) pode ser usado como um adjuvante para imunização oral (O’Hagan DT, Palin KJ, Davis SS. Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral im munization. Vaccine 1989;7:213-216). As microcápsulas são úteis para administração à mucosa de vacinas. Partículas de tamanho muito pe-queno(nanopartículas) são particularmente adequadas. A digestão no estômago pode ser contrabalançada por polímeros com revestimento entérico e o revestimento com substâncias que aumentem a absorção intestinal, como necessário.

[00127] Várias bactérias, diferentes de M. tuberculosis morta, podem ser usadas como adjuvantes. Onde a preparação com bactérias mortas é por si mesma altamente antigênica, as propriedades de adjuvante se estendem para o antígeno coadministrardo. Organismos úteis incluem Bordetella pertussis, Corynecbacterium parvum e Nippos- trongylus brasiliensis. Componentes lipídicos e peptídicos de bactérias também podem ser usados. Componentes exemplares incluem acetil- muramil-L-alanil-D-isoglutamina ou dipeptídeo de muramila (MDP) (El- louz F, Adam A, Ciorbaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans. Biochem Bio-phys Res Commun 1974;59:1317-1325), MDP (murabutida) (Chedid L, Parant MA, Audibert FM, et al. Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid of pyrogenicity. Infect Immun 1982;35:417- 424), treonil MDP (Allison AC, Byars NE. An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity. J Immunol Methods 1986;95:157-168), e MTP- PE. Adjuvantes lipídicos podem compreender endotoxinas LPS de bactérais Gram-negativas, tais como Escherichia, Salmonella, e Pseudomonas. Em certas abordagens, a estrutura do lipídeo A pode ser quimicamente modificada para reduzir a toxicidade, mas mantendo sua capacidade como adjuvante, por exemplo, como o monofosforil lipideo A (MPL) (Johnson AG, Tomai M, Solem L, Beck L, Ribi E. Cha-racterization of non-toxic monophosphoryl lipid. Rev Infect Dis 1987;9:S512).

[00128] Vários químicos podem ser usados como adjuvantes, inclu-indopolinucleotídeos, tais como poli-I:C e poli-A:U, vitamina D3, sulfato de dextran, inulina, brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA), avridina, polímeros de carboidrato similares a manana e dimicolato de trealose (Morein B, Lovgren-Bengtsson K, Cox J. Modern adjuvants: functional aspects. In: Kaufmann SHE, ed. Concepts in vaccine development. Berlin: Walter de Gruyter, 1996:243-263). Também estão incluídas as polifosfazinas (inicialmente introduzidas como agentes promotores de liberação lenta) e uma proteína de Leishmania, LeIF. As citocinas também podem ser usadas como adjuvantes, por exemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF e IFN-g.

[00129] Para direcionar as células que apresentam antígeno, domínios C3d, domínios Fc e domínios CTB podem ser usados (Dempsey PW, Allison MED, Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT. C3d of complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science 1996;271:348-350; Sun J-B, Holmgren J, Czerkinsky C. Cholera toxin B subunit: an efficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:10795-10799; Sun J-B, Rask C, Olsson T, Holmgren J, Czerkinsky C. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin B subunit. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7196-7201).

[00130] Adjuvantes específicos para liberação na mucosa, por exemplo, CT, LT e o fragmento C da toxina tetânica também podem ser usados(Elson CJ, Ealding W. Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J Immunol 1984;132:2736-2743; Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine 1993;11:1179-1184; Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL. Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelated protein antigens. Vaccine 1988;6:269-277; Gomez-Duarte OG, Galen J, Chatfield SN, Rappuoli R, Eidels L, Levine MM. Expression of fragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheria toxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain. Vaccine 1995;13:1596- 1602).

Terapêutica e Diagnóstico

[00131] Os peptídeos, polipeptídeos, polinucleotídeos e anticorpos da presente invenção são considerados como possuindo benefícios para a saúde. Em aspectos particulares, as vacinas que atingem me- tanógenos podem ser usadas para restaurar a energia que um indivíduo perde normalmente como metano. Portanto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica (especialmente uma composição de vacina) em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso com qualquer um dos métodos discutidos acima. Tais composições farmacêuticas podem compreender um peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo em combinação com um inibidor celular. Alternativamente, as composições farmacêuticas podem compreender um polinucleotí- deo, vetor de expressão ou uma célula hospedeira como descrito aqui em detalhes. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto estabilizante, que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril, biocompatível incluindo, mas não limitado a salina, salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas sozinhas ao indivíduo ou em combinação com outros agentes, fármacos (por exemplo, fármacos antimicrobianos) ou hormônios.

[00132] Além dos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados que compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o pro- cessamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Detalhes adicionais sobre técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). As composições farmacêuticas utilizadas nessa invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitadas a vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, in- tramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral tópica, sublingual ou retal.

[00133] As composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, em dosagens adequadas para a administração oral. Tais veículos possibilitam que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares para a ingestão pelo indivíduo. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da combinação dos compostos ativos com um excipiente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, depois da adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter os núcleos de comprimidos ou drágeas. Excipientes adequadossão carboidratos ou cargas de proteína, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, tal como metil-celulose, hidroxipropi- lmetil-celulose ou carboximetilcelulose de sódio; gomas, incluindo arábica e de tragacanto; e proteínas, tais como gelatina e colágeno. Se de-sejado, agentes de desintegração ou solubilizantes podem ser adicionados, tais como polivinil pirrolidona reticulada, agar, ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio.

[00134] As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas "push-fit" feitas de gelatina, assim como cápsulas fechadas feitas de gelatina macia e um revestimento, tal como glicerol ou sorbitol. Cápsulas push-fit podem conter os ingredientes ativos misturados com uma carga ou ligante, tal como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, líquidos ou polietileno glicol líquido com ou sem estabilizadores. Os núcleos de drágea podem ser usados em conjunto com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concentradas, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirroli- dona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções laqueadoras e solventes orgânicos ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágeas para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade do composto ativo, isto é, a dosagem.

[00135] As formulações farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou salina tamponada fisiologicamente. Suspensões aquosas para injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextran. Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões para injeção oleosa apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos ou lipossomas. Polimeros não-lipídicos de aminas policatiônicas também podem ser usados para a liberação. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamen- te concentradas. Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropriados para a barreira em particular a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[00136] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser produzidas de uma maneira que é conhecida na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de misturação, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigação, emulsificação, en- capsulação, aprisionamento ou liofilização. A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com vários ácidos, incluindo, mas não limitados a clorídrico, sulfúrico, acético, lático, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos do que as formas de base livre. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos os seguintes: histidina 1-50 mM, sacarose 0,1%-2% e manitol 2-7% em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinada com tampão antes do uso. Depois que as composições farmacêuticas são preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente adequado e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada. Para administração de uma composição da invenção, tal rotulação pode incluir a quantidade, frequência e método de administração.

[00137] As composições farmacêuticas adequadas para uso na invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o propósito pretendido. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser avaliada inicialmente tanto em ensaios celulares, por exemplo, em células microbianas, em particular células metanogênicas, quanto em modelos animais, geralmente com camundongos, coelhos, cães ou porcos ou em espécies de ruminantes, tais como ovelhas, gado, vea- dos e cabras. O modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Tal informação pode ser usada depois para determinar as doses e vias úteis para administração. As quantidades de dosagem normais podem variar entre 0,1 a 100.000 microgramas, até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo da via de administração. Orientações sobre dosagens particulares e métodos de liberação são fornecidas na literatura e comumente disponíveis para os praticantes da técnica. Aqueles versados na técnica empregarão formulações diferentes para polinucleotí- deos e polipeptídeos. Similarmente, a liberação de peptídeos, polipep- tídeos, polinucleotídeos ou anticorpos será específica para as células em particular, condições, localizações, etc.

[00138] A dose exata será determinada pelo praticante, à luz dos fatores relacionados com o indivíduo que requer o tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para fornecer níveis suficientes de ingrediente ativo ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em consideração incluem a severidade dos estado de doença, a saúde geral do indivíduo, idade, peso, sexo, dieta tempo e frequência de administração, combinação de fármacos,reações de sensibilidade e tolerância/resposta a terapia. Composições farmacêuticas de ação prolongada podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana ou uma vez a cada duas semanas dependendo da meia- vida e taxa de depuração da formulação em particular. As composições podem ser coadministrardas com um ou mais agentes antimicro- bianos adicionais, incluindo compostos antimetanogênese (por exemplo,ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, peptídeos antimicrobi- anos ou outros antibióticos como descrito aqui em detalhes. A coadmi- nistrarção pode ser simultânea ou sequencial ou pode alternar com administração repetida.

[00139] Particularmente úteis para as composições da invenção (por exemplo, composições farmacêuticas) são as fórmulas ou mecanismos de liberação lenta. Por exemplo, dispositivos intrarruminais incluem, mas não são limitados a Time Capsule® Bolus da Agri-Feeds Ltd., Nova Zelândia, desenvolvida originalmente dentro da AgRese- arch Ltd., Nova Zelândia, como descrito em WO 95/19763 e NZ 278977, e CAPTEC da Nufarm Health & Sciences, uma divisão da Nu- farm Ltd., Auckland, Nova Zelândia, como descrito em AU 35908178, PCT/AU81/100082, e Laby et al., 1984, Can. J. Anim. Sci. 64 (Suppl.), 337-8, todos os quais estão incorporados aqui por referência. Como um exemplo em particular, o dispositivo pode incluir uma mola e um êmbolo que forçam a composição contra um orifício no final de um cilindro.

[00140] Como uma modalidade adicional, a invenção refere-se a uma composição para suplementação na água, por exemplo, composição umedecida ou suplemento alimentar, por exemplo, suplemento para ração de ruminante, para uso com qualquer um dos métodos discutidos acima. Em aspectos particulares, o suplemento alimentício compreende pelo menos um material vegetal que é comestível e um peptídeo ou polipeptídeo da invenção. Alternativamente, o suplemento alimentício compreende pelo menos um material vegetal que é comestível e um peptídeo ou polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica o peptídeo ou polipeptídeo aqui descritos, por exemplo, como um vetor de expressão ou uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão. Em particular, a composição inclui ainda um inibidor celular, fundido ou ligado a sequência resultante. O material vegetal preferido inclui qualquer um de forragem, capim, grão ou farelo, por exemplo, forragem de legumes, capim forrageiro, silagem de milho, silagem de capim, silagem de legumes, grãos de milho, aveia, cevada, destilados de grão, grãos fermentados, farelo de soja e farelo de semente de algodão. Em particular, a silagem de capim é útil como composição alimentícia para ruminantes. O material de planta pode ser geneticamente modificado para conter um ou mais componentes da invenção, por exemplo, um ou mais polipeptídeos ou peptídeos, polinucleotídeos ou vetores.

[00141] Em outra modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente aos peptídeos, polipeptídeos, ou polinucleotídeos da invenção podem ser usados para determinar a presença de micróbios, especialmente de metanogênicos ou em ensaios para monitorizar os níveis de tais micróbios. Os anticorpos úteis para os propósitos de diagnóstico podem ser preparados da mesma maneira como aqueles descritos acima. Os ensaios de diagnóstico incluem métodos que utilizam o anticorpo e um marcador para detectar um peptídeo ou polipeptídeo em fluidos corporais humanos ou extratos de células ou tecidos. Os anticorpos também podem ser usados com ou sem modificação e podem ser marcados pela união deles tanto covalentemente quanto não- covalentemente com uma molécula repórter. Uma grande variedade de moléculas repórteres que são conhecidas na técnica podem ser usadas, várias das quais estão descritas acima.

[00142] Uma variedade de protocolos para a medição dos níveis de um peptídeo, polipeptídeo ou polinucleotídeo é conhecida na técnica (por exemplo, ELISA, RIA e FACS) e fornece uma base para o diagnóstico da presença ou os níveis de um micróbio, especialmente um metanogênico. Níveis normais ou padronizados são estabelecidos pela combinação de fluidos corporais ou extratos celulares retirados de indivíduos normais, por exemplo, humanos ou ruminantes normais, com o anticorpo sob condições adequadas para a formação do complexo. A quantidade da formação do complexo padronizado pode ser quantificada por vários métodos, mas preferivelmente por meios fotométricos. As quantidades de peptídeos, polipeptídeos, ou polinucleotídeos ex- pressos em um indivíduo, controle e em amostras tratadas (por exemplo, amostras de indivíduos vacinados) são comparadas com os valores padronizados. O desvio entre os valores do padrão e do indivíduo estabelece os parâmetros para a determinação da presença ou dos níveis do micróbio.

[00143] Em outra modalidade da invenção, os polinucleotídeos podem ser usados para os propósitos de diagnóstico, usando técnicas particulares de hibridização e/ou amplificação. Os polinucleotídeos que podem ser usados incluem oligonucleotídeos, moléculas de RNA complementar e DNA e PNAs. Os polinucleotídeos podem ser usados para detectar e quantificar a expressão de gene em amostras nas quais a expressão pode estar relacionada com a presença ou níveis do micróbio. O ensaio de diagnóstico pode ser usada para distinguir entre a presença, ausência e a alteração dos níveis de micróbios e para monitorizar os níveis durante a intervenção terapêutica.

[00144] Em um aspecto, a hibridização com sondas de PCR pode ser usada para identificar sequências de ácido nucleico, especialmente sequências genômicas, que codificam peptídeos ou polipeptídeos da invenção. A especificidade da sonda, se ela é feita a partir de uma região altamente específica, por exemplo, 10 nucleotídeos únicos na região regulatória 5' ou de uma região menos especifica, por exemplo, na região codificadora 3' e a estringência da hibridização ou da amplificação (máxima, alta, intermediária ou baixa) determinará se a sonda identifica apenas sequências que ocorrem naturalmente, alelas ou sequências relacionadas. As sondas também podem ser usadas para a detecção de sequências relacionadas e preferivelmente devem conter pelo menos 50% dos nucleotídeos de qualquer uma das sequências codificadoras. As sondas de hibridização da presente invenção podem ser de DNA ou RNA e derivadas de uma sequência de nucleotídeos das SEQ ID NO:703-1395, ou complementos ou sequências modifica- das dessas ou a partir de sequências genômicas incluindo elementos promotores e intensificadores da sequência que ocorre naturalmente.

[00145] Meios para a produção de sondas de hibridização específicas para DNAs incluem a clonagem de sequências de ácido nucleico em vetores para a produção de sondas de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, comercialmente disponíveis e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro por meio da adição de RNA polimerases adequadas e os nucleotídeos marcados apropriados. As sondas de hibridização podem ser marcadas por uma variedade de grupos repórter, por exemplo, radionuclídeos tais como 32P ou 35S, ou marcadores enzimáticos tais como fosfatase alcalina acoplada com a sonda através de sistemas de acoplamento de avidina/biotina e similares. Os polinucleotídeos podem ser usados em análises Souther ou northern, dot blot e outras tecnologias baseadas na membrana; em tecnologias de PCR; ou em ensaios com tiras, "pin", ELISA ou microar- ranjos que utilizam fluidos ou tecidos de indivíduos biopsiados para detectar a presença ou os níveis do micróbio. Tais métodos qualitativos e quantitativos são bem conhecidos na técnica.

[00146] Em um aspecto particular, as sequências de ácido nucleico podem ser úteis em vários ensaios marcados pelos métodos padronizados e adicionados a um fluido ou amostra de tecido de um indivíduo sob condições adequadas para hibridização e/ou amplificação. Depois de um período de incubação adequado, a amostra é lavada e o sinal é quantificado e comparado com um valor padronizado. Se a quantidade de sinal na amostra de teste está significativamente alterada a partir daquele de uma amostra de controle comparável, a presença dos níveis alterados de sequências de nucleotídeos na amostra indica a presença ou os níveis do micróbio. Tais ensaios também podem ser usados para avaliar a eficácia de um regime de vacinação em particular em estudos com animais, testes clínicos ou na monitorização do tra- tamento de um indivíduo.

[00147] A fim de fornecer uma base para o diagnóstico da presença ou dos níveis de um micróbio, um perfil normal ou padronizado para a expressão é estabelecido. Isso pode ser obtido pela combinação de fluidos corporais ou extratos de tecido de indivíduos normais com um polinucleotídeo ou seu fragmento, sob condições adequadas para a hibridização e/ou amplificação. Os níveis padronizados podem ser quantificados pela comparação dos valores obtidos a partir de indivíduos normais com aqueles de um experimento, onde uma quantidade conhecida de um polinucleotídeo substancialmente purificado é usada. Os valores padronizados obtidos das amostras normais podem ser comparados com os valores das amostras dos indivíduos tratados para o crescimento microbiano. O desvio entre os valores do padrão e do indivíduo é usado para estabelecer a presença ou os níveis do micróbio.

[00148] Uma vez que o micróbio é identificado e um protocolo de vacinação é iniciado, os ensaios de hibridização e/ou amplificação podem ser repetidos em uma base regular para avaliar se o nível de expressão no indivíduo começa a diminuir em relação àquele que é observado no indivíduo normal. Os resultados obtidos a partir de ensaios sucessivos podem ser usados para mostrar a eficácia da vacinação durante um período que varia de vários dias a meses.

[00149] Usos para diagnóstico em particular para os oligonucleotí- deos designados a partir de sequências de ácido nucleico podem envolver o uso de PCR. Tais oligômeros podem ser quimicamente sintetizados, gerados enzimaticamente ou produzidos in vitro. Os oligôme- ros consistirão preferivelmente de duas sequências de nucleotídeos, uma com orientação senso (5.fwdarw.3') e outra com orientação antis- senso (3'.fwdarw.5'), empregadas sob condições otimizadas para identificação de um gene ou condição específica. Os mesmos dois oligô- meros, conjuntos agrupados de oligômeros ou até um pool de oligôme- ros degenerados podem ser empregados sob condições menos estrin- gentes para a detecção e/ou quantificação de sequências de DNA ou RNA intimamente relacionadas.

[00150] Os métodos que também podem ser usados para quantificar a expressão incluem a radiomarcação ou nucleotídeos biotinilados, coamplificação de um ácido nucleico de controle e curvas padronizadas cujos resulatdos experimentais são interpolados (Melby, P.C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al (1993) Anal. Biochem. 229-236). A velocidade de quantificação de amostras múltiplas pode ser acelerada realizando o ensaio em formato ELISA onde o oligômero de interesse é apresentado em várias diluições e uma resposta espectrofotométrica ou colorimétrica dá uma rápida quantificação.

[00151] Em modalidades adicionais, os oligonucleotídeos ou fragmentos mais longos derivados de qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos podem ser usados como alvos em um microarranjo. O microarranjo pode ser usado para monitorizar o nível de expressão de um grande número de genes simultaneamente (para produzir uma imagem do transcrito)e para identificar variantes genéticas, mutações e polimorfismos. Essa informação pode ser usada para determinar a função do gene, para compreender a base genética da doença, para diagnosticar a doença e para desenvolver e monitorizar as atividades de agentes terapêuticos. Em uma modalidade, o microarranjo é preparado e usado de acordo com métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos no pedido PCT WO95/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) e Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619).

[00152] Em um aspecto, os oligonucleotídeos podem ser sintetizados sobre a superfície do microarranjo usando um procedimento de acoplamento químico e um aparelho de aplicação de jato de tinta, tal como aquele descrito no pedido PCT WO95/251116 (Baldeschweiler et al.). Em outro aspecto, um arranjo "quadriculado" semelhante a um dot ou slot blot (aparelho HYBRIDOT, Life Technologies) pode ser usado para arranjar e ligar fragmentos de cDNA ou oligonucleotídeos à superfície de um substrato usando um sistema à vácuo, térmico, UV, mecânico ou procedimentos químicos de ligação. Em outro aspecto, um arranjo pode ser produzido manualmente ou pelo uso de dispositivos, materiais e máquinas (incluindo pipetas de múltiplos canais ou instrumentos robóticos; Brinkmann, Westbury, N.Y) e pode incluir, por exemplo, 24, 48, 96, 384, 1024, 1536 ou 6144 spots ou poços (por exemplo, como uma placa de múltiplos poços) ou mais ou qualquer outro múltiplo entre 2 a 1.000.000, que proporcionam o uso eficiente da instrumentação comercialmente disponível.

[00153] A fim de conduzir a análise da amostra usanso os microar- ranjos, os polinucleotídeos são extraídos de uma amostra biológica. A amostra biológica pode ser obtida a partir de (sangue, urina, saliva, bile, sucos gástricos, etc.), células cultivadas, biópsias ou outras preparações de tecido. Para produzir as sondas, os polinucleotídeos extraídos da amostra são usados para produzir sequências de ácido nu- cleico que são complementares aos ácidos nucleicos do microarranjo. Se o microarranjo consiste em cDNAs, RNAs antissenso são as sondas apropriadas. Portanto, em um aspecto, o mRNA é usado para produzir fragmentos ou sondas de RNA antissenso. Essas sondas flu-orescentemente marcadas são incubadas com o microarranjo, tal que as sequências de sonda hibridizam com os oligonucleotídeos de cDNA do microarranjo. Em outro aspecto, as sequências de ácido nucleico usadas como sondas podem incluir polinucleotídeos, fragmentos e sequências complementares ou antissenso produzidas usando enzimas de restrição, tecnologias de PCR e kits de marcação de oligos (Amersham Pharmacia Biotech) bem conhecidas na área da tecnologia de hibridização.

[00154] Em outra modalidade da invenção, os peptídeos ou polipep- tídeos da invenção ou seus fragmentos funcionais ou imunogênicos ou seus oligopeptídeos podem ser usados para rastrear bibliotecas de compostos por qualquer uma de uma variedade de técnicas de seleção de fármaco. O fragmento empregado em tal rastreamento pode estar livre em solução, fixado a um suporte sólido, gerado na superfície celular ou localizado intracelularmente. A formação de complexos de ligação entre o peptídeo ou polipeptídeo e o agente a ser testado pode ser medida.

[00155] Outra técnica para a seleção de fármaco que pode ser usada fornece um rastreamento de alta eficiência de compostos que têm afinidade de ligação adequada ao peptídeo ou polipeptídeo de interesse como descrito no pedido publicado PCT WO84/03564. Nesse método, um grande número de compostos de teste pequenos diferentes são sintetizados sobre um substrato sólido, tal como pinos de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de teste são reagidos com o peptídeo ou polipeptídeo ou seus fragmentos e lavados. O peptídeo ou polipeptídeo ligado é detectado depois por métodos bem conheci-dos na técnica. O peptídeo ou polipeptídeo purificado também pode ser colocado diretamente sobre placas para uso nas técnicas de seleção de fármaco acima mencionadas. Alternativamente, anticorpos não- neutralizantes podem ser usados para capturar o peptídeo e imobilizá- lo sobre um suporte sólido.

[00156] Em outra técnica, pode-se usar ensaios competitivos para o seleção de fármaco nos quais os anticorpos neutralizantes capazes de se ligarem ao peptídeo ou polipeptídeo, competem especificamente com o composto de teste pela ligação ao peptídeo ou polipeptídeo. Dessa maneira, os anticorpos podem ser usados para detectar a pre- sença de um composto de teste que compartilha um ou mais sítios de ligação ao antígeno com o anticorpo.

EXEMPLOS

[00157] Os exemplos aqui descritos são para propósitos ilustrativos das modalidades da invenção. Outras modalidades, métodos, tipos de análises estão dentro do escopo das pessoas versadas na técnica de diagnóstico molecular e não necessitam ser descritas aqui em detalhes. Outras modalidades dentro do escopo da técnica são consideradas como parte dessa invenção.

EXEMPLO 1: Avaliação do Tamanho do Genoma

[00158] A cepa M1T (DSM1093) de Methanobrevibacter ruminantium foi cultivada em meio BY+ (meio basal, Joblin et al., 1990) que consiste em [g/l] NaCl (1), KH2PO4 (0,5), (NH4)2SO4 (0,25), CaCl2.2H2O (0,13), MgSO4.7H2O (0,2), K2HPO4 (1), fluido de rume clarificado (300 ml) dH2O (360 ml), NaHCO3 (5), resazurina (0,2 ml) L-cisteina-HCl (0,5), extrato de levedura (2), e solução de elementos residuais de Balch (10 ml) (elementos residuais adicionados; Balch et al., 1979) que consiste em (g/l) ácido nitrilatriacético (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4.H2O (0,5), NaCl (1), Fe- SO4.7H2O (0,1), CoCl2.6H2O (0,1), CaCl2.2H2O (0,1), ZnSO4.7H2O (0,1), CuSO4.5H2O (0,01), AlK(SO4)2.12H2O (0,01), H3BO3 (0,01), Na2MoO4.2H2O (0,01), NiSO4.6H20 (0,03), Na2SeO3 (0,02), e Na2WO4.2H2O (0,02). O DNA genômico foi extraído pelo congelamento de péletes celulares sob N2 líquido e trituração usando um almofariz e um pilão pré-resfriados esterilizados. Os homogenatos celulares foram embebidos em tampões de agarose e as manipulações subsequentes foram realizadas nos plugues para reduzir o cisalhamento físico do DNA genô- mico. Digestões foram realizadas com endonucleases de restrição e os fragmentos de DNA foram separados usando eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE).

EXEMPLO 2: Clonagem e Sequenciamento de DNA

[00159] O DNA do genoma de M. ruminantium foi sequenciado por Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA) usando uma abordagem de clonagem aleatória com shotgun (Fleischmann et al., 1995) e por Macrogen Corporation (Rockville, MD, USA) usando o pirossequenciamento. Resumidamente, as bibliotecas de DNA de M. ruminantium foram construídas em E. coli pela ruptura física aleatória do DNA genômico e separação dos fragmentos por eletroforese em gel. Fragmentos grandes na faixa de 40 Kb foram recuperados do gel e usados para gerar uma pequena biblioteca de inserto em plasmídeo. Os clones resultantes de ambas as bibliotecas de insertos grandes e pequenos foram cultivados e seus fosmídeos ou plasmídeos de DNA foram recuperados e sequenciados usando uma tecnologia de se- quenciamento de alta eficiência. Um número suficiente de clones foi sequenciado para fornecer uma cobertura teórica de 8 vezes o geno- ma de M. ruminantium. A cobertura adicional da sequência foi obtida pelo pirossequenciamento de fragmentos de DNA aleatoriamente cortados (Macrogen Corporation) até uma cobertura teórica final do ge- noma de aproximadamente 10 vezes.

EXEMPLO 3: Montagem e Anotação da Sequência

[00160] As sequências de DNA foram alinhadas para procurar superposições de sequência e montadas em sequências contíguas (contigs) usando Paracel Genome Assembler (Paracel Inc, CA, USA) e o pacote Staden (Staden et al., 1998) em combinação com a sequência de ambos os PCRs padronizado e inverso. Contigs foram analisados usando o rastreador de fase de leitura aberta (ORF) GLIMMER (Gene Locator Interpolated Markov Model ER, Delcher et al., 1999) e cada ORF foi analisada por gapped BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al., 1997) contra bancos de dados não-redundantes de nucleotídeo e proteína do National Center for Biotechnology Information (NCBI).

[00161] Os contigs da sequência da fase preliminar de 8 vezes foram reunidos aleatoriamente pela ligação artificial de sequências para gerar uma "pseudomolécula"e submetidos ao The Institute for Genomic Research (TIGR, DC, USA) para autoanotação. Os contigs reunidos a partir do pirossequenciamento de 10 vezes foram reanalisados usando GLIMMER e as ORFs foram autoanotadas usando GAMOLA (Global Annotation of Multiplexed On-site Blasted DNA sequences; Al- termann e Klaenhammer, 2003). Anotações automatizadas foram subsequentemente verificadas manualmente. As ORFs foram classificadas pela função usando clusters de banco de dados de proteínas ortó- logas (COG) (limite 1e-02) (Tatusov et al., 2001).

[00162] Os motivos de proteína foram determinados por HMMER (protocolo de transferência de hipertexto://hmmer. wustl.edu) usando bibliotecas PFAM HMM e TIGRFAM, com alinhamento global e local (protocolo de transferência de hipertexto://pfam.wustl.edu) e modelos padronizados e do tipo fragmento TIGRFAM HMMs (protocolo de transferência de hipertexto://world wide web.tigr.org/TIGRFAMs) respectivamente (limite 1e-02). tRNAs foram identificados usando TRNASCAN-SE (Lowe and Eddy, 1997) e as repetições de nucleotí- deo foram identificadas usando o pacote de programas KODON (Applied Maths, Austin, TX, USA) REPUTER (Kurtz and Schleiermacher, 1999). Foram construídas visualizações em um atlas de genoma usando GENEWIZ (Jensen et al., 1999). As reconstruções da via do ORFeoma predito de M. ruminantium foram realizadas em conjunto com o banco de dados on-line KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al., 2004) usando um programa desenvolvido internamente (PathwayVoyager; Altermann and Klaenhammer, 2005).

EXEMPLO 4: Resultados e Análise do Sequenciamento

[00163] A avaliação do tamanho do genoma de M. ruminantium pe- la digestão com enzima de restrição e a classificação por tamanho dos fragmentos através de PFGE, indicou um cromossomo único de aproximadamente 2,5 a 2,0 Mb. O sequenciamento inicial de clones de in- sertos grandes e pequenos (cobertura preliminar de 6 vezes) e reunião da sequência em contigs indicou que uma região de 40Kb do genoma estava altamente super-representada (>20 vezes), particularmente dentro da biblioteca de inserto pequeno. Isso foi possível devido ao alto número de cópias do plasmídeo (embora nenhum DNAs extra- cromossomicos tenham sido identificados) ou a um bacteriófago liso- gênico que replicou durante o crescimento da cultura usada para extração de DNA. Devido a esse grande desvio da previsão da sequência, o sequenciamento adicional foi realizado (cobertura teórica de 2 vezes o genoma) para clones com grandes insertos apenas fornecendo uma cobertura final de 8 vezes a partir do sequenciamento de Sanger. A sequência da fase preliminar de 8 vezes foi reunida em 756 contigs que foram ligados através de 105 arcabouços. O pirossequen- ciamento posterior foi realizado em uma cobertura de ~10 vezes e a incorporação dessas sequências no conjunto resultou em uma queda no número de contigs para 27. O fechamento subsequente da lacuna usando técnicas de PCR inversa e de grande amplitude reduziu o número de contigs para 14.

[00164] A extensão combinada da sequência de 14 contigs indicou que o genoma é discretamente maior (2.920.443 bp) do que o tamanho estimado por PFGE (figura 1A) e significativamente maior do que seu parente mais próximo, M. smithii (1,9 mB). O %G+C de 32,7 está próximo da faixa relatada de 27,5% a 31,6% para as cepas de M. ru- minantium (Balch et al., 1979). A análise da sequência prevê 2672 ORFs e o número total de acertos para famílias de proteínas (TI- GRFam e PFam) e Clusters de Grupos Ortólogos (COGs) estão descritos na Fig. 1B. Todos os genes preditos estarão envolvidos na me- tanogênese a partir de H2 + CO2 e formato estão presentes (figura 1C e FIGS 6A-6C). Entretanto, a sequência preliminar de M. ruminantium carece de um sistema de metil coenzima redutase II (mcr II ou mrt). Em outros metanogênicos, o cluster de mrc II codifica uma isoenzima da enzima metil CoM redutase I que é regulada positivamente durante o desenvolvimento em pressões parciais altas de H2 (Reeve et al., 1997). H2 é usado rapidamente no rume e não se acumula em níveis elevados, portanto M. ruminantium parece ter se adaptado a usar níveis baixos de H2 através dos sistema mrc I apenas.

[00165] A comparação do genoma preliminar de M. ruminantium com M. smithii intimamente relacionado e Mt. thermoautotrophicus revela várias regiões de diferença. Algumas das diferenças de gene codificam grandes proteínas de superfície da família de proteínas grandes ricas em asparagina-treonina que podem conter repetições de sequência CPOMP e DUF11 (chlamydial polymorphic outer membrane proteins, e domain of unknown function, respectivamente) que são prováveis mediadores de interações com superfícies ou outros microorganismos no ambiente do rume (vide figuras7A-7C). Repetições de sequência similares também são encontradas nas grandes proteínas de superfície codificadas em ambos os genomas de Ms. stadtmanae e M. smithii (Samuel et al., 2007).

[00166] M. ruminantium foi descrito previamente como produtor de uma cápsula (Smith e Hungate, 1958) e a análise da sequência mostrou que ele codifica mais do que 50 genes (glicosil transferases (GT), outras transferases, epimerases e transportadores) envolvidos na síntese e exportação de exopolissacarídeos confirmando que ele recobre sua superfície com polissacarídeos (vide FIGS 8A-8C). M. ruminantium tem pelo menos 30 glicosil transferases (6 GT1, 21 GT2, 2 GT4 e 1 GT66;vide figuras8A-8C) comparado com 28 em M. smithii (1 GT1; 22 GT2; 4 GT4 e 1 GT66) e 41 em M. stadtmanae (2 GT1; 26 GT2; 12 GT4 e 1 GT66) (Samuel et al, 2007; Fricke et al., 2006; Coutinho e Henrissat, 1999). Esse é um número relativamente grande de genes destinados a codificar polissacarídeos de superfície por esses organismos e sugere que esse é um fator importante para a sobrevida em ambientes gastrointestinais.

[00167] A análise de repetições de nucleotídeos revelou a presença de pelo menos duas regiões Spacer Interspersed Direct Repeats (SPIDRs) no genoma de M. ruminantium. SPIDRs são repetições de nucleotídeo (geralmente menores do que 40 nt) feitas por unidades idênticas separadas pelas sequências heterólogas e que foram inicialmente caracterizadas em procariotas (Jansen et al., 2002). O SPIDR I de M. ruminantium tem um arranjo genético único que consiste em duas estruturas de repetição idênticas flanqueando uma região de 17 kb que abriga um cluster de genes associados a cas. Estruturas de repetição similares foram encontradas em vários genomas de metano- gênicos. Methanocaldococcus jannaschiicontém 18 cópias de um elemento repetitivo de múltiplas cópias de nucleotídeo (Bult et al., 1996) que consiste em um segmento de repetição longo (391-425 bp) seguido por até 25 segmentos curtos de repetição (27-28 bp) que estão eles próprios separados por 31 a 51 bp de uma sequência única. O genoma de Ms. stadtmanaecontém uma região de 4,8 Kb na qual um elemento de 30 bp é repetido 59 vezes (Fricke et al., 2006). Mt. ther- moautotrophicuscontém duas repetições estendidas (3,6 e 8,6 kb de tamanho) que contêm uma sequência de repetição com 372-bp seguida por 47 e 124 cópias da mesma sequência de repetição de 30 bp separadas por sequências únicas de 34 a 38 bp de extensão (Smith et al., 1997). A função biológica desses SPIDRs é desconhecida, embora uma hipótese atual especule que esse sistema é um análogo funcional dos sistemas de RNA pequeno de interferência eucariótico e represente um sistema de defesa contra réplicons estranhos que funcionam sobre o princípio do RNA antissenso (Jansen et al., 2002; Haft et al., 2005; Godde and Bickerton, 2006; Makarova et al., 2006).

[00168] O genoma de M. ruminantiumtambém codifica um grande número de ORFs preditas para codificar proteínas com domínios que ultrapassam a membrana, que consequentemente são esperados conterregiões que estão expostas sobre a superfície celular (figuras9A, 9B e 9C).

EXEMPLO 5: Produção e Teste de Anticorpo

[00169] Preparação de paredes celulares de M. ruminantium: As paredes celulares de M. ruminantium foram preparadas pelo congelamento dos péletes celulares sob N2 e trituração usando um almofariz e um pilão pré-resfriados esterilizados. As células finamente trituradas foram re-suspensas em tampão de tripsina-fosfato (40 mg de tripsi- na/200 ml de tampão fosfato a 0,1 M, pH 7,9) e incubadas a 37°C por 2 horas. A preparação foi centrifugada a 48.000 g por 30 minutos a 4°C e o pélete resultante foi lavado duas vezes com H2O destilada e liofilizado.

[00170] Produção de Anticorpo: nove sequências de peptídeo que foram preditas estarem localizadas fora da célula foram identificadas na sequência do genoma de M. ruminantium selecionadas como antí- genos em potencial. Cinco miligramas de cada um desses peptídeos foram sintetizadas (Invitrogen) e sua pureza avaliada por espectrosco- pia de massa. Os peptídeos e suas sequências codificadoras são mostradas na figura 4. As sequências completas de ácido nucleico e ami- noácidos são mostradas na figura 5. Dois miligramas de cada peptídeo permaneceram não-conjugados para ELISA e 3 mg foram conjugadas com Hemocianina de Keyhole Limpet (KLH) para imunização de animal.

[00171] O programa de vacinação está resumido na figura 2 e ocorreu como se segue. Cada imunização usou uma ovelha (1-3 anos de idade) que foi pré-sangrada para fornecer 2-5 ml de soro pré-imune no dia 0. Isso foi seguido por injeções intradérmicas (ID) primárias de 200 μg de peptídeo conjugado em CFA (Adjuvante Completo de Freund) em 10-15 locais no Dia 0. As injeções intradérmicas (ID) de 200 μg de KLH-peptídeo em IFA (Adjuvante Incompleto de Freund) em 10-15 sítios foram feitas no Dia 14 e 200 μg de KLH-peptídeo em CFA em 1015 locais no Dia 28. Um adicional de cinco injeções intradérmicas (ID) de 200 μg de KLH-peptídeo em IFA em 10-15 sítios foram feitas nos Dias 56, 70, 84, 98 e 112. Quatro sangrias de teste (2-5 ml) foram feitas nos Dias 42, 56, 84 e 112. Uma sangria fornecendo aproximadamente 1000 ml de antissoro foi feita no final do protocolo padronizado.

[00172] O título de anticorpo foi determinado com um ensaio imu- nossorvente ligado a enzima (ELISA) com peptídeo-GGG (gama- globulina de cabra) ligado em fase sólida (0,1 μg/100 μl/poço) em placas de 96 poços de alta ligação. O soro foi diluído primeiro 50 vezes e depois diluído em diluições seriadas 2 vezes. o Título de ELISA foi calculado como o fator de diluição estimado o que resultou em uma OD a 405 nm de 0,2 e foi derivado por uma análise de regressão não-linear da curva de diluição seriada. A detecção foi obtida usando um anticorpo secundário conjugado com HRP e um substrato ABTS.

[00173] As respostas de anticorpo de ovelha à vacinação são mostradas na figura 3. Todos os soros de ovelha tiveram títulos em 6 semanas que eram pelo menos 32 vezes maiores do que a pré- imunização (1:1600). A preparação mais antigênica foi de peptídeo mtrD que teve um título 1024 vezes maior do que o nível de pré- imunização. as preparações menos imunogênicas foram de peptídeo mtrE, ORF508 e ORF819 de peptídeos da proteína de superfície. A preparação de parede celular de M. ruminantium induziu uma boa resposta de anticorpo (256 vezes maior do que os níveis de pré- imunização), mas não se sustentaram por mais do que 15 semanas apesar de vários reforços.

[00174] Ligação de anticorpo a células de M. ruminantium: um ensaio ELISA foi usado para medir a ligação de anticorpo com células de M. ruminantium. Placas MaxiSorp para ELISA (Nunc) foram revestidas com células inteiras de M. ruminantium (40 μl de células em 2 ml de tampão de carbonato de sódio) e com frações de proteína citosólica de M. ruminantium. As amostras de soro foram diluídas 1/20 (25 μl em 475 μl de diluente) em PBS Tween20 contendo caseína a 1% em pe- so/volume e incubadas em temperatura ambiente por 1 hora. A placa foi lavada 6 vezes com PBS Tween20. Um soro de controle negativo foi incluído e esse foi obtido de uma ovelha que não tinha tido colostro nem cria.

[00175] Para a detecção o conjugado usado era IgG de asno anti- ovelha/cabra HRP (Lote 061005 Star 88P da Serotec) e 50 μl de uma diluição 1/5000 (2 μl em 10 ml de diluente) foram adicionados a cada poço. O substrato 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionado depois (50 μl/poço) e a reação foi incubada em temperatura ambiente no escuro por 15 min. A solução supressora (H2SO4 a 0,05M, 50 μl/poço) foi adicionada e a placa foi lida a 450 nm.

[00176] Teste de inibição do crescimento de M. ruminantium: as amostras de soro imune foram descongeladas na capela anaeróbica e 0,1 ml de cada uma das 10 amostras foi colocada em um tubo de mi- crocentrífuga de 1,5 ml. A mistura (1 ml) foi incubada em temperatura ambiente com a tampa da capela anaeróbica aberta durante a noite para remover qualquer oxigênio dissolvido. O soro pré-imune serviu como controle negativo. A amostra de soro combinado (0,3 ml) foi adicionada em 5 ml de cultura de M. ruminantium em crescimento em tubos de Hungate em triplicata na capela anaeróbica. Gás (80% de H2 e 20% de CO2) foi bombeado para os tubos de Hungate e as culturas foram incubadas a 39°C em uma centrífuga (100 rpm). O crescimento de metanogênicos foi monitorizado pela mediação da OD a 600 nm com um espectrofotômetro e pela determinação com um cromatógrafo a gás da utilização de hidrogênio e produção de metano.

[00177] Ensaios ELISA mostraram que os anticorpos gerados por cada um dos antígenos ligaram-se a células de M. ruminantium fixadas a placas de microtitulação. Os anticorpos foram mostrados se ligar a células de M. ruminantium in vitro, embora preparações de anticorpo isolado adicionadas a culturas de M. ruminantiumnão inibissem o crescimento de metanógeno ou reduzisse a quantidade de metano formada. Entretanto, uma preparação que consistia em amostras agrupadas de antissoro de cada um dos 10 antígenos diferentes, pareceu aumentar a agregação celular quando adicionadas a culturas de M. ruminantium.

EXEMPLO 6: Síntese

[00178] Methanobrevibacter ruminantium foi escolhido para o se- quenciamento do genoma por causa de sua prevalência no rume sob uma variedade de condições dietéticas (com base nos dados da cultura e detecção molecular), na disponibilidade das culturas, na sua conveniência para o cultivo de rotina no laboratório e pela quantidade relativamente grande de estudos anteriores e literatura prévia disponíveis para esse organismo. Um número significativamente grande de genes dentro de M. ruminantium foram determinados ter uma função e dessa maneira possibilitam um quadro detalhado da vida desse organismo dentro do rume. A dependência de M. ruminantium de substratos simples (H2 + CO2, formiato) e sua interação com o ambiente do rume através de proteínas de superfície e exopolissacarídeos são alvos importantes para a inibição. Similarmente, SPIDRs guardam uma pro-messa para o direcionamento específico de M. ruminantium e para manipulações genéticas futuras para auxiliar na determinação da função do gene. Os dados da sequência elucidaram o metabolismo desse organismo e como ele interage com outros micróbios e apontam sistemas conservados e componentes entre metanogênicos que podem ser inativados para prevenir ou reduzir a formação de metano no rume. Referências Altermann E, Klaenhammer TR (2005) Pathway Voyager: pathway mapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. BMC Genomics 6:60-66. Altermann, E., and T. R. Klaenhammer. 2003. GAMOLA: a new local solution for sequence annotation and analyzing draft and finished prokaryotic genomes. Omics 7:161-169. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25, 3389-3402. Balch WE, Fox GE, Magrum LJ, Woese CR, Wolfe RS (1979) Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiological Reviews 43, 260-296. Baresi, L. and Bertani, G. 1984. Isolation of a bacteriophage for a methanogenic bacterium. In Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology. Washington DC: American Society for Microbiology, p 133. Bickle, T. A. and D. H. Kruger. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57:434-450. Bult CJ, et al. (1996) Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcusjannaschii. Science 273,1058-1073. Coutinho PM, Henrissat B (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In 'Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering' (Eds HJ Gilbert, G Davies, B Henrissat and B Svensson) pp. 3-12 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge) (Carbohydrate Active Enzymes database, hypertext transfer protocol://world wide web.cazy.org/). Delcher AL, Harmon D, Kasif S, White O, Salzberg SL (1999) Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic Acids Research 27, 4636—4641. Fleischmann et al., 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd Science 269:496-512. Fricke WF, Seedorf H, Henne A, Kruer M, Liesegang H, Hedderich R, Gottschalk HG, Thauer RK (2006) The genome sequence of Methanosphaera stadtmanae reveals why this human intestinal archaeon is restricted to methanol and H2 for methane formation and ATP synthesis. Journal of Bacteriology 188, 642-658. Godde JS, Bickerton A (2006) The repetitive DNAe called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes. Journal of Molecular Evolution 62, 718-729 Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005) A guild of 45 CRISPR- associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS Computational Biology 1:474-483. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002) Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43, 1565-1575. Jansen R, van Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002) Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. OMICS: A journal of integrative biology 6, 23-33. Jensen, L. J., Friis, C. and Ussery, D. W. 1999 Three views of microbial genomes. Res. Microbiol. 150,773-777. ’ . Joblin KN, Naylor GE, Williams AG (1990) Effect of Methanobrevibacter smithii on xylanolytic activity of anaerobic ruminal fungi. Applied and Environmental Microbiology 56, 2287-2295. Knox, M. R. and Harris, J. E. 1986. Isolation and characterisation of a bacteriophage of Methanobrevibacter smithii. In Abstracts of the XIV International Congress on Microbiology. Manchester International Union of Microbiological Societies. Kurtz S, Schleiermacher C (1999) REPuter fast computation of maximal repeats in complete genomes. Bioinformatics 15, 426-427. Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Research 25, 955-964. Loenen, W. and N. Murray. 1986 Modification enhancement by restriction alleviation protein (Ra1) of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol. 190:11-22. Lucchini, S., F. Desiere, and H. Brussow. 1999. Comparative genomics of Streptococcus thermophilus phage species supports a modular evolution theory. J. Virol. 73:8647-8656. Luo, Y. N., Pfister, P., Leisinger, T. and Wasserfallen, A. 2002. Pseudomurein endoisopeptidases PeiW and PeiP, two moderately related members of a novel family of proteases produced in Methanothermobacter strains. FEMS Microbiol. Lett. 208, 4751. Makarova, K. S., Aravind, L. and Koonin, E. V. 1999. A superfamily of archaeal, bacterial, and eukaryotic proteins homologous to animal transglutaminases. Protein Sci. 8, 1714-1719. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf Yl, Koonin EV (2006) A putative RNA interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biology Direct 1:7-32. New Zealand Statistics 2005 (www.stats.govt nz) New Zealand’s Greenhouse Gas Inventory 1990 - 2004. The National Inventory Report and Common Reporting Format. (2006) Ministry for the Environment. Hypertext transfer protocol://www.mfe.govtnz/publications/climate/nir-aprü6/nir-aprt)6.pdf. Rawlings, N. D., Morton, F. R. and Barrett, A. J. 2006. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 34, D270-D272. Reeve JN, Nolliπg J Morgan RM, Smith DR (1997) Methanogenesis: genes, genomes and who's on first? Journal of Bacteriology 179, 5975-5986. Samuel BS, Hansen EE, Manchester JK, Coutinho PM, Henrissat B, Fulton R, Latreille P, Kim K, Wilson RK, Gordon JI (2007) Genomic adaptations of Methanobrevibacter smithii to the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104, 10643-10648 Smith DR, et al. (1997) Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum ΔH: Functional analysis and comparative genomics. Journal of Bacteriology 179, 7135-7155. Smith PH, Hungate RE (1958) Isolation and characterization of Methanobacterium ruminantium n. sp. Journal of Bacteriology 75, 713-718. Staden R, Beal KF, Bonfield JK (1998) The Staden Package. Methods in Molecular Biology: Bioinformatics Methods and Protocols 132, 115-130. Tatusov RL, Natale DA, Garkavtsev IV, Tatusova TA, Shankavaram UT, Rao BS, Kiryutin B, Galperin MY, Fedorova ND, Koonin EV (2001) The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes Nucleic Acids Research 29, 22-28.

[00179] Todas as publicações e patentes mencionadas na especificação acima estão aqui incorporadas por referência. Onde a descrição precedente faz referência a números inteiros que têm equivalentes conhecidos dos mesmos, aqueles equivalentes estão aqui incorporados como se descritos individualmente. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas preferidas, deve ser compreendido que a invenção como reivindicada não deve ser in-devidamente limitada a tais modalidades específicas. É considerado que modificações adicionais podem ser feitas à invenção como aqui descrita sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Claims (8)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 641 ou SEQ ID NO: 165; e um adjuvante.

2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um conjugado ou molécula de fusão.

3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para uso na vacinação de um animal contra um metanogênio.

4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o metanogênio é Methanobrevibacter ruminantium.

5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o animal é um ruminante.

6. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em gado, ovelha, cabra, búfalo, alce, antílope, caribu e veado.

7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução das emissões de metano de um ruminante.

8. Kit para reduzir o crescimento de metanogênio ou a produção de metano em um ruminante, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de vacina, como definida na reivindicação 1.

Images