ES2587595T3 - Péptidos y polipéptidos de permeabilización celular para células microbianas - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido o péptido aislado: a) que comprende SEC. ID. NO: 117, 118 o 119; b) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 117, y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 90% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 117; c) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 118, y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 95% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 118; d) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 119, y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 90% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 119; e) un fragmento de SEC. ID. NO: 117, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 117; f) un fragmento de SEC. ID. NO: 118, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 118; g) un fragmento de SEC. ID. NO: 119, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 119, en el que dicho polipéptido o péptido tiene actividad de asociación celular o permeabilización celular.

Description

DESCRIPCIÓN Péptidos y polipéptidos de permeabilización celular para células microbianas Campo de la Invención 5 La invención se relaciona con composiciones y métodos para aplicar moléculas inhibitorias al interior de las células microbianas, especialmente de células de metanógenos. Específicamente, la invención se relaciona con péptidos señal y con los polipéptidos que contienen estos péptidos, así como con polinucleótidos que codifican estos péptidos o polipéptidos. La invención se relaciona asimismo con vectores de expresión y células huésped para la producción 10 de estos péptidos o polipéptido. La invención se relaciona también con métodos para la detección, direccionamiento, permeabilización e inhibición de células microbianas, especialmente células metanógenas, utilizando los péptidos o polipéptidos, vectores de expresión y células huésped descritos. Antecedentes de la Invención 15 En Nueva Zelanda, la actividad agrícola es responsable de la mayor parte de las emisiones de gas de invernadero. Por lo tanto, la reducción de las emisiones agrícolas de gases invernadero es importante para que Nueva Zelanda cumpla las obligaciones surgidas del Protocolo de Kioto. El Protocolo requiere la reducción de los gases invernadero a los niveles de 1990 antes del final del primer período de compromiso (2008–2012). Para este fin, algunos grupos 20 del sector agrícola y el gobierno de Nueva Zelanda establecieron el Consorcio Pastoral de Investigaciones sobre Gases invernadero (PGGRC) para identificar medios para reducir las emisiones de gases invernadero en la agricultura de Nueva Zelanda. Una parte importante de las actividades del PGGRC ha consistido en investigar la forma de reducir las emisiones de 25 metano producidas por los rumiantes que pastan en Nueva Zelanda. La mitigación de las emisiones de metano de los rumiantes es de interés comercial por dos razones. En primer lugar, la falta de cumplimiento de los compromisos asumidos bajo el Protocolo de Kioto obligará al gobierno a adquirir créditos de carbono. Se estima que actualmente el costo es de $350 millones. En segundo lugar, la producción de metano da lugar a la pérdida de 8–12% de la energía bruta producida en el rumen. Esta energía se podría utilizar, en su lugar, para mejorar la productividad de 30 los rumiantes. El metano se produce en el rumen merced a los microbios denominados metanógenos que son parte del filum Euryarchaeota dentro del reino de los Archaea. La mayoría de los metanógenos se desarrollan en CO2 y H2 como única fuente de energía, aunque pueden utilizar compuestos de acetato o metilo para desarrollarse. En el rumen 35 existen varios géneros diferentes de archaea metanogénicos, aunque se piensa que algunas especies del género Methanobrevibacter, especialmente M. ruminantium y M. smithii son los metanógenos predominantes en los rumiantes de Nueva Zelanda. En la actualidad, M. ruminantium es el tema central de un proyecto de secuenciación de genoma con fondos otorgados por el PGGRC. El proyecto es la primera secuenciación del genoma de un metanógeno del rumen y apunta a cimentar una mejor comprensión de la biología de Methanobrevibacter para 40 descubrir blancos para la inhibición de la formación de metano. La reducción de la producción de metano en el rumen requiere la inhibición de los metanógenos o la inactivación de su vía de metanogénesis. Un medio para inhibir la producción de metano consiste en aplicar moléculas inhibitorias específicas a las células metanógenas. Esto se puede lograr, por ejemplo, acoplando moléculas inhibitorias a 45 péptidos impermeabilizantes de las células. En las células microbianas, los péptidos señal median en la translocación de las proteínas extracelulares desde el interior al exterior de la célula y son adecuados para el transporte de las moléculas inhibitorias. Por lo tanto, sería provechoso identificar péptidos señal que tengan la capacidad de permeabilizar las células metanógenas y aplicar inhibidores. 50 Los péptidos señal, o secuencias señal, están incluidos típicamente en las proteínas precursoras secretadas por las células procariotas y eucariotas. Los péptidos señal son parte de una extensión permeabilizante de las células que existe en el término N del precursor. La secuencia primaria de aminoácidos de los péptidos señal no se conserva aparte del sitio de escisión de la peptidasa señal (von Heijne, 1985). Sin embargo, los péptidos señal sí comparten similitudes estructurales. Por lo general, los péptidos señal incluyen de uno a cinco residuos aminoácidos N–55 terminales con carga positiva (región n) seguidos por 10 a 15 residuos aminoácidos hidrófobos (región h). Habitualmente hay un residuo de glicina o prolina situado dentro del dominio hidrófobo y uno o más residuos de treonina y/o serina forman un dominio polar (región c) cerca del sitio de escisión (Inouye y Halegoua, 1980; Vlasuk et al., 1983, von Heijne, 1985). 60 Se ha propuesto un modelo de bucle para la translocación de los péptidos señal (Inouye et al., 1977; lnouye y Halagoua, 1980) por el cual el término N con carga positiva del péptido señal interactúa con la superficie interna con carga negativa de la membrana celular. De esa manera, el dominio hidrófobo es atraído hacia la bicapa lipídica hidrófoba de la membrana, formando un bucle. Eventualmente el bucle incluye el sitio de escisión, que queda expuesto a la peptidasa señal para la eliminación del péptido señal. Una de las barreras para la inhibición o limitación de la formación de metano es la capacidad de aplicar compuestos inhibitorios al interior de las células metanógenas. Por consiguiente, existe la necesidad de identificar péptidos señal que puedan adherirse a las 5 membranas celulares y transportar moléculas a través de la bicapa lipídica, como portadores útiles de inhibidores celulares. Breve Descripción de la Invención 10 La invención presenta un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172. En un aspecto específico, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos KKLIIILLLLILLLSI de SEC. ID. NO: 117, o por lo menos una secuencia de aminoácidos KKIIIILLLLILLLISI de SEC. ID. NO: 119. En otro aspecto, el péptido o polipéptido comprende un fragmento que incluye, por ejemplo, por lo menos una secuencia de 15 aminoácidos que comprende los aminoácidos 3–14, 3–16 o 2–16 de SEC. ID. NO: 117, o por lo menos una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 3–15, 3–17 o 2–17 de SEC. ID. NO: 119. En otro aspecto, el péptido o polipéptido comprende un fragmento que incluye por lo menos una secuencia núcleo conservada de acuerdo con SEC. ID. NO: 1–172, como se describe en la presente. En un aspecto más, el péptido o polipéptido es codificado por al menos un fragmento de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en 20 SEC. ID. NO: 173–341 o SEC. ID. NO: 342–533. La invención presenta asimismo un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificadora para por lo menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido. En un aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste 25 en SEC. ID. NO: 1–172. En un aspecto específico, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos KKLIIILLLLILLLSI de SEC. ID. NO: 117, o una secuencia codificadora para al menos una secuencia de aminoácidos KKIIIILLLLILLLISI de SEC. ID. NO: 119. En otro aspecto, el polinucleótido comprende un fragmento de una secuencia codificadora, por ejemplo una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 3–14, 3–16 o 2–16 de SEC. ID. NO: 117, o una 30 secuencia codificadora, por ejemplo una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 3–15, 3–17 o 2–17 de SEC. ID. NO: 119. En un aspecto adicional, el polinucleótido comprende un fragmento de una secuencia codificadora, por ejemplo una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una secuencia núcleo conservada correspondiente a SEC. ID. NO: 1–172, de acuerdo con lo descrito en la presente. 35 En un aspecto adicional, la invención presenta un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 173–341 o SEC. ID. NO: 342–533. En un aspecto específico, el polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos de SEC. ID. NO: 531, 532, o 533. En otro aspecto, el polinucleótido es un fragmento o un oligonucleótido que comprende, por ejemplo, la secuencia de ácidos 40 nucleicos que se extiende desde el nucleótido 7–42, 7–48 o 4–48 de SEC. ID. NO: 531, 532 o 533. Además, la invención abarca un polinucleótido aislado, o un fragmento del mismo, que se hibrida a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de SEC. ID. NO: 173–341 o SEC. ID. NO: 342–533. La invención abarca además un polinucleótido aislado que comprende el complemento, complemento inverso, secuencia inversa o fragmentos de la misma, de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un péptido señal ó un polipéptido que 45 comprende este péptido. La invención presenta un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora para al menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido. En un aspecto, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada 50 del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172. En un aspecto específico, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos KKLIIILLLLILLLSI de SEC. ID. NO: 117, o una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos KKIIIILLLLILLLISI de SEC. ID. NO: 119. En otro aspecto, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 3–14, 3–16 o 2–16 de SEC. ID. NO: 117 o una 55 secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 3–15, 3–17 o 2–17 de SEC. ID. NO: 119. En un aspecto más, la invención presenta una célula huésped, por ejemplo una célula huésped microbiana, que comprende por lo menos un vector de expresión. La invención presenta específicamente un anticuerpo dirigido a un péptido, polipéptido o polinucleótido descrito en 60 este documento. En ciertos aspectos, el anticuerpo se dirige a por lo menos una secuencia de péptido señal seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de la misma. En otros aspectos, el anticuerpo se dirige a por lo menos un fragmento de una secuencia peptídica señal, por ejemplo una secuencia núcleo conservada de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172. En otro aspecto, el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende una secuencia peptídica señal de acuerdo con cualquiera de SEC. ID. NO: 1–172. En otros aspectos, el anticuerpo se dirige a por lo menos un fragmento de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 173–341 o SEC. ID. NO: 342–533 o un complemento o secuencia modificada de los mismos. En otro aspecto, el anticuerpo incluye una o más fusiones o 5 conjugados con por lo menos un inhibidor celular, por ejemplo compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. La invención presenta además péptidos señal modificados y polipéptidos que comprenden estos péptidos, así como 10 anticuerpos dirigidos a estos péptidos o polipéptidos, incluyendo las alternaciones, fragmentos, variantes y derivados biológicamente activos descritos en el presente documento. También se presentan polinucleótidos que codifican estos péptidos o polipéptidos modificados, como así también alteraciones, fragmentos, variantes y derivados de los polinucleótidos descritos, vectores de expresión que comprenden estas secuencias de ácido nucleico y células huésped que comprenden estos vectores.. En aspectos específicos, las composiciones y métodos de la presente 15 invención emplean estos polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos modificados o los correspondientes vectores de expresión o células huésped. En aspectos específicos, los péptidos o polipéptidos se producen en forma de fusiones o conjugados con por lo menos un inhibidor celular, por ejemplo compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos de acuerdo con lo descrito en forma detallada en la presente. 20 La invención presenta además una composición que comprende un péptido señal aislado (por ejemplo, por lo menos una de SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas) o un polipéptido que comprende este péptido o un anticuerpo dirigido a este péptido o polipéptido. También se presenta una composición que comprende un polinucleótido aislado (por ejemplo, por lo menos uno de SEC. ID. NO: 173–341 o SEC. ID. NO: 342–533 o un 25 complemento o secuencia modificada de las mismas). Se presenta asimismo una composición que incluye un vector de expresión o una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la presente invención. La composición puede incluir cualquiera de las alteraciones, fragmentos, variantes biológicamente activas y derivados descritos en la presente. Las composiciones pueden comprender además por lo menos un inhibidor celular y pueden ser formuladas, por ejemplo, en forma de composiciones farmacéuticas o como suplementos alimentarios, 30 específicamente componentes del alimento para rumiantes. En un aspecto específico, la invención presenta una composición de la presente invención como parte de un kit para la detección y/o medición o direccionamiento, permeabilización y/o inhibición de células microbianas, especialmente células metanógenas, de acuerdo con los métodos descritos. Los kits comprenden: a) por lo menos una composición 35 descrita en este documento y b) optativamente, instrucciones para su uso, por ejemplo en el direccionamiento o permeabilización de las células o la inhibición del desarrollo o replicación de las células para los metanógenos u otros microbios. En aspectos específicos, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. 40 La invención presenta un método para producir un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, método que comprende: a) cultivar un vector de expresión o célula huésped que comprende un vector de expresión, que comprende una secuencia codificadora para por lo menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, en condiciones adecuadas para la expresión del péptido o polipéptido y b) recuperar el péptido o 45 polipéptido del cultivo. También se presentan métodos para la producción de las composiciones descritas. En otros aspectos, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. La invención presenta además un método para producir un péptido señal o un polipéptido que comprende este 50 péptido, que incluye una fusión o conjugado con por lo menos un inhibidor celular, por ejemplo compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. Dicho método comprende: a) cultivar un vector de expresión o una célula huésped que comprende un vector de expresión, que comprende una secuencia codificadora para por lo menos un péptido o polipéptido en 55 condiciones adecuadas para la expresión del péptido o polipéptido, b) formar la fusión o conjugado (por ejemplo, mediante la expresión de la secuencia fusionada o por conjugación química al inhibidor celular) y c) recuperar la fusión o conjugado. En aspectos específicos, el péptido señal o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. 60 La invención presenta un método para permeabilizar una célula microbiana, especialmente una célula metanógena, que comprende: a) optativamente, producir o aislar por lo menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido y b) poner en contacto a la célula con el péptido señal o polipéptido. En un aspecto específico, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. En otros aspectos, el péptido o polipéptido comprende una fusión o conjugado con por lo menos un inhibidor celular, por ejemplo compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas 5 líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. La invención presenta además un método para inhibir una célula microbiana (por ejemplo, inhibir el desarrollo o replicación), específicamente una célula metanógena, que comprende: a) optativamente, producir o aislar por lo 10 menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, que a su vez comprende por lo menos un inhibidor celular y b) poner en contacto a la célula con el péptido señal o polipéptido. En un aspecto específico, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. En otro aspecto, el inhibidor celular es seleccionado entre compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y 15 fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. La invención presenta asimismo un método para inhibir una célula microbiana (por ejemplo, inhibir el desarrollo o replicación), específicamente una célula metanógena, que comprende: a) optativamente, producir o aislar por lo 20 menos un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, que a su vez comprende por lo menos un inhibidor celular y b) poner en contacto a la célula con el péptido señal o polipéptido. En un aspecto específico, el péptido o polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas. En otro aspecto, el inhibidor celular es seleccionado entre compuestos antimetanogénesis (por ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y 25 fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. La invención presenta también un método para la detección y/o medición de los niveles de un péptido señal o un polipéptido o polinucleótido correspondiente, que comprende: 1) poner en contacto a una muestra obtenida de un 30 sujeto con un anticuerpo dirigido a un péptido señal (por ejemplo, por lo menos uno de SEC. ID. NO: 1–172 o una secuencia modificada de las mismas) o un polipéptido o polinucleótido correspondiente y 2) determinar la presencia o niveles del complejo anticuerpo formado con el péptido señal o un polipéptido o polinucleótido correspondiente en la muestra. Dichos métodos se pueden utilizar asimismo para la detección y/o medición de los niveles de una célula microbiana, especialmente una célula metanógena. 35 La invención presenta además un método para la detección y/o medición de los niveles de una secuencia de polinucleótidos señal (por ejemplo, una secuencia codificadora de un péptido señal o una secuencia codificadora de un polipéptido correspondiente), que comprende: 1) poner en contacto a una muestra obtenida de un sujeto con un polinucleótido complementario (por ejemplo una secuencia complementaria de cualquiera de SEC. ID. NO: 173–341 40 o una secuencia modificada de las mismas) y 2) determinar la presencia o niveles del complejo de hibridación formado con el polinucleótido de la secuencia señal en la muestra. Dichos métodos se pueden utilizar asimismo para la detección y/o medición de los niveles de una célula microbiana, especialmente una célula metanógena. En aspectos específicos, los métodos de la presente invención utilizan componentes de expresión in vivo o in vitro. 45 En otros aspectos, los métodos emplean péptidos o polipéptidos producidos por medios o péptidos o polipéptidos recombinantes, sintéticos o semisintéticos producidos por medios endógenos. A continuación se describen otros aspectos y modalidades de la presente invención. 50 Breve Descripción de las Figuras Se describe la presente invención con referencia a modalidades específicas de la misma y con referencia a las Figuras. 55 Figuras 1A–1C: Comparación de genomas metanobacterianos (Figura 1A); estadísticas correspondientes al genoma de M. ruminantium (Figura 1B); Genes que se consideran implicados en la metanogénesis en las especies Metanobacterianas (Figura 1C). Figura 2: Alineación del péptido señal de Methanobrevibacter ruminantium. La región núcleo conservada de cada 60 péptido se presenta en negrita. Figura. 3A: Logo de la secuencia proteica de 102 secuencias generadas empleando LogoBar. Figura 3B: Logo de la secuencia proteica de 102 secuencias generadas empleando LogoBar, que ilustra los residuos aminoácidos más conservados. Figura 3C: Secuencia del péptido señal consensual núcleo correspondiente a M. ruminantium. Figura 3D: secuencia de aminoácidos de un péptido permeabilizador de células de M. ruminantium con la adición de lisina–fluoresceína N–terminal. 5 Figura 4: Permeabilización de células de M. ruminantium con un péptido marcado con fluoresceína. Figura 5: Diagrama de Venn que ilustra las predicciones de péptidos señal de SignalP 3.0–HMM usando tres modelos diferentes correspondientes al orfeoma señal M1093 de M. ruminantium. 10 Figura 6: Genes de M. ruminantium y los correspondientes puntajes de péptido señal. Figura 7: Genes de M. ruminantium y los correspondientes péptidos señal. 15 Figura 8: Secuencias codificadoras para los péptidos señal de la FIG. 7. Figura 9: Secuencias codificadoras para los péptidos señal de la figura 7 con codones optimizados para la expresión en E. coli. 20 Descripción Detallada de la Invención Definiciones Las secuencias de ácido nucleico "alteradas" que codifican péptidos señal incluyen, en el presente contexto, las que 25 tienen deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos, lo que da origen a un polinucleótido que codifica péptidos iguales o funcionalmente equivalentes. El péptido codificado también puede ser “alterado” y contener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos aminoácidos, lo que produce un cambio silencioso y de lugar a un péptido funcionalmente equivalente. Se pueden efectuar sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática 30 de los residuos, siempre que se mantenga la actividad biológica (por ejemplo, la asociación a las células o la permeabilización de las células) o la actividad inmunogénica del péptido. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva pueden incluir lisina y arginina y los aminoácidos con grupos al frente polares sin carga con valores de hidrofilicidad similares pueden incluir leucina, isoleucina y valina, glicina y alanina, asparagina y glutamina, serina y treonina y fanilalanina y tirosina. 35 "Secuencia de aminoácidos ", se refiere, en el presente contexto, a la secuencia de un oligopéptido, péptido, polipéptido o proteína, y fragmentos de los mismos, y a moléculas de origen natural, sintético o semisintético. Las secuencias de la presente invención (por ejemplo, SEC. ID. NO: 1–172) comprenden por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 19 o 22 aminoácidos, preferentemente por lo menos 5 a 10, 5 a 15, 10 a 15, 12 a 15, 15 a 17, 17 a 19 o 17 a 22 aminoácidos y que, preferentemente, retienen la actividad biológica (por ejemplo, la asociación a las 40 células o la permeabilización de las células) o la actividad inmunológica (por ejemplo un sitio de unión al anticuerpo) de la secuencia original. Cuando en la presente se menciona la frase “secuencia de aminoácidos “ para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula peptídica o polipeptídica de origen natural, dicha expresión secuencia de aminoácidos o términos similares no tienen por fin limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada a la molécula en toda su extensión. 45 El término "amplificación", empleado en la presente se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico y en general se lleva a cabo utilizando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) muy conocidas en la técnica (Dieffenbach, C. W. y G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY). 50 El término “anticuerpo” debe ser interpretado en su sentido más amplio posible y ha de incluir anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos policlonales. También se pretende que cubra fragmentos y derivados de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica pretendida. Los anticuerpos abarcan moléculas de inmunoglobulina y porciones activas de moléculas de inmunoglobulina (lg), es decir, moléculas que contienen un 55 sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Entre estas se incluyen, aunque no a modo de limitación, los policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fc, Fab, Fab’, y Fab2 y una biblioteca de expresión de Fab. La expresión moléculas de anticuerpos se relaciona con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE y IgD, que 60 difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Estas incluyen también las subclases, como por ejemplo IgG1, IgG2, y otras. La cadena liviana puede ser una cadena kappa o lambda. La referencia a anticuerpos en la presente incluye la referencia a todas las clases, subclases y tipos. También se incluyen los anticuerpos quiméricos, por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que son específicos para más de un origen, por ejemplo una o más secuencias de ratón, humanos o rumiantes. También se incluyen los anticuerpos o nanocuerpos de camélidos. Se ha de entender que cada referencia a "anticuerpos” o cualquier término similar, incluye anticuerpos intactos, así como cualquier fragmento, alteración, derivado o variante de los mismos. 5 Los términos “biológicamente activo” o “funcional” empleados en este contexto se refieren a un péptido o polipéptido que retiene una o más funciones estructurales, inmunogénicas o bioquímicas (por ejemplo, la asociación a las células o la permeabilización de las células) de una secuencia de origen natural. Por ejemplo, en un caso, una secuencia funcional puede comprender por lo menos una de las regiones núcleo conservadas descritas en la 10 presente. Los términos “inhibidor celular” o “inhibidor” empleados en la presente se refieren a agentes que reducen o bloquean el crecimiento o replicación de células microbianas, especialmente células metanógenas. Un inhibidor celular puede actuar reduciendo o bloqueando, por ejemplo, la división celular. Un inhibidor puede reducir o bloquear, por ejemplo, 15 la síntesis de ADN, la síntesis de ARN, la síntesis proteica o las modificaciones post–traducción. Un inhibidor también puede reducir o bloquear la actividad de las enzimas implicadas en la vía de la metanogénesis. Un inhibidor también puede orientar a una célula para el reconocimiento por componentes del sistema inmune. La inhibición de una célula también incluye la muerte celular, por ejemplo como resultado de lisis, apoptosis, necrosis, etc. Entre los inhibidores provechosos se cuentan, aunque no a modo de limitación, los compuestos antimetanogénesis (por 20 ejemplo ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos, como se describe en la presente en forma detallada. Los términos “complementarios” o “complementariedad” empleados en este contexto, se refieren a la unión natural de polinucleótidos en condiciones de sal y temperatura permisibles mediante apareamiento de bases. En el caso de 25 la secuencia A–G–T, la secuencia complementaria es T–C–A, el complemento inverso es A–C–T y la secuencia inversa es T–G–A. La complementariedad entre dos moléculas de cadena simple puede ser parcial, donde sólo parte del ácido nucleico se une o puede ser completa cuando existe complementariedad total entre las moléculas de cadena simple. El grado de complementariedad entre hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la potencia de la hibridación entre hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las 30 reacciones de amplificación, que dependen de la unión entre hebras de ácidos nucleicos y en el diseño y uso de moléculas de PNA. El término "derivado", utilizado en el presente contexto, se refiere a la modificación química de un ácido nucleico que codifica un péptido señal o de un ácido nucleico complementario del mismo. Dichas modificaciones incluyen, por 35 ejemplo, el reemplazo del hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. En los aspectos preferidos, un derivado de ácido nucleico codifica un péptido que retiene la función biológica o inmunológica de la molécula natural. Un derivado peptídico es aquel que ha sido modificado por glicosilación, pegilación o cualquier proceso similar y que retiene una o más funciones biológicas (por ejemplo, la asociación a las células y la permeabilización de las células) o función inmunogénica de la secuencia de la cual se la derivara. 40 El término “homología” empleado en la presente se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial (es decir, menos de 100 % de identidad) u homología completa (s decir, 100 % de identidad). Se hace referencia a una secuencia parcialmente complementaria que inhibe, por lo menos parcialmente, una secuencia idéntica impidiendo que se hibride a un ácido nucleico objetivo utilizando el término funcional 45 “sustancialmente homóloga”. La inhibición de la hibridación de la secuencia totalmente complementaria a la secuencia objetivo se puede examinar empleando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en solución y demás) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda de hibridación sustancialmente homóloga compite por la unión de una secuencia completamente homóloga a la secuencia objetivo, y la inhibe, en condiciones de baja rigurosidad. Esto no significa que las condiciones de baja rigurosidad sean tales 50 como se permita la unión no específica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de las dos secuencias entre sí represente una interacción específica (es decir, selectiva). El término "hibridación", utilizado en el presente contexto, se refiere a cualquier proceso por el cual una hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria por medio de apareamiento de bases. 55 Una "inserción" o "adición", se refiere, en el presente contexto, a un cambio de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos como resultado de la adición de uno o más residuos aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula de origen natural. 60 Un “metanógeno” se refiere, en este contexto, a microbios que producen gas metano, entre los que se incluyen Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium y Methanosarcina. Entre los metanógenos específicos se incluyen, aunque no a modo de limitación, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii y Methanolobus taylorii. Todos los géneros y especies de metanógenos están abarcados por este término. 5 La expresión células “microbianas” empleada en la presente se refiere a células microbianas de origen natural o genéticamente modificadas que incluyen arqueobacterias tales como metanógenos, halófilos y termoacidóficos y cianobacterias, espiroquetas, proteobacterias, como así también bacterias gram positivas y gram negativas. El término “modificado” se refiere a secuencias alteradas y a fragmentos, variantes y derivados de secuencias, de 10 acuerdo con lo descrito en la presente. La expresión “secuencia de ácido nucleico” o “secuencia nucleotídica” empleada en este contexto, se refiere a una secuencia de un polinucleótido, oligonucleótido o fragmentos de los mismos y al ADN o ARN de origen natural, recombinante, sintético o semisintético que puede ser mono– o bicatenario, y puede representar la hebra en sentido 15 o antisentido y las regiones codificadoras y no codificadoras. Las secuencias de la presente invención incluyen, muy preferentemente, secuencias codificadoras de polipéptidos (por ejemplo, SEC. ID. NO: 173–341 o 342–533 o complementos o secuencias modificadas de las mismas) que comprenden por lo menos 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 45, 51, 57 o 66 nucleótidos, preferentemente por lo menos 15 a 30, 15 a 45, 30 a 45, 36 a 45, 45 a 51, 51 a 57 o 51 a 66 nucleótidos o por lo menos 100 nucleótidos o por lo menos 1000 nucleótidos. Se ha de entender que 20 cada referencia a una “secuencia de ácido nucleico” o “secuencia nucleotídica” en este contexto debe incluir la secuencia completa nativa (por ejemplo, SEC. ID. NO: 173–341 o 342–533), así como todo complemento, fragmento, alteración, derivado o variante de la misma. El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 6, 8, 10, 12, 25 15, 18, 21, 25, 27, 30 o 36 nucleótidos o por lo menos 12 a 36 nucleótidos o por lo menos 15 a 30 nucleótidos (por ejemplo, por lo menos un fragmento de SEC. ID. NO: 173–341 o 342–533 o un complemento de la misma), que se puede utilizar en ensayos de amplificación por PCR, secuenciación o hibridación. En el presente contexto, el término oligonucleótido es sustancialmente equivalente a los términos “amplímeros”, “cebadores”, “oligómeros”, “oligos” y “sondas” de acuerdo con las definiciones corrientes en la técnica. 30 El término “polinucleótido,” utilizado en singular o plural, se refiere en general a cualquier secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cualquier polirribonucleótido o polidesoxrribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Esto incluye, aunque no a modo de limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser 35 monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o incluir regiones mono y bicatenarias. También se incluyen regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ADN como ARN. Se incluyen específicamente ARNm, ADNc y ADN genómicos y cualquier fragmento de los mismos. El término incluye ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas, tales como bases tritiadas o bases inusuales tales como inosina. Los polinucleótidos de la presente invención pueden abarcar secuencias codificadoras o no codificadoras o secuencias en sentido o 40 antisentido o ARNi tales como ARNsi. Se ha de entender que cada referencia a un “polinucleótido” o término similar incluye las secuencias de extensión total así como cualquier complemento, fragmento, alteración, derivado o variante de las mismas. "Péptido ácido nucleico" o “PNA” utilizado en la presente se refiere a una molécula antisentido o agente antigénico 45 que comprende bases ligadas por medio de un esqueleto peptídico. El término “rumiante,” empleado en este contexto se refiere a animales que tienen un rumen como tipo especial de órgano digestivo. Entre los rumiantes se incluyen, aunque no a modo de limitación, vacunos, ovejas, cabras, búfalos, alces, antílopes, caribú y ciervos. 50 La expresión “péptidos señal,” utilizada en el presente contexto se refiere a péptidos aislados de acuerdo con la presente invención obtenidos de cualquier especie, preferentemente microbiana, de cualquier origen, ya sea natural, sintético, semisintético o recombinante. Específicamente, se puede obtener un péptido señal de células metanógenas tales como células de Methanobrevibacter, especialmente células de M. ruminantium o M. smithii. 55 Para la producción recombinante, se puede obtener un péptido señal de acuerdo con la presente invención de células microbianas o eucariotas por ejemplo, Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, levadura, células de insectos tales como Drosophila, células animales tales como células COS y CHO o células vegetales. Se ha de entender que cada referencia a un "péptido" en este contexto incluye la secuencia de longitud total (por ejemplo, SEC. ID. NO: 1–172), así como cualquier alteración, fragmento, derivado o variante de la misma. 60 Los términos “condiciones rigurosas” o "rigurosidad" utilizados en este contexto se refieren a las condiciones para hibridación de acuerdo con lo definido por el ácido nucleico, sal y temperatura. Estas condiciones son muy conocidas en la técnica y pueden ser modificadas para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos idénticas o relacionadas. Remitirse, por ejemplo, a Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, y Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Numerosas condiciones equivalentes que comprenden baja o alta rigurosidad dependen de factores tales como la longitud y la naturaleza de la secuencia (ADN, ARN, composición base), la naturaleza del 5 objetivo (ADN, ARN, composición base), medio (en solución o inmovilizado en un sustrato sólido), la concentración de sales y otros componentes (por ejemplo, - formamida, sulfato de dextrano y/o polietilenglicol) y la temperatura de las reacciones (dentro de un rango de aproximadamente 5°C por debajo del punto de fusión de la sonda a aproximadamente 20°C a 25°C por encima de la temperatura de fusión). Se puede variar uno o más factores para generar condiciones de baja o alta rigurosidad diferentes, aunque equivalentes a las condiciones antes enumeradas. 10 El término “sujeto” incluye animales humanos y no humanos. Entre los animales no humanos se cuentan, aunque no a modo de limitación, aves y mamíferos tales como rumiantes y, en particular, ratones, conejos, gatos, perros, cerdos, ovejas, cabras, vacas y caballos. Los términos “sustancialmente purificado” o “aislado” utilizados en este contexto se refieren a secuencias de ácido 15 nucleicos o aminoácidos que han sido separadas de su medio celular, recombinante o sintético y que están por lo menos 60 % libres, preferentemente 75 % libres y muy preferentemente por lo menos 90 % o por lo menos 99 % libres de otros componentes con los cuales están asociadas en un medio celular, recombinante o sintético. En el presente contexto la "transformación," describe un proceso por el cual ingresa ADN exógeno y modifica una 20 célula receptora. Esto puede tener lugar en condiciones naturales o artificiales empleando diversos métodos muy conocidos en la técnica. La transformación se puede basar en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácidos nucleicos extrañas en una célula huésped procariota o eucariota. El método se elige basándose en el tipo de célula huésped que se está transformando y puede incluir, aunque no a modo de limitación, la infección viral, electroporación, choque térmico, lipofección y bombardeo de partículas. Dichas células 25 “transformadas” incluyen células transformadas de manera estable en las cuales el ADN insertado tiene la capacidad de replicarse ya sea como plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma del huésped. También se incluyen las células que expresan transitoriamente el ADN o ARN insertado durante períodos de tiempo limitados. Una "variante" de un péptido o polipéptido, en el presente contexto, se refiere a una secuencia de aminoácidos que está modificada por uno o más aminoácidos. Un polinucleótido variante está modificado por uno o más nucleótidos. 30 Una variante puede dar lugar a cambios “conservadores”, en los cuales un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo el reemplazo de leucina por isoleucina. Más raramente, una variante puede dar lugar a cambios “no conservadores”, por ejemplo el reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores análogas también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos o ambas. Los 35 lineamientos para determinar qué residuos aminoácidos se pueden sustituir, insertar o suprimir sin abolir la actividad biológica o inmunogénica se pueden encontrar empleando programas de computación muy conocidos en la técnica, por ejemplo el software LASERGENE (DNASTAR). La invención abarca asimismo las variantes que retienen por lo menos una actividad biológica (por ejemplo, 40 asociación a las células o permeabilización de las células) o actividad funcional del péptido o polipéptido. Una variante preferida es la que tiene por lo menos 80 %, y más preferentemente por lo menos 90 % de identidad de secuencia con una secuencia descrita. Una variante muy preferida es la que tiene por lo menos 95 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,8 % o por lo menos 99,9 % de identidad de secuencia con una secuencia descrita en la presente. El porcentaje de identidad se determina 45 alineando las dos secuencias a comparar de acuerdo con lo descrito más adelante, determinando el número de residuos idénticos incluidos en la porción alineada, dividiendo ese número por el número total de residuos de la secuencia de la invención (consultada) y multiplicando el resultado por 100. Un programa de alineación ventajoso es AlignX (Vector NTI). 50 El metano se produce en el intestino anterior de los rumiantes debido a los metanógenos que actúan como reductores terminales del carbono en el sistema del rumen. La vía de metanogénesis de múltiples etapas ha sido claramente dilucidada, principalmente por el estudio de metanógenos que no son del rumen, aunque no se han aclarado del todo las adaptaciones que permiten que los metanógenos se desarrollen y persistan en el rumen. Methanobrevibacter ruminantium es un metanógeno primordial en los rumiantes de Nueva Zelanda. De acuerdo con 55 lo aquí descrito, el proyecto de secuencia genómica M. ruminantium exhibe un tamaño de aproximadamente 3,0 Mb y un contenido de GC de 33,68%. Como hallazgo importante, se encontró que el genoma de M. ruminantium incluía secuencias peptídicas señal para usar en la selección como blanco y permeabilización de células. Por lo tanto, la invención abarca péptidos señal, incluyendo los que comprenden SEC. ID. NO: 1–172, así como polipéptidos que comprenden estos péptidos y alteraciones, fragmentos, variantes y derivados de los mismos. 60 La invención abarca el uso de estos péptidos o polipéptidos para seleccionar como objetivo y permeabilizar células microbianas, especialmente células metanógenas. La invención abarca asimismo el uso de los péptidos o polipéptidos para la inhibición del desarrollo o replicación de esas células. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención se pueden expresar u utilizar en diversos ensayos para determinar su actividad biológica. Los péptidos y polipéptidos se pueden utilizar para la síntesis protocolos de aislamiento en gran escala y, por ejemplo para la producción comercial. Dichos péptidos y polipéptidos pueden ser utilizados para generar anticuerpos, aislar las correspondientes secuencias de aminoácidos y determinar cuantitativamente los niveles de las secuencias de 5 aminoácidos. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados asimismo como composiciones, por ejemplo composiciones farmacéuticas, y como suplementos alimentarios, por ejemplo componentes del pienso para rumiantes. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden también ofrecer ventajas sanitarias. Por 10 ejemplo, en los aspectos relacionados con la salud, se pueden utilizar inhibidores de metanógenos para restablecer la energía al sujeto, que normalmente pierde en forma de metano. En aspectos específicos, se pueden utilizar dispositivos para rumiantes en combinación con los péptidos, polipéptidos y composiciones (por ejemplo composiciones farmacéuticas y suplementos alimentarios) de la presente invención. 15 Los péptidos y polipéptidos de la presente invención comprenden por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) péptidos o polipéptidos que comprenden por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivadas de las mismas, (b) péptidos o polipéptidos que comprenden un dominio funcional (por ejemplo, una región núcleo conservada descrita en la presente) de por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que 20 consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivadas de las mismas y (c) péptidos o polipéptidos que comprenden por lo menos un número especificado de residuos contiguos de por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 alteraciones, fragmentos, variantes o derivadas de las mismas. En la presente se hace referencia a todas estas secuencias, en forma colectiva, como péptidos y polipéptidos de la presente invención. En una modalidad, la invención abarca un péptido 25 o polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de por lo menos una de SEC. ID. NO: 1–172. La invención abarca además polinucleótidos que codifican por lo menos un péptido señal, que incluyen los correspondientes a SEC. ID. NO: 1–172, como así también los polipéptidos que comprenden estos péptidos y alteraciones, fragmentos, variantes o derivados de los mismos. 30 La invención abarca además el uso de estos polinucleótidos para la preparación de vectores de expresión y células huésped para seleccionar como objetivos y permeabilizar células microbianas, especialmente células metanógenas. La invención abarca asimismo el uso de los polinucleótidos para la inhibición del desarrollo o replicación de dichas células. Los polinucleótidos aislados de acuerdo con la presente invención también son de utilidad en el mapeo de genomas, en el mapeo físico y en la clonación de genes de bacterias más o menos relacionadas. Las sondas 35 diseñadas mediante el uso de los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para detectar la presencia y examinar los patrones de expresión de genes en cualquier organismo que tenga secuencias de ADN y ARN suficientemente homólogas y sus células, empleando técnicas muy conocidas en el medio, tales como técnicas de transferencia por ranuras o análisis de micromatrices. Se pueden utilizar los cebadores diseñados utilizando los polinucleótidos de la presente invención para secuenciación y amplificaciones por PCR. 40 También se pueden utilizar los polinucleótidos de la presente invención en forma de composiciones, por ejemplo composiciones farmacéuticas, como suplementos alimentarios, por ejemplo componentes del pienso para rumiantes. Los polinucleótidos de la presente invención también ofrecen beneficios para la salud. En el caso de esos beneficios, los polinucleótidos se pueden presentar en forma de vectores de expresión o células huésped que comprenden 45 vectores de expresión. En aspectos específicos, se pueden utilizar dispositivos para el rumen de liberación lenta en combinación con los polinucleótidos, vectores, células huésped y composiciones (por ejemplo composiciones farmacéuticas y suplementos alimentarios) de la presente invención. Los polinucleótidos de la presente invención comprenden por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que 50 consiste en: (a) secuencias que comprenden por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivados de las mismas; (b) complementos, secuencias inversas y complementos inversos de una secuencia codificadora correspondiente a por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivados de las mismas; (c) marcos de lectura abiertos contenidos en la 55 secuencia codificadora correspondiente a por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o sus alteraciones, fragmentos, variantes o derivados; (d) dominios funcionales (por ejemplo, regiones núcleo conservadas descritas en la presente) de una secuencia codificadora correspondiente a por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivados de las mismas y (e) secuencias que comprenden por lo menos un 60 número especificado de residuos contiguos de una secuencia codificadora correspondiente a por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172 o alteraciones, fragmentos, variantes o derivados de las mismas. También se dan a conocer sondas y cebadores oligonucleotídicos. En el contexto del presente documento, se hace referencia a todos estos polinucleótidos y sondas y cebadores oligonucleotídicos, en forma colectiva, como polinucleótidos de la presente invención. En una modalidad, la invención abarca un polinucleotido aislado que comprende una secuencia codificadora para por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NO: 1–172. 5 Los expertos en la técnica sabrán apreciar que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias nucleotídicas que codifican los péptidos de la presente invención, algunos con mínima homología con las secuencias nucleotídicas de cualquier gen conocido y de origen natural. Por consiguiente, la invención contempla todas y cada una de las variaciones posibles de las secuencias nucleotídicas que se podrían generar seleccionando combinaciones basándose en elecciones de los codones posibles. Estas combinaciones se 10 generan de acuerdo con los tripletes del código genético standard aplicado a las secuencias de origen natural y todas dichas variaciones se deben considerar específicamente descritas. Las secuencias nucleotídicas que codifican péptidos o polipéptidos señal o sus secuencias modificadas son capaces preferentemente de hibridarse a la secuencia nucleotídica de la secuencia de origen natural en condiciones de 15 rigurosidad seleccionadas de manera Sin embargo, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifiquen un péptido o sus derivados, que posea un uso de codones sustancialmente diferente. Los codones que se pueden seleccionar para aumentar la velocidad a la que tiene lugar la expresión del péptido en un huésped procariota o eucariota específico de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones específicos son utilizados por el huésped. Por ejemplo, se pueden optimizar los codones para la expresión en E. coli, por ejemplo, la provista por 20 SEC. ID. NO: 342–533. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia nucleotídica que codifica péptidos y sus derivados sin alterar las secuencias de aminoácidos incluyen la producción de transcripciones de ARN con más propiedades convenientes, como por ejemplo una vida media más prolongada que las transcripciones producidas a partir de la secuencia de origen natural. 25 La invención abarca asimismo la producción de secuencias de ADN o fragmentos de las mismas, que codifican los péptidos o polipéptidos o sus secuencias modificadas, completamente por química sintética. Después de la producción, la secuencia sintética se puede insertar en cualquiera de los numerosos vectores de expresión y sistemas celulares disponibles empleando reactivos que son muy cot reactivos que son muy conocidos en la técnica. Más aun, se puede utilizar la química de síntesis para introducir mutaciones en una secuencia que codifica un 30 péptido o polipéptido o cualquier alteración, variante, derivado o fragmento de la misma. También están cubiertas por la invención las secuencias de polinucleótidos con capacidad de hibridarse a las secuencias nucleotídicas reivindicadas y, en particular, las expuestas en SEC. ID. NO: 173–341 o 342–533 o sus complementos, en diversas condiciones de rigurosidad de acuerdo con lo descrito por Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399–407) y Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507–511). 35 Los métodos para la secuenciación de ADN son muy conocidos y por lo general están disponibles en la técnica y se los puede utilizar para poner en práctica cualquiera de las modalidades de la presente invención. Los métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp, Cleveland, OH), polimerasa Taq (Perkin Elmer), polimerasa T7 termoestable de Amersham Pharmacia Biotech 40 (Piscataway, NJ) o combinaciones de polimerasas y exonucleasas para corrección de pruebas tales como las que se encuentran en el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Life Technologies (Gaithersburg, MD). De preferencia, el proceso se automatiza con máquinas tales como el Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), el Ciclador Térmico Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) los secuenciadores de ADN ABI Catalyst y 373 y 377 (Perkin Elmer) o el Genome Sequencer 20TM (Roche Diagnostics). 45 Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos se pueden prolongar utilizando una secuencia nucleotídica parcial y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para la detección de secuencias de la parte anterior tales como promotores y elementos regulatorios. Por ejemplo, un método que se puede emplear, PCR de “sitios de restricción”, utiliza cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida adyacente a un 50 locus conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318–322). En particular, en primer lugar se amplifica ADN genómico en presencia de un cebador para una secuencia ligante y un cebador específico para la región conocida. A continuación se somete a las secuencias amplificadas a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador ligante y otro cebador específico interno con respecto al primero. Los productos de cada ronda de PCR son transcriptos con una ARN polimerasa adecuada y secuenciados utilizando transcriptasa inversa. 55 Se pueden utilizar los sistemas de electroforesis capilar que existen en el comercio para analizar el tamaño o confirmar la secuencia nucleotídica de los productos de la secuenciación o la PCR. Específicamente, la secuenciación capilar puede emplear polímeros fluyentes para la separación por electroforesis, cuatro tinturas fluorescentes diferentes (una por cada nucleótido) que son activadas por láser y la detección de las longitudes de 60 onda emitidas por una cámara del dispositivo acoplada con carga. Se puede convertir la salida/intensidad de la luz a una señal eléctrica utilizando el software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) y se puede controlar por computadora la totalidad del proceso, desde la carga de las muestras hasta el análisis informático y la visualización de los datos electrónicos. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de pequeños trozos de ADN que pudieran estar presentes en cantidades limitadas en una muestra específica. En otra modalidad de la presente invención, se pueden utilizar polinucleótidos o fragmentos de los mismos que 5 codifican péptidos o polipéptidos en moléculas de ADN recombinante par dirigir la expresión de los péptidos, polipéptidos o secuencias modificadas de los mismos, en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales o funcionalmente equivalentes, y se pueden utilizar estas secuencias para clonar y expresar péptidos o polipéptidos señal. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden 10 modificar utilizando métodos generalmente conocidos en la técnica a fin de alterar las secuencias de aminoácidos por una variedad de razones, entre las que se incluyen, aunque no a modo de limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Se puede recurrir al reordenamiento de ADN por fragmentación al azar y el reensamble por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos para modificar las secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, se puede emplear la mutagénesis dirigida a un sitio específico 15 para insertar nuevos sitios de restricción, modificar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia por codones, introducir mutaciones y así sucesivamente. En otra modalidad de la presente invención, se pueden ligar secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas o recombinantes que codifican los péptidos o polipéptidos a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de 20 fusión. Por ejemplo, puede ser de utilidad codificar una secuencia quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo existente en el comercio. También se puede diseñar una proteína de fusión que contenga un sitio de escisión situado entre el péptido o polipéptido de la presente invención y la secuencia proteica heteróloga, de manera que el péptido o polipéptido se pueda escindir y pueda ser purificada aparte de la porción heteróloga. 25 En otra modalidad, se pueden sintetizar secuencias que codifiquen péptidos o polipéptidos, en todo o en parte, utilizando métodos químicos muy conocidos en la técnica (Ver Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232). Por otro lado, se puede producir el péptido o polipéptido en sí utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma. Por ejemplo, se puede realizar la síntesis peptídica utilizando diversas técnicas en fase sólida 30 (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202–204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149–2154) y se puede obtener la síntesis automática, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer). Se pueden sintetizar químicamente varios fragmentos de péptidos o polipéptidos por separado y combinarlos empleando métodos químicos para producir la molécula completa. 35 El péptido o polipéptido recién sintetizado puede ser aislado por cromatografía líquida de alto rendimiento (por ejemplo, Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY). La composición de los péptidos o polipéptidos sintéticos se puede confirmar mediante análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; Creighton, supra). Además, la secuencia de aminoácidos del péptido o polipéptido o cualquier parte de la misma se puede modificar durante la síntesis directa 40 y/o combinar utilizando métodos químicos con secuencias de otras proteínas o cualquier parte de las mismas, para producir una molécula modificada. Para expresar un péptido biológicamente activo, las secuencias nucleotídicas que codifican el péptido o equivalentes funcionales, se pueden insertar las secuencias que codifican el péptido o equivalentes funcionales en un vector de 45 expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora insertada. Se pueden utilizar métodos que son muy conocidos por Los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican el péptido y los elementos de transcripción y traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas han sido descritas por Sambrook, J. et al. (1989) 50 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, y Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Se puede utilizar una variedad de sistemas vector de expresión /huésped para que contengan y expresen secuencias que codifican los péptidos de la presente invención. Entre estos se cuentan, aunque no a modo de 55 limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de bacteriófagos recombinantes, plásmidos o cósmido ADN, levadura transformada con vectores de expresión en levadura, sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión en virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión virales (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV, el virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, los pásmidos Ti o 60 pBR322); o sistemas celulares animales. En el caso de las bacterias, los plásmidos provechosos incluyen los pásmidos pET, pRSET, pTrcHis2, y pBAD de Invitrogen, pET y pCDF de Novagen, y los plásmidos DirectorTM de Sigma–Aldrich. En el caso de los metanógenos, entre los plásmidos útiles se cuentan, aunque no a modo de limitación, pME2001, pMV15 y pMP1. Específicamente, se puede utilizar Escherichia coli con el vector de expresión pET. La invención no está limitada por el vector de expresión ni la célula huésped empleada. Los “elementos de control” o “secuencias regulatorias” son las regiones no traducidas del vector –potenciadores, promotores, regiones sin traducir 5’ y 3’ – que interactúan con las proteínas celulares del huésped para levar a cabo 5 la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en cuanto a su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema vector y el huésped utilizado, se puede utilizar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se realiza la clonación en sistemas bacterianos, se pueden utilizar promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, CA) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y demás. En 10 células de insectos se puede utilizar el promotor de polihedrina de baculovirus. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de células vegetales (por ejemplo, genes termosensibles, RUBISCO y de almacenamiento de proteínas) o de virus de las plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias quía) se pueden clonar en el vector. 15 En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido del péptido. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de péptido, se pueden utilizar vectores que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas de fusión que son fácilmente purificadas. Entre dichos vectores se incluyen, aunque no a modo de limitación, los vectores de clonación y expresión multifuncionales en E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los cuales se puede ligar la secuencia que codifica un péptido a un vector en 20 marco con las secuencias para la Met amino–terminal y los 7 residuos subsiguientes de la β–galactosidasa de manera que se produzca una proteína híbrida, vectores pIN (Van Heeke, G. y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503–5509); y demás. También se pueden utilizar vectores pGEX (Promega, Madison, WI) para expresar péptidos extraños como proteínas 25 de fusión con glutatión S–transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas de células lisadas mediante absorción a perlas de glutatión–agarosa para luego proceder a la elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden ser diseñadas de manera que incluyan sitios de escisión de heparina, trombina o factor Xa proteasa de manera que el péptido de interés clonado se pueda liberar de la porción GST a voluntad. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se puede 30 utilizar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para encontrar reseñas, remitirse a Ausubel et al. (supra) and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516–544. También se pueden utilizar señales de iniciación específicas para obtener una traducción más eficiente de las 35 secuencias que codifican los péptidos de la presente invención. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en que se insertan secuencias que codifican un péptido, su codón de iniciación y secuencias de la porción anterior en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias otras señales de control de la transcripción o la traducción. Sin embargo, en los casos en que sólo se inserta una secuencia codificadora o un fragmento de la misma, se deben incluir señales exógenas de control de la traducción 40 que incluyan el codón de iniciación ATG. Más aun, el codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de la totalidad del inserto. Los elementos de traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. Se puede potenciar la eficiencia de la expresión mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular específico que se utiliza, como por ejemplo los descritos en la literatura (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125–162). 45 Además, se puede elegir una cepa de célula huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o procesar el péptido o polipéptido expresado en la forma pretendida. Dichas modificaciones de la secuencia incluyen, aunque no a modo de limitación, la acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También se puede hacer uso del procesamiento postraducción que escinde una forma “prepro” del péptido o polipéptido para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Las diferentes células huésped 50 que tienen una maquinaria celular específica y mecanismo característicos para actividades post–traducción se pueden obtener en la American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) y pueden ser elegidas para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la secuencia. Entre las células huésped específicas se cuentan, aunque no a modo de limitación, células de metanógenos tales como células de Methanobrevibacter, especialmente células de M. ruminantium o M. smithii. Las células huésped de interés incluyen, por ejemplo, 55 Rhodotorula, Aureobasidium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Pseudomonas, Erwinia y Flavobacterium; u otros organismos tales como Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Streptomyces, y demás. Entre las células huésped específicas se cuentan Escherichia coli, que es especialmente adecuada para usar en la presente invención, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, y demás. 60 Hay varias técnicas para introducir ácidos nucleicos en células eucariotas cultivadas in vitro. Entre éstas se incluyen los métodos químicos (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992) y Farhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994)), el uso de protoplastos (Bothwell, supra) o pulsos eléctricos (Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al., supra; y Ausubel et al., supra), el uso de virus atenuados (Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); and Bothwell et al., supra), así como métodos físicos 5 (Fynan et al., supra; Johnston et al., Meth. Cell Biol., 43(Pt A):353 365 (1994); Bothwell et al., supra y Ausubel et al., supra). La aplicación favorable de ácidos nucleicos a tejidos animales se puede obtener por medio de liposomas catiónicos (Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)), inyección directa de ADN o ARN desnudo en el tejido 10 muscular del animal (Robinson et al., Vacc., 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397–1400), y embriones (Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); y Burdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)), inyección intramuscular de vacunas de autorreplicación de 15 ARN (Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617) o inyección intradérmica de ADN utilizando la tecnología de “pistola de genes” (Johnston et al., supra). En la técnica se conoce una variedad de protocolos para la detección y medición de la expresión de los péptidos o polipéptidos de la presente invención, ya sea utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la 20 proteína. Entre los ejemplos se cuentan el ensayo de inmunoabsorbencia ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se puede utilizar un inmunoensayo de dos sitios, basado en anticuerpos monoclonales con anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes que no interfieran del péptido o polipéptido, aunque también se puede utilizar un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos han sido descritos, entre otros, por Hampton, R. et al. (1990; Serological 25 Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211–1216). Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación que pueden utilizar en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para la producción de sondas marcadas 30 para hibridación o PCR para la detección de secuencias relacionadas con los polinucleótidos incluyen oligomarcación, traducción de mellas, marcación de extremos o amplificación de PCR utilizando un nucleótido marcado. Por otro lado, se pueden clonar las secuencias que codifican el péptido o los polipéptidos que puedan comprender este péptido o cualquier secuencia modificada del mismo en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, existen en el comercio y se los puede utilizar para sintetizar 35 sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo utilizando una variedad de kits existentes en el comercio, de Amersham Pharmacia Biotech, Promega t US Biochemical. Las moléculas marcadoras o marcas adecuadas que se pueden utilizar para facilitar la detección incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, como así también sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y 40 demás. Se pueden cultivar vectores de expresión o células huésped transformadas con vectores de expresión en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación del péptido o polipéptido del cultivo. El cultivo puede comprender componentes para la expresión in vitro o in vivo. Los componentes para la expresión in vitro incluyen los 45 correspondientes a los lisados de reticulocitos de conejo, lisados de E. coli y extractos de germen de trigo, por ejemplo, los sistemas Expressway™ o RiPs de Invitrogen, los sistemas GenelatorTM de iNtRON Biotechnology, los sistemas EcoPro™ o STP3™ de Novagen, los sistemas TNT® Quick Coupled de Promega y los sistemas EasyXpress de QIAGEN. El péptido o polipéptido producido por el cultivo puede ser secretado o contenido en el interior de la célula dependiendo de la secuencia y/o el vector empleado. Como comprenderán Los expertos en la 50 técnica, los vectores de expresión que codifican los péptidos o polipéptidos son diseñados preferentemente de manera que contengan secuencias señal que dirigen la secreción del péptido a través de la membrana de una célula procariota o eucariota. Otras construcciones pueden incluir un dominio aminoácido que facilite la purificación del péptido o polipéptido. 55 Dichos dominios incluyen, aunque no a modo de limitación, péptidos quelantes de metal tales como moléculas de histidina–triptófano (por ejemplo, 6X–HIS (SEQ ID NO: 514)) que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAG® (Immunex Corp., Seattle, WA). Las marcas de epítopes útiles incluyen 3XFLAG®, HA, VSV–G, V5, HSV, GST, GFP, MBP, GAL4, y β–galactosidasa. Entre los plásmidos 60 ventajosos se cuentan los que comprenden una marca de biotina (por ejemplo los plásmidos PinPoint™ de Promega), proteína de unión a calmodulina (por ejemplo, plásmidos pCAL de Stratagene), péptido de unión a estreptavidina (por ejemplo, los plásmidos InterPlay™ de Stratagene), una marca c–myc o FLAG® (por ejemplo, plásmidos de inmunoprecipitación de Sigma–Aldrich) o una marca de histidina (por ejemplo, los plásmidos QIAExpress de QIAGEN). Para facilitar la purificación, se puede utilizar una secuencia ligante escindible, como las específicas para el Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA). Por ejemplo, el vector puede incluir uno o más ligantes entre el 5 dominio de purificación y el péptido o polipéptido. En un aspecto, el vector de expresión puede dar lugar a la expresión de una proteína de fusión que comprende el péptido o polipéptido de la presente invención y un ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina (SEQ ID NO: 514) que precede a un sitio de escisión de tiorredoxina o enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMAC (cromatografía de afinidad de iones metal inmovilizados según lo descrito por Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263–281) en tanto que el sitio de 10 escisión de enteroquinasa ofrece un medio para la purificación del péptido o polipéptido de la proteína de fusión. Se puede encontrar una explicación de los vectores con contenido de proteínas de fusión en el trabajo de Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441–453). Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir empleando métodos generalmente conocidos en la 15 técnica, por ejemplo, para usar en técnicas de purificación o diagnóstico. En particular, se pueden utilizar péptidos, polipéptidos o polinucleótidos purificados para producir anticuerpos de acuerdo con protocolos generalmente conocidos. Dichos anticuerpos pueden incluir, aunque no a modo de limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Son especialmente preferibles los anticuerpos neutralizantes (es decir, los que inhiben la función) 20 para usar con la presente invención. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diversos huéspedes, incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, humanos y otros, mediante inyección con un péptido, polipéptido, polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos que tenga propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie del huésped, se pueden utilizar 25 diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, aunque no a modo de limitación, el de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Entre los adyuvantes empleados en humanos, son especialmente preferibles BCG (bacilos de Calmette–Guerin) y Corynebacterium parvum. 30 Es preferible que los péptidos, polipéptidos o fragmentos utilizados para inducir anticuerpos tengan una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos cinco aminoácidos y más preferentemente por lo menos 10 aminoácidos. También es preferible que sean idénticos a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural y pueden contener la secuencia de aminoácidos completa de una molécula pequeña de origen natural. Se 35 pueden fusionar tramos cortos de aminoácidos a los de otra proteína tal como hemocianina de lapa californiana y producir anticuerpos contra la molécula quimérica. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar empleando cualquier técnica que dé lugar a la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque no a modo de limitación, 40 la técnica de hibridomas, la técnica de hibridoma de células B humanas y la técnica de EBV–hibridoma (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495–497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31–42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026–2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109–120). También se pueden producir anticuerpos induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o seleccionando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión sumamente específicos de acuerdo con lo descrito en la literatura 45 (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833–3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293–299). Además, se pueden emplear técnicas para la producción de “anticuerpos quiméricos”, por ejemplo la combinación de genes de anticuerpos para obtener una molécula con la especificidad por el antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851–6855; Neuberger, M.S. et al. (1984) Nature 312:604–608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452–454). Por otro lado, las técnicas descritas para la producción 50 de anticuerpos de cadena simple se pueden adaptar, empleando métodos conocidos en la técnica, a la producción de anticuerpos específicos de cadena simple. Se pueden generar anticuerpos con especificidad relacionada, aunque de composición idiotípica diferenciada, mediante reordenamiento de cadena a partir de bibliotecas de inmunoglobulinas por combinación (Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120–3). 55 Los expertos en la técnica a la cual la presente invención pertenece sabrán comprender los términos “diacuerpos” y “triacuerpos”. Estas son moléculas que comprenden un dominio de cadena pesada variable (VH) conectado a un dominio de cadena liviana variable (VL) por un corto ligante peptídico que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto promueve el apareamiento con los dominios complementarios de una o más cadenas adicionales y fomenta la formación de moléculas diméricas o triméricas con 60 dos o más sitios funcionales de unión al antígeno. Las moléculas de anticuerpos así obtenidas pueden ser monoespecíficas o multiespecíficas (por ejemplo biespecíficas en el caso de los diacuerpos). Dichas moléculas de anticuerpos pueden ser generadas a partir de dos o más anticuerpos utilizando metodología standard en la técnica a la cual la invención pertenece, por ejemplo de acuerdo con lo descrito por Todorovska et al. (Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1–2):47–66). También se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque no a modo de limitación, fragmentos F(ab')2 que se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los 5 puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Por otro lado, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab para permitir la rápida y fácil identificación de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad pretendida (Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:1275–1281). Se pueden utilizar diversos inmunoensayos para el análisis para la identificación de anticuerpos con especificidad de 10 unión. Numerosos protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas son muy conocidos en la técnica. Dichos inmunoensayos implican típicamente la medición de la formación de complejos entre un péptido, polipéptido o polinucleótido y su anticuerpo específico. Es preferible un inmunoensayos de dos sitios, basado en anticuerpos monoclonales que utilizan anticuerpos monoclonales reactivos para dos epítopes no interferentes, aunque también 15 se puede emplear un ensayo de unión competitiva (Maddox, supra). Los péptidos señal descritos en la presente tienen la capacidad de penetrar en las células y, por lo tanto, son útiles como moléculas portadoras para la aplicación de moléculas inhibitorias a las células microbianas. La química para el acoplamiento de los compuestos a aminoácidos está muy desarrollada y se podría ligar un número de tipos de 20 moléculas diferentes al péptido señal. Los métodos de acoplamiento más comunes se basan en la presencia de grupos amino libres (alfa–amino o Lys), sulfhidrilo (Cys) o ácido carboxílico (Asp, Glu o alfa–carboxilo). Se pueden utilizar métodos de acoplamiento para ligar el péptido al inhibidor celular por medio del residuo carboxi– o amino–terminal. En algunos casos, una secuencia incluye múltiples residuos que pueden reaccionar con la química elegida. Esto se puede utilizar para producir multímeros, que comprenden más de un inhibidor celular. Por otro lado, el 25 péptido o polipéptido puede ser acortado o elegido de manera que los residuos reactivos estén localizados en el término amino o el término carboxilo de la secuencia. Por ejemplo, se puede incorporar específicamente una molécula reportera tal como fluoresceína en un residuo de lisina (Ono et al., 1997) utilizando N–α–Fmoc–Nε–1–(4.4–dimetil–2,6 dioxociclohex–1–ilideno–3–metilbutil)–L–lisina 30 durante la síntesis del péptido. Después de la síntesis, se pueden acoplar ésteres de succinimidilo de 5– y 6–carboxifluoresceína, después de retirar el 4.4–dimetil–2,6 dioxociclohex–1–ilideno mediante tratamiento con hidrazina. Por lo tanto, el acoplamiento de una molécula inhibitoria el péptido o polipéptido señal se puede realizar mediante la inclusión de un residuo de lisina en la secuencia permeabilizante y luego la reacción con un inhibidor celular adecuadamente derivado. 35 También se puede utilizar el método de acoplamiento de EDC (clorhidrato de 1–etil–3–(3–dimetilaminopropil) carbodiimida) o el de carbodiimida. Las carbodiimidas pueden activar los grupos carboxílico de cadena lateral del ácido aspártico y glutámico, así como el grupo carboxilo terminal para tornarlos sitios reactivos para el acoplamiento con aminas primarias. Los péptidos activados se mezclan con el inhibidor celular para producir el conjugado final. Si 40 se activa primero el inhibidor celular, el método EDC acopla el inhibidor celular a través de la alfa amina N–terminal y posiblemente a través de la amina de la cadena lateral de Lys, en caso de estar presente en la secuencia. El éster de m–maleimidobenzoil–N–hidroxisuccinimida (MBS) es un reactivo heterobifuncional que se puede utilizar para ligar péptidos a inhibidores celulares por medio de cisteínas. El acoplamiento tiene lugar con el grupo tiol de los residuos de cisteína. Si la secuencia elegida no contiene Cys, es común colocar un residuo Cys en el término N o C 45 para obtener una ligadura sumamente controlada del péptido al inhibidor celular. Para fines de síntesis, puede ser conveniente colocar la cisteína en el término N del péptido. El MBS es particularmente adecuado para usar con la presente invención. Se puede utilizar glutaraldehído como reactivo de acoplamiento bifuncional que liga a dos compuestos a través de 50 sus grupos amino. El glutaraldehído otorga un espaciador sumamente flexible entre el péptido y el inhibidor celular para una presentación favorable. El glutaraldehído es un compuesto muy reactivo y reacciona con Cys, Tyr e His en un grado limitado. El método de acoplamiento con glutaraldehído es de particular utilidad cuando un péptido contiene sólo un grupo amino libre único en su término amino. Si el péptido contiene más de un grupo amino libre, se pueden formar grandes complejos multiméricos. 55 En un aspecto, se pueden fusionar los péptidos o polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, mediante clonación en marco) o ligar (por ejemplo, mediante acoplamiento químico) a inhibidores celulares tales como agentes antimicrobianos. Entre estos se incluyen los péptidos antimicrobianos, por ejemplo proteína bactericida/potenciadora de la permeabilidad, proteínas antimicrobianas catiónicas, lisozimas, lactoferrinas y 60 catelicidinas (por ejemplo, de neutrófilos; ver, por ejemplo, Hancock y Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1317–1323; Ganz y Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:53–58; Hancock et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135–175). Los péptidos antimicrobianos incluyen además defensinas (por ejemplo, de células epiteliales o neutrófilos) y proteínasa microbicidas de plaquetas (ver, por ejemplo, Hancock y Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317–1323). Entre los péptidos antimicrobianos adicionales se incluyen, aunque no a modo de limitación, gramicidina S, bacitracina, polimixina B, taquiplesina, bactenecina (por ejemplo, bactenecina de vacuno), ranalexina, cecropina A, indolicidina (por ejemplo, indolicidina de vacuno), y nisina (por ejemplo, nisina bacteriana). 5 También se incluyen como agentes antimicrobianos los ionóforos, que facilitan la transmisión de un ion (tal como sodio), a través de una barrera lipídica tal como una membrana celular. Dos compuestos de ionóforos especialmente adecuados para esta invención son el RUMENSINTM (Eli Lilly) y Lasalocid (Hoffman LaRoche). Entre otros ionóforos se incluyen, aunque no a modo de limitación, salinomicina, avoparcina, aridcina y actaplanina. Otros 10 agentes antimicrobianos incluyen Monensin™ y azitromicina, metronidazol, streptomicina, kanamicina y penicilina, como así también, en general, ß–lactamas, aminoglucósidos, macrólidos, cloranfenicol, novobiocina, rifampina y fluoroquinolonas (ver, por ejemplo, Horn et al., 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74–83; Eckburg et al., 2003, Infection Immunity 71:591–596; Gijzen et al., 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630–1634; Bonelo et al., 1984, FEMS Microbiol. Lett. 21:341–345; Huser et al., 1982, Arch. Microbiol. 132:1–9; Hilpert et al., 1981, Zentbl. Bakteriol. 15 Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21–31). Los inhibidores particularmente ventajosos son compuestos que bloquean o interfieren con la metanogénesis, incluyendo ácido bromoetansulfónico, por ejemplo ácido 2–bromoetansulfónico (BES) o una sal del mismo, por ejemplo una sal de sodio. El molibdato de sodio (Mo) es un inhibidor de la reducción del sulfato y se lo puede utilizar 20 con el ácido bromoetansulfónico. Entre otros compuestos antimetanogénicos se cuentan, aunque no a modo de limitación, nitrato, formato, metil fluoruro, cloroformo, hidrato de cloral, sulfito de sodio, etileno e hidrocarburos insaturados, acetileno, ácidos grasos tales como el ácido linoleico y ácido cis–oleico, ácidos grasos saturados tales como ácido behénico y ácido esteárico y también lumazina (por ejemplo, 2,4–pteridinediona). Otros compuestos incluyen 3–bromopropansulfonato (BPS), ácido propiónico y etil 2–butinoato. 25 También se incluyen como agentes natimicrobianos las enzimas líticas, incluyendo la lisozima, endolisina, lisozima, lisina, lisina de fagos, muralisina, muramidasa y virolisina. Las enzimas útiles exhiben la capacidad de hidrolizar enlaces específicos en la pared de la célula bacteriana. Las enzimas líticas específicas incluyen, aunque no a modo de limitación, glucosaminidasas, que hidrolizan los enlaces glucosídicos entre los amino azúcares (por ejemplo, el 30 ácido N–acetilmurámico y N–acetilglucosamina) del péptidoglicano, amidasas, que escinden el ligadura N–acetilmuramoil–L–alanina amida entre la hebra de glicano y el péptido entrecruzador, y endopeptidasas, que hidrolizan el ligadura entre péptidos (por ejemplo cisteína endopeptidasas) y las endoisopeptidasas que atacan la pseudomureína de los metanógenos de la familia Methanobacteriacaea. 35 Además, se incluyen los PNAs como agentes antimicrobianos. Los PNAs son híbridos péptido–ácido nucleico en los cuales se ha reemplazado la columna principal de fosfato por una columna principal aquiral y neutra preparada a partir de unidades de N–(2–aminoetil)–glicina (ver, por ejemplo, Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory y S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003). Las bases A, G, T, C se anexan al nitrógeno de amino de la columna vertebral por medio de ligaduras metilencarbonilo 40 (P.E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497–1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566–568). Los PNAs enlazan secuencias complementarias con alta especificidad, y una mayor afinidad con respecto al ADN o ARN análogo (M. Egholm et al., supra). Los híbridos PNA/DNA o PNA/RNA exhiben además una mayor termoestabilidad que los correspondientes dúplexes DNA/DNA o DNA/RNA (M. Egholm et al., supra). Los PNAs también posee alta estabilidad química y biológica, debido a la columna principal amídica no natural que no es reconocida por las 45 nucleasas ni las proteasas (V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310–1313). Por lo general, los PNAs tienen una longitud de por lo menos 5 bases e incluyen una lisina terminal. Los PNA pueden ser pegilados para extender aun más su vida útil (Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53–63). En un aspecto especifico, los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden estar fusionados (por ejemplo, 50 por clonación en marco) o ligados (por ejemplo, mediante acoplamiento químico) a inhibidores celulares tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden dirigir a las células microbianas o, especialmente, a las células metanógenas o a uno o más componentes celulares. Por ejemplo, se pueden tomar como blancos proteínas superficiales de las células, por ejemplo receptores. Se incluyen las moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina (Ig), 55 es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Los péptidos o polipéptidos de la presente invención son de uso específico en la selección como blanco de una célula microbiana, especialmente una célula metanógena. En ciertos aspectos, se pueden utilizar los péptidos y 60 polipéptidos para fijarse a la pared o la membrana celular y/o permeabilizar la célula. Por tal motivo, los péptidos o polipéptidos se pueden utilizar para la unión transitoria o extendida a la célula o para penetrar en la pared o membrana celular y/o acumularse en el ambiente celular. Se entiende que los péptidos, polipéptidos, como así los correspondientes polinucleótidos, vectores de expresión, células huésped y anticuerpos de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar para tomar como blanco diversos microbios, por ejemplo Methanobrevibacter ruminantium, que es un metanógeno común en los rumiantes, y Methanobrevibacter smithii, que es un metanógeno común en los humanos. Para realizar la selección como blanco, se puede poner en contacto a la célula microbiana con el péptido señal o el polipéptido que comprende el péptido, aislado de una o más fuentes naturales o producido 5 por vectores de expresión y/o células huésped o por química sintética o semisintética descrita en detalle en la presente. En los aspectos específicos, se administra el péptido o polipéptido a los sujetos en forma de composición descrita en este documento en forma detallada, por ejemplo por medio del uso de un dispositivo de liberación lenta en el caso de los rumiantes. 10 En ciertas modalidades, el polipéptido se fusiona o liga a un inhibidor celular, por ejemplo un compuesto antimetanogénico (por ejemplo, ácido bromoetansulfónico), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, enzima lítica, ácido nucleico peptídico, péptido antimicrobiano u otro antibiótico. El inhibidor peptídico o inhibidor polipeptídico es administrado a los sujetos en forma de composición para inhibir el desarrollo o replicación de las células microbianas, especialmente células metanógenas. La composición comprende, por ejemplo: a) un péptido señal 15 aislado o un polipéptido que comprende este péptido o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo; b) un polinucleótido aislado o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo; c) un vector de expresión que comprende este polinucleótido o d) una célula huésped que comprende este vector de expresión. Las composiciones de la presente invención pueden ser envasadas específicamente como parte de kits para la selección como blanco, permeabilización y/o inhibición de células microbianas, especialmente células metanógenas, de 20 acuerdo con los métodos descritos. Los kits comprenden por lo menos una composición de acuerdo con lo expuesto en la presente e instrucciones para su uso en la permeabilización de las células o para inhibir el desarrollo o replicación de metanógenos u otros microbios. Como modalidad adicional, la invención se relaciona con una composición farmacéutica en combinación con un 25 vehículo aceptable para uso farmacéutico, para usar con cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender un péptido señal o un polipéptido que comprende este péptido, en combinación con un inhibidor celular. Por otro lado, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un vector de expresión o célula huésped descrita en la presente. Las composiciones pueden ser administradas solas o en combinación con por lo menos un agente adicional, como por ejemplo un compuesto estabilizador, que se puede 30 administrar en cualquier vehículo farmacéutico estéril biocompatible, incluyendo, aunque no a modo de limitación, solución salina, salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto solas o en combinación con otros agentes, fármacos (por ejemplo fármacos antimicrobianos) u hormonas. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos aceptables para 35 uso farmacéutico que comprenden excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar en forma farmacéutica. Se pueden encontrar más detalles sobre técnicas de formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención se pueden administrar por cualquier número de vías incluyendo, aunque no a modo de limitación, la vía oral, endovenosa, intramuscular, intra–40 arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual o rectal. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular utilizando vehículos aceptables para uso farmacéutico muy conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la administración oral. Dichos vehículos permiten la formulación de las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, 45 cápsulas, líquidos, geles, jarabes, geles, suspensiones y demás, para ser ingeridos por el sujeto. Las composiciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante la combinación de los compuestos activos con un excipiente sólido, optativamente la molienda de la mezcla obtenida y el procesamiento de la mezcla de gránulos, después de agregar los auxiliares adecuados, si resulta conve3niente, para obtener núcleos de comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son materiales de carga de carbohidratos o proteínas tales como azúcares, 50 incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa u otras plantas; celulosa, como por ejemplo metil celulosa, hidroxipropilmetil–celulosa o carboximetilcelulosa sódica; gomas, incluyendo arábiga y tragacanto y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si conviene, se pueden agregar agentes desintegrantes o solubilizantes tales como polivinil pirrolidona entrecruzada, agar, ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. 55 Las preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar por vía oral incluyen las cápsulas de calce a presión hechas de gelatina, así como las cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas calzadas a presión pueden contener ingredientes activos mezclados con un material de carga o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, 60 optativamente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores. Los núcleos de grageas se pueden utilizar en combinación con revestimientos adecuados tales como soluciones azucaradas concentradas, que pueden contener además goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Se pueden agregar tinturas o pigmentos a los revestimientos de los comprimidos o grageas para la identificación del producto o a fin de caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, la dosis. 5 Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden ser formuladas en soluciones acuosas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o salina con amortiguador fisiológico. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas 10 para inyección apropiadas. Los solventes lipofílicos apropiados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres sintéticos de ácidos grasos tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. También se pueden utilizar amino polímeros policatiónicos no lipídicos para la administración. Optativamente, la suspensión puede contener además estabilizadores o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para la administración tópica o nasal, se utilizan en la 15 formulación agentes de penetración apropiados para la barrera específica que se ha de permear. Dichos agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden elaborar de manera conocida en el medio, por ejemplo por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, 20 levigación, emulsionamiento, encapsulación, atrapamiento o liofilización. La composición farmacéutica puede presentarse en forma de sal y puede estar conformada con muchos ácidos, entre los que se incluyen, aunque no a modo de limitación, los ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos o protónicos de otro tipo que las correspondientes formas de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede consistir en un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o 25 todos los siguientes:: histidina 1–50 mM, 0.1%–2% de sacarosa y 2–7% de manitol, a un pH en el rango de 4,5 a 5,5, que se combinan con un amortiguador antes de usar. Una vez preparadas las composiciones farmacéuticas, se las puede colocar en un recipiente apropiado y rotular para el tratamiento de un trastorno adecuado. Para la administración de una composición de acuerdo con la presente invención, dicha rotulación incluiría la cantidad, frecuencia y método de administración. 30 Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la invención incluyen composiciones en las cuales los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para obtener el fin pretendido. Para cualquier compuesto, se puede estimar la dosis terapéuticamente efectiva en ensayos celulares, por ejemplo en células microbianas o, en particular, células metanógenos o en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros o 35 cerdos, o en especies de rumiantes tales como ovejas, vacas, ciervos y cabras. También se puede utilizar el modelo animal para determinar la concentración y la vía de administración apropiadas. Seguidamente se puede utilizar esa información para determinar las dosis y vías de administración útiles en un sujeto. Las cantidades de dosificación normal pueden variar entre 0.1 y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. Se presentan lineamientos en cuanto a las dosis específicas y los métodos de 40 administración en la literatura y generalmente están a disposición de los profesionales en la técnica. Los expertos en la técnica han de emplear diferentes formulaciones para los polinucleótidos que en el caso de los péptidos o polipéptidos. Del mismo modo, la administración de polinucleótidos o polipéptidos han de ser específicas para las células, condiciones, ubicaciones particulares, etc. 45 Las terapias basadas en péptidos y polipéptidos son muy conocidas y los métodos de elaboración de dichas composiciones ya han sido cimentados en la técnica. Se han descrito ejemplos de terapias con péptidos y polipéptidos y su elaboración, con respecto, por ejemplo, adenileuquin difitox, octreótido, vapreótido, lanreótido, péptidos de la serie RC–3940, decapeptilo, lupron, zoladex, cetrorelix (ver, por ejemplo, Lu et al., 2006, AAPS J 8:E466–472), hemocidinas, estafopaínas (ver, por ejemplo, Dubin et al., 2005, Acta Biochemica Polonica, 52:633–50 638), como así también indolicidina, defensinas, lantibióticos, microcidina B17, histatinas y maganina (ver, por ejemplo, Yeaman y Yount, 2003, Pharmacol Rev 55:27–55). También se puede encontrar una guía general para las terapias con péptidos y polipéptidos en el trabajo de Degim et al., 2007, Curr Pharm Des 13:99–117 y Shai et al., 2006, Curr Prot Pept Sci, 7:479–486. Los fármacos basados en péptidos recientemente apropiados incluyen Hematide™ (agente estimulante de la eritropoyesis basado en péptidos, Affymax, Inc.), Exenatida (exendina–4 55 sintética, Amylin/Eli Lilly), Natrecor (nesiritida, péptido natriurético, Scios), Plenaxis (abarelix, Praecis Pharmaceuticals) y SecreFlo (secretina, Repligen). La dosis exacta debe ser determinada por el profesional, tomando en cuenta los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosis y la administración se ajustan de manera que otorguen niveles suficientes del 60 agente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tomar en cuenta incluyen la severidad de la patología, el estado de salud general del sujeto, la edad, peso y sexo del sujeto, la dieta, tiempo y frecuencia de administración, la combinación (o combinaciones) de fármacos, las sensibilidad a la reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Se pueden administrar composiciones farmacéuticas de acción prolongada cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la velocidad de clearance de la formulación específica. Son de particular utilidad para las composiciones de la presente invención (por ejemplo, composiciones 5 farmacéuticas) las fórmulas o mecanismos de liberación lenta. Por ejemplo, los dispositivos intra–ruminales incluyen, aunque no a modo de limitación, el rango de bolo de Time Capsule™ Bolus de Agri–Feeds Ltd., Nueva Zelanda, desarrollada originariamente en AgResearch de Nufarm Health & Sciences, división de Nufarm Ltd., Auckland, Nueva Zelanda, descrita en AU 35908178, PCT/AU81/100082, y Laby et al., 1984, Can. J. Anim. Sci. 64 (Suppl.), 337–8. Como ejemplo específico, el dispositivo puede incluir un resorte y émbolo que empujan a la composición 10 contra un orificio en el extremo de un barril. Como modalidad adicional, la invención se relaciona con una composición para un suplemento acuoso, por ejemplo remojando la composición o suplemento alimentario, por ejemplo un componente de pienso para rumiantes, para usar con cualquiera de los métodos antes descritos. En aspectos específicos, el suplemento alimentario comprende 15 por lo menos un material vegetal comestible y un péptido o polipéptido de la presente invención. Por otro lado, el suplemento alimentario comprende por lo menos un material vegetal comestible y un péptido o polipéptido o polinucleótido que codifica un péptido o polipéptido descrito en la presente, por ejemplo como vector de expresión o célula huésped que comprende el vector de expresión. Específicamente, la composición comprende además un inhibidor celular, fusionado o ligado a la secuencia obtenida. El material vegetal preferido incluye cualquiera de los 20 siguientes: heno, pasto, grano o harina, por ejemplo heno de legumbres, heno de hierbas, maíz para ensilaje, pastos para ensilaje, legumbres para ensilaje, granos de maíz, avena, cebada, granos para destiladores, granos para cerveceros, harina de soja y harina de semillas de algodón. Específicamente, los pastos para ensilaje son útiles como composición alimenticia para rumiantes. El material de plantas puede ser genéticamente modificado de manera que tenga uno o más componentes de la presente invención, por ejemplo uno o más polipéptidos o 25 péptidos, polinucleótidos o vectores.En otra modalidad, se pueden utilizar anticuerpos que se unen específicamente a los péptidos, polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención para determinar la presencia de microbios, especialmente metanógenos, o en ensayos para monitorear los niveles de esos microbios. Los anticuerpos ventajosos para fines de diagnóstico se pueden preparar de la misma manera que los descritos anteriormente. Los ensayos de diagnóstico incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar un péptido o 30 polipéptido en fluidos o extractos de células o tejidos del cuerpo humano. Los anticuerpos se pueden utilizar con o sin modificación y se los puede marcar uniéndolos, ya sea en forma covalente o no covalente, con una molécula reportera. Se puede utilizar una amplia variedad de moléculas reporteras que son conocidas en la técnica, varias de las cuales fueron descritas anteriormente. 35 En la técnica se conoce una variedad de protocolos para medir los niveles de un péptido, polipéptido o polinucleótido (por ejemplo, ELISA, RIA, FACS, y transferencias), y otorgan una base para determinar la presencia o los niveles de un microbio, especialmente un metanógeno. Se establecen los niveles normales o standard combinando los fluidos corporales o los extractos celulares extraídos de sujetos normales (por ejemplo humanos o rumiantes normales, con el anticuerpo en condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación de complejos 40 standard se puede cuantificar por diversos métodos, aunque preferentemente por medios fotométricos. Se comparan las cantidades de péptido, polipéptido o polinucleótido expresadas en muestras de un sujeto, control y tratadas (por ejemplo, muestras de sujetos tratados) con los valores standard. La desviación entre los valores standard y del sujeto establece los parámetros para determinar la presencia o los niveles del microbio. 45 En una modalidad específica de la presente invención, los polinucleótidos se pueden utilizar con fines de diagnóstico utilizando técnicas de hibridación y/o amplificación específicas. Los polinucleótidos que se pueden utilizar incluyen oligonucleótidos, moléculas de ARN y ADN complementario y PNAs. Los polinucleótidos se pueden utilizar para detectar y cuantificar la expresión génica en las muestras en las cuales se puede correlacionar la expresión con la presencia o niveles de un microbio. Se puede emplear el ensayo de diagnóstico para distinguir entre la ausencia, 50 presencia y modificación de los niveles de microbios, y para monitorear los niveles durante la intervención terapéutica. En un aspecto, se puede utilizar la hibridación con sondas de PCR para identificar secuencias de ácido nucleico, especialmente secuencias genómicas, que codifican los péptidos o polipéptidos de la presente invención. La 55 especificidad de la sonda, ya sea que esté preparada a partir de una región altamente específica, por ejemplo 10 nucleótidos individuales de la región regulatoria 5’ o una región menos específica, por ejemplo en la región codificadora 3’, y la rigurosidad de la hibridación o amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinará si la sonda identifica sólo secuencias de origen natural, alelos o secuencias relacionadas. También se pueden utilizar sondas para la detección de secuencias relacionadas, y deben contener preferentemente por lo menos 50 % de los 60 nucleótidos de cualquiera de las secuencias codificadoras. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser de ADN o ARN y derivar de la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. NO: 173–341 o 342–533 o complementos o secuencias modificadas de las mismas o de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones de la secuencia de origen natural. Los medios para la producción de sondas de hibridación específica para los ADN incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos en vectores para la producción de sondas de ARNm. Dichos vectores son conocidos 5 en la técnica, existen en el comercio y se los puede utilizar para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de las ARN polimerasa apropiadas y los nucleótidos marcados apropiados. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas por una variedad de grupos reporteros, por ejemplo radionúclidos tales como 32P o 35S o marcas enzimáticas, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda por medio de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina y demás. Los polinucleótidos se pueden utilizar en análisis Southern o northern, de transferencias de 10 puntos u otras tecnologías basadas en membranas, en tecnologías de PCR o en ensayos de varilla indicadora, perno, ELISA o micromatrices que utilizan fluidos o tejidos de biopsias de sujetos para detectar la presencia o los niveles de un microbio. Dichos métodos cualitativos o cuantitativos son muy conocidos en la técnica. En un aspecto específico, las secuencias de ácido nucleico pueden ser de utilidad en diversos ensayos marcados 15 por métodos standard y agregados a una muestra de fluido o tejido de un sujeto en condiciones adecuadas para la hibridación y/o amplificación. Después de un período de incubación adecuado, se lava la mezcla y se cuantifica la señal y se l” compara con un valor standard. Si la cantidad de señal presente en la muestra de ensayo está significativamente modificada con respecto a la de una muestra control comparable, la presencia de niveles alterados de secuencias nucleotídicas en la muestra indica la presencia o niveles del microbio. Dichos ensayos se 20 pueden utilizar asimismo para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento específico en estudios con animales, en ensayos clínicos o en el monitoreo del tratamiento impartido a un sujeto. Para otorgar una base para el diagnóstico de la presencia o niveles de un microbio, se establece un perfil normal o standard para la expresión. Esto se puede lograr combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de 25 sujetos normales con un polinucleótido o un fragmento del mismo, en condiciones adecuadas para la hibridación y/o amplificación. Se pueden cuantificar los niveles standard comparando los valores obtenidos de sujetos normales con los obtenidos en un experimento en que se utiliza una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Se pueden comparar los valores standard obtenidos de las muestras normales con los valores obtenidos de muestras de sujetos tratados para el desarrollo de microbios. Se utiliza la desviación entre los valores standard y 30 los del sujeto para establecer la presencia o los niveles del microbio. Una vez identificado el microbio e iniciado un protocolo de tratamiento, se pueden repetir los ensayos de hibridación y/o amplificación en forma regular para evaluar si el nivel de expresión en el sujeto comienza a decrecer con respecto al observado en el sujeto normal. Se pueden utilizar los resultados obtenidos de ensayos sucesivos para 35 demostrar la eficacia del tratamiento en el curso de un período en el rango de varios días a meses. Los usos de diagnóstico específicos para los oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias de ácidos nucleicos pueden implicar el uso de PCR. Dichos oligómeros pueden ser sintetizados químicamente, generados enzimáticamente o producidos in vitro. Los oligómeros consisten preferentemente en dos secuencias nucleotídicas, una con orientación en sentido directo (5’.fwdarw.3') y otra con orientación antisentido (3'.fwdarw.5'), empleadas en 40 condiciones optimizadas para la identificación de un gen o condición específica. Se pueden utilizar dos oligómeros iguales, series anidadas de oligómeros o incluso un grupo degenerado de oligómeros en condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias de ADN o ARN estrechamente relacionadas. Los métodos que también se pueden utilizar para cuantificar la expresión incluyen nucleótidos para radiomarcación o 45 biotinilación, coamplificación de un ácido nucleico control y curvas standard sobre las cuales se interpolan los resultados experimentales (Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235–244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229–236). Se puede acelerar la velocidad de cuantificación de múltiples muestras corriendo el ensayo en un formato ELISA en el cual se presenta el oligómero de interés en diversas diluciones y una respuesta espetrofotométrica o colorimétrica da una cuantificación rápida. 50 En otras modalidades, se pueden utilizar oligonucleótidos o fragmentos de mayor longitud derivados de cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente como blancos en una micromatriz. Se puede utilizar la micromatriz para monitorear el nivel de expresión de grandes números de genes simultáneamente (para producir una imagen transcripta) y para identificar las variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Se puede utilizar esta información 55 para determinar la función génica, para comprender la base genética de la enfermedad, para diagnosticar la enfermedad y para desarrollar y monitorear las actividades de los agentes terapéuticos. En una modalidad, se prepara la micromatriz y se la utiliza de acuerdo con métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la solicitud PCT WO 95/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675–1680) y Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614–10619). 60 En un aspecto, los oligonucleótidos pueden ser sintetizados sobre la superficie de una micromatriz utilizando un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta tal como el descrito en la solicitud PCT WO95/251116 (Baldeschweiler et al.). En otro aspecto, se puede utilizar una matriz “de parrilla” análoga a una transferencia de puntos o ranura (aparato HYBRIDOT, Life Technologies) para disponer y lugar fragmentos de ADNc u oligonucleótidos a la superficie de un sustrato utilizando un sistema de vacío, procedimientos de enlace térmicos, por UV, mecánicos o químicos. En un aspecto más, se puede producir una matriz a mano o utilizando dispositivos, materiales y máquinas existentes (incluyendo pipeteadoras multicanales o instrumentos 5 robóticos; Brinkmann, Westbury, N.Y.) y pueden contener 8, 24, 96, 384, 1536 o 6144 oligonucleótidos o cualquier otro múltiplo de 2 a 1.000.000 que se preste al uso eficiente de los instrumentos existentes en el comercio. Para llevar a cabo el análisis de las muestras empleando las micromatrices, se extraen polinucleótidos de una muestra biológica. Se pueden obtener las muestras biológicas de cualquier fluido corporal (sangre, orina, saliva, flema, jugos gástricos, etc.), células cultivadas, biopsias u otras preparaciones de tejidos. Para producir sondas, se 10 utilizan los polinucleótidos extraídos de la muestra para producir secuencias de ácidos nucleicos que sean complementarias de los ácidos nucleicos dispuestos en la micromatriz. Si la micromatriz consiste en ADNc, son apropiadas las sondas de ARNm. Por lo tanto, en un aspecto, se utiliza ARNm para producir ADNc que, a su vez, y en presencia de nucleótidos fluorescentes, para producir fragmentos o sondas de ARN antisentido. Estas sondas con marca fluorescente son incubadas con la micromatriz, de manera que las secuencias de la sonda se hibriden a 15 los oligonucleótidos de ADNc de la micromatriz. En otro aspecto, las secuencias de ácido nucleico utilizadas como sondas pueden incluir polinucleótidos, fragmentos y secuencias complementarias o antisentido utilizando enzimas de restricción, tecnologías de PCR y kits de oligomarcación (Amersham Pharmacia Biotech) muy conocidos en el campo de la tecnología de hibridación. 20 En otra modalidad de la presente invención, se pueden utilizar los péptidos o polipéptidos de la presente invención o fragmentos funcionales o inmunogénicos de los mismos, para clasificar bibliotecas de compuestos en cualquiera de una variedad de técnicas de clasificación de fármacos. El fragmento empleado en esa clasificación puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido, soportado sobre la superficie de una célula o ubicado en el interior de la célula. Se puede medir la formación de complejos de unión entre el péptido o polipéptido y el agente que se está 25 analizando. Una técnica para la clasificación de fármacos que se puede utilizar da lugar a la clasificación de alto rendimiento de compuestos con afinidad de unión con el péptido o polipéptido de interés, de acuerdo con lo descrito en la solicitud PCT publicada WO 84/03564. En este método, se sintetizan grandes números de pequeños compuestos de ensayo 30 diferentes sobre un sustrato sólido, como por ejemplo pernos plásticos o alguna otra superficie. Se hace reaccionar los compuestos de ensayo con el péptido o polipéptido o fragmentos del mismo y se los lava. A continuación se detecta el péptido o polipéptido unido mediante métodos muy conocidos en la técnica. También se puede aplicar el péptido o polipéptido purificado directamente sobre placas para usar en las técnicas de clasificación de fármacos antes mencionadas. Por otro lado, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e 35 inmovilizarlo sobre un soporte sólido. En otra técnica, se pueden utilizar ensayos de clasificación competitiva de fármacos en los cuales anticuerpos con capacidad para unirse al péptido o polipéptido específicamente compiten con un compuesto de ensayo por la unión al péptido o polipéptido. De esta manera, se pueden utilizar los anticuerpos para detectar la presencia de un 40 compuesto de ensayo que comparte uno o más sitios de unión al antígeno con el anticuerpo. EJEMPLOS Los ejemplos descritos en la presente se presentan con el propósito de ilustrar modalidades de la invención. Otras 45 modalidades, métodos y tipos de análisis están dentro del alcance de Los expertos en la técnica del diagnóstico molecular y no es necesario describirlas en forma detallada en este documento. Otras modalidades dentro del alcance de la técnica se consideran partes de la presente invención. EJEMPLO 1: Materiales y métodos 50 Estimado del tamaño del genoma Se cultivó la cepa M1T de Methanobrevibacter ruminantium (DSM1093) en medio BY+ (medio basal, Joblin et al., 1990) que consiste en [g/l]: NaCl (1), KH2PO4 (0,5), (NH4)2SO4 (0,25), CaCL2.2H2O (0.13), MgSO4.7H2O (0,2), 55 K2HPO4 (1), fluido de rumen clarificado (300 ml) dH2O (360 ml), NaHCO3 (5), resazurina (0,2 ml) L–cisteína–HCl (0.5), extracto de levadura (2), y solución de oligoelementos de Balch (10 ml) (elementos trazo agregados; Balch et al., 1979) que consiste en: (g/l) ácido nitriloacético (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4.H2O (0,5), NaCl (1), FeSO4.7H2O (0.1), CoCl2.6H2O (0.1), CaCl2 (0.1), ZnSO4.7H2O (0.1), CuSO4.5H2O (0,01), AlK(SO4)2.12H2O (0.01), H3BO3 (0.01), Na2MoO4.2H2O (0,01), NiSO4.6H20 (0,03), Na2SeO3 (0,02) y Na2Wo4.2H2O (0,02). Se 60 extrajo ADN genómico utilizando un método de congelación y molienda. Se cosecharon las células por centrifugación y se colocó el pellet celular en un mortero previamente enfriado, congelado con nitrógeno líquido y suavemente molido hasta obtener un polvo fino utilizando un mortero con mano esterilizado previamente enfriado. Se embutieron los homogenatos celulares en tapones de agarosa y se llevaron a cabo sucesivas manipulaciones en los tapones para reducir el corte físico de ADN genómico. Se llevaron a cabo digestiones con endonucleasas de restricción y se separaron los fragmentos de ADN utilizando electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Clonación y secuenciación de ADN 5 El ADN del genoma de M. ruminantium fue secuenciado por Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, Estados Unidos) utilizando una técnica de clonación con pistola aleatoria (Fleischmann et al., 1995) y por Macrogen Corporation (Rockville, MD, Estados Unidos) usando pirosecuenciación. Se construyeron bibliotecas de ADN de M. ruminantium en Escherichia coli mediante alteración física aleatoria del ADN genómico y separación de los fragmentos por electroforesis en gel. Se recuperaron grandes fragmentos en el rango de 40 Kb del gel y se los utilizó 10 para generar una biblioteca de insertos de fásmido de gran tamaño. Se recuperaron los fragmentos de ADN en el rango de 2 y 4 kb y se los utilizó para generar una biblioteca de insertos plasmídicos de tamaño pequeño. Se desarrollaron los clones producidos como resultado de las bibliotecas de grandes y pequeños insertos, se recuperó su ADN de fásmido o plásmido y se lo secuenció utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Se secuenciaron suficientes clones para dar, teóricamente, una cobertura de 8 veces el genoma de M. ruminantium. Se 15 realizó la pirosecuenciación en los fragmentos de ADN genómico cortados al azar para dar una cobertura teórica final de 10 veces. Ensamble y análisis de Secuencias 20 Se alinearon las secuencias de ADN para encontrar traslapos y se las ensambló para formar secuencia contiguas (contig) utilizando Paracel Genome Assembler (Paracel Inc, CA, USA) y el paquete Staden (Staden et al., 1998) en combinación con secuencias tanto de PCR normal como inversa. Se analizaron las contiguas utilizando el localizador de marcos de lectura abiertos (ORF) GLIMMER (Gene Locator Interpolated Markov Model ER, Salzberg et al., 1998) y se analizó cada ORF por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al., 1997) contra 25 bases de datos de nucleótidos no redundantes y proteínas del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se unieron las contiguas de la secuencia de la fase preliminar de 8 veces al azar por medio del ligadura artificial de las secuencias para generar una “pseudomolécula” y se la sometió al Institute for Genomic Research (TIGR, DC, 30 Estados Unidos) para la autoanotación. Se ensamblaron los contiguos de la pirosecuenciación de 10 veces utilizando GLIMMER y se autoanotaron los ORFs empleando GAMOLA (Global Annotation of Multiplexed On–site Blasted DNA sequences; Altermann and Klaenhammer, 2003). Seguidamente se verificaron manualmente las anotaciones automáticas. Se categorizaron los ORF de acuerdo con su función utilizando la base de datos de cúmulos de proteínas ortólogas (COG) (umbral 1e–02) (Tatusov et al., 2001). 35 Se determinaron los motivos proteicos por HMMER (protocolo de transferencia de hipertexto://hmmer.wustl.edu) utilizando bibliotecas PFAM HMM y TIGRFAM, con alineación global y local (protocolo de transferencia de hipertexto://pfam.wustl.edu) y los modelos standard y en modalidad de fragmentos TIGRFAM HMMs (protocolo de transferencia de hipertexto://www.tigr.org/TIGRFAMs) respectivamente (umbral 1e–02). Se identificaron los ARNt 40 utilizando TRNASCAN–SE (Lowe y Eddy, 1997) y se identificaron repeticiones nucleotídicas empleando el paquete de software KODON (Applied Maths, Austin, TX, Estados Unidos) y REPUTER (Kurtz y Schleiermacher, 1999). Se construyeron visualizaciones del atlas del genoma utilizando GENEWIZ (Jensen et al., 1999). Se llevaron a cabo reconstrucciones de las vías del ORFeoma previsto de M. ruminantium en combinación con la base de datos en línea KEGG (Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al., 2004) utilizando software desarrollado 45 internamente (PathwayVoyager; Altermann y Klaenhammer, 2005). Identificación de Péptidos Señal Hasta la fecha no hay modelo de péptido señal para los archaea. Simplemente hay muy pocas proteínas secretorias 50 verificadas experimentalmente disponibles para Archaea para generar un modelo específico. Por esta razón, se analizaron las secuencias de los marcos de lectura abiertos (ORF) para determinar la presencia de péptidos señal utilizando la Versión 3.0 de SignalP (Bendtsen et al., 2004) generados contra modelos gram positivos, Gram negativos y Eucariotas. Se utilizó SignalP–HMM (modelos ocultos de markov) para discriminar entre el péptido señal y los ORF de péptidos no señal, en tanto que se utilizó SignalP–NN (redes neurales) para la predicción de los sitios 55 de escisión de acuerdo con lo descrito por Emanuelsson et al., 2007. SignalP predice la presencia y ubicación de los sitios de escisión de péptidos señal en las secuencias de aminoácidos de diferentes organismos. El método incorpora una predicción de los sitios de escisión y una predicción de péptidos señal/péptidos no señal basada en una combinación de varias redes neurales artificiales y modelos 60 ocultos de Markov.. Se alinearon las secuencias peptídicas señal identificadas de la serie de datos de Gram +ve y se calculó una secuencia consenso empleando el programa AlignX de Vector NTI (versión 9.1.0, Invitrogen Corporation). Se identificó el núcleo hidrófobo conservado por análisis de hidrofobicidad de los aminoácidos. Se identificó una serie de datos de consenso de los tres modelos SignalP y se alinearon las secuencias de péptidos señal correspondientes empleando ClustalW (Larkin et al., 2007) y se las editó utilizando BioEdit (protocolo de transferencia de hipertexto://world wide web.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Se generó un logo de secuencia proteica (FIG. 3A) utilizando LogoBar (Perez–Bercoff et al., 2006) para representar la información presente en este múltiple alineamiento de secuencias. En este estudio, se consideró que los ORF que contenían un péptido señal y 5 tres o más dominios transmembrana eran proteínas de membrana y quedaron excluidos de los estudios posteriores. Se tomó el mejor puntaje Y de cada uno de los tres modelos como sitio de escisión putativo (FIG. 6). Se calculó el uso de codones optimizado (FIG. 9) utilizando un script perl interno opt_codons.pl (Altermann, E) basado en la tabla de codones de Escherichia coli K12. 10 Síntesis peptídica y marcación con fluoresceína Se sintetizó el péptido consenso núcleo utilizando comercialmente el servicio de péptidos especializados de Invitrogen (Invitrogen NZ Ltd). Se sintetizó el péptido utilizando la química Fmoc en pequeña escala (10–12 mg) y se lo purificó por HPLC a una pureza >95%. Se marcó el péptido en la lisina N–terminal (K) con fluoresceína. 15 Ensayo de Permeabilización de las células Se siguió el ingreso del péptido marcado al interior de las células de M. ruminantium por el ensayo de fluorescencia. Se desarrolló un cultivo de M. ruminantium en 10 ml de medio BY+ y se lo recogió por centrifugación a 10.000 x g 20 por espacio de 10 min a 4oC. Las células fueron transferidas a un tubo Eppendorf de polipropileno de 1,5 ml y se las lavó en 1 ml de amortiguador TE (Tris–HCl10 mM, ácido etilendiamino tetraacético 1 mM, pH 8) se las recogió por centrifugación en una microcentrífuga a 13.000 x g por espacio de 10 min a 4oC. Se resuspendió a las células (aproximadamente 1 x 108) en un volumen total de 200 l de amortiguador TE y se agregaron 20 g de péptido marcado con fluoresceína. Se incubó la mezcla por espacio de 30 minutos a 37°C y luego se la centrifugó a 13.000 x 25 g durante 10 min a 4oC. Se retuvo el fluido celular por encima del pellet de células que constituyó la fracción del sobrenadante. Se lavó tres veces el pellet celular con 200 µl de amortiguador TE resuspendiendo repetidamente las células en amortiguador y centrifugándolas a 13.000 x g por espacio de 10 min a 4oC. Se agruparon los lavados y se constituyó la fracción de lavado de las células. Se resuspendió el pellet celular que 30 quedó después del tercer lavado en 200 µl de amortiguador TE que contenía 1 % de dodecilsulfato de sodio. Se centrifugaron las células a 13.000 x g por espacio de 10 min a 4°C para formar pellets con las células y se recolectó el fluido por encima del pellet celular y se constituyó la fracción asociada a las células. Se congeló el pellet celular restante en N2 líquido y se sometió a las células a alteración física mediante la molienda el pellet congelado con una varilla de vidrio. Se centrifugó el homogenato celular obtenido a 20.000 x g por espacio de 30 min a 4°C. Se colectó 35 el fluido presente por encima de las células que representaba la fracción intracelular, en tanto se resuspendía el material restante reducido a pellets en amortiguador TE, representando la fracción de pared / membrana celular. Se midió la fluorescencia en cada una de estas fracciones sellando una muestra de cada fracción en un capilar de vidrio y midiendo la fluorescencia emitida a 510–533 nm contra standards de péptidos marcados con fluoresceína utilizando el detector de fluorescencia (Canal 1) de un Lightcycler (Roche). 40 EJEMPLO 2: Resultados experimentales El cálculo del tamaño del genoma de M. ruminantium mediante digestión con enzimas de restricción de ADN genómico y la determinación del tamaño de los fragmentos por medio de PFGE, indicó un solo cromosoma de 45 aproximadamente 2.5–2.9 Mb. La secuenciación inicial de clones insertados de gran y pequeño tamaño (cobertura proyectada de 6 veces) y el ensamble de la secuencia en contiguos indicó que una región de 40 Kb del genoma estaba sumamente sobre–representada (>20 veces), especialmente dentro de la biblioteca de pequeños insertos. Debido a esta inclinación por las grandes secuencias, se llevó a cabo la secuenciación adicional (cobertura teórica 50 del genoma de 2 veces) sólo correspondiente a clones de grandes insertos para dar una cobertura final de 8 veces producida por la secuenciación de Sanger. Se ensambló la fase proyectada de 8 veces formando 756 contiguos que estaban ligados por medio de 105 andamios. Se llevó a cabo otra pirosecuenciación hasta obtener una cobertura adicional de ~ 10 veces y la incorporación de estas secuencias al ensamble dio lugar a que el número de contiguos cayera a 27. El subsiguiente cierre de las brechas utilizando técnicas de PCR inversa y de largo plazo redujo el 55 número de contiguos a 14. La longitud combinada de la secuencia de 14 contiguos indica que el genoma es ligeramente mayor (2.937.347 pb) que el tamaño estimado por PFGE (FIG. 1A) y significativamente mayor que su pariente más cercano, M. smithii (1,9 Mb). El % G+C de 32,64% se aproxima al rango informado de 27,5% a 31,6% dado a conocer respecto de las cepas 60 de M. ruminantium (Balch et al, 1979). El análisis de la secuencia predice 2.239 ORFs y el número total de aciertos correspondientes a las familias proteicas (TIGRFam y PFam) y se dan a conocer los Cúmulos de Grupos Ortólogos (COGs) en la FIG. 1B. Todos los genes que se estimaban involucrados en la metanogénesis de H2 + CO2 y formiato están presentes (FIG. 1C) Sin embargo, la secuencia proyectada de M. ruminantium carece de un sistema metil coenzima reductasa II (mcr II o mrt). En otros metanógenos, el cúmulo mcrII codifica una isoenzima de la enzima metil CoM reductasa I, que se regula a más durante el cultivo a altas presiones parciales de H2 (Reeve et al., 1997). Se utiliza H2 rápidamente en el rumen y no se acumula en altos niveles, por lo que M. ruminantium parece adaptarse al uso de bajos niveles de H2 por medio del sistema mcr I únicamente. 5 Se identificó un total de 169 ORFs con contenido de péptidos señal en el genoma de M. ruminantium. (FIG. 7). De estos, se identificaron 102 péptidos señal utilizando los tres modelos SignalP y se alinearon las secuencias de aminoácidos de estos péptidos señal (FIG. 2) y se generó un logo de secuencia proteica (FIG. 3A). Se identificó una secuencia núcleo de 17 aminoácidos hidrófobos (KKIIIILLLLILLLISI; SEC. ID. NO: 119). SignalP–HMM calcular la 10 probabilidad de que la secuencia contenga un péptido señal. Esta probabilidad de péptidos señal es un valor comprendido entre 0 y 1, definiéndose 0,5 como valor de corte para distinguir entre péptidos señal y péptidos no señal para este análisis. El puntaje Y de SignalP–NN da la mejor estimación del lugar donde se escinde un SP (FIG. 6). El puntaje Y se define como el promedio geométrico del puntaje C (puntaje bruto del sitio de escisión) y una pendiente allanada del puntaje S (puntaje de péptido señal) generado por SignalP–NN. El puntaje Y es un valor 15 comprendido entre 0 y 1, donde los puntajes más altos son indicativos de una predicción satisfactoria del sitio de escisión. Se sintetizó una secuencia de aminoácidos consenso (FIG. 3C) y se la conjugó a la marca de fluoresceína fluorescente por medio de un residuo adicional de lisina N–terminal (FIG. 3D) haciendo que la longitud final del 20 péptido sea de 17 aminoácidos. Se analizó el péptido FITC purificado para determinar la permeabilización de las células de M. ruminantium (FIG. 4). En el ensayo de permeabilización celular de M. ruminantium 23.5% del péptido se mantenía en el sobrenadante sin unirse a las células al cabo de 30 minutos a 37°C. Se pudo retirar 3.4 % más del péptido de las células mediante 3 lavados con buffer. Se recuperó aproximadamente 62.9 % del péptido después de la extracción con SDS al 1 % de las células, indicando que la mayor parte del péptido estaba asociada a las células. 25 Del péptido restante, se encontró que 5.8 % estaba en el interior de la fracción intracelular y 4.4 % estaba asociado a la fracción de pared/membrana celular. Por lo tanto, 4,8 % del péptido inicial (equivalente a 1.16 µg) se pudo unir a M. ruminantium y cruzar la membrana celular para penetrar en el citoplasma de la célula, lo que representa aproximadamente 2,3 x 106 moléculas peptídicas por célula. 30 EJEMPLO 3: Comentarios generales Se optó por Methanobrevibacter ruminantium para la secuenciación del genoma debido a su prevalencia en el rumen en una variedad de condiciones dietarias (basándose en datos de cultivo y detección molecular), la disponibilidad de los cultivos, su aptitud para el cultivo de rutina en el laboratorio, y la cantidad relativamente grande de estudios 35 anteriores y literatura de antecedentes disponible respecto de este organismo. Se ha asignado una función a un número considerable de secuencias dentro de M. ruminantium y de esa manera se ha permitido obtener una imagen detallada del estilo de vida de este organismo dentro del rumen. La dependencia de M. ruminantium de sustratos sencillos (H2 + CO2, formiato) y su interacción con el medio del rumen a través de proteínas superficiales y exopolisacáridos son blancos importantes para la inhibición. Los datos de secuencias dilucidan el metabolismo de 40 este organismo y la manera en que interactúa con otros microbios y apunta a los sistemas conservados y componentes entre los metanógenos, que se pueden inactivar para prevenir o reducir la formación de metano en el rumen. Referencias 45 Altermann E, Klaenhammer TR (2005) Trayectoria Voyager: mapeo de trayectoria utilizando la base de datos de Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) (Pathway Voyager:pathway mapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. BMC Genomics 6:60-66. Altermann, E., y T. R. Klaenhammer. 2003. 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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido o péptido aislado: a) que comprende SEC. ID. NO: 117, 118 o 119; b) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 117, y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 90% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 117; c) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 118, y 5 comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 95% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 118; d) que es una variante funcional de SEC. ID. NO: 119, y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 90% de la identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 119; e) un fragmento de SEC. ID. NO: 117, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 117; f) un fragmento de SEC. ID. NO: 118, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 118; g) un 10 fragmento de SEC. ID. NO: 119, cuyo fragmento incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 119, en el que dicho polipéptido o péptido tiene actividad de asociación celular o permeabilización celular.
  2. 2. Un polipéptido aislado que comprende: a) una secuencia codificante entera de SEC. ID. NO: 117, 118 o 119; b) una secuencia codificante para el péptido o polipéptido que comparte por lo menos el 90% de identidad con la 15 secuencia entera de SEC. ID. NO: 117; c) una secuencia codificante para el péptido o polipéptido que comparte por lo menos el 95% de identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 118; d) una secuencia codificante para el péptido o polipéptido que comparte por lo menos el 90% de identidad con la secuencia entera de SEC. ID. NO: 119; e) una secuencia codificante del fragmento de SEC. ID. NO: 117, 118 o 119, cuyo fragmetno incluya por lo menos 15 aminoácidos de SEC. ID. NO: 117, 118 o 119; f) SEC. ID. NO: 511, 512 o 513; o g) una secuencia nucleotídica 20 complementaria a cualquiera de las (a) a (f), en la que dicho polinucleótido codifica para un péptido o polipéptido con actividad de asociación celular o permeabilización celular.
  3. 3. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 2.
    25
  4. 4. Una célula huésped a) que está modificada genéticamente para codificar el polipéptido o péptido de la reivindicación 1; b) que está modificada para comprender el polinucleótido de la reivindicación 2; c) que comprenda el vector de la reivindicación 3.
  5. 5. La célula huésped de la reivindicación 4, que es seleccionada de una célula procariota y una célula metanógena. 30
  6. 6. La célula huésped de la reivindicación 5, que se selecciona de Escherichia coli y Methanobrevibacter ruminantium, incluyendo la cepa M1T (DSM1093) Methanobrevibacter ruminantium.
  7. 7. Una molécula conjugada o de fusión que comprende a) el polipéptido o péptido de la reivindicación 1; o b) el 35 polinucleótido de la reivindicación 2.
  8. 8. Una molécula conjugada o de fusión que comprende el polipéptido o péptido de la reivindicación 1, y que además comprende un compuesto anti-metanogénico, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, un enzima lítico, un ácido nucléico de un péptido, un péptido antimicrobiano, o un antibiótico. 40
  9. 9. Un método para la permeabilización de una célula microbiana que comprende: contactar con la célula con el polipéptido o péptido de la reivindicación 1.
  10. 10. Un método para la permeabilización de una célula microbiana que comprende: contactar con la célula con la 45 molécula conjugada o de fución de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8.
  11. 11. El método de la reivindicación 9 o 10, en el cual la célula es metanógena.
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en la que la célula es Methanobrevibacter ruminantium. 50
  13. 13. El método de la reivindicación 12, en la que la célula es de la cepa M1T (DSM1093) de Methanobrevibacter ruminantium.
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