JP2017046704A - 微生物細胞抑制のためのワクチンおよびワクチン構成成分 - Google Patents
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Abstract
【課題】構成成分、特にペプチドおよびポリペプチドを含む微生物細胞、特にメタン生成菌細胞由来の細胞表面構成成分、および関連ヌクレオチドならびに抗菌ワクチンとして使用できる抗体の提供。
【解決手段】特定の配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2007年9月25日に提出した米国特許出願第60/975,104号、2007年11月22日に提出した米国特許出願第60/989,840号、および2007年11月22日に提出した米国特許出願第60/989,841号の利益を主張するものであり、これら全ての出願内容はその全体が参照によりここに取り込まれる。
本出願は、2007年9月25日に提出した米国特許出願第60/975,104号、2007年11月22日に提出した米国特許出願第60/989,840号、および2007年11月22日に提出した米国特許出願第60/989,841号の利益を主張するものであり、これら全ての出願内容はその全体が参照によりここに取り込まれる。
本発明は、ペプチド、これらのペプチドを含むポリペプチド、これらのペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドに向けた抗体を含む、抗体産生に有用な微生物細胞由来の構成成分に関する。本発明はまた、これらのペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を産生するための発現ベクターならびにホスト細胞にも関する。本発明はさらに、開示されるペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、発現ベクター、およびホスト細胞のうち1種以上を用いて、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を検出、標的化、および抑制するための方法ならびに組成物、特にワクチン組成物に関する。
ニュージーランドにおいては、農業活動が温室効果ガス排出の大部分を占める。従って農業による温室効果ガス排出を減少させることは、京都議定書によるニュージーランドの義務に応じるため重要である。この議定書は、最初の公約期間(2008〜2012)の終了までに温室効果ガスを1990年のレベルにまで減少させることを要求している。このため農業部門集団およびニュージーランド政府は、ニュージーランドの農業温室効果ガス排出を減少させる方法を同定するため、牧畜温室効果ガス研究コンソーシアム(PGGRC)を設立した。
PGGRC活動の重要な部分は、ニュージーランドで放牧される反すう動物からのメタン排出減少に対する研究であった。反すう動物からのメタン排出を軽減することについては、二つの理由から商業的に関心を持たれている。第一は、京都議定書による確約に応じないことは、政府にカーボン・クレジットの購入を強制することであり、現在のところこれは3億5千万ドルになると推定される。第二は、メタン生成は反すう胃において産生される総エネルギーの8〜12%の損失をもたらすことである。このエネルギーを逆に利用すれば、反すう動物の生産性を改善することが可能であるかもしれない。
メタンは、古細菌(Euryarchaeota)界のユリ古細菌(Archaea)門の一部である、メタン生成菌と呼ばれる微生物により反すう胃において産生される。ほとんどのメタン生成菌はCO2およびH2を唯一のエネルギー源として生育するが、あるものは生育のために酢酸またはメチル化合物を使用できる。反すう胃には、メタン生成古細菌の幾つかの異なる属が存在するが、メタノブレビバクター(Methanobrevibacter)属の種、特にM.ルミナンチウム(M.ruminantium)、およびM.スミシー(M.smithii)は、ニュージーランドの反すう動物における主なメタン生成菌であると考えられている。現在のところM.ルミナンチウム(M.ruminantium)が、PGGRCより助成金を得ているゲノム配列決定プロジェクトの課題である。このプロジェクトは反すう胃のメタン生成菌の最初のゲノム配列決定であり、メタン形成抑制の標的を発見するためのメタノブレビバクター生物学のより良い理解の確立を目的とする。
反すう胃におけるメタン生成の減少には、メタン生成菌の抑制またはそれらのメタン生成経路の不活性化が要求される。メタン産生の抑制方法は、メタン生成菌細胞を抑制する特
定の分子を同定することである。これは例えば、メタン生成菌を標的とする薬剤の使用により達成されてよい。一アプローチによれば、微生物細胞を標的とするためにワクチンが調製できる。従って、構成成分、特にペプチドおよびポリペプチドを含む微生物細胞由来の細胞表面構成成分、および関連ヌクレオチドならびに抗菌ワクチンとして使用できる抗体の同定が有用であろう。
定の分子を同定することである。これは例えば、メタン生成菌を標的とする薬剤の使用により達成されてよい。一アプローチによれば、微生物細胞を標的とするためにワクチンが調製できる。従って、構成成分、特にペプチドおよびポリペプチドを含む微生物細胞由来の細胞表面構成成分、および関連ヌクレオチドならびに抗菌ワクチンとして使用できる抗体の同定が有用であろう。
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本発明はここに詳述するように、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の単離されたペプチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチド、特にM.ルミナンチウム(M.ruminantium)の細胞表面構成成分、同様に発現ベクター、ホスト細胞、および抗体、ならびにそれらの使用法を特徴とする。
本発明は特に、例えば配列番号1〜702から成る群より選択される1アミノ酸配列の少なくとも1つの断片を含む、単離されたペプチドを特徴とする。特定の態様によれば、該ペプチドは、配列番号45〜260および332〜702のうちのいずれか1つのアミノ酸配列の少なくとも1つの断片を含む。さらなる態様によれば、該ペプチドは、配列番号10〜17のうちのいずれか1つのアミノ酸配列の少なくとも1つの断片を含む。別の態様によれば、該ペプチドは、例えば配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの細胞外ドメインを包含する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む1断片である。
本発明は特に、例えば配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを特徴とする。特定の態様によれば、該ポリペプチドは、配列番号45〜260および332〜702のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリペプチドは、配列番号10〜17のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。別の態様によれば、該ポリペプチドは、例えば配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの細胞外ドメインを包含する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む1断片である。
加えて、本発明は少なくとも1つのペプチドに対するコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。一態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号1〜702から成る群より選択される1アミノ酸配列の少なくとも1つの断片に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号45〜260および332〜702のうちのいずれか1つの少なくとも1つの断片に対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号10〜17のうちのいずれか1つの少なくとも1つの断片に対するコード配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドはコード配列の断片、例えば配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの細胞外ドメインを包含する最少の1アミノ酸配列を含む。
加えて、本発明は少なくとも1つのポリペプチドに対するコード配列を含む単離されたポ
リヌクレオチドを特徴とする。一態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号45〜260および332〜702のうちのいずれか1つに対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号10〜17のうちのいずれか1つに対するコード配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドはコード配列の断片、例えば配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの細胞外ドメインを包含する最少の1アミノ酸配列を含む。
リヌクレオチドを特徴とする。一態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号45〜260および332〜702のうちのいずれか1つに対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号10〜17のうちのいずれか1つに対するコード配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドはコード配列の断片、例えば配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの細胞外ドメインを包含する最少の1アミノ酸配列を含む。
さらなる態様によれば、本発明は、例えば配列番号703〜1373から成る群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号703〜710の核酸配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、例えば配列番号703〜710、737〜931、および1003〜1373のうちのいずれか1つによりコードされる細胞外ドメインを包含する核酸配列を含む断片またはオリゴヌクレオチドである。さらに本発明は、配列番号703〜1373のいずれか1つの核酸配列とハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を包含する。本発明はさらに、いずれか1つの核酸配列の相補体、逆相補体、逆配列、またはその断片を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを特徴とする。一態様によれば、該発現ベクターは、配列番号1〜702から成る群より選択される1アミノ酸配列の少なくとも1つの断片に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該発現ベクターは、配列番号45〜260および332〜702のうち少なくとも1つの、少なくとも1つの断片に対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該発現ベクターは、配列番号10〜17のうち少なくとも1つの、少なくとも1つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。別の態様によれば、該発現ベクターは、配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの、細胞外ドメインを包含する少なくとも1つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。
本発明はまた、ホスト細胞、例えば少なくとも1つの発現ベクターを含む微生物ホスト細胞も特徴とする。
本発明は特に、ここに開示されるペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドに向けた抗体を特徴とする。特定の態様によれば、該抗体は配列番号1〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列に向けられる。代替の態様によれば、該抗体は配列番号10〜17、45〜260、および332〜702から成る群より選択されるポリペプチド配列の少なくとも1つの断片に向けられる。特定の態様によれば、該抗体は配列番号10〜17のいずれか1つのペプチド配列の少なくとも1つの断片に結合する。さらなる態様によれば、該抗体は配列番号45〜260および332〜702のいずれか1つのポリペプチド配列の少なくとも1つの断片に結合する。代替の態様によれば、該抗体は配列番号10〜17、45〜260、および332〜702のうちのいずれか1つの、細胞外ドメインを包含するペプチドまたはポリペプチドの少なくとも1つの断片に結合する。別の態様によれば、ここに詳述されるように該抗体は、少なくとも1種の細胞抑制剤、例えば抗メタン生成化合物(例えばブロモエタンスルホン酸)、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、ならびにその他の抗生剤との1種以上の融合体または抱合体を含む。
加えて本発明は、例えばここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体を含む、配列番号1〜702のうち少なくとも1つの、改変されたペプチドまたはポリペプチドを特徴とする。これらの改変されたペプチドまたはポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、同様に開示されるポリヌクレオチドの変化、断片、変異体、および誘導体;これらの改変されたペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを用いて産生した抗体;これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター;およびこれらのベクターを含むホスト細胞もまた特徴とする。さらに、ここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体を含む改変された抗体も特徴とする。特定の態様によれば、本発明の組成物および方法はこれらの改変されたペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、または対応する発現ベクターもしくはホスト細胞を用いる。
ドするポリヌクレオチド、同様に開示されるポリヌクレオチドの変化、断片、変異体、および誘導体;これらの改変されたペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを用いて産生した抗体;これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター;およびこれらのベクターを含むホスト細胞もまた特徴とする。さらに、ここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体を含む改変された抗体も特徴とする。特定の態様によれば、本発明の組成物および方法はこれらの改変されたペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、または対応する発現ベクターもしくはホスト細胞を用いる。
本発明は単離されたペプチドまたはポリペプチド、例えば配列番号1〜702のうち少なくとも1つを含む組成物を特徴とする。単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号703〜1373のうち少なくとも1つを含む組成物もまた特徴とする。加えて本発明は、例えばここに開示されるペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド配列に向けた抗体を含む組成物を特徴とする。さらに、本発明に従う、発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を含む組成物も特徴とする。該組成物はここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体のいずれか1つを含んでよい。該組成物は少なくとも1種の細胞抑制剤(例えば融合体または抱合体として)を含んでよく、かつ例えば医薬組成物、特にワクチン組成物として処方されてよい。
本発明はまた、開示される方法に従い、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化および/または抑制するためのキットの一部としての本発明の組成物も特徴とする。該キットは、a)ここに提示される組成物の少なくとも1種;およびb)必要に応じて、例えば細胞の標的化、またはメタン生成菌もしくはその他の微生物の細胞生育または複製の抑制における使用のための説明書を含む。
本発明はまた、ペプチドまたはポリペプチド、例えば配列番号1〜702のうちのいずれか1つの少なくとも1つの断片を産生するための方法も特徴とし、該方法は、a)少なくとも1つのペプチドまたはポリペプチドのコード配列の少なくとも一部を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、ペプチドまたはポリペプチドの発現に適切な条件下で培養すること;およびb)該培養からペプチドまたはポリペプチドを回収することを含む。特定の態様によれば該ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。
本発明はまた、抗体、例えば配列番号1〜702のうちのいずれか1つの少なくとも1つの断片に向けた抗体を産生するための方法も特徴とし、該方法は、a)少なくとも1種の抗体または抗体断片のコード配列の少なくとも一部を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、抗体または抗体断片の発現に適切な条件下で培養すること;およびb)該培養からアミノ酸配列を回収することを含む。特定の態様によれば、該抗体または抗体断片は、配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列、またはその改変された配列に向けられる。代替の態様によれば、該抗体は、ここに詳述されるようにホスト動物への投与によって産生される。
加えて本発明は、少なくとも1種の細胞抑制剤の融合体または抱合体を含む抗体、例えば配列番号1〜702のうちのいずれか1つの少なくとも1つの断片に向けた抗体を産生するための方法も特徴とする。このような方法は、a)少なくとも1種の抗体もしくは抗体断片のコード配列を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、抗体または抗体断片の発現に適切な条件下で培養すること;b)抗体もしくは抗体断片に対する融合体または抱合体を形成すること(例えば、融合配列の発現または細胞抑制剤に対する化学的抱合により);およびc)該融合体または抱合体を回収することを含む。
特定の態様によれば、該抗体は、配列番号1〜702のいずれか1つの少なくとも1つの断片、またはその改変された配列に向けられる。さらなる態様によれば、ここに詳述されるように該抑制剤は、抗メタン生成化合物(例えばブロモエタンスルホン酸)、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、ならびにその他の抗生剤から選択される。代替の態様によれば、該抗体は、ここに詳述されるようにホスト動物への投与よって産生され、次いで抱合される。
加えて、本発明は微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の抑制(例えば生育または複製の抑制)方法を特徴とし、該方法は細胞を、例えば配列番号1〜702のいずれか1つの少なくとも1つの断片に向けた抗体もしくは抗体断片、または抗体融合体もしくは抱合体、またはいずれの改変抗体と接触させることを含む。
別の方法として、該細胞はここに詳述されるワクチン組成物の投与によって抑制される。
さらに本発明は微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の抑制(例えば生育または複製の抑制)方法を特徴とし、該方法は、a)必要に応じて、ここに開示される少なくとも1種の抗体を産生または単離すること;およびb)該細胞を該抗体に接触させることを含む。特定の態様によれば、該抗体は配列番号1〜702のいずれか1つの少なくとも1つの断片、またはその改変配列に向けられる。特定の態様によれば、該抗体はさらに、例えば融合体または抱合体として付着する少なくとも1種の細胞抑制剤を含む。その他の態様によれば、該抗体は組成物、例えばワクチン組成物として被験体に投与される。
加えて、本発明は微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の抑制(例えば生育または複製の抑制)方法を特徴とし、該方法は、a)必要に応じて、ここに開示される少なくとも1つのペプチドもしくはポリペプチドを産生または単離すること;およびb)被験体に免疫反応を誘導するため、それらに該ペプチドまたはポリペプチドを投与することを含む。特定の態様によれば、該ペプチドまたはポリペプチドは配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。その他の態様によれば、該ペプチドまたはポリペプチドは組成物、例えばワクチン組成物として被験体に投与される。
本発明はさらに、ポリペプチド、特に細胞表面ポリペプチドまたは対応するペプチドもしくはポリヌクレオチドのレベルを検出および/または測定するための方法を特徴とし、該方法は、1)被験体由来のサンプルをポリペプチド(例えば、配列番号1〜702のいずれか1つの少なくとも1つの断片、またはその改変配列)、または対応するペプチドもしくはポリヌクレオチド(例えば、配列番号703〜1373のいずれか1つの少なくとも1つの断片、またはその改変配列)に向けた抗体と接触させること;および2)サンプル中で対応するポリペプチド、ペプチド、またはポリヌクレオチドと形成された抗体複合体の存在またはレベルを決定することを含む。このような方法はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞のレベルを検出および/または測定するためにも使用できる。
本発明はまた、ポリヌクレオチド、特に細胞表面構成成分をコードするポリヌクレオチドのレベルを検出および/または測定する方法も特徴とし、該方法は、1)被験体由来のサンプルを相補的ポリヌクレオチド(例えば、配列番号703〜1373のいずれか1つの少なくとも1つの断片、またはその改変配列に相補的な配列)と接触させること;および2)サンプル中でポリヌクレオチドと形成されたハイブリダイゼーション複合体の存在またはレベルを決定することを含む。このような方法はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞のレベルを検出および/または測定するためにも使用できる。
特定の態様によれば、本発明の方法はin vivoまたはin vitro発現構成成分
を利用する。その他の態様によれば、該方法は、組み換え、合成、もしくは半合成の方法、または内在性の方法により産生される、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を用いる。
を利用する。その他の態様によれば、該方法は、組み換え、合成、もしくは半合成の方法、または内在性の方法により産生される、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を用いる。
本発明のその他の態様および実施形態を以下に述べる。
本発明をその特定の実施形態への参照および図面への参照と共に記述する。
発明の詳細な説明
定義
「抗体」という用語は可能な意味の最も広い範囲において理解されなければならず、かつ未変化のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことが意図される。抗体の断片および誘導体もまた、それらが望まれる生物学的活性を示す限りにおいて網羅されることが意図される。抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ig)分子の免疫学的活性部位、すなわち抗原に特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含む分子を包含する。限定はされないが、これらはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fc、Fab、Fab’、およびFab2断片、ならびにFab発現ライブラリーを含む。
定義
「抗体」という用語は可能な意味の最も広い範囲において理解されなければならず、かつ未変化のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことが意図される。抗体の断片および誘導体もまた、それらが望まれる生物学的活性を示す限りにおいて網羅されることが意図される。抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ig)分子の免疫学的活性部位、すなわち抗原に特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含む分子を包含する。限定はされないが、これらはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fc、Fab、Fab’、およびFab2断片、ならびにFab発現ライブラリーを含む。
抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる、IgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのクラスのいずれかに関連する。同様に、これらはサブクラス、例えばIgG1、IgG2、およびその他を含む。軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であってよい。ここでの抗体への参照は、全てのクラス、サブクラス、および型への参照を含む。例えば、1種以上の源、例えばマウス、ヒト、もしくは反すう動物の配列のうち1種以上に対して特異的であるモノクローナル抗体またはその断片であるキメラ抗体もまた含まれる。さらに、カメリド抗体またはナノボディーも含まれる。ここで、「抗体」またはいずれの類似語へのそれぞれの参照は、未変化の抗体、同様に断片、変化、誘導体、またはそれらの変異体のいずれも含むことが理解されるであろう。
ここで用いられる、ペプチド、ポリペプチド、または抗体をコードする「変化した」核酸配列は、同じかまたは機能的に同等な配列をコードするポリヌクレオチドをもたらす、異なるヌクレオチドの欠失、挿入、または置換による核酸配列を含む。コードされるペプチド、ポリペプチド、または抗体もまた「変化」してよく、サイレント変化を生じて機能的に同等な配列をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含む。意図されたアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性性質の類似性に基づき、生物学的活性(例えば細胞結合、膜結合)または免疫原性/免疫学的活性を保持する限りにおいて行なわれてよい。例えば陰性荷電アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでよく;陽性荷電アミノ酸はリジンおよびアルギニンを含んでよく;類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基をもつアミノ酸はロイシン、イソロイシン、およびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびスレオニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンを含んでよい。
ここで用いられる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体、およびそれらのいずれの断片の配列をも意味し、かつ天然発生、組み換え、合成、または半合成分子のいずれも意味する。本発明の配列は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250アミノ酸、好ましくは少なくとも5から10、10から20、20から30、30から40、40から50、50から100、100から150、150から200、または200から250アミノ酸を含む。配列は、アミノ酸配列の生物学的活性(例えば細胞生育および/または増殖における効果)または免疫原性/免疫学的活性を保持する。「アミノ酸配列」および類似語は完全長分子に付随する完全な天然アミノ酸配列に限定されず、そのいずれの断片、変化、誘導体、および変異体も含む。
ここで用いられる「増幅」は、核酸配列の追加コピーの産生を意味し、一般には当該技術分野において公知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行われる(Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY)。
ここで用いられる「生物学的に活性のある」または「機能的」という用語は、天然発生配列の構造的、免疫原的、もしくは生化学的機能(例えば細胞結合、膜結合)の1種以上を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
ここで用いられる「細胞抑制剤」または「抑制剤」という用語は、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の生育もしくは複製を減少または遮断する薬剤を意味する。細胞抑制剤は、例えば細胞分裂を減少または遮断するために作用できる。抑制剤は、例えばDNA合成、RNA合成、タンパク質合成、もしくは翻訳後修飾を減少または遮断できる。抑制剤はまた、メタン生成経路に関与する酵素の活性を減少または遮断することもできる。抑制剤はまた、免疫システム構成成分による認識のために細胞を標的化することもできる。細胞の抑制はまた、例えば溶解、アポトーシス、壊死などによる細胞の死滅および細胞死も含む。有用な抑制剤は、ここに詳述されるように抗メタン生成化合物(例えばブロモエタンスルホン酸)、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、ならびにその他の抗生剤を含むが、これらに限定されない。
ここで用いられる「相補的な」または「相補性」という用語は、許容される塩および温度条件下での塩基対によるポリヌクレオチドの自然結合を意味する。配列A−G−Tに対する相補的配列はT−C−A、逆相補体はA−C−T、および逆配列はT−G−Aである。二つの単鎖分子の間での相補性は、幾つかの核酸のみの結合においては部分的であってよく、また二つの単鎖分子の間に全て相補性が存在するときには完全であってよい。核酸鎖の間での相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響をもつ。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応ならびにPNA分子の設計および使用において特に重要である。
ここで用いられる「誘導体」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、もしくは抗体をコードする核酸、またはそれらに相補的な核酸の化学的修飾を意味する。このような修飾は例えば、水素のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換を含む。好ましい態様によれば核酸誘導体は、天然分子の生物学的もしくは免疫原性/免疫学的活性を保持する、ペプチド、ポリペプチド、または抗体をコードする。誘導体ペプチド、ポリペプチド、または抗体は、グリコシル化、ペグ化により、またはそれが由来する配列の生物学的機能(例えば細胞結合、膜結合)の1種以上、もしくは免疫原性/免疫学的活性を保持する同様の過程により修飾されたものである。
ここで用いられる「相同性」という用語は、相補性の程度を意味する。部分的相同性(す
なわち100%同一性未満)、または完全相同性(すなわち100%同一性)があってよい。標的核酸へのハイブリダイズから、同一配列を少なくとも部分的に抑制する部分的相補配列には、機能的用語である「実質的に相同」の使用が適用される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの抑制は、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ(例えばサザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて試験されてよい。実質的に相同な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全相同配列の標的配列への結合に競合、および該結合を抑制し得る。これは低ストリンジェンシー条件が非特異結合を許容するということ;低ストリンジェンシー条件は二つの配列の互いの結合が特異的(すなわち選択的)相互作用であることを要求すると述べるものではない。
なわち100%同一性未満)、または完全相同性(すなわち100%同一性)があってよい。標的核酸へのハイブリダイズから、同一配列を少なくとも部分的に抑制する部分的相補配列には、機能的用語である「実質的に相同」の使用が適用される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの抑制は、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ(例えばサザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて試験されてよい。実質的に相同な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全相同配列の標的配列への結合に競合、および該結合を抑制し得る。これは低ストリンジェンシー条件が非特異結合を許容するということ;低ストリンジェンシー条件は二つの配列の互いの結合が特異的(すなわち選択的)相互作用であることを要求すると述べるものではない。
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対を通して相補鎖に結合するいずれの過程も意味する。
ここで用いられる「挿入」または「付加」という用語は、天然発生分子に比較したアミノ酸残基またはヌクレオチドのそれぞれ1つ以上の追加をもたらす、アミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
ここで用いられる「メタン生成菌」は、メタンガスを産生する微生物を意味し、メタノブレビバクター、メタノサーモバクター、メタノミクロビウム、メタノバクテリウム、およびメタノサルシナを含む。特定のメタン生成菌は、メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)(すなわち、M1系統または系統DSM1093)、メタノブレビバクター・スミシー(Methanobrevibacter smithii)、メタノブレビバクター・アシディデュランス(Methanobrevibacter acididurans)、メタノブレビバクター・サウエリ(Methanobrevibacter thaueri)、メタノブレビバクテリウム・ブライアンティイ(Methanobacterium bryantii)、メタノブレビバクテリウム・フォルミシカム(Methanobacterium formicicum)、メタノサーモバクター・マーブルゲンシス(Methanothermobacter marburgensis)、メタノサーモバクター・ウォルフェイイ(Methanothermobacter wolfeii)、メタノスファエラ・スタッドマナエ(Methanosphaera stadtmanae)、メタノミクロビウム・モービレ(Methanomicrobium mobile)、メタノサルシナ・バーケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノコッコイデス・ブルトニイ(Methanococcoides burtonii)、およびメタノロブス・テイロリイ(Methanolobus taylorii)を含むがこれらに限定されない。全てのメタン生成菌の属および種はこの用語により包含される。
ここで用いられる「微生物」細胞は、天然発生または遺伝的に改変された微生物細胞を意味し、メタン生成菌、好塩菌、および好熱好酸菌のような古細菌、ならびにシアノバクテリア、スピロヘータ、プロテオバクテリア、同様にグラム陽性およびグラム陰性菌のような真正細菌を含む。
「改変された」という用語は、ここに述べられるような、変化した配列、および配列断片、変異体、ならびに誘導体を意味する。
ここで用いられる「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはそれらの断片の配列、および単鎖もしくは二重鎖であってよい天然、組み換え、合成、もしくは半合成起源の、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または翻訳領域もしくは非翻訳領域を表してよい、DNAまたはRNAを意味する。本発明の配列は、好ましくは少なくとも12、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、300、450、600、750ヌクレオチド、好ましくは少なくとも15から30、30から60、60から90、90から120、120から150、1
50から300、300から450、450から600、もしくは600から750ヌクレオチド、または少なくとも1000ヌクレオチド、または少なくとも1500ヌクレオチドを含む。ここで「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」への各参照は、天然の完全長配列、同様にそのいずれの相補体、断片、変化、誘導体、または変異体も含み得ることが理解されるであろう。
50から300、300から450、450から600、もしくは600から750ヌクレオチド、または少なくとも1000ヌクレオチド、または少なくとも1500ヌクレオチドを含む。ここで「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」への各参照は、天然の完全長配列、同様にそのいずれの相補体、断片、変化、誘導体、または変異体も含み得ることが理解されるであろう。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、PCR増幅、配列決定、またはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用できる、少なくとも6、8、10、12、15、18、21、25、27、30、もしくは36ヌクレオチド、または少なくとも12から36ヌクレオチド、または少なくとも15から30ヌクレオチドの核酸配列を意味する。ここで用いられるオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において一般に定義される「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、および「プローブ」の語に実質的に同等である。
「ポリヌクレオチド」という用語が単数または複数で用いられるとき、一般にいずれの核酸配列、例えば、未改変のRNAもしくはDNAまたは改変RNAもしくはDNAであってよい、いずれのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。これは単鎖および二重鎖DNA、単鎖および二重鎖領域を含むDNA、単鎖および二重鎖RNA、ならびに単鎖および二重鎖領域を含むRNA、単鎖もしくはより典型的には二重鎖であってよく、または単鎖および二重鎖領域を含んでよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。RNAもしくはDNA,またはRNAおよびDNAの両方を含む三重鎖領域もまた含まれる。特にmRNA、cDNA、およびゲノムDNA、ならびにそれらのいずれの断片も含まれる。この用語は1以上の改変された塩基、例えばトリチウム標識された塩基、またはイノシンのような独特な塩基を含む、DNAおよびRNAを含む。本発明のポリヌクレオチドはコード配列もしくは非コード配列、またはセンスもしくはアンチセンス配列、またはsiRNAのようなiRNAを包含できる。ここで「ポリヌクレオチド」または類似語への各参照は、完全長配列、同様にそのいずれの相補体、断片、変化、誘導体、または変異体も含み得ることが理解されるであろう。
ここで用いられる「ペプチド」および「ポリペプチド」は、天然、合成、半合成、または組み換えを問わないいずれの源由来の、いずれの種、好ましくは微生物から得られた、本発明の単離されたペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に本発明のペプチドまたはポリペプチドは、メタン生成菌細胞、例えばメタノブレビバクター細胞、特にM.ルミナンチウム(M.ruminantium)、またはM.スミシー(M.smithii)細胞から得ることができる。組み換え産生のためには、本発明のペプチドまたはポリペプチドは微生物細胞または真核細胞、例えば大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、バチルス属(Bacillus)、サルモネラ属(Salmonella)、酵母、ショウジョウバエ(Drosophila)のような昆虫細胞、COSおよびCHO細胞のような動物細胞、または植物細胞から得ることができる。ここで「ペプチド」または「ポリペプチド」への各参照は、完全長配列、同様にそのいずれの断片、変化、誘導体、または変異体も含み得ることが理解されるであろう。
ここで用いられる「ペプチド核酸」または「PNA」は、ペプチド骨格を通して連結する塩基を含むアンチセンス分子または抗遺伝子薬剤を意味する。
ここで用いられる「反すう動物」という用語は、特別な型の消化器官として反すう胃をもつ動物を意味する。反すう動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ヘラジカ、アンテロープ、カリブー、およびシカを含むがこれらに限定されない。
ここで用いられる「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー」という用語
は、核酸、塩、および温度によって規定されるハイブリダイゼーションの条件を意味する。これらの条件は当該技術分野において公知であり、同一または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更されてよい。例えば、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, および Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York, NY. を参照のこと。低または高ストリンジェンシーのいずれかを含む多数の同等な条件は、配列(DNA、RNA、塩基組成物)の長さおよび性質、標的(DNA、RNA、塩基組成物)の性質、環境(溶液中または固体基質上での不動化)、塩およびその他の構成成分(例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび/またはポリエチレングリコール)の濃度、ならびに反応温度(例えば、プローブの融解温度より約5℃低い温度から、融解温度より約20℃から25℃低い温度の範囲内)のような因子に依存する。上に列挙した条件とは異なるが同等である、低または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を作り出すため、1つ以上の因子が変化させられてよい。
は、核酸、塩、および温度によって規定されるハイブリダイゼーションの条件を意味する。これらの条件は当該技術分野において公知であり、同一または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更されてよい。例えば、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, および Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York, NY. を参照のこと。低または高ストリンジェンシーのいずれかを含む多数の同等な条件は、配列(DNA、RNA、塩基組成物)の長さおよび性質、標的(DNA、RNA、塩基組成物)の性質、環境(溶液中または固体基質上での不動化)、塩およびその他の構成成分(例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび/またはポリエチレングリコール)の濃度、ならびに反応温度(例えば、プローブの融解温度より約5℃低い温度から、融解温度より約20℃から25℃低い温度の範囲内)のような因子に依存する。上に列挙した条件とは異なるが同等である、低または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を作り出すため、1つ以上の因子が変化させられてよい。
「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は鳥類ならびに哺乳類、例えば反すう動物、および特にマウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、牝ウシ、およびウマを含むがこれらに限定されない。
ここで用いられる「実質的に精製された」または「単離された」という用語は、細胞、組み換え、または合成環境から取り除かれ、かつその環境において付随しているその他の構成成分を少なくとも60%含まない、好ましくは75%含まない、最も好ましくは少なくとも90%含まないかまたは少なくとも99%含まない、核酸またはアミノ酸配列を意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、同定され、かつそれらが自然状態において付随している少なくとも1つの混入分子から分離されている。従って、単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらが自然界において見出される形または設定とは異なる形であることが理解されるであろう。「単離された」は、必ずしも配列が精製された正確な程度を(例えば特定のパーセンテージ)反映しないことがさらに認識されるであろう。
ここで定義される「形質転換」は、外来性DNAが進入してレシピエント細胞を変化させる過程を表す。これは当該技術分野において公知の様々な方法を用い、自然または人工的条件下で起こってよい。形質転換は、原核または真核ホスト細胞内に外来核酸配列を挿入するための、いずれの公知の方法にも依存してよい。方法は形質転換されるホスト細胞の型に基づいて選択され、ウィルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および微粒子銃を含んでよいがこれらに限定されない。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたDNAが自己複製プラスミドまたはホスト染色体の一部のいずれかとして複製できる、安定的に形質転換された細胞を含む。これらはまた、挿入されたDNAまたはRNAを限られた期間に一過性に発現する細胞も含む。
ここで用いられる「ワクチン」は、被験体における免疫反応を刺激するための全ての構成成分および組成物を含む。この点において特に有用なものはペプチドワクチンを含むサブユニットワクチン、ならびにベクターワクチン、核酸ワクチン、および食用ワクチンである。ワクチンは抗原、特に微生物抗原に対する免疫反応を確立または強化するために用いることができる。特定の態様によれば、ワクチンはホストの防御反応、例えば抗体形成、Tヘルパー、およびT細胞反応を惹起する抗原を含む。ワクチンはまた、例えば受動免疫のために抗体を含むこともできる。
ここで用いられるペプチド、ポリペプチド、または抗体の「変異体」は、1つ以上のアミノ酸により変化させられたアミノ酸配列を意味する。変異体ポリヌクレオチドは1つ以上のヌクレオチドにより変化させられる。変異体は、例えばロイシンのイソロイシンによる
置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学特性を有する「保存的な」変化をもたらしてよい。さらにまれには、変異体は、例えばグリシンのトリプトファンによる置換のような「非保存的な」変化をもたらしてよい。類似の小さな変異はアミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方もまた含んでよい。生物学的または免疫原性/免疫学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、当該技術分野において公知のコンピュータープログラム、例えばLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて見出されてよい。
置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学特性を有する「保存的な」変化をもたらしてよい。さらにまれには、変異体は、例えばグリシンのトリプトファンによる置換のような「非保存的な」変化をもたらしてよい。類似の小さな変異はアミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方もまた含んでよい。生物学的または免疫原性/免疫学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、当該技術分野において公知のコンピュータープログラム、例えばLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて見出されてよい。
本発明はまた、少なくとも1つの生物学的活性(例えば細胞結合、膜結合)または免疫原性/免疫学的活性を保持する変異体も包含する。好ましい変異体は、実質的に同じであるかまたは機能的に同等な配列を有する、例えば開示される配列に対して少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するものである。最も好ましい変異体は、ここに開示される配列に対して少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するものである。パーセンテージ同一性は、以下に述べるように二つの配列を比較するため整列させること、整列された部分における同一な残基の数を決定すること、この数を本発明の(クエリー)配列内の全残基数で割ること、および結果に100を掛けることにより決定される。有用なアラインメントプログラムはAlignX(Vector NTI)である。
発明の説明
メタンは反すう動物の前腸内で、反すう胃システムにおける炭素の最終還元作用を行うメタン生成菌により産生される。多段階メタン生成経路は、主に非反すう胃メタン生成菌の研究によって十分に解明されているが、反すう胃においてメタン生成菌の生育および存続を可能にするための適応はよく理解されていない。メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)は、ニュージーランドの反すう動物における有名なメタン生成菌である。ここに述べるように、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のゲノムが配列決定され、約3.0Mbのサイズにおける33.68%のGC含有量が示された。メタン生成経路の全ての構成成分が同定され、これらの遺伝子配列と、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum) および メタノスファエラ・スタッドマナエ(Methanosphaera stadtmanae)の遺伝子配列との比較は、メタノバクテリウム目内でメタン生成遺伝子機構が保存されていることを示した(図1C)。該ゲノムは、その他の反すう胃微生物との共生を仲介し得ることを示す特徴を持つ、多数の大きな表面タンパク質を含む。本発明の様々な態様によれば、同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、反すう胃におけるメタン生成菌および/またはメタン生成を抑制し、かつメタン生成におけるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)の役割をさらに解明するための方法として使用できる。特に有用なものは、メタン生成に関与する構成成分として(図6A〜6C)、細胞表面構成成分として(図7A〜7C)、菌体外多糖の生合成に関与する構成成分として(図8A〜8C)、膜貫通ドメインの構成成分として(図9A〜9C)同定された開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド、同様に抗体産生に用いられるポリヌクレオチドおよびポリペプチド(図5A〜5B)である。
メタンは反すう動物の前腸内で、反すう胃システムにおける炭素の最終還元作用を行うメタン生成菌により産生される。多段階メタン生成経路は、主に非反すう胃メタン生成菌の研究によって十分に解明されているが、反すう胃においてメタン生成菌の生育および存続を可能にするための適応はよく理解されていない。メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)は、ニュージーランドの反すう動物における有名なメタン生成菌である。ここに述べるように、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のゲノムが配列決定され、約3.0Mbのサイズにおける33.68%のGC含有量が示された。メタン生成経路の全ての構成成分が同定され、これらの遺伝子配列と、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum) および メタノスファエラ・スタッドマナエ(Methanosphaera stadtmanae)の遺伝子配列との比較は、メタノバクテリウム目内でメタン生成遺伝子機構が保存されていることを示した(図1C)。該ゲノムは、その他の反すう胃微生物との共生を仲介し得ることを示す特徴を持つ、多数の大きな表面タンパク質を含む。本発明の様々な態様によれば、同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、反すう胃におけるメタン生成菌および/またはメタン生成を抑制し、かつメタン生成におけるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)の役割をさらに解明するための方法として使用できる。特に有用なものは、メタン生成に関与する構成成分として(図6A〜6C)、細胞表面構成成分として(図7A〜7C)、菌体外多糖の生合成に関与する構成成分として(図8A〜8C)、膜貫通ドメインの構成成分として(図9A〜9C)同定された開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド、同様に抗体産生に用いられるポリヌクレオチドおよびポリペプチド(図5A〜5B)である。
ペプチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチド
本発明は、配列番号1〜702のうち少なくとも1つ、ならびにその断片、変異体、および誘導体を含む、ペプチドおよびポリペプチドを包含する。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、その生物学的活性を決定するため、様々なアッセイにおいて、発現され、かつ使用されてよい。該ペプチドおよびポリペプチドは大量合成および単離手順、例えば商業的産生のために使用されてよい。このようなペプチドおよびポリペプチドは、抗体を産生するため、対応するアミノ酸配列を単離するため、かつ該アミノ酸配列のレベルを定量的に決定するために使用されてよい。該ペプチドおよびポリペプチドは、微生物細胞、特
にメタン生成菌細胞の標的化および抑制のためのワクチンに使用できる。該ペプチドおよびポリペプチドはまた、このような細胞の生育および複製を抑制するための抗体の調製にも使用できる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、組成物、例えば医薬組成物、特にワクチン組成物としても使用されてよい。特定の態様によれば、徐放反すう胃装置が、本発明のペプチド、ポリペプチド、抗体、および組成物(例えば医薬組成物、特にワクチン組成物)と共に使用できる。
本発明は、配列番号1〜702のうち少なくとも1つ、ならびにその断片、変異体、および誘導体を含む、ペプチドおよびポリペプチドを包含する。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、その生物学的活性を決定するため、様々なアッセイにおいて、発現され、かつ使用されてよい。該ペプチドおよびポリペプチドは大量合成および単離手順、例えば商業的産生のために使用されてよい。このようなペプチドおよびポリペプチドは、抗体を産生するため、対応するアミノ酸配列を単離するため、かつ該アミノ酸配列のレベルを定量的に決定するために使用されてよい。該ペプチドおよびポリペプチドは、微生物細胞、特
にメタン生成菌細胞の標的化および抑制のためのワクチンに使用できる。該ペプチドおよびポリペプチドはまた、このような細胞の生育および複製を抑制するための抗体の調製にも使用できる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、組成物、例えば医薬組成物、特にワクチン組成物としても使用されてよい。特定の態様によれば、徐放反すう胃装置が、本発明のペプチド、ポリペプチド、抗体、および組成物(例えば医薬組成物、特にワクチン組成物)と共に使用できる。
本発明のペプチドは、(a)配列番号1〜702から成る群より選択される1アミノ酸配列の少なくとも1つの断片、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含むペプチド;(b)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列の機能的ドメイン、ならびにその断片および変異体を含むペプチド;および(c)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列の少なくとも1つの特定された数の近接残基、またはその変異体もしくは誘導体を含むペプチドから成る群より選択される少なくとも1つの配列を含む。一実施形態によれば、本発明は配列番号1〜9のうち少なくとも1つのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドを包含する。これらの配列の全ては、ここに本発明のペプチドとして総称される。
本発明のポリペプチドは、(a)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含むポリペプチド;(b)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列の機能的ドメイン、ならびにその断片および変異体を含むポリペプチド;および(c)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列の少なくとも1つの特定された数の近接残基、またはその変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドから成る群より選択される少なくとも1つの配列を含む。一実施形態によれば、本発明は配列番号1〜9のうち少なくとも1つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。これらの配列の全ては、ここに本発明のポリペプチドとして総称される。
本発明はまた、配列番号1〜702のペプチドまたはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ゲノムマッピング、物理的マッピング、および多かれ少なかれ関連する細胞表面構成成分の遺伝子のクローニングにおいて有用である。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されるプローブは、スロットブロット技術またはマイクロアレイ分析のような当該技術分野における公知の技術を用いて、十分に相同的なDNAおよびRNA配列を細胞内に有するいずれの生物の遺伝子の存在を検出、および発現パターンを試験するために用いられてよい。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されるプライマーは、配列決定およびPCR増幅に用いられてよい。本発明のポリヌクレオチドは、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化および抑制するワクチンのための発現ベクターおよびホスト細胞の調製に使用できる。本発明はさらに、このような細胞の生育または複製を抑制する抗体の産生のための、該ポリヌクレオチドの使用も包含する。本発明のポリヌクレオチドはまた、組成物、例えば医薬組成物、特にワクチン組成物としても使用されてよい。特定の態様によれば、徐放反すう胃装置が、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞、および組成物(例えば医薬組成物、特にワクチン組成物)と共に使用できる。
本発明のポリヌクレオチドは、(a)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列を含む配列、またはその断片もしくは変異体;(b)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列の相補体、逆配列、および逆相補体、またはその断片もしくは変異体;(c)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列に含まれる翻訳領域、ならびにその断片および変異体;(d)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列の機能的ドメイン、ならび
にその断片および変異体;および(e)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列の少なくとも1つの特定された数の近接残基を含む配列、またはその変異体;ならびに(f)配列番号703〜1373のいずれか1つの少なくとも1つの特定された数の近接ヌクレオチド、を含む配列から成る群より選択される配列の少なくとも1つを含む。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、ならびにその変異体もまた提供される。これらのポリヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの全ては、ここに本発明のポリヌクレオチドとして総称される。
にその断片および変異体;および(e)配列番号1〜702から成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列のコード配列の少なくとも1つの特定された数の近接残基を含む配列、またはその変異体;ならびに(f)配列番号703〜1373のいずれか1つの少なくとも1つの特定された数の近接ヌクレオチド、を含む配列から成る群より選択される配列の少なくとも1つを含む。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、ならびにその変異体もまた提供される。これらのポリヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの全ては、ここに本発明のポリヌクレオチドとして総称される。
当業者は、遺伝コードの縮重の結果として、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多数、いずれの既知および天然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最小の相同性を有する幾つか、が産生されてよいことが認識されるであろう。従って本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によって作り出されてよいヌクレオチド配列の、可能な変動のそれぞれおよび全てを意図する。これらの組み合わせは、天然発生アミノ酸配列に適用される標準的な三つ組の遺伝コードに従って作られ、かつこれら全ての変異体は具体的に開示されたものとみなされる。
ペプチドもしくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体は、適切に選択されたペプチドまたはストリンジェンシーの条件下で天然発生配列のヌクレオチド配列に好ましくハイブリダイズできる。しかしながら、実質的に異なるコドン用法を有する、ペプチドもしくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは誘導体を産生することは有利であろう。コドンは、ホストによる特定のコドンの使用頻度に従い、特定の原核または真核ホストにおけるペプチドまたはポリペプチドの発現率を増大させるように選択されてよい。コードされるアミノ酸配列を変化させることなく、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその誘導体を実質的に変化させるその他の理由は、より望ましい特性、例えば天然発生配列から産生された転写物よりも長い半減期を有するRNA転写物の産生を含む。
本発明はまた、ペプチドもしくはポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードする、DNA配列またはその断片の、完全な合成化学による産生も包含する。産生後、該合成配列は当該技術分野において公知の試薬を用いて、多数の利用可能な発現ベクターおよび細胞システムのいずれにも挿入されてよい。さらに合成化学は、ペプチドもしくはポリペプチドをコードする配列、またはそのいずれの変異体もしくは断片に変異を導入するために使用されてよい。本発明はまた、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) および Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511) に説明されるようなストリンジェンシーの様々な条件下において、特許請求されるヌクレオチド配列、特に配列番号703〜1373に示されるものにハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列もまた包含する。
当該技術分野において公知かつ一般的に入手可能なDNA配列決定法は、本発明の実施形態のいずれの実践にも使用されてよい。該方法は、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp、クリーブランド、オハイオ州)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、熱安定型T7ポリメラーゼAmersham Pharmacia Biotech(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)のような酵素、またはLife Technologies(ゲイサーズバーグ、メリーランド州)により市販されているELONGASE Amplification Systemに見出されるような、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組み合わせを用いてよい。好ましくは、この過程はHamilton Micro Lab 2200(ハミルトン、リノ、ネバダ州)、Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research、ウォータータウン、マサチューセッツ州)、ABI Catalyst ならびに 373 および 377 DNA Sequencers(Perkin Elmer)、またはGenome Sequencer 20(商標)(Roche Diagnostics)のような装置を用いて自動化される。
ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を用いて、かつプロモーターおよび調節性エレメントのような上流の配列を検出するための当該技術分野において公知の様々な方法を用いることにより伸長されてよい。例えば、用いられてよい一方法である「制限酵素部位」PCRは、既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を取得するために普遍的なプライマーを使用する(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322)。特にゲノムDNAは、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーの存在下で最初に増幅される。増幅された配列は、次に同じリンカープライマーおよび最初のプライマーの内部に特異的な別のプライマーによる2回目のPCRに供される。PCRの各回の産物は適切なRNAポリメラーゼによって転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。
サイズの解析または配列決定法もしくはPCR産物のヌクレオチド配列の確認のため、市販されているキャピラリー電気泳動システムが使用されてよい。特にキャピラリー配列決定法は、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、レーザーにより活性化される4種の異なる蛍光色素(各ヌクレオチドに対して1種)、および放射された波長の電荷結合素子カメラによる検出を用いてよい。出力/光強度は適切なソフトウェア(例えばGENOTYPER および Sequence NAVIGATOR、Perkin Elmer)を用いて電気的シグナルに変換されてよく、サンプルの負荷からコンピューター解析までの全体の過程および電気的データ表示は、コンピューターにより制御されてよい。キャピラリー電気泳動は、特定のサンプル中に限られた量で存在し得るDNA小片の配列決定に特に好ましい。
本発明の別の実施形態によれば、適切なホスト細胞内でペプチドもしくはポリペプチド、またはその断片もしくは変異体の発現を導く組み換えDNA分子内で、該ペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片が使用されてよい。遺伝子コードに固有の縮重により、実質的に同じかまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列が産生され得り、これらの配列はペプチドまたはポリペプチドのクローニングおよび発現のために使用されてよい。本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および/または発現を修飾する変化を含むがこれらに限定されない様々な理由によりアミノ酸をコードする配列を変化させるため、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて操作することができる。ヌクレオチド配列の操作のため、ランダム断片化および遺伝子断片のPCR再構築によるDNAシャッフリング、ならびに合成オリゴヌクレオチドが使用されてよい。例えば新しい制限酵素部位の挿入、グリコシル化パターンの変化、コドン優先度の変更、変異の導入などのために部位特異的変異誘発が使用されてよい。
本発明の別の実施形態によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする天然、改変、または組み換え核酸配列が、融合タンパク質をコードするために異種性配列に連結されてよい。これは例えば、市販の抗体により認識できるキメラ配列をコードするために有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のペプチドまたはポリペプチドと異種性タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作されてもよく、これによりペプチドまたはポリペプチドは異種性部分から切断され精製され得る。
別の実施形態によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列は、当該技術分野において公知の化学的方法を用い、全体または一部が合成されてよい(Caruthers, M. H.
et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl.
Acids Res. Symp. Ser. 225-232を参照)。あるいは、該ポリペプチドそれ自体は、アミノ酸配列またはその断片を合成する化学的方法を用いて産生されてよい。例えば、ポリペプチド合成は様々な固相技術を用いて行うことができ(Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)、かつ
例えばABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer)を用いた自動合成が達成されてよい。ペプチドまたはポリペプチドの様々な断片は別々に化学合成され、完全長分子を産生するための化学的方法を用いて組み合わせられてよい。
et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl.
Acids Res. Symp. Ser. 225-232を参照)。あるいは、該ポリペプチドそれ自体は、アミノ酸配列またはその断片を合成する化学的方法を用いて産生されてよい。例えば、ポリペプチド合成は様々な固相技術を用いて行うことができ(Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)、かつ
例えばABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer)を用いた自動合成が達成されてよい。ペプチドまたはポリペプチドの様々な断片は別々に化学合成され、完全長分子を産生するための化学的方法を用いて組み合わせられてよい。
新たに合成されたペプチドまたはポリペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY)により単離されてよい。合成ペプチドまたはポリペプチドの組成物は、アミノ酸分析または配列決定により確認されてよい(例えば、エドマン分解法;Creighton、上記)。加えて、ペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列またはそのいずれの一部は、変異分子を産生するため、直接合成の間に変化させられてよく、かつ/または化学的方法を用いてその他のタンパク質由来の配列またはそのいずれの一部と組み合わせられてよい。
生物学的に活性のあるペプチドまたはポリペプチドを発現させるため、該配列または機能的同等物をコードするヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターへ挿入されてよい。ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するため、当業者に公知の方法が用いられてよい。これらの方法は、in vitro組み換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組み換えを含む。このような技術は、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, および Ausubel, F. M. et
al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,
NYに記載されている。
al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,
NYに記載されている。
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含み、かつ発現するために、様々な発現ベクター/ホストシステムが利用されてよい。これらは、組み換えファージ、プラスミド、もしくはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された細菌のような微生物;酵母発現ベクターにより形質転換された酵母;ウィルス発現ベクター(例えばバキュロウィルス)に感染した昆虫細胞システム;ウィルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウィルス、CaMV;タバコモザイクウィルス、TMV)もしくは細菌発現ベクター(例えばTiもしくはpBR322プラスミド)により形質転換された植物細胞システム;または動物細胞システムを含むがこれらに限定されない。細菌のために有用なプラスミドは、Invitrogenにより市販されているpET、pRSET、pTrcHis2、およびpBADプラスミド、Novagenにより市販されているpETおよびpCDFプラスミド、ならびにSigma-Aldrichにより市販されているDirector(商標)プラスミドを含む。メタン生成菌のために有用なプラスミドは、pME2001、pMV15、およびpMP1を含むがこれらに限定されない。本発明は、用いられる発現ベクターまたはホスト細胞により限定されない。
「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するためにホスト細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、5’および3’非翻訳領域−である。このようなエレメントはその強度および特異性において異なり得る。ベクターシステムおよび利用するホストに依存して、恒常的および誘導的プロモーターを含む、適切な転写および翻訳エレメントが幾つでも使用されてよい。例えば細菌システムにおけるクローニングのとき、BLUESCRIPTファージミド(Stratagene、ラホヤ、カリフォルニア州)のハイブリッドlacZプロモーター、またはpSPORT1プラスミド(Life Technologies)などのような誘導性プロモーターが使用されてよい。昆虫細胞においては、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターが使用されてよい。植物細胞ゲノム由来(例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子)もしくは植物ウィルス由来(例えばウィルス性プロモーターまたはリーダー配列)のプロモーターまたはエンハ
ンサーがベクター内へクローン化されてよい。
ンサーがベクター内へクローン化されてよい。
細菌システムにおいては、幾つかの発現ベクターがペプチドまたはポリペプチドに対して意図された使用に依存して選択されてよい。例えば大量のペプチドまたはポリペプチドが必要なとき、容易に精製されるハイブリッドタンパク質の高レベルの発現を導くベクターが使用されてよい。このようなベクターは、融合タンパク質を産生できるように、ポリペプチドをコードする配列がベクター内でβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Metおよびそれに続く7残基の配列とインフレームで連結し得るBLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能大腸菌(E. coli)クローニングおよび発現ベクター;pINベクター(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509)などを含むが、これらに限定されない。
ペプチドまたはポリペプチドをグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために、pGEXベクター(Promega、マディソン、ウィスコンシン州)もまた使用されてよい。一般にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着とそれに続く遊離グルタチオン存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製できる。このようなシステムで作られるタンパク質は、クローン化された目的のペプチドまたはポリペプチドがGST成分から必要に応じて遊離できるよう、ヘパリン、トロンビン、または因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されてよい。酵母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHのような恒常的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用されてよい。概説として、Ausubel et al.(上記)およびGrant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544を参照のこと。
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列のさらに効率的な翻訳を達成するため、特定の開始シグナルもまた用いられてよい。このようなシグナルはATG開始コドンおよび隣接配列を含む。ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列の場合には、その開始コドンおよび上流配列は適切な発現ベクターへ挿入されており、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要ではないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルが供給されなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするため、開始コドンは正確な読み枠になければならない。外来性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方による、様々な起源であってよい。発現の効率は、文献(Scharf, D. et al. (1994)
Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)に記載されているような、使用される特定の細胞システムに適切なエンハンサーを含むことにより増大し得る。
Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)に記載されているような、使用される特定の細胞システムに適切なエンハンサーを含むことにより増大し得る。
加えて、ホスト細胞の系統が、その挿入配列の発現を調節する能力または発現されるペプチドもしくはポリペプチドを望まれる様式で処理する能力について選択されてよい。このような配列の修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を含むがこれらに限定されない。ペプチドまたはポリペプチドの「プレプロ」型を切断する後翻訳プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、および/または機能を促進するために用いられてよい。後翻訳活性に対する特定の細胞機構および特徴的な機序を有する異なるホスト細胞が、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC;ベセスダ、メリーランド州)から入手可能であり、配列の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択されてよい。特定のホスト細胞は、メタノブレビバクター細胞、特にM.ルミナンチウム(M. ruminantium)またはM.スミシー (M.smithii)細胞のようなメタン生成菌細胞を含むがこれらに限定されない。目的のホスト細胞は、例えばロドトルラ属(Rhodotorula)、アウレオバシジウム属(Aureobasidium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、スポロボロミセス属(Sporobolomyces)、シュードモナス属(Pseudomonas)、エルウィニア属(Erwinia)およびフラボバクテリウム属(Flavobacte
riυm);または大腸菌(Escherichia coli)、乳酸桿菌属(Lactobacillus)、バチルス属(Bacillus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)のようなその他の生物などを含む。本発明の特定のホスト細胞は、本発明の使用に特に適している大腸菌(Escherichia coli)を含み、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)などを含む。
riυm);または大腸菌(Escherichia coli)、乳酸桿菌属(Lactobacillus)、バチルス属(Bacillus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)のようなその他の生物などを含む。本発明の特定のホスト細胞は、本発明の使用に特に適している大腸菌(Escherichia coli)を含み、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)などを含む。
in vitro培養されている真核細胞内へ核酸を導入するための幾つかの方法が存在する。これらは化学的方法(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992);およびFarhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994))、プロトプラスト(Bothwell、上記)または電気的パルス(Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993);
Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al.、上記;および Ausubel et al.、上記)の使用、弱毒化ウィルスの使用(Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369
381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); および Bothwell et al.、上記)、同様に物理的方法(Fynan et al., lnt J Immunopharmacol. 1995 Feb;17(2):79-83; Johnston et al., Meth Cell Biol., 43(Pt A): 353 365 (1994); Bothwell et al.、上記; および Ausubel et al.、上記)を含む。
Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al.、上記;および Ausubel et al.、上記)の使用、弱毒化ウィルスの使用(Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369
381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); および Bothwell et al.、上記)、同様に物理的方法(Fynan et al., lnt J Immunopharmacol. 1995 Feb;17(2):79-83; Johnston et al., Meth Cell Biol., 43(Pt A): 353 365 (1994); Bothwell et al.、上記; および Ausubel et al.、上記)を含む。
動物組織への核酸の良好な送達は、陽イオン性リポソーム(Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994))、動物筋肉組織(Robinson et al., Vacc, 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132
140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400)および胚(Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994);およびBurdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992))へのネイキッドDNAもしくはRNAの直接注入、自己複製RNAワクチンの筋肉内注入(Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617)、または「遺伝子銃」技術を用いるDNAの皮内注入(Johnston et al.、上記)により達成できる。
140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400)および胚(Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994);およびBurdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992))へのネイキッドDNAもしくはRNAの直接注入、自己複製RNAワクチンの筋肉内注入(Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617)、または「遺伝子銃」技術を用いるDNAの皮内注入(Johnston et al.、上記)により達成できる。
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、本発明のペプチドまたはポリペプチドの発現を検出および測定するための様々な手順が当該技術分野において公知である。例として、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射線免疫測定法(RIA)、および蛍光標識細胞分取(FACS)が含まれる。ペプチドまたはポリペプチド上の2種の非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、2部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイが使用できるが、競合的結合アッセイもまた使用できる。これらおよびその他のアッセイは、特にHampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) および Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)に記載されている。
広く様々な標識および抱合技術が当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いられてよい。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを産生するための方法は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いるPCR増幅を含む。あるいは、ペプチドもしくはポリペプチドをコードする配列、またはそのいずれの断片もしくは変
異体は、mRNAプローブを産生するためのベクター内へクローン化されてよい。このようなベクターは当該技術分野において公知かつ市販されており、T7、T3、またはSP6のような適切なRNAポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられてよい。これらの方法は、Amersham
Pharmacia Biotech、Promega、およびUS Biochemicalの様々な市販キットを用いて行われてよい。検出を容易にするために用いられてよい適切なレポーター分子または標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色薬剤、同様に基質、補因子、抑制剤、磁性粒子などを含む。
異体は、mRNAプローブを産生するためのベクター内へクローン化されてよい。このようなベクターは当該技術分野において公知かつ市販されており、T7、T3、またはSP6のような適切なRNAポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられてよい。これらの方法は、Amersham
Pharmacia Biotech、Promega、およびUS Biochemicalの様々な市販キットを用いて行われてよい。検出を容易にするために用いられてよい適切なレポーター分子または標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色薬剤、同様に基質、補因子、抑制剤、磁性粒子などを含む。
発現ベクターまたは発現ベクターにより形質転換されるホスト細胞は、ペプチドまたはポリペプチドの発現および培養からの回収に適した条件下で培養されてよい。該培養はin
vitroまたはin vivoでの発現のための構成成分を含んでよい。in vitro発現の構成成分は、ウサギ網状赤血球ライセート、大腸菌(E. coli)ライセート、およびコムギ胚芽抽出物のためのもの、例えばInvitrogenから市販されているExpressway(商標)またはRiPs system、iNtRON Biotechnologyから市販されているGenelator(商標)system、Novagenから市販されているEcoPro(商標)またはSTP3(商標)system、Promegaから市販されているTNT(登録商標)Quick Coupled system、およびQIAGENから市販されているEasyXpress systemを含む。培養から産生されるペプチドまたはポリペプチドは、配列および/または使用されるベクターに依存して、分泌されるかまたは細胞内に含まれてよい。特定の態様によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする発現ベクターは、原核または真核細胞の膜を通してペプチドまたはポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を含むように設計できる。
vitroまたはin vivoでの発現のための構成成分を含んでよい。in vitro発現の構成成分は、ウサギ網状赤血球ライセート、大腸菌(E. coli)ライセート、およびコムギ胚芽抽出物のためのもの、例えばInvitrogenから市販されているExpressway(商標)またはRiPs system、iNtRON Biotechnologyから市販されているGenelator(商標)system、Novagenから市販されているEcoPro(商標)またはSTP3(商標)system、Promegaから市販されているTNT(登録商標)Quick Coupled system、およびQIAGENから市販されているEasyXpress systemを含む。培養から産生されるペプチドまたはポリペプチドは、配列および/または使用されるベクターに依存して、分泌されるかまたは細胞内に含まれてよい。特定の態様によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする発現ベクターは、原核または真核細胞の膜を通してペプチドまたはポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を含むように設計できる。
その他の構成は、ペプチドまたはポリペプチドの精製を促進し得るアミノ酸ドメインを含んでよい。このようなドメインは、固定化された金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファン(例えば6X−HIS)モジュールのような金属キレート化ドメイン、固定化された免疫グロブリンにおける精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAG(登録商標)extension/affinity purification system(Immunex Corp.、シアトル、ワシントン州)において利用されるドメインを含むが、これらに限定されない。有用なエピトープタグは、3XFLAG(登録商標)、HA、VSV−G、V5、HSV、GST、GFP、MBP、GAL4、およびβ−ガラクトシダーゼを含む。有用なプラスミドは、ビオチンタグ(例えばPromegaから市販されているPinPoint(商標)プラスミド)、カルモジュリン結合タンパク質(例えばStratageneから市販されているpCALプラスミド)、ストレプトアビジン結合ペプチド(例えばStratageneから市販されているInterPlay(商標)プラスミド)、c−mycもしくはFLAG(登録商標)タグ(例えばSigma-Aldrichから市販されている免疫沈降プラスミド)、またはヒスチジンタグ(例えばQIAGENから市販されているQIAExpressプラスミド)を含むものを、含む。
精製を促進するために発現ベクターは、例えば因子Xaまたはエンテロキナーゼに特異的である切断可能なリンカー配列(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア州)を含んでよい。例えば、ベクターは精製ドメインとペプチドまたはポリペプチドの間に1つ以上のリンカーを含んでよい。このような発現ベクターの一つは、本発明のペプチドまたはポリペプチド、およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先立つ6ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はIMAC(Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載される、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)における精製を促進するが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からペプチドまたはポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察はKroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)により提供される。
抗体およびワクチン
本発明の抗体は、例えば精製または診断技術における使用のために、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて産生されてよい。特に、公知の方法に従って抗体を産生するため、精製ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドが使用されてよい。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および単鎖抗体、Fab断片、ならびにFab発現ライブラリーにより産生された断片を含んでよいがこれらに限定されない。中和抗体(すなわち機能を抑制するもの)は、ワクチンとの併用に特に好ましい。
本発明の抗体は、例えば精製または診断技術における使用のために、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて産生されてよい。特に、公知の方法に従って抗体を産生するため、精製ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドが使用されてよい。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および単鎖抗体、Fab断片、ならびにFab発現ライブラリーにより産生された断片を含んでよいがこれらに限定されない。中和抗体(すなわち機能を抑制するもの)は、ワクチンとの併用に特に好ましい。
抗体産生のため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他を含む様々なホストが、免疫原性を有するペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのいずれの断片の注入により免疫されてよい。免疫反応を増大させるため、様々なアジュバントがホストの種に依存して使用されてよい。このようなアジュバントは、水酸化アルミニウムのようなフロイントミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質を含むがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、BCG(bacilli Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumは特に好ましい。
抗体を誘導するために使用されるペプチド、ポリペプチド、または断片は、少なくとも5アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも10アミノ酸を含むアミノ酸配列を有することが好ましい。これらは天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることもまた好ましく、かつ小さな天然発生分子の全体のアミノ酸配列を含んでよい。アミノ酸の短い伸展は、キーホールリンペットヘモシアニンおよびキメラ分子に対して産生される抗体のような別のタンパク質のものと融合されてよい。
モノクローナル抗体は、培養における継続的な細胞株による抗体分子の産生を提供するいずれの技術を用いて調製されてもよい。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120)を含むがこれらに限定されない。
加えて「キメラ抗体」を産生するために開発された技術、例えば適切な抗原特異性および生物学的活性をもつ分子を得るための、マウス抗体遺伝子およびヒト抗体遺伝子の組み合わせが使用できる(Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S. et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454)。あるいは、特異的な単鎖抗体を産生するために、単鎖抗体の産生のために記述された技術が当該技術分野において公知の方法を用いて適応されてよい。ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖のシャッフリングにより、関連した特異性を有するが、明確なイディオタイプ構造である抗体が作られてよい(Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。
本発明が関連する技術分野の当業者は、「ダイアボディ(diabodies)」および「トリアボディ(triabody)」という用語を理解し得る。これらは同鎖上の二つのドメインを対合させるには短すぎる短ペプチドリンカーにより、軽鎖可変ドメイン(VL)に結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む分子である。これは1つ以上のその他の鎖の相補的ドメインとの対合を促進し、2つ以上の機能的抗原結合部位をもつ二量体または三量体分子の形成を助長する。得られた抗体分子は単一特異性または多特異性であり得る(例えばダイアボディの場合、二特異性)。このような抗体分子は、本発明が関連する技術分野において標準的な方法論を用いて、例えばTodorovska et al. (Design and application of dia
bodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66)によって記載されるように、2種以上の抗体から作られる。
bodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66)によって記載されるように、2種以上の抗体から作られる。
抗体はまた、リンパ球集団内でのin vivo産生の誘導、または文献(Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293-299)に開示されるような、免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングにより産生されてもよい。
特異的結合部位を含む抗体断片もまた作られてよい。例えばこのような断片は、抗体分子のペプシン消化により産生できるF(ab’)2断片、およびF(ab’)2断片のジスルフィド橋を還元することにより作られるFab断片を含むがこれらに限定されない。あるいは、望まれる特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリーが構築されてよい(Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:1275-1281)。
結合特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、様々な免疫アッセイが用いられてよい。確立された特異性をもつポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合または免疫放射線測定法のための多数の手順が当該技術分野において公知である。このような免疫アッセイは典型的に、ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドとそれに特異的な抗体との間の複合体形成の測定に関与する。2種の非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイもまた用いられてよい(Maddox、上記)。
ここに述べられる抗体は、細胞を標的化および/または抑制する能力を有し、かつさらなる抑制分子の微生物細胞への送達の担体分子としてもまた有用である。化合物をアミノ酸へ共役させるための化学はよく開発されており、幾つかの異なる分子の型が抗体へ連結され得る。最も一般的な共役法は、遊離アミノ(アルファアミノもしくはLys)、スルフヒドリル(Cys)、またはカルボン酸基(Asp、Glu、もしくはアルファカルボキシル)の存在に依存する。共役法は、カルボキシまたはアミノ末端残基を通して抗体を細胞抑制剤へ連結するために使用できる。幾つかの場合、配列は、選択された化学に反応してよい複数の残基を含む。これは、1を超える細胞抑制剤を含む多量体の産生のために用いることができる。あるいは、抗体は、反応残基が配列のアミノもしくはカルボキシル末端のいずれかに局在するように短くできるかまたは選択できる。
例えば、フルオレセインのようなレポーター分子は、ポリペプチド合成の間にN−α−Fmoc−Nε−1−(4,4−ジメチル−2,6ジオキソシクロヘキサ−1−イリデン−3−メチルブチル)−L−リジンを用いて、リジン残基に特異的に取り込むことができる(Ono et al., 1997)。合成に続き、ヒドラジン処理によって4,4−ジメチル−2,6ジオキソシクロヘキサ−1−イリデンが除去された後、5−および6−カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステルを共役できる。従って、抗体への抑制分子の共役は、ポリペプチド配列へのリジン残基の包含、続いて適切に誘導体化された細胞抑制剤との反応により達成できる。
EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)またはカルボジイミド共役法もまた使用できる。カルボジイミドは、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボン酸基、同様にカルボキシル末端基を、一級アミンとの共役の反応部位とするために活性化できる。活性化された抗体は、最終抱合体を産生するために細胞抑制剤と混合される。細胞抑制剤が最初に活性化される場合には、EDC法はN−末端アルファアミンを通して、かつそれが配列中に存在する場合にはおそらくLysの側鎖内
のアミンを通して、細胞抑制剤を共役し得る。
のアミンを通して、細胞抑制剤を共役し得る。
m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシサクシニミドエステル(MBS)は、システインを通して抗体を細胞抑制剤へ連結するために使用できる、ヘテロ二機能性試薬である。共役はシステイン残基のチオール基により起こる。選択された配列がCysを含まない場合、抗体の細胞抑制剤への高度に制御された連結を得るため、N−またはC−末端にCys残基を配置することは一般的である。合成の目的のため、抗体のN−末端にシステインが配置されることは役に立つであろう。MBSは本発明の使用に特に適している。
グルタルアルデヒドは、二つの化合物をそれらのアミノ基を通して連結する、二機能性の共役試薬として使用できる。グルタルアルデヒドは好ましい提示のため、抗体と細胞抑制剤の間に高度に柔軟性のあるスペーサーを提供する。グルタルアルデヒドは非常に反応性のある化合物であり、Cys、Tyr、およびHisとは限られた程度に反応し得る。グルタルアルデヒド共役法は、ポリペプチドがそのアミノ末端に単一の遊離アミノ基のみを含む時に特に有用である。抗体が1を超える遊離アミノ基を含む場合、大きな多量体複合体が形成できる。
一態様によれば、本発明の抗体は、抗菌剤のような細胞抑制剤へ融合(例えばインフレームクローニングにより)または連結(例えば化学共役により)できる。これらに含まれるものは抗菌ペプチド、例えば殺菌性/透過性増大タンパク質、陽イオン性抗菌タンパク質、リゾチーム、ラクトフェリン、およびカテリシジンである(例えば好中球由来の;例えば、Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323; Ganz and Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:53-58; Hancock et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135-175を参照)。抗菌ペプチドはさらにデフェンシン(例えば上皮細胞または好中球由来の)および血小板殺微生物性タンパク質(例えば、Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323を参照)を含む。さらなる抗菌ペプチドはグラミシジンS、バシトラシン、ポリミキシンB、タキプレシン、バクテネシン(例えばウシバクテネシン)、ラナレキシン、セクロピンA、インドリシジン(例えばウシインドリシジン)およびナイシン(例えば細菌性ナイシン)を含むがこれらに限定されない。
細胞膜のような脂質バリアを横断して、イオン(例えばナトリウム)の透過を促進するイオノフォアもまた抗菌剤として含まれる。RUMENSIN(商標)(Eli Lilly)およびLasalocid(Hoffman LaRoche)の二つのイオノフォア化合物が、本発明に特に適する。その他のイオノフォアは、サリノマイシン、アボパルシン、アリドシン(aridcin)、およびアクタプラニンを含むがこれらに限定されない。その他の抗菌剤は、Monensin(商標)およびアジスロマイシン、メトロニダゾール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ならびにペニシリン、同様に、一般的にβ−ラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、クロラムフェニコール、ノボビオシン、リファンピン、およびフルオロキノロンを含む(例えば、Horn et al., 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74-83; Eckburg et al., 2003, Infection Immunity 71:591-596; Gijzen et al., 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630-1634; Bonelo et al., 1984, FEMS Microbiol. Lett. 21:341-345; Huser et al., 1982, Arch. Microbiol. 132:1-9; Hilpert et al., 1981, Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21-31を参照)。
特に有用な抑制剤は、ブロモエタンスルホン酸、例えば2−ブロモエタンスルホン酸もしくはその塩、例えばナトリウム塩を含む、メタン生成を遮断する、または妨げる化合物である。モリブデン酸ナトリウム(Mo)は硫酸還元抑制剤であり、ブロモエタンスルホン酸と共に使用できる。その他の抗メタン生成化合物は、硝酸、ギ酸、フッ化メチル、クロロホルム、抱水クロラール、亜硫酸ナトリウム、エチレン、およびアセチレンのような不
飽和炭化水素、リノール酸、シスオレイン酸のような脂肪酸、ベヘン酸およびステアリン酸のような飽和脂肪酸、ならびにルマジン(例えば、2,4−プテリジンジオン)もまた含むがこれらに限定されない。さらなる化合物は、3−ブロモプロパンスルホン酸塩(BPS)、プロピン酸および2−ブチン酸エチルを含む。
飽和炭化水素、リノール酸、シスオレイン酸のような脂肪酸、ベヘン酸およびステアリン酸のような飽和脂肪酸、ならびにルマジン(例えば、2,4−プテリジンジオン)もまた含むがこれらに限定されない。さらなる化合物は、3−ブロモプロパンスルホン酸塩(BPS)、プロピン酸および2−ブチン酸エチルを含む。
抗菌剤としてさらに、ファージリゾチーム、エンドリシン、リゾチーム、溶解素、ファージ溶解素、muralysin、ムラミダーゼ、およびビロリシンを含む溶解酵素が含まれる。有用な酵素は、細菌細胞壁の特異的結合の加水分解能を示す。特定の溶解酵素は、ペプチドグリカンのアミノ糖(例えばN−アセチルムラミン酸、およびN−アセチルグルコサミン)間のグリコシド結合を加水分解するグルコサミニダーゼ、グリカン鎖および架橋結合ペプチド間のN−アセチルムラモイル−L−アラニンアミド結合を切断するアミダーゼ、ならびに内部ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼ(例えばシステインエンドペプチダーゼ)、およびメタノバクテリウム科(Methanobacteriacaea)ファミリー由来のメタン生成菌のシュードムレインを攻撃するエンドイソペプチダーゼを含むがこれらに限定されない。
加えて、抗菌剤としてPNAが含まれる。PNAは、リン酸骨格がN−(2−アミノエチル)−グリシン単位から作られるアキラルかつ中性の骨格により置換された、ペプチド−核酸ハイブリッドである(例えば、Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003を参照)。A、G、T、Cの塩基が、骨格上のアミノ窒素にメチレンカルボニル結合を通して付着する(P. E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568)。PNAは相補配列に、高い特異性、および類似DNAまたはRNAに比較してより高いアフィニティーで結合する(M. Egholm et al.、上記)。PNA/DNAまたはPNA/RNAハイブリッドもまた、対応するDNA/DNAまたはDNA/RNA二本鎖に比較してより高い熱安定性を示す(M. Egholm et al.、上記)。PNAはまた、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない非天然のアミド骨格のために、高い化学的および生物学的安定性も有する(V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313)。典型的には、PNAは少なくとも5塩基の長さであり、末端リジンを含む。PNAは、その寿命をさらに延長するためにペグ化されてよい(Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63)。
特定の一態様によれば、本発明の抗体はその他の抗体またはその断片へ融合または連結できる。付加された抗体または抗体断片は、微生物細胞もしくは特にメタン生成菌細胞、または1種以上の細胞構成成分へ向けられてよい。例えば、細胞外レセプターのような細胞表面タンパク質が標的にされ得る。特定の態様によれば、抗体または抗体断片は、被験体に特異的に発現する配列、例えばヒトまたは反すう動物配列により操作できる。キメラ抗体、例えば1種以上の源、例えばマウス、ヒト、または反すう動物のうち1種以上に特異的なモノクローナル抗体またはその断片もまた含まれる。さらに、カメリド抗体またはナノボディーも含まれる。
本発明の抗体には、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の標的化における特定の使用が見出される。特定の態様によれば、抗体は、細胞壁もしくは膜への付随または結合、および/または細胞の生育もしくは複製の抑制のために使用できる。このように、抗体は、細胞への一過性もしくは延長された付着、または細胞の隔離もしくは貪食、および/または溶解の仲介のために使用できる。標的化を達成するため、微生物細胞はここに詳述されるように、ホスト生物から単離された、または発現ベクターおよび/もしくはホスト細胞により産生された、あるいは合成もしくは半合成化学の抗体に接触させることができる。または抗体は、ここに開示されるペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの投与に
反応して、ホスト生物自身により産生できる。本発明の抗体、同様に対応するポリヌクレオチド、発現ベクター、ホスト細胞、ペプチドおよびポリペプチドは、様々な微生物、例えば反すう動物における主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)、およびヒトにおける主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・スミシー(Methanobrevibacter smithii)を標的化するために使用できることが理解される。特定の態様によれば、抗体または対応するポリヌクレオチド、発現ベクター、ホスト細胞、ペプチドもしくはポリペプチドは、ここに詳述される組成物として、例えば徐放反すう胃装置の使用を通して被験体へ送達される。
反応して、ホスト生物自身により産生できる。本発明の抗体、同様に対応するポリヌクレオチド、発現ベクター、ホスト細胞、ペプチドおよびポリペプチドは、様々な微生物、例えば反すう動物における主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)、およびヒトにおける主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・スミシー(Methanobrevibacter smithii)を標的化するために使用できることが理解される。特定の態様によれば、抗体または対応するポリヌクレオチド、発現ベクター、ホスト細胞、ペプチドもしくはポリペプチドは、ここに詳述される組成物として、例えば徐放反すう胃装置の使用を通して被験体へ送達される。
様々な態様によれば、本発明の薬剤(例えば1つ以上のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体)は、組成物、例えば医薬組成物および特にワクチン組成物に含まれてよい。組成物は例えば、a)単離されたペプチド、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体;b)単離されたポリペプチド、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体;c)単離されたポリヌクレオチド、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体;d)このポリヌクレオチドを含む発現ベクター;e)この発現ベクターを含むホスト細胞;または(f)抗体、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体を含む。本発明の組成物は、開示される方法に従い、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化および/または抑制するためのキットの一部として特に包装できる。該キットは、ここに提示される組成物の少なくとも1種、および細胞の標的化、またはメタン生成菌もしくはその他の微生物の細胞生育または複製の抑制における使用のための説明書を含む。
ワクチンのため、幾つかのアプローチが、例えば抗原粒子;抗原ポリマーおよび重合;乳化剤;抗原のマイクロカプセル化;死滅細菌および細菌産物;化学アジュバントおよびサイトカイン;ならびに抗原提示細胞へ抗原を標的化する薬剤の使用により、抗原の免疫原性を増大させるために使用できる(Paul, Fundamental Immunology, 1999, Lippincott-Raven Publishers, New York, NY, p. 1392-1405に概説される)。
抗原を粒状にするため、ミョウバン沈降が使用できる。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの使用により、問題の抗原は不溶性のゲル様沈殿に取り込まれるか、または静電気的相互作用により前もって作られたゲルへ結合する。抗原は穏やかな熱凝集へ提供できる。自己集合を示す抗原もまた使用できる。リポソーム、ビロソーム、および免疫染色複合体(ISCOM)もまた、粒子の形成に有用である。
重合を促進するため、非イオン性のブロック共重合体が、例えばポリオキシプロピレンおよびポリエチレンのポリマーなどの、抗原が付随することのできるアジュバントへの添加物として使用できる。これらは、Syntex (SAF-1, Syntex Adjuvant Formulation-1)およびRibi Chemical Co.の両者による複合体アジュバント製剤の構成成分として見出される。マンノースの炭水化物ポリマー(例えばマンナン)またはβ1−3グルコースの炭水化物ポリマー(例えばグルカン)が、類似の様式において使用できる(Okawa Y, Howard CR, Steward MW. Production of anti- peptide antibody in mice following immunization of mice with peptides conjugated to mannan. J Immunol Methods 1992; 142: 127-131; Ohta M, Kido N, Hasegawa T, et al. Contribution of the mannan side chains to
the adjuvant action of lipopolysaccharides. Immunology 1987; 60: 503-507)。
the adjuvant action of lipopolysaccharides. Immunology 1987; 60: 503-507)。
フロイントアジュバント(例えばフロイント不完全アジュバント)のような油中水乳剤、またはミネラルオイルもしくはスクアランのようなその他の油の連続相内でモノオレイン酸マンニドのような界面活性剤により安定化される水の小さな液滴を含むその他の混合物を含む、様々な薬剤が乳化のために使用できる。別のアプローチは、MF5963 (Chiron)のような油中水乳剤、またはスクアランの油滴および乳化剤TWEEN80およびSPAN85の混合物を含むその他の混合物、ならびにムラミルジペプチドの誘導体、例えばムラミルトリペプ
チド−ホスファチジルエタノールアミン(MTP−PE)のような化学的免疫調節剤の使用である(Valensi J-PM, Carlson JR, Van Nest GA. Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized with trivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advanced adjuvants. J Immunol 1994; 153:4029-4039)。混合物中に少量のポリソルベート80およびトリオレイン酸ソルビタンもまた使用されてよい。別の例として、SAF-165 (Syntex)、またはPluronic L121、スクアレン、およびTWEEN80を含む油中水混合物が使用できる。
チド−ホスファチジルエタノールアミン(MTP−PE)のような化学的免疫調節剤の使用である(Valensi J-PM, Carlson JR, Van Nest GA. Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized with trivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advanced adjuvants. J Immunol 1994; 153:4029-4039)。混合物中に少量のポリソルベート80およびトリオレイン酸ソルビタンもまた使用されてよい。別の例として、SAF-165 (Syntex)、またはPluronic L121、スクアレン、およびTWEEN80を含む油中水混合物が使用できる。
マイクロカプセル、特に生物分解性のマイクロカプセルが制御放出ワクチンの調製のために使用できる(Chang TMS. Biodegradable, semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones, vaccines and other biologicals. J Bioeng 1976; 1:25-32; Langer
R. Polymers for the sustained release of macromolecules: their use in a single step method of immunization. Methods Enzymol 1981 ; 73: 57-75)。シアノアクリル酸は生物分解性ポリマーの別の形である。例えばポリ(ブチル−2−シアノアクリル酸)が、経口免疫のためのアジュバントとして使用できる(O'Hagan DT, Palin KJ, Davis SS. Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral immunization. Vaccine 1989;7:213-216)。マイクロカプセルはワクチンの粘膜投与に有用である。非常に小さなサイズの粒子(ナノ粒子)は特に適している。胃内での消化は、腸溶性のポリマー、および必要に応じて腸管内の吸収を増大させる物質によるコーティングにより対処できる。
R. Polymers for the sustained release of macromolecules: their use in a single step method of immunization. Methods Enzymol 1981 ; 73: 57-75)。シアノアクリル酸は生物分解性ポリマーの別の形である。例えばポリ(ブチル−2−シアノアクリル酸)が、経口免疫のためのアジュバントとして使用できる(O'Hagan DT, Palin KJ, Davis SS. Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral immunization. Vaccine 1989;7:213-216)。マイクロカプセルはワクチンの粘膜投与に有用である。非常に小さなサイズの粒子(ナノ粒子)は特に適している。胃内での消化は、腸溶性のポリマー、および必要に応じて腸管内の吸収を増大させる物質によるコーティングにより対処できる。
死滅したM. tuberculosis以外の様々な細菌がアジュバントとして使用できる。死滅した細菌性製剤それ自体に高い抗原性がある場合、アジュバント特性は共投与される抗原に及ぶ。有用な生物は、Bordetella pertussis、Corynebacterium parvum、およびNippostrongylus brasiliensisを含む。細菌のペプチドおよび脂質構成成分もまた使用できる。例となる構成成分は、アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、またはムラミルジペプチド(MDP)(Ellouz F, Adam A, Ciorbaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans. Biochem Biophys Res Commun 1974;59:1317-1325)、MDP(ムラブチド)(Chedid L, Parant MA, Audibert FM, et al. Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid of pyrogenicity. Infect Immun 1982;35:417-424)、スレオニルMDP(Allison AC, Byars NE. An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity. J Immunol Methods 1986;95: 157-168)、およびMTP−PEを含む。脂質アジュバントは、Escherichia、Salmonella、およびPseudomonasのようなグラム陰性菌のLPSエンドトキシンを含んでよい。特定のアプローチによれば、例えば一リン酸化リピドA(MPL)(Johnson AG, Tomai M, Solem L, Beck L, Ribi E. Characterization of non-toxic monophosphoryl lipid. Rev Infect Dis 1987;9:S512)のように、リピドA構造は低毒性へ化学的に改変できるが、アジュバント活性は保持する。
ポリI:CおよびポリA:Uのようなポリヌクレオチド、ビタミンD3、硫酸デキストラン、イヌリン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、アブリジン、マンナンに類似の炭水化物ポリマー、およびトレハロースジミコレートを含む様々な化学物質がアジュバントとして使用できる(Morein B, Lovgren-Bengtsson K, Cox J. Modern
adjuvants: functional aspects. In: Kaufmann SHE, ed. Concepts in vaccine development. Berlin: Walter de Gruyter, 1996:243-263)。ポリホスファジン(最初に徐放促進剤として導入された)およびリーシュマニアタンパク質のLelFもまた含まれる。サイトカイン、例えばIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、GM−CSF、およびIFN−gもまたアジュバントとして使用できる。
adjuvants: functional aspects. In: Kaufmann SHE, ed. Concepts in vaccine development. Berlin: Walter de Gruyter, 1996:243-263)。ポリホスファジン(最初に徐放促進剤として導入された)およびリーシュマニアタンパク質のLelFもまた含まれる。サイトカイン、例えばIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、GM−CSF、およびIFN−gもまたアジュバントとして使用できる。
抗原提示細胞を標的にするため、C3dドメイン、Fcドメイン、およびCTBドメインが使用できる(Dempsey PW, Allison MED, Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT. C3d of
complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science 1996;271 :348-350; Sun J-B, Holmgren J. Czerkinsky C. Cholera toxin B subunit: an efficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheral
immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: 10795-10799; Sun J-B, Rask C, Olsson T, Holmgren J, Czerkinsky C. Treatment of experimental autoimmune
encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin B
subunit. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7196-7201)。
complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science 1996;271 :348-350; Sun J-B, Holmgren J. Czerkinsky C. Cholera toxin B subunit: an efficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheral
immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: 10795-10799; Sun J-B, Rask C, Olsson T, Holmgren J, Czerkinsky C. Treatment of experimental autoimmune
encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin B
subunit. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7196-7201)。
粘膜送達のための特定のアジュバント、例えばCT、LT、および破傷風毒素のフラグメントCもまた使用できる(Elson CJ, Ealding W. Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J Immunol 1984; 132:2736-2743; Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B subunit as oral- mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine 1993; 11:1179-1184; Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL. Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelated protein antigens. Vaccine 1988;6:269-277; Gomez-Duarte OG, Galen J, Chatfield SN, Rappuoli R, Eidels L, Levine MM. Expression of fragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheria toxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain. Vaccine 1995; 13: 1596-1602)。
治療学および診断学
本発明のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は健康上の効用を有すると考えられる。特定の態様によれば、メタン生成菌を標的とするワクチンが、通常はメタンとして失われるエネルギーを被験体へ還元するために使用できる。本発明は従って、上で考察されたいずれの方法の使用のための、薬理学的に許容される担体との組み合わせにおける医薬組成物(特にワクチン組成物)に関する。このような医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、または抗体を細胞抑制剤と組み合わせて含んでよい。あるいは該医薬組成物は、ここに詳述されるように、ポリヌクレオチド、発現ベクター、またはホスト細胞を含んでよい。該組成物は単独で投与されてよいか、または生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない無菌、生体適合性のいずれの薬理学的担体中で投与されてよい、安定化化合物のような少なくとも1種のその他の薬剤との組み合わせにより投与されてよい。該組成物は被験体へ単独で、またはその他の薬剤、薬物(例えば抗菌薬物)、もしくはホルモンと組み合わせて投与されてよい。
本発明のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は健康上の効用を有すると考えられる。特定の態様によれば、メタン生成菌を標的とするワクチンが、通常はメタンとして失われるエネルギーを被験体へ還元するために使用できる。本発明は従って、上で考察されたいずれの方法の使用のための、薬理学的に許容される担体との組み合わせにおける医薬組成物(特にワクチン組成物)に関する。このような医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、または抗体を細胞抑制剤と組み合わせて含んでよい。あるいは該医薬組成物は、ここに詳述されるように、ポリヌクレオチド、発現ベクター、またはホスト細胞を含んでよい。該組成物は単独で投与されてよいか、または生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない無菌、生体適合性のいずれの薬理学的担体中で投与されてよい、安定化化合物のような少なくとも1種のその他の薬剤との組み合わせにより投与されてよい。該組成物は被験体へ単独で、またはその他の薬剤、薬物(例えば抗菌薬物)、もしくはホルモンと組み合わせて投与されてよい。
有効成分に加え、これらの医薬組成物は、薬理学的に使用できる製剤への有効化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、適切な薬理学的に許容される担体を含んでよい。製剤および投与のための技術におけるさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA)の最新版に見出されるであろう。本発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、延髄内、包膜内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、外用、舌下、または直腸の手段を含むがこれらに限定されないいずれの数の経路により投与されてよい。
経口投与のための医薬組成物は、当該技術分野において公知の薬理学的に許容される担体を経口投与に適した用量で用いることにより処方できる。被験体の摂取のため、このような担体は医薬組成物の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などへの処方を可能にする。経口投与のための医薬製剤は、有効化合物と固体賦形剤との混合物を通して得ることができ、得られた混合物は必要に応じて粉砕され、錠剤または糖衣コアを得るために所望により適切な助剤を加えた後、顆粒混合物が加
工される。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤であり、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、もしくはその他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルローススナトリウムのようなセルロース;アラビアゴム、またはトラガントゴムを含むゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩が添加されてよい。
工される。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤であり、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、もしくはその他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルローススナトリウムのようなセルロース;アラビアゴム、またはトラガントゴムを含むゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩が添加されてよい。
経口的に使用される医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、同様にゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングにより作られたソフトな密封カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトースもしくはデンプンのような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および必要に応じて安定剤と混合された有効成分を含んでよい。ソフトカプセル内で有効化合物は、安定剤を含むかまたは含まない、脂肪油、液体、もしくは液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁されてよい。糖衣コアが濃縮糖液のような適切なコーティングと組み合わせて使用されてよく、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物も含んでよい。製品の識別、または有効化合物の量すなわち用量を特徴付けるため、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてよい。
非経口投与に適切な医薬製剤は、水性溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水のような生理的適合性緩衝液中に処方されてよい。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでよい。加えて、有効化合物の懸濁液は適切な油性注射用懸濁液として調製されてよい。適切な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質のポリカチオン性アミノポリマーもまた、送達のために用いられてよい。懸濁液は必要に応じて、適切な安定剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための化合物の溶解度を増大させる薬剤もまた含んでよい。外用または鼻内投与のため、透過すべき特定のバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当該技術分野において公知である。
本発明の医薬組成物は当該技術分野において公知の様式において、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、被包、封入、または凍結乾燥過程の手段によって製造されてよい。該医薬組成物は塩として供給されてよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない多数の酸により形成できる。塩は、相当する遊離塩基型に比較して、水性またはその他のプロトン性溶媒にさらに可溶性となる傾向がある。その他の場合の好ましい製剤は、使用前に緩衝液と組み合わせた4.5ないし5.5のpH範囲において、1〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%ショ糖、および2〜7%マンニトールのいずれかまたは全てを含んでよい、凍結乾燥粉末であってよい。医薬組成物の調製後、これらは適切な容器に配置でき、表示される状態の治療のために標識される。本発明の組成物の投与のため、このような標識は投与の量、頻度、および方法を含んでよい。
本発明における使用に適切な医薬組成物は、意図される目的を達成するため、有効成分が有効量含まれる組成物を含む。いずれの化合物についても、治療的に有効な用量は最初に、例えば微生物細胞、もしくは特にメタン生成菌細胞、または通常マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタ等の動物モデル、またはヒツジ、ウシ、シカ、およびヤギのような反すう
動物種のいずれかにおける細胞アッセイにおいて推定できる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路の決定のためにも用いられてよい。このような情報は次に、被検体における投与のために有用な用量および経路の決定のために使用できる。投与経路に依存して、通常の投与量は0.1ないし100,000マイクログラム、全用量が約1gまでに変動してよい。送達の特定の用量および方法のガイダンスは文献により提供され、当業者に一般的に利用可能である。当業者はポリヌクレオチドに対し、ポリペプチドとは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ペプチド、もしくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の送達は、特定の細胞、状態、部位などに対して特異的であり得る。
動物種のいずれかにおける細胞アッセイにおいて推定できる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路の決定のためにも用いられてよい。このような情報は次に、被検体における投与のために有用な用量および経路の決定のために使用できる。投与経路に依存して、通常の投与量は0.1ないし100,000マイクログラム、全用量が約1gまでに変動してよい。送達の特定の用量および方法のガイダンスは文献により提供され、当業者に一般的に利用可能である。当業者はポリヌクレオチドに対し、ポリペプチドとは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ペプチド、もしくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の送達は、特定の細胞、状態、部位などに対して特異的であり得る。
正確な用量は、治療を必要とする被験体に関する因子に鑑みて、実行者により決定され得る。用量および投与は、有効薬剤を十分な濃度で供給するため、または望まれる効果を維持するために調整される。考慮され得る因子は、疾病状態の重症度、被験体の一般的健康、年齢、体重、および性別、食事、時間、および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性/反応性を含む。長時間作用型の医薬組成物は、特定製剤の半減期およびクリアランス率に依存して、3ないし4日毎、週1回、または2週間に1回投与されてよい。該組成物は、ここに詳細が述べられる、さらなる抗メタン生成化合物(例えばブロモエタンスルホン酸)を含む抗菌剤、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、ならびにその他の抗生剤の1種以上と共投与できる。共投与は同時もしくは連続的であってよく、または交互に反復投与されてよい。
徐放処方または機序は、本発明の組成物(特に医薬組成物)に特に有用である。例えば反すう胃内装置は、国際公開第95/19763号およびニュージーランド特許第278977号に開示される、最初にAg Research Ltd.、ニュージーランドで開発され、Agri-Feeds Ltd.、ニュージーランドにより市販されるTime Capsule(商標)Bolus range、ならびにオーストラリア特許第35908178号、国際特許出願PCT/AU81/100082号、およびLaby et al., 1984, Can. J. Anim. Sci 64 (Suppl.), 337-8に開示される、Nufarm Ltd.、オークランド、ニュージーランドの一部門であるNufarm Health & Sciencesにより市販されるCAPTECを含むがこれらに限定されず、これら全ては参照によりここに取り込まれる。特定の例によれば、該装置は、注射外筒末端の穴へ組成物を押し進めるバネおよびプランジャーを含んでよい。
さらなる実施形態として、本発明は上で考察されたいずれの方法の使用のための、水サプリメント、例えば水薬組成物、または食物サプリメント、例えば反すう動物の飼料構成成分のための組成物に関する。特定の態様によれば、食物サプリメントは少なくとも1種の食用野菜材料、および本発明のペプチドもしくはポリペプチドを含む。あるいは、食物サプリメントは少なくとも1種の食用野菜材料、およびポリペプチドもしくはペプチド、または例えば発現ベクターもしくは該発現ベクターを含むホスト細胞として、ここに開示されるペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に該組成物は、得られる配列に融合または連結される細胞抑制剤をさらに含む。好ましい野菜材料は、乾草、草、穀粒、または穀粉、例えば豆乾草、草乾草、トウモロコシサイレージ、草サイレージ、豆サイレージ、トウモロコシ粒子、カラスムギ、オオムギ、蒸留かす、ビールかす、大豆穀粉、および綿実穀粉のいずれか1を含む。特に、反すう動物の食物組成物として草サイレージが有用である。植物材料は、本発明の構成成分の1種以上、例えばポリペプチドもしくはペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターのうち1種以上を含むように遺伝的に改変できる。
別の実施形態によれば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体が、微生物、特にメタン生成菌の存在を決定するため、またはこのような微生物のレベルをモニターするアッセイにおいて使用されてよい。診断目的に有用な抗体が、上記に同じ様式で調製されてよい。診断アッセイは、ヒト体液または細胞もしく
は組織の抽出液中のペプチドまたはポリペプチドを検出するために抗体および標識を利用する方法を含む。該抗体は改変してまたは改変なしで使用されてよく、かつ共有結合もしくは非共有結合のいずれかによるレポーター分子との結合により標識されてよい。当該技術分野において公知の広く様々なレポーター分子が用いられてよく、その幾つかは上述である。
は組織の抽出液中のペプチドまたはポリペプチドを検出するために抗体および標識を利用する方法を含む。該抗体は改変してまたは改変なしで使用されてよく、かつ共有結合もしくは非共有結合のいずれかによるレポーター分子との結合により標識されてよい。当該技術分野において公知の広く様々なレポーター分子が用いられてよく、その幾つかは上述である。
ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドのレベルを測定するための様々な手順は当該技術分野において公知であり(例えばELISA、RIA、およびFACS)、微生物、特にメタン生成菌の存在またはレベルを診断するための基礎を提供する。正常または標準レベルは、正常被験体、例えば正常のヒトまたは反すう動物から得られた体液または細胞抽出液を複合体形成に適した条件下で抗体と組み合わせることによって確立される。標準的複合体形成の量は様々な方法により定量されてよいが、側光手段によることが好ましい。被験体、コントロール、および処理サンプル(例えばワクチン接種された被験体からのサンプル)に発現するペプチド、ポリペプチド、もしくはポリヌクレオチドの量は標準的な値と比較される。標準値と被験体の値との間の偏差は、微生物の存在またはレベルを決定するためのパラメーターを確立する。
本発明の別の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは特定のハイブリダイゼーションおよび/または増幅技術を用いる診断目的で使用されてよい。使用されてよいポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、相補的RNAおよびDNA分子、ならびにPNAを含む。ポリヌクレオチドは、発現が微生物の存在またはレベルと関連し得る、サンプル中の遺伝子発現を検出または定量するために使用されてよい。診断アッセイは、不在、存在と微生物レベルの変化の間を区別するため、および治療介入中のレベルをモニターするために使用されてよい。
一態様によれば、PCRプローブとのハイブリダイゼーションは、核酸配列、特に本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするゲノム配列を同定するために用いられてよい。プローブの、それが高度に特異的な領域、例えば5’調節性領域の10の独特なヌクレオチドから作られたか、または特異性のより少ない領域、例えば3’コード領域から作られたかという特異性、およびハイブリダイゼーションもしくは増幅のストリンジェンシー(最大、高、中、もしくは低)は、プローブが天然発生の配列、対立遺伝子のみを同定するか、または関連配列を同定するかを決定し得る。プローブはまた、関連配列の検出にも使用されてよく、好ましくはいずれのコード配列からのヌクレオチドの少なくとも50%を含む必要がある。対象発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであってよく、配列番号703〜1373、もしくは相補体、もしくはその改変配列のヌクレオチド配列由来、または天然発生配列のプロモーターおよびエンハンサーエレメントを含むゲノム配列由来であってよい。
DNAに対する特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための手段は、mRNAプローブ産生のためのベクターへの核酸配列のクローン化を含む。このようなベクターは当該技術分野において公知かつ市販されており、適切なRNAポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドの添加によるin vitroでのRNAプローブ合成に使用されてよい。ハイブリダイゼーションプローブは様々なレポーター群、例えば32Pもしくは35Sのような放射性核種、またはアビジン/ビオチン共役システムを通してプローブに共役されたアルカリホスファターゼのような酵素ラベルなどにより標識されてよい。ポリヌクレオチドは、サザンもしくはノーザン分析、ドットブロット、またはその他の膜に基づく技術;PCR技術;または試験紙、ピン、ELISAアッセイ、または微生物の存在もしくはレベルを検出するために、被験体生検由来の液体または組織を利用するマイクロアレイにおいて使用されてよい。このような定性または定量法は当該技術分野において公知である。
特定の態様によれば核酸配列は、標準法により標識される様々なアッセイにおいて有用である可能性があり、ハイブリダイゼーションおよび/または増幅に適した条件下で被験体由来の液体もしくは組織サンプルに加えられる。適切なインキュベーション期間の後、サンプルは洗浄され、シグナルが定量されて標準値と比較される。試験サンプル中のシグナル量が、比較されるコントロールサンプルのそれよりも著しく変化している場合、サンプル中のヌクレオチド配列の変化したレベルの存在は、微生物の存在またはレベルを示す。このようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験、または被験体の治療のモニターにおいて特定のワクチン療法の有効性を評価するためにも用いられてよい。
微生物の存在またはレベルの診断の基礎を提供するため、発現特性の正常または標準プロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションおよび/または増幅に適した条件下で、正常被験体由来の体液または細胞抽出物をポリヌクレオチドまたはその断片と組み合わせることにより達成され得る。標準レベルは、正常被験体から得られた値を、実質的に精製されたポリヌクレオチドの既知の量を使用した実験から得られた値と比較することにより定量されてよい。正常サンプルから得られた標準値は、微生物の生育に対して治療された被験体のサンプルから得られた値と比較されてよい。標準値と被験体の値との間の偏差は、微生物の存在またはレベルを確立するために使用される。
一旦微生物が同定され、ワクチン接種手順が開始されると、被験体における発現レベルが正常被験体において観察されるそれに比べて減少し始めるか否かを評価するため、ハイブリダイゼーションおよび/または増幅アッセイが定期的に反復されてよい。連続的なアッセイから得られた結果は、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたってワクチン接種の有効性を示すために用いられてよい。
核酸配列から設計されたオリゴヌクレオチドの特定の診断的使用は、PCRの使用に関連してよい。このようなオリゴマーは化学的に合成、酵素的に産生、またはin vitroで産生されてよい。オリゴマーは好ましくは二つのヌクレオチド配列から成る可能性があり、特定の遺伝子または状態を同定するための最適化された状態の下で用いられる、一つはセンス方向(5’.fwdarw.3’)およびもう一つはアンチセンス方向(3’.fwdarw.5’)である。同一の二つのオリゴマー、オリゴマーの入れ子状態のセット、またはオリゴマーの縮重プールでさえも、密接に関連するDNAもしくはRNA配列の検出および/または定量のための少ないストリンジェント状態の下で用いられてよい。
発現の定量のために用いてもよい方法は、放射標識またはビオチン化ヌクレオチド、コントロール核酸の共増幅、および実験結果が補間された検量線を含む(Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236)。複数のサンプルを定量する速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈で存在し、かつ分光光度的または比色反応が迅速な定量を生ずるELISA形式におけるアッセイを行うことによって促進され得る。
さらなる実施形態によれば、ここに記載されるいずれかのポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドまたは長めの断片は、マイクロアレイにおける標的として使用されてよい。マイクロアレイは多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターし(転写像を作り出すため)、かつ遺伝的変異体、変異および多型性を同定するために使用できる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、および治療薬活性の開発およびモニターのために使用されてよい。一実施形態によればマイクロアレイは、PCT出願国際公開第95/11995号(Chee et al.)、Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) および Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
10614-10619)に記載されるような当該技術分野において公知の方法に従って準備、および使用される。
10614-10619)に記載されるような当該技術分野において公知の方法に従って準備、および使用される。
一態様によればオリゴヌクレオチドは、PCT出願国際公開第95/251116号(Baldeschweiler et al.)に記載されるような化学共役手順およびインクジェット適用装置を用い、マイクロアレイの表面で合成されてよい。別の態様によれば、ドットまたはスロットブロットに類似した「格子」アレイ(HYBRIDOT器具、Life Technologies)が、真空システム、熱、UV、機械的または化学的結合手順を用いて、基質の表面にcDNA断片またはオリゴヌクレオチドを整列および連結するために用いられてよい。さらに別の態様によれば、アレイは用手で、または利用可能な装置、材料、および機械(マルチチャンネルピペッターまたはロボット機器;Brinkmann、ウェストベリー、ニューヨーク州、を含む)を用いて産生され、かつ例えば24、48、96、384、1024、1536、もしくは6144スポットまたはウェル(例えばマルチウェルプレートとして)、またはそれを超えて、またはそれ自体が市販の機器使用を効率的にする、その他のいずれの2ないし1,000,000の複数を含んでよい。
マイクロアレイを用いるサンプル分析を行うため、生物学的サンプルからポリヌクレオチドが抽出される。生物学的サンプルはいずれの体液(血液、尿、唾液、痰、胃液など)、培養細胞、生検、またはその他の組織標本から得られてよい。プローブの産生のため、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドを用いてマイクロアレイの核酸に相補的な核酸配列が産生される。マイクロアレイがcDNAから成る場合、適切なプローブはアンチセンスRNAである。従って一態様によれば、mRNAを用いてcDNAを産生し、蛍光ヌクレオチドの存在下で、今度はそのcDNAを用いて断片またはアンチセンスRNAプローブを産生する。次々にcDNAを産生するmRNAが用いられる。これらの蛍光標識されたプローブはマイクロアレイと共にインキュベートされ、プローブ配列はマイクロアレイのcDNAオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。別の態様によれば、プローブとして用いられる核酸配列は、ハイブリダイゼーション技術の分野において公知の制限酵素、PCR技術、およびオリゴ標識キット(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて産生される、ポリヌクレオチド、断片、および相補またはアンチセンス配列を含んでよい。
本発明の別の実施形態によれば、本発明のペプチドもしくはポリペプチド、またはその機能性もしくは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドは、様々な薬物スクリーニング技術のいずれにおいても、化合物ライブラリーのスクリーニングのために使用できる。このようなスクリーニングに用いられる断片は、溶液中で遊離型であるか、固体支持体へ固定されるか、細胞表面上にあるか、または細胞内に位置し得る。ペプチドまたはポリペプチドと、試験される薬剤の間での結合複合体の形成が測定されてよい。
使用されてよい薬物スクリーニングの一技術は、公開されたPCT出願国際公開第84/03564号に記載されるように、目的のペプチドまたはポリペプチドへの適切な結合アフィニティーを有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この方法によれば、多数の異なる小さな試験化合物が、プラスチックピン、またはその他の幾つかの表面のような固体基質上で合成される。試験化合物は、ペプチドもしくはポリペプチド、またはその断片と反応し、洗浄される。結合したペプチドまたはポリペプチドは、次に当該技術分野において公知の方法により検出される。精製されたペプチドまたはポリペプチドはまた、上述の薬物スクリーニング技術における使用のため、プレート上に直接コートもできる。あるいは非中和抗体が、ペプチドの捕獲および固体支持体上への不動化のために使用できる。
別の技術によれば、ペプチドまたはポリペプチドと結合できる中和抗体が、ペプチドまたはポリペプチドへの結合に対して試験化合物と特異的に競合する、競合薬物スクリーニン
グアッセイが使用されてよい。この様式によれば該抗体は、1つ以上の抗原結合部位を該抗体と共有する試験化合物の存在を検出するために使用できる。
グアッセイが使用されてよい。この様式によれば該抗体は、1つ以上の抗原結合部位を該抗体と共有する試験化合物の存在を検出するために使用できる。
ここに記載される実施例は、本発明の実施形態を例証する目的のためにある。その他の実施形態、方法、および分析の型は分子診断技術における当業者の範囲内であり、ここに詳述する必要はない。当該技術分野の範囲内のその他の実施形態は、本発明の一部とみなされる。
実施例1:ゲノムサイズの推定
メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)の種であるM1T(DSM1093)は、[g/l]NaCl(1)、KH2PO4(0.5)、(NH4)2SO4(0.25)、CaCl2.2H2O(0.13)、MgSO4.7H2O(0.2)、K2HPO4(1)、浄化した反すう胃液(300ml)dH2O(360ml)、NaHCO3(5)、レザズリン(0.2ml)L−システイン−HCl(0.5)、酵母抽出物(2)、ならびに、(g/l)ニトリロ三酢酸(1.5)、MgSO4.7H2O(3)、MnSO4.H2O(0.5)、NaCl(1)、FeSO4.7H2O(0.1)、CoCl2.6H2O(0.1)、CaCl2.2H2O(0.1)、ZnSO4.7H2O(0.1)、CuSO4.5H2O(0.01)、AlK(SO4)2.12H2O(0.01)、H3BO3(0.01)、Na2MoO4.2H2O(0.01)、NiSO4.6H2O(0.03)、Na2SeO3(0.02、およびNa2WO4.2H2O(0.02)から成るBalchの微量元素溶液(10ml)(微量元素の添加;Balch et al., 1979)、から成るBY+培地(基本培地、Joblin et al., 1990)中で生育した。細胞ペレットを液体N2下で凍結すること、および予め冷却した滅菌乳鉢および乳棒を用いて粉砕することによりゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAの物理的せん断を減少させるため、細胞ホモジネートをアガロースプラグ上に包埋し、続く操作をプラグ内で行った。制限酵素により消化を行い、DNA断片をパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて分離した。
メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)の種であるM1T(DSM1093)は、[g/l]NaCl(1)、KH2PO4(0.5)、(NH4)2SO4(0.25)、CaCl2.2H2O(0.13)、MgSO4.7H2O(0.2)、K2HPO4(1)、浄化した反すう胃液(300ml)dH2O(360ml)、NaHCO3(5)、レザズリン(0.2ml)L−システイン−HCl(0.5)、酵母抽出物(2)、ならびに、(g/l)ニトリロ三酢酸(1.5)、MgSO4.7H2O(3)、MnSO4.H2O(0.5)、NaCl(1)、FeSO4.7H2O(0.1)、CoCl2.6H2O(0.1)、CaCl2.2H2O(0.1)、ZnSO4.7H2O(0.1)、CuSO4.5H2O(0.01)、AlK(SO4)2.12H2O(0.01)、H3BO3(0.01)、Na2MoO4.2H2O(0.01)、NiSO4.6H2O(0.03)、Na2SeO3(0.02、およびNa2WO4.2H2O(0.02)から成るBalchの微量元素溶液(10ml)(微量元素の添加;Balch et al., 1979)、から成るBY+培地(基本培地、Joblin et al., 1990)中で生育した。細胞ペレットを液体N2下で凍結すること、および予め冷却した滅菌乳鉢および乳棒を用いて粉砕することによりゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAの物理的せん断を減少させるため、細胞ホモジネートをアガロースプラグ上に包埋し、続く操作をプラグ内で行った。制限酵素により消化を行い、DNA断片をパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて分離した。
実施例2:DNAクローニングおよび配列決定
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムのDNAは、Agencourt Biosciences Corporation(マサチューセッツ州、米国)によりランダムショットガンクローニングアプローチ(Fleischmann et al., 1995)を用いて、およびMacrogen Corporation(ロックビル、メリーランド州、米国)によりピロシーケンスを用いて配列決定された。簡単に述べると、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のDNAのライブラリーを、ゲノムDNAのランダムな物理的破壊およびゲル電気泳動による断片の分離により、大腸菌(Escherichia coli)内へ構築した。40kb範囲の大きな断片をゲルから回収し、大インサートのフォスミドライブラリーを作製するために使用した。2ないし4kb範囲のDNA断片を回収し、小インサートのプラスミドライブラリーを作製するために使用した。大および小インサートライブラリーの両方からもたらされたクローンを生育させ、それらのフォスミドまたはプラスミドDNAを回収し、ハイスループット配列決定技術を用いて配列決定した。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムの理論的な8倍のカバー率を生ずるために十分な数のクローンを配列決定した。さらなる配列のカバー率が、ランダムにせん断されたゲノムDNA断片のピロシーケンス(Macrogen Corporation)により得られ、約10倍の最終理論的なゲノムのカバー率となった。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムのDNAは、Agencourt Biosciences Corporation(マサチューセッツ州、米国)によりランダムショットガンクローニングアプローチ(Fleischmann et al., 1995)を用いて、およびMacrogen Corporation(ロックビル、メリーランド州、米国)によりピロシーケンスを用いて配列決定された。簡単に述べると、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のDNAのライブラリーを、ゲノムDNAのランダムな物理的破壊およびゲル電気泳動による断片の分離により、大腸菌(Escherichia coli)内へ構築した。40kb範囲の大きな断片をゲルから回収し、大インサートのフォスミドライブラリーを作製するために使用した。2ないし4kb範囲のDNA断片を回収し、小インサートのプラスミドライブラリーを作製するために使用した。大および小インサートライブラリーの両方からもたらされたクローンを生育させ、それらのフォスミドまたはプラスミドDNAを回収し、ハイスループット配列決定技術を用いて配列決定した。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムの理論的な8倍のカバー率を生ずるために十分な数のクローンを配列決定した。さらなる配列のカバー率が、ランダムにせん断されたゲノムDNA断片のピロシーケンス(Macrogen Corporation)により得られ、約10倍の最終理論的なゲノムのカバー率となった。
実施例3:配列構築およびアノテーション
配列の重複を見出すためにDNA配列を整列し、Paracel Genome Assembler(Paracel Inc、カリフォルニア州、米国)およびStadenパッケージ(Staden et al., 1998)を用い、標準および逆PCRの両方から得られた配列を組み合わせて、近接する(コンティグ)配
列へ構築した。コンティグは翻訳領域(ORF)ファインダーGLIMMER(Gene
Locator Interpolated Markov Model ER、Delcher et al., 1999)を用いて分析し、各ORFは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)の非重複性ヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対するギャップ付きBLAST(Basic Local Alignment Search Tool(Altschul et al., 1997)により分析した。
配列の重複を見出すためにDNA配列を整列し、Paracel Genome Assembler(Paracel Inc、カリフォルニア州、米国)およびStadenパッケージ(Staden et al., 1998)を用い、標準および逆PCRの両方から得られた配列を組み合わせて、近接する(コンティグ)配
列へ構築した。コンティグは翻訳領域(ORF)ファインダーGLIMMER(Gene
Locator Interpolated Markov Model ER、Delcher et al., 1999)を用いて分析し、各ORFは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)の非重複性ヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対するギャップ付きBLAST(Basic Local Alignment Search Tool(Altschul et al., 1997)により分析した。
8倍のドラフト段階の配列からのコンティグを、「偽分子」を産生するために配列の人工連結によってランダムに連結し、自動アノテーションのためThe Institute for Genomic Research(TIGR、ワシントンDC、米国)へ提出した。10倍のピロシーケンスから構築されたコンティグはGLIMMERを用いて再分析し、ORFはGAMOLA(Global Annotation of Multiplexed On-site Blasted DNA sequences; Altermann and Klaenhammer, 2003)を用いて自動アノテートした。自動アノテーションは、次に手動で確認した。ORFはオルソログタンパク質(COG)データベース(閾値1e−02)(Tatusov et al., 2001)のクラスターを用いる関数により分類した。
タンパク質モチーフは、広範囲および局所性のアラインメント(hypertext transfer protocol://pfam.wustl.edu)ならびに標準および断片モードTIGRFAM HMMモデル(hypertext
transfer protocol ://world wide web.tigr.org/TIGRFAMs)それぞれと共に、PFAM HMMならびにTIGRFAMライブラリーを用いたHMMER(hypertext transfer protocol://hmmer.wustl.edu)により決定した(閾値1e−02)。tRNAはTRNASCAN-SE(Lowe and Eddy,
1997)を用いて同定し、ヌクレオチド反復はKODONソフトウェアパッケージ(Applied Maths、オースティン、デキサス州、米国)およびREPUTER(Kurtz and Schleiermacher, 1999)を用いて同定した。ゲノムアトラス描出はGENEWIZ (Jensen et al., 1999)を用いて構築した。予測されるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)のORFeomeからの経路再構築は、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al., 2004)オンラインデータベースを併用し、社内開発のソフトウェア(PathwayVoyager; Altermann and Klaenhammer, 2005)を用いて行った。
transfer protocol ://world wide web.tigr.org/TIGRFAMs)それぞれと共に、PFAM HMMならびにTIGRFAMライブラリーを用いたHMMER(hypertext transfer protocol://hmmer.wustl.edu)により決定した(閾値1e−02)。tRNAはTRNASCAN-SE(Lowe and Eddy,
1997)を用いて同定し、ヌクレオチド反復はKODONソフトウェアパッケージ(Applied Maths、オースティン、デキサス州、米国)およびREPUTER(Kurtz and Schleiermacher, 1999)を用いて同定した。ゲノムアトラス描出はGENEWIZ (Jensen et al., 1999)を用いて構築した。予測されるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)のORFeomeからの経路再構築は、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al., 2004)オンラインデータベースを併用し、社内開発のソフトウェア(PathwayVoyager; Altermann and Klaenhammer, 2005)を用いて行った。
実施例4:配列決定結果および分析
ゲノムDNAの制限酵素消化およびPFGEによる断片のサイズ決定によるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムのサイズ推定は、約2.5〜2.9Mbの単一染色体を示した。大および小インサートクローン(6倍ドラフトカバー率)の最初の配列決定および配列のコンティグへの構築は、ゲノムの40kb範囲が、特に小インサートライブラリー内で高度に過剰表現(>20倍)されていることを示した。これは高コピー数のプラスミド(染色体外DNAは同定されていないが)、またはDNA抽出のために使用した培養物の生育の間に複製した溶原性バクテリオファージによる可能性がある。この大きな配列バイアスのため、さらなる配列決定(2倍の理論的ゲノムカバー率)を、サンガー配列決定法により最終の8倍のカバー率をもたらす大インサートクローンのみについて行った。8倍のドラフト段階の配列を、105のスキャフォールドを通して連結した756のコンティグへ構築した。さらなる〜10倍のカバー率に対してさらなるピロシーケンスを行い、これらの配列の構築への取り込みはコンティグの数を27に低下させた。これに続く逆および長距離PCR技術を用いるギャップ閉鎖は、コンティグの数を14に減少させた。
ゲノムDNAの制限酵素消化およびPFGEによる断片のサイズ決定によるM.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノムのサイズ推定は、約2.5〜2.9Mbの単一染色体を示した。大および小インサートクローン(6倍ドラフトカバー率)の最初の配列決定および配列のコンティグへの構築は、ゲノムの40kb範囲が、特に小インサートライブラリー内で高度に過剰表現(>20倍)されていることを示した。これは高コピー数のプラスミド(染色体外DNAは同定されていないが)、またはDNA抽出のために使用した培養物の生育の間に複製した溶原性バクテリオファージによる可能性がある。この大きな配列バイアスのため、さらなる配列決定(2倍の理論的ゲノムカバー率)を、サンガー配列決定法により最終の8倍のカバー率をもたらす大インサートクローンのみについて行った。8倍のドラフト段階の配列を、105のスキャフォールドを通して連結した756のコンティグへ構築した。さらなる〜10倍のカバー率に対してさらなるピロシーケンスを行い、これらの配列の構築への取り込みはコンティグの数を27に低下させた。これに続く逆および長距離PCR技術を用いるギャップ閉鎖は、コンティグの数を14に減少させた。
14コンティグ配列を組み合わせた長さは、ゲノムがPFGEにより推定されたサイズよりもわずかに長く(2,920,443bp)(図1A)、最も近い類縁体であるM.スミシー(M.smithii)(1.9Mb)に比べて著しく大きなことを示す。32.7%の%G+Cは、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)系統について報告されている27.5%ないし31.6%範囲に近い(Balch et al, 1979)。配列解析は2672のORFを予測し、タンパク質ファミリー(TIGRFamおよびPFam)およびオルソログ群のクラスター
(COG)へのヒットの総数は図1Bに報告される。H2+CO2およびギ酸塩からのメタン生成に関与すると予測される遺伝子の全てが存在する(図1C;および図6A〜6C)。しかしながら、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のドラフト配列はメチル補酵素還元酵素II(mcrIIまたはmrt)システムを欠く。その他のメタン生成菌においてmcrIIクラスターは、H2の高い分圧における生育の間に発現増加される、メチルCoM還元酵素Iのアイソザイムをコードする(Reeve et al., 1997)。H2は反すう胃内で迅速に使用され高レベルで蓄積しないため、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)はmcrIシステムのみを通して低レベルのH2を使用するように順応すると考えられる。
(COG)へのヒットの総数は図1Bに報告される。H2+CO2およびギ酸塩からのメタン生成に関与すると予測される遺伝子の全てが存在する(図1C;および図6A〜6C)。しかしながら、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のドラフト配列はメチル補酵素還元酵素II(mcrIIまたはmrt)システムを欠く。その他のメタン生成菌においてmcrIIクラスターは、H2の高い分圧における生育の間に発現増加される、メチルCoM還元酵素Iのアイソザイムをコードする(Reeve et al., 1997)。H2は反すう胃内で迅速に使用され高レベルで蓄積しないため、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)はmcrIシステムのみを通して低レベルのH2を使用するように順応すると考えられる。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のゲノムのドラフトと密接に関連するM.スミシー(M.smithii)およびMt. thermoautotrophicusとの比較は、異なる幾つかの領域を明らかにした。遺伝子の相違の幾つかは、反すう胃内の環境で表面またはその他の微生物との相互作用を仲介すると考えられるCPOMPおよびDUF11反復配列(それぞれ、chlamydial polymorphic outer membrane proteins、およびdomain of unknown function)を含み得る、アスパラギン/スレオニンリッチの大きなタンパク質ファミリーの、非常に大きな表面タンパク質をコードする(図7A〜7Cを参照)。類似の反復配列もまた、Ms. stadtmanaeおよびM.スミシー(M.smithii)ゲノムの両方においてコードされる大きな表面タンパク質内に見出される(Samuel et al., 2007)。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)は以前に莢膜を産生することが報告されており(Smith and Hungate, 1958)、配列解析は、多糖類により表面を装飾することが確認されている菌体外多糖の合成および搬出に関与する50を超える遺伝子(糖転移酵素(GT)、その他の転移酵素、エピメラーゼおよび輸送体)をコードすることを示す(図8A〜8Cを参照)。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)は、M.スミシー(M.smithii)における28(1GT1;22GT2;4GT4および1GT66)ならびにM. stadtmanaeにおける41(2GT1;26GT2;12GT4および1GT66)に比べ、少なくとも30種の糖転移酵素(6GT1、21GT2、2GT4および1GT66;図8A〜8Cを参照)を有する(Samuel et al, 2007; Fricke et al., 2006; Coutinho and Henrissat, 1999)。これは、これらの生物による表面多糖類をコードするために充てられた遺伝子としては比較的多数であり、胃腸環境内での生存に重要な因子であることが示唆される。
ヌクレオチド反復分析により、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)ゲノム内に少なくとも2つのスペーサー分散型ダイレクトリピート(SPIDR)領域の存在が明らかにされた。SPIDRは最初に原核生物において特徴付けられた(Jansen et al., 2002)、異種性配列により分離される同一単位から作られるヌクレオチド反復(通常40nt未満)である。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のSPIDR Iは、付随するcas遺伝子のクラスターを持つ17kbの領域に隣接する、二つの同一反復構造から成る独特の遺伝的配置を有する。類似の反復構造は、幾つかのメタン生成菌ゲノムに見出されている。メタノカルドコッカス・ジャナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)は、長い(391〜425bp)反復区域とそれに続く25までの短い(27〜28bp)反復区域から成り、これら自体が31ないし51bpの独特の配列により分離される、18コピーの多コピー反復ヌクレオチドエレメントを含む(Bult et al, 1996)。Ms. stadtmanaeのゲノムは、30bpのエレメントが59回反復される4.8kbの領域を含む(Fricke et al., 2006)。Mt. thermoautotrophicusは、372bpの反復配列を含む二つの伸長した反復(3.6および8.6kbのサイズ)と、これに続く長さ34ないし38bpの独特の配列によって分離される47および124コピーの同じ30bp反復配列を含む(Smith et al., 1997)。これらSPIDRの生物学的機能は不明であるが、現在の仮説は、こ
のシステムが真核生物の小干渉RNAシステムの機能的類似であり、かつアンチセンスRNAの原理において機能する外来性レプリコンに対する防御システムを表すと推測する(Jansen et al., 2002; Haft et al., 2005; Godde and Bickerton, 2006; Makarova et al., 2006)。
のシステムが真核生物の小干渉RNAシステムの機能的類似であり、かつアンチセンスRNAの原理において機能する外来性レプリコンに対する防御システムを表すと推測する(Jansen et al., 2002; Haft et al., 2005; Godde and Bickerton, 2006; Makarova et al., 2006)。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のゲノムはまた、結果的に細胞表面に曝露される領域を含むことが予想される膜貫通ドメインをもつタンパク質をコードすると予測される、多数のORFもまたコードする(図9A、9Bおよび9C)。
実施例5:抗体産生および試験
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞壁の調製:M.ルミナンチウム(M.ruminantium)由来の細胞壁を、細胞ペレットを液体N2下で凍結すること、および予め冷却した滅菌乳鉢および乳棒を用いて粉砕することにより調製した。微細に粉砕した細胞をトリプシンリン酸緩衝液(40mgトリプシン/200mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.9)に再懸濁し、37℃において2時間インキュベートした。調製品をその後48,000gで、4℃において30分間遠心し、得られたペレットを滅菌蒸留H2Oで2回洗浄して凍結乾燥した。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞壁の調製:M.ルミナンチウム(M.ruminantium)由来の細胞壁を、細胞ペレットを液体N2下で凍結すること、および予め冷却した滅菌乳鉢および乳棒を用いて粉砕することにより調製した。微細に粉砕した細胞をトリプシンリン酸緩衝液(40mgトリプシン/200mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.9)に再懸濁し、37℃において2時間インキュベートした。調製品をその後48,000gで、4℃において30分間遠心し、得られたペレットを滅菌蒸留H2Oで2回洗浄して凍結乾燥した。
抗体産生:M.ルミナンチウム(M.ruminantium)のゲノム配列から細胞外部に位置すると予測される9ペプチド配列を同定し、潜在的抗原として選択した。これらのペプチド各5mgを合成し(Invitrogen)、その純度をマススペクトロメトリーにて調べた。ペプチドおよびそのコード配列を図4に示す。完全な核酸およびアミノ酸配列を図5に示す。各ペプチドの2mgをELISAのために未抱合にとどめ、3mgを動物免疫のためにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合した。
図2に要約されるワクチン接種プログラムは以下のように進行させた。0日目に2〜5mlの免疫前血清を生ずるために前採血したヒツジ(1〜3歳)を、各免疫に一頭使用した。これに続き0日目に、CFA(フロイント完全アジュバント)中の抱合ペプチド200μgの最初の皮内(ID)注射を10〜15箇所に行った。14日目に、IFA(フロイント不完全アジュバント)中のKLH−ペプチド200μgを10〜15箇所に、28日目に、CFA中のKLH−ペプチド200μgを10〜15箇所に皮内(ID)注射した。IFA中のKLH−ペプチド200μgの、10〜15箇所へのさらなる5回の皮内(ID)注射を、56、70、84、98および112日目に行った。4回の試験採血(2〜5ml)を、42、56、84、および112日目に行った。採血によって標準的手順の最後に約1,000mlの抗血清が得られた。
抗体力価は、高結合96ウェルプレート上の固相に結合したペプチド−GGG(ヤギガンマグロブリン)(0.1μg/100μl/ウェル)を用いた酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により決定した。血清は最初に50倍希釈し、次にさらに2倍の連続希釈を行った。ELISA力価は、405nmにおいて0.2のODをもたらす推定希釈因子として算出し、これは連続希釈曲線の非線形回帰分析に由来する。検出はHRP抱合二次抗体およびABTS基質を用いて得た。
ワクチン接種に対するヒツジ抗体の反応を図3に示す。全てのヒツジ血清は、6週目に免疫前より少なくとも32倍高い力価を有した(1:1600)。最も抗原性の高い調製物はmtrDペプチドであり、免疫前レベルよりも1024倍高い力価を有した。最も抗原性の低い調製物は、mtrEペプチド、ORF508およびORF819表面タンパク質ペプチドであった。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞壁調製物は良好な抗体反応を誘導したが(免疫前レベルよりも256倍高い)、これは数回の追加免疫にもかかわらず、15週を越えて長くは持続しなかった。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞への抗体結合:以下のように、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞への抗体結合を測定するためELISAアッセイを用いた。MaxiSorp ELISAプレート(Nunc)に、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の全細胞(2mlの炭酸ナトリウム緩衝液中の40μlの細胞)およびM.ルミナンチウム(M.ruminantium)のサイトゾルタンパク質分画をコートした。血清サンプルを、1%w/vカゼインを含むPBS Tween20中に1/20希釈し(25μlを475μlの希釈液へ)、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS Tween20で6回洗浄した。陰性コントロール血清を含み、これは子ヒツジのときに初乳を与えられなかったヒツジから得られた。
抱合体の検出にはロバ抗ヒツジ/ヤギIgGHRP(SerotecによるBatch 061005 Star 88P)を用い、1/5000希釈(2μlを10mlの希釈液へ)の50μlを各ウェルに加えた。次に3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン(TMB)基質を加え(50μl/ウェル)、反応物を室温にて暗所で15分間インキュベートした。次に停止液(0.05M H2SO4、50μl/ウェル)を加え、450nmでプレートの読み取りを行った。
M.ルミナンチウム(M.ruminantium)生育抑制試験:免疫血清サンプルを嫌気性フード内で解凍し、10のサンプルのそれぞれから0.1mlを1.5mlの微量遠心チューブ内へ入れた。溶解したいずれの酸素を取り除くため、混合物(1ml)を室温にて、嫌気性フード内で蓋を開いた状態で一晩インキュベートした。前免疫血清は陰性コントロールとして働いた。組み合わせた血清サンプル(0.3ml)を、嫌気性フード内のHungateチューブ内で生育している5mlのM.ルミナンチウム(M.ruminantium)培養物へ三通りに加えた。気体(80%H2および20%CO2)をHungateチューブ内へポンプで注入し、培養物を振とう機(100rpm)上で39℃においてインキュベートした。メタン生成菌の生育は、分光光度計での600nmにおけるODの測定、ならびに水素の使用およびメタン生成のガスクロマトグラフ決定によりモニターした。
ELISAアッセイは、各抗原から産生された抗体が、マイクロタイタープレートに固定化したM.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞に結合することを示した。抗体はin vitroでM.ルミナンチウム(M.ruminantium)細胞に結合することが示されたが、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)培養物に加えた単一の抗体試料はメタン形成菌の生育を抑制せず、または形成されたメタンの量も減少させなかった。しかしながら、10の異なる抗原それぞれからのプール抗血清のサンプルから成る調製物は、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)培養物に加えたときに細胞凝集を増大させるように見えた。
実施例6:概観
メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)は、様々な食餌条件下でのその反すう胃内における有病率(培養および分子検出データに基づく)、培養物の有効性、実験室での日常的生育の快適性、ならびにこの生物に対する比較的多数の以前の研究および入手可能な背景文献により、ゲノム配列決定のために選択された。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)内の著しく多数の遺伝子が機能を割り当てられ、これによってこの生物の反すう胃内での生活様式の詳細な描写が可能になる。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の単純な基質(H2+CO2、ギ酸塩)依存性、ならびにその表面タンパク質および菌体外多糖を通した反すう胃環境との相互作用は抑制の重要な標的である。同様にSPIDRは、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の特異的標的化および遺伝子機能決定補助のための将来の遺伝的操作の両方について期待される。配列データはこの生物の代謝およびそれが他の微生物とどのように相互作用するかを明らかにし、かつ反すう胃内におけるメタン生成を阻止または減少させるために不活性化できる、メタン
生成菌の間で保存されたシステム、および構成成分を示している。
メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)は、様々な食餌条件下でのその反すう胃内における有病率(培養および分子検出データに基づく)、培養物の有効性、実験室での日常的生育の快適性、ならびにこの生物に対する比較的多数の以前の研究および入手可能な背景文献により、ゲノム配列決定のために選択された。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)内の著しく多数の遺伝子が機能を割り当てられ、これによってこの生物の反すう胃内での生活様式の詳細な描写が可能になる。M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の単純な基質(H2+CO2、ギ酸塩)依存性、ならびにその表面タンパク質および菌体外多糖を通した反すう胃環境との相互作用は抑制の重要な標的である。同様にSPIDRは、M.ルミナンチウム(M.ruminantium)の特異的標的化および遺伝子機能決定補助のための将来の遺伝的操作の両方について期待される。配列データはこの生物の代謝およびそれが他の微生物とどのように相互作用するかを明らかにし、かつ反すう胃内におけるメタン生成を阻止または減少させるために不活性化できる、メタン
生成菌の間で保存されたシステム、および構成成分を示している。
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の説明では、その公知の同等物を有する完全なものについて言及してきたが、それらの同等物は個々に説明したものとして本明細書に全体が組み込まれる。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて説明してきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の発明にさらなる変更を加えることが可能なことを理解されたい。
Claims (62)
- 配列番号1〜9から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号10〜17から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号18〜44から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号45〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号261〜331から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号332〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号1〜9から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号10〜17から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号18〜44から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号45〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号261〜331から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号332〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列と90%の同一性を共有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号10〜17から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインを含む、単離されたポリペプチドまたはペプチド。
- 配列番号45〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインを含む、単離されたポリペプチドまたはペプチド。
- 配列番号332〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインを含む、単離されたポリペプチドまたはペプチド。
- 配列番号1〜9から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号10〜17から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号18〜44から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号45〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号261〜331から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号332〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号10〜17から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号45〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号332〜702から成る群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号703〜710から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号711〜736から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号737〜931から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号932〜1002から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1003〜1373から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項16〜29のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドに相補的な、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするベクター。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドをコードするベクター。
- 請求項16〜30のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項31〜33のいずれか1項に記載のベクターを含むホスト細胞。
- 原核生物である、請求項34に記載のホスト細胞。
- Escherichia coliである、請求項35に記載のホスト細胞。
- メタン生成菌である、請求項34に記載のホスト細胞。
- メタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)である、請求項37に記載のホスト細胞。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む抱合体分子。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドを含む抱合体分子。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む融合体分子。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドを含む融合体分子。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドに結合する、抗体または抗体断片。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドに結合する、抗体もしくは抗体断片。
- ポリクローナルである、請求項43または44に記載の抗体もしくは抗体断片。
- モノクローナルである、請求項43または44に記載の抗体もしくは抗体断片。
- 請求項43〜46のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を含む抱合体分子。
- 抗メタン生成化合物、シグナル配列、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、または抗生剤をさらに含む、請求項47に記載の抱合体分子。
- 請求項43〜46のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を含む融合体分子。
- 抗メタン生成化合物、シグナル配列、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、または抗生剤をさらに含む、請求項49に記載の融合体分子。
- 請求項43〜46のいずれか1項に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 請求項39、40、47、および48のいずれか1項に記載の抱合体分子を含む医薬組成物。
- 請求項41、42、49、および50のいずれか1項に記載の融合体分子を含む医薬組成物。
- 同定、単離、または抑制のためにメタン生成菌細胞を標的化する方法であって、a)必要に応じて、請求項43〜46のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を産生もしくは単離すること;およびb)該細胞を該抗体または抗体断片に接触させることを含む方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)である、請求項54に記載の方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)のM1T種(DSM1093)である、請求項55に記載の方法。
- 同定、単離、または抑制のためにメタン生成菌細胞を標的化する方法であって、a)必要に応じて、請求項47もしくは48に記載の抱合体分子を産生または単離すること;およびb)該細胞を該抱合体分子に接触させることを含む方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)である、請求項57に記載の方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)のM1T種(DSM1093)である、請求項58に記載の方法。
- 同定、単離、または抑制のためにメタン生成菌細胞を標的化する方法であって、a)必要に応じて、請求項49もしくは50に記載の融合体分子を産生または単離すること;およびb)該細胞を該融合体分子に接触させることを含む方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)である、請求項60に記載の方法。
- 該細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム(Methanobrevibacter ruminantium)のM1T種(DSM1093)である、請求項61に記載の方法。
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