ES2895908T3 - Vacunas y componentes de vacunas para inhibición de células microbianas - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado de SEC ID No:641, o un polipéptido o fragmento de SEC ID No:641 que comparte al menos el 90 % de identidad de secuencia con al menos 10 aminoácidos contiguos de SEC ID No:641 y un adyuvante.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas y componentes de vacunas para inhibición de células microbianas

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente estadounidense No. 60/975.104, presentada el 25 de septiembre del 2007, solicitud de patente estadounidense N.° 60/989.840, presentada el 22 de noviembre de 2007, y solicitud de patente estadounidense N.° 60/989.841, presentada el 22 de noviembre de 2007, cuyos contenidos se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Campo de la Invención

La invención se relaciona con componentes de las células microbianas que son útiles para producción de anticuerpos, incluyendo péptidos, polipéptidos que comprenden estos péptidos, polinucleótidos que codifican estos péptidos o polipéptidos, y anticuerpos dirigidos a estos péptidos, polipéptidos, o polinucleótidos. La invención también se relaciona con vectores de expresión y células huésped para producir estos péptidos, polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos. La invención se relaciona además con métodos y composiciones, especialmente composiciones de vacunas, para detectar, dirigir e inhibir células microbianas, especialmente células metanógenas, usando uno o más de los péptidos, polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, vectores de expresión y células huésped descritas.

Antecedentes de la Invención

En Nueva Zelanda, la actividad agrícola explica la mayoría de las emisiones de gas de efecto invernadero. Por consiguiente, reducir las emisiones agrícolas de gases de efecto invernadero es importante para cumplir con las obligaciones en Nueva Zelanda bajo el Protocolo de Kyoto. El Protocolo requiere la reducción de gases de efecto invernadero a niveles del 1990 para fines del primer período de compromiso (2008-2012). Con este propósito, los grupos de sectores agrícolas y el gobierno de Nueva Zelanda establecieron el Consorcio de Investigación de Gas de Efecto Invernadero Pastoral o PGGRC (del inglés, Pastoral Greenhouse Gas Research Consortium) para identificar medios para reducir las emisiones agrícolas de gases de efecto invernadero de Nueva Zelanda.

Una parte importante de las actividades del PGGRC ha sido investigar la reducción de emisiones de metano de los rumiantes en pastoreo de Nueva Zelanda. La mitigación de emisiones de metano de los rumiantes es de interés comercial por dos razones. En primer lugar, la imposibilidad de cumplir con los compromisos bajo el Protocolo de Kyoto obligará al gobierno a comprar bonos de carbono. Se estima que actualmente esto cuesta $ 350 millones. En segundo lugar, la producción de metano ocasiona la pérdida del 8-12% de la energía bruta producida en el rumen. Esta energía se podría usar, en cambio, para mejorar la productividad del rumiante.

El metano es producido en el rumen por los microbios denominados metanógenos que son parte del reino Euryarchaeota en el reino de Archaea. La mayoría de los metanógenos crecen en CO2 y H2 como su única fuente de energía, pero algunos pueden usar compuesto de acetato o metilo para su crecimiento. Varios géneros diferentes de arqueas metanogénicas existen en el rumen, pero se considera que las especies del gen Methanobrevibacter, especialmente M. ruminantium, y M. smithii son los metanógenos predominantes en los rumiantes de Nueva Zelanda. M. ruminantium es actualmente el objeto de un proyecto de secuenciación genómica fundado por el PGGRC. El proyecto es la primera secuenciación genómica de un metanógeno del rumen y se propone construir un mejor entendimiento de la biología de Methanobrevibacter para descubrir blancos para inhibición de formación de metano.

Reducir la producción de metano en el rumen requiere de la inhibición de metanógenos o inactivación de sus vías de metanogénesis. Una forma de inhibición de producción de metano es identificar moléculas específicas que inhiben las células metanógenas. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de agentes que se dirigen a metanógenos. En un enfoque, las vacunas se pueden preparar para dirigir células microbianas. Por consiguiente, sería útil identificar componentes, especialmente componentes de superficie celular a partir de células microbianas, incluyendo péptidos y polipéptidos, y polinucleótidos y anticuerpos relacionados, que se pueden usar para vacunas anti-microbianas.

Breve Descripción de la Invención

La invención se refiere a péptidos, polipéptidos y polinucleótidos aislados de M. ruminantium, particularmente a componentes de superficie celular de M. ruminantium, así como también a vectores de expresión, células huésped y anticuerpos, y a métodos de uso de los mismos, como se describe en detalle en la presente.

La invención presenta en forma específica un péptido aislado que comprende, por ejemplo, al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID No:1-702. En un aspecto particular, el péptido comprende al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En otro aspecto, el péptido comprende al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID No:10-17. En otro aspecto, el péptido es un fragmento, por ejemplo, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las SEC ID No:10-17, 45-260, y 332-702.

La invención presenta en forma específica un polipéptido aislado que comprende, por ejemplo, al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:1-702. En un aspecto particular, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En otro aspecto, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID No:10-17. En otro aspecto, el polipéptido es un fragmento, por ejemplo, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las s Ec ID No:10-17, 45-260 y 332-702.

La invención presenta en forma adicional un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificadora para al menos a un péptido. En un aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora de al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:1-702. En un aspecto particular, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En otro aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:10-17. En otro aspecto, el polinucleótido comprende un fragmento de una secuencia codificadora, por ejemplo, al menos una secuencia de aminoácidos que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las SEC ID No:10-17, 45-260, y 332-702.

La invención presenta en forma adicional un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificadora para al menos a un polipéptido. En un aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:1-702. En un aspecto particular, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para cualquiera de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En otro aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia codificadora para cualquiera de las SEC ID No:10-17. En otro aspecto, el polinucleótido comprende un fragmento de una secuencia codificadora, por ejemplo, al menos una secuencia de aminoácidos que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las SEC ID No:10-17, 45-260, y 332-702.

En un aspecto adicional, la invención presenta un polinucleótido aislado que comprende, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:703-1395. En un aspecto particular, el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID No:703-710. En otro aspecto, el polinucleótido es un fragmento o un oligonucleótido que comprende, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que engloba un dominio extracelular como el codificado por cualquiera de las SEC ID No:703-710, 737-931, y 1003-1395. Asimismo, la invención incluye un polinucleótido aislado, o fragmento del mismo, que se hibrida a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de SEC ID No:703-1395. La invención incluye además un polinucleótido aislado que comprende el complemento, complemento reverso, secuencia reversa, o fragmentos de los mismos, de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico.

La invención presenta un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención. En un aspecto, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para al menos a un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No:1-702. En un aspecto particular, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para al menos a un fragmento de al menos una de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En un aspecto adicional, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEC ID No:10-17. En otro aspecto, el vector de expresión comprende una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las SEC ID No: 10-17, 45-260, y 332-702.

La invención también presenta una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped microbiana, que comprende al menos un vector de expresión.

La invención presenta en forma específica un anticuerpo dirigido a un péptido, polipéptido, o polinucleótido como se revela en la presente. En ciertos aspectos, el anticuerpo se dirige a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702. En aspectos alternativos, el anticuerpo se dirige al menos a un fragmento de una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:10-17, 45-260, y 332-702. En un aspecto particular, el anticuerpo se une al menos a un fragmento de la secuencia de péptidos de cualquiera de las SEC ID No:10-17. En un aspecto adicional, el anticuerpo se une al menos a un fragmento de la secuencia de polipéptido de cualquiera de las SEC ID No:45-260 y 332-702. En un aspecto alternativo, el anticuerpo se une al menos a un fragmento de un péptido o polipéptido que engloba un dominio extracelular de cualquiera de las SEC ID No:10-17, 45-260, y 332-702. En otro aspecto, el anticuerpo incluye una o más fusiones o conjugados con al menos un inhibidor celular, por ejemplo, compuestos de anti-metanogénesis (por ejemplo, ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos, y otros antibióticos como se describe en detalle en la presente.

La invención presenta en forma adicional péptidos o polipéptidos modificados, por ejemplo, para al menos a una de las SEC ID No:1-702, incluyendo alteraciones biológicamente activas, fragmentos, variantes, y derivados, como se describe en la presente. También se presentan polinucleótidos que codifican estos péptidos o polipéptidos modificados, así como también alteraciones, fragmentos, variantes, y derivados de los polinucleótidos descritos; anticuerpos elevados usando estos péptidos, polipéptidos o polinucleótidos modificados; vectores de expresión que comprenden estos polinucleótidos; y células huésped que comprenden estos vectores. También se presentan anticuerpos modificados, incluyendo alteraciones biológicamente activas, fragmentos, variantes, y derivados, como se describe en la presente. En aspectos específicos, las composiciones y métodos de la invención emplean estos péptidos, polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos modificados, o correspondientes vectores de expresión o células huésped.

La invención presenta una composición que comprende un péptido o polipéptido aislado, por ejemplo, al menos una de las SEC ID No:1-702. También se presenta una composición que comprende un polinucleótido aislado, por ejemplo, al menos uno de las SEC ID No:703-1395. La invención presenta en forma adicional una composición que comprende un anticuerpo, por ejemplo, dirigido a una secuencia de péptidos, polipéptidos, o polinucleótidos revelada en la presente. Se presenta además una composición que incluye un vector de expresión, o célula huésped que comprende un vector de expresión, de acuerdo con la invención. La composición puede incluir cualquiera de las alteraciones biológicamente activas, fragmentos, variantes, y derivados como se describe en la presente. Las composiciones pueden incluir al menos un inhibidor celular (por ejemplo, como una fusión o conjugado), y se pueden formular, por ejemplo, como composiciones farmacéuticas, en particular, composiciones de vacunas.

La invención también presenta una composición de la invención como parte de un equipo para dirigir y/o inhibir células microbianas, especialmente células metanógenas, de acuerdo con los métodos descritos. Los equipos comprenden: a) al menos una composición como se establece en la presente; y b) en forma opcional, instrucciones para uso, por ejemplo, en dirigir células o inhibir el crecimiento o réplica celular por metanógenos u otros microbios.

La invención también presenta un método para producir un péptido o polipéptido, por ejemplo, al menos un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702; el método comprende: a) cultivar un vector de expresión o célula huésped que comprende un vector de expresión, que comprende al menos parte de una secuencia codificadora para al menos a un péptido o polipéptido bajo condiciones adecuadas para la expresión del péptido o polipéptido; y b) recuperar el péptido o polipéptido del cultivo. En aspectos particulares, el péptido o polipéptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o secuencias modificadas de las mismas. La invención también presenta un método para producir un anticuerpo, por ejemplo, dirigido al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702; el método comprende: a) cultivar un vector de expresión o célula huésped que comprende un vector de expresión, que comprende al menos parte de una secuencia codificadora para al menos a un anticuerpo o fragmento del anticuerpo bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o fragmento del anticuerpo; y b) recuperar la secuencia de aminoácidos del cultivo. En aspectos particulares, el anticuerpo o fragmento del anticuerpo se dirige al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o secuencias modificadas de las mismas. En un aspecto alternativo, el anticuerpo es producido por la administración a un animal huésped, como se describe en detalle en la presente.

La invención presenta en forma adicional un método para producir un anticuerpo, por ejemplo, dirigido al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702, que comprende una fusión o conjugado con al menos un inhibidor celular. Dicho método comprende: a) cultivar un vector de expresión o célula huésped que comprende un vector de expresión, que comprende un secuencia codificadora para al menos a un anticuerpo o fragmento del anticuerpo bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o fragmento del anticuerpo; b) formar una fusión o conjugado al anticuerpo o fragmento del anticuerpo (por ejemplo, por expresión de la secuencia fusionada o conjugación química del inhibidor celular); y c) recuperar la fusión o conjugado.

En aspectos particulares, el anticuerpo se dirige al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702, o secuencias modificadas de las mismas. En otros aspectos, el inhibidor está seleccionado de compuestos de antimetanogénesis (por ejemplo, ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de los anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos, y otros antibióticos como se describe en detalle en la presente. En un aspecto alternativo, el anticuerpo se produce por administración a un animal huésped y luego se conjuga, como se describe en detalle en la presente.

Asimismo, la invención presenta un método de inhibición (por ejemplo, de inhibición de crecimiento o réplica) de una célula microbiana, en particular, una célula metanógena, que comprende: poner en contacto la célula con el anticuerpo o fragmento del anticuerpo, por ejemplo, dirigido al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702, o una fusión o conjugado de anticuerpo, o cualquier anticuerpo modificado. Como otro método, la célula se inhibe por administración de una composición de vacuna como se describe en detalle en la presente.

La invención además presenta un método de inhibición (por ejemplo, de inhibición de crecimiento o réplica) de una célula microbiana, en particular, una célula metanógena, que comprende: a) en forma opcional, producir o aislar al menos un anticuerpo como se revela en la presente; y b) poner en contacto la célula con el anticuerpo. En un aspecto particular, el anticuerpo se dirige al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702, o una secuencia modificada de las mismas. En ciertos aspectos, el anticuerpo comprende además al menos un inhibidor celular, adherido, por ejemplo, como una fusión o conjugado. En otros aspectos, el anticuerpo se administra a un sujeto como una composición, por ejemplo, una composición de vacuna.

Además, la invención presenta un método de inhibición (por ejemplo, inhibición de crecimiento o réplica) de una célula microbiana, en particular, una célula metanógena, que comprende: a) en forma opcional, producir o aislar al menos un péptido o polipéptido como se revela en la presente; y b) administrar el péptido o polipéptido a un sujeto para inducir una respuesta inmune al mismo. En un aspecto particular, el péptido o polipéptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o una secuencia modificada de las mismas. En otros aspectos, el péptido o polipéptido se administra a un sujeto como una composición, por ejemplo, una composición de vacuna.

La invención además presenta un método para detectar y/o medir los niveles de un polipéptido, en particular, un polipéptido de superficie celular, o correspondientes péptidos o polinucleótidos, que comprende: 1) poner en contacto una muestra de un sujeto con un anticuerpo dirigido al polipéptido (por ejemplo, al menos un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:1-702, o un secuencia modificada de las mismas), o un péptido o polinucleótido correspondiente (por ejemplo, al menos un fragmento de una de las SEC ID No:703-1395, o una secuencia modificada de las mismas); y 2) determinar la presencia o niveles del complejo de anticuerpo formado con el polipéptido, péptido, o polinucleótido correspondiente en la muestra. Dichos métodos también se pueden usar para detectar y/o medir los niveles de una célula microbiana, en particular, una célula metanógena.

La invención también presenta un método para detectar y/o medir los niveles de un polinucleótido, en particular, un polinucleótido que codifica un componente de superficie celular, que comprende: 1) poner en contacto una muestra de un sujeto con un polinucleótido complementario (por ejemplo, una secuencia complementaria al menos a un fragmento de cualquiera de las SEC ID No:703-1395, o una secuencia modificada de las mismas); y 2) determinar la presencia o niveles del complejo de hibridación formado con el polinucleótido en la muestra. Dichos métodos también se pueden usar para detectar y/o medir los niveles de una célula microbiana, en particular, una célula metanógena. En aspectos particulares, los métodos de la invención utilizan expresión componentes de in vivo o in vitro. En otros aspectos, los métodos emplean péptidos, polipéptidos, polinucleótidos, o anticuerpos producidos por medios recombinantes, sintéticos, o semisintéticos, o por medios endógenos.

Otros aspectos y modalidades de la invención son como se describe en la presente a continuación.

Breve Descripción de las Figuras

Esta invención se describe con referencia a sus modalidades específicas y con referencia a las figuras.

Las figuras 1A-1C. Comparación de genomas metanobacterianos (Figura 1A); estadísticas del genoma M. ruminantium (Figura 1B); Genes predestinados a implicarse en metanogénesis en especies metanobacterianas (Figura 1C).

Figura. 2. Protocolo de vacunación.

Figura. 3. Las respuestas de anticuerpo de oveja a vacunación con preparación de pared celular de M. ruminantium y péptidos designados contra M. ruminantium mtr y proteínas de superficie celular.

Figura 4. Secuencia de péptidos usada para producción de anticuerpo.

Figuras 5A-5B. ORFs seleccionados para producción de anticuerpo: Secuencias de nucleótidos (Figura 5A); Secuencias de aminoácidos (Figura 5B).

Figuras 6A-6C. ORFs que codifican enzimas de vías de metanogénesis identificadas de M. mminantium: Anotación (Figura 6A); Secuencias de nucleótidos (Figura 6B); Secuencias de aminoácidos (Figura 6C).

Figuras 7A-7C. ORFs para proteínas de superficie celular identificadas de M. ruminantium: Anotación (Figura 7A); Secuencias de nucleótidos (Figura 7B); Secuencias de aminoácidos (Figura 7C).

Figuras 8A-8C. ORFs que codifican la biosíntesis de exopolisacáridos identificados de M. niminantium: Anotación (Figura 8A); Secuencias de nucleótidos (Figura 8B); Secuencias de aminoácidos (Figura 8C).

Figuras 9A-9C. ORFs que comprenden dominios de extensión en membrana identificados de M. ruminantium: Anotación (Figura 9A); Secuencias de nucleótidos (Figura 9B); Secuencias de aminoácidos (Figura 9C).

Descripción Detallada de la Invención

Definiciones

El término “anticuerpo” deberá entenderse en el sentido más amplio posible y está destinado a incluir anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales intactos. También está destinado a cubrir fragmentos y derivados de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos comprenden moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (lg), es decir, moléculas que contiene un sitio de fijación de antígeno que en forma específica se fija (inmunoreacciona con) un antígeno. Estos incluyen, mas no se limitan a, policlonal, monoclonal, quimérico, de cadena única, fragmentos Fc, Fab, Fab', y Fab2, y una biblioteca de expresión de Fab.

Las moléculas de anticuerpos se relacionan con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE, e IgD, que difieren una de la otra por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. También se incluyen subclases, tales como IgG1, IgG2, y otras. La cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. En la presente, la referencia a anticuerpos incluye una referencia a todas las clases, subclases y tipos. También se incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que son específicos a más de una fuente, por ejemplo, una o más secuencias de ratón, humano o rumiante. También se incluyen anticuerpos o nanocuerpos de camélidos. Se debe entender que cada referencia a “anticuerpos” o cualquier otro término, incluyen en la presente anticuerpos intactos, así como también cualquier fragmento, alteración, derivado, o variante del mismo.

Las secuencias "alteradas" de ácido nucleico que codifican péptidos, polipéptidos, o anticuerpos, como se usa en la presente, incluyen aquellas con extracciones, inserciones o substituciones de diferentes nucleótidos que generan un polinucleótido que codifica la misma secuencia o una secuencia funcionalmente equivalente. El péptido, polipéptido, o anticuerpo codificados también pueden ser “alterados” y contener extracciones, inserciones o substituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y generan una secuencia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas se pueden realizar sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se retenga la actividad biológica (por ejemplo, asociación celular, asociación de membrana) o actividad inmunogénica/inmunológica. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados pueden incluir lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos principales polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares pueden incluir leucina, isoleucina, y valina, glicina y alanina, asparagina y glutamina, serina y treonina, y fenilalanina y tirosina.

"Secuencia de aminoácidos", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de un oligopéptido, péptido, polipéptido, proteína o anticuerpo, y cualquier fragmento de los mismos, y a cualquier molécula de ocurrencia natural, recombinante, sintética, o semisintética. Las secuencias de la invención comprenden al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 aminoácidos, preferentemente al menos 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200, o 200 a 250 aminoácidos. Las secuencias retienen la actividad biológica (por ejemplo, efecto sobre el crecimiento celular y/o proliferación) o la actividad inmunogénica/inmunológica de la secuencia de aminoácidos. Las "secuencias de aminoácidos" y términos similares no se limitan a la secuencia nativa completa de aminoácidos asociada con la molécula de longitud completa, sino que también incluye cualquier fragmento, alteración, derivado, y variante de la misma.

"Amplificación", como se usa en la presente, se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico y por lo general se lleva a cabo usando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés, polymerase chain reaction) que se conocen en el arte (Dieffenbach, C. W. y G. S. Dveksler (1995) PCR Pnmer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

Los términos "biológicamente activo" o “funcional”, como se usa en la presente, se refieren a un péptido o polipéptido que retiene una o más funciones estructurales, inmunogénicas o bioquímicas (por ejemplo, asociación celular, asociación membranal) de una secuencia de ocurrencia natural.

Los términos “inhibidor celular” o “inhibidor”, como se usa en la presente, se refieren a agentes que reducen o bloquean el crecimiento o réplica de células microbianas, especialmente células metanógenas. Un inhibidor celular puede actuar para reducir o bloquear, por ejemplo, división celular. Un inhibidor puede reducir o bloquear, por ejemplo, síntesis de ADN, síntesis de ARN, síntesis proteica, o modificaciones post-traduccionales. Un inhibidor también puede reducir o bloquear la actividad de enzimas envueltas en las vías de metanogénesis. Un inhibidor también puede dirigir una célula para reconocimiento por parte de componentes del sistema inmune. La inhibición de una célula también incluye exterminio celular y muerte celular, por ejemplo, a partir de lisis, apoptosis, necrosis, etc. Los inhibidores útiles incluyen, mas no se limitan a, compuestos anti-metanogénesis (por ejemplo, ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de los anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos, y otros antibióticos como se describe en detalle en la presente.

Los términos "complementario" o "complementariedad”, como se usa en la presente, se refieren a la fijación natural de polinucleótidos bajo condiciones permisivas de sal y temperatura por formación de pares de bases. Para la secuencia A-G -T, la secuencia complementaria es T-C-A, el complemento reverso es A -C -T y la secuencia reversa es T-G -A. La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser parcial, en donde solamente algunos de los ácidos nucleicos se fijan, o puede ser completa cuando existe total complementariedad entre las moléculas monocatenarias. El grado de complementariedad entre las cadenas del ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y fuerza de hibridación entre las cadenas del ácido nucleico. Esto tiene particular importancia en las reacciones de amplificación, que depende de la fijación entre las cadenas de los ácidos nucleicos y el diseño y uso de moléculas de PNA.

El término "derivado", como se usa en la presente, se refiere a la modificación química de un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido, o anticuerpo, o un ácido nucleico complementario a los mismos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, reemplazo de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. En aspectos preferentes, un derivado de ácido nucleico codifica un péptido, polipéptido, o anticuerpo que retiene actividad biológica o inmunogénica/inmunológica de la molécula natural. Un péptido, polipéptido, o anticuerpo derivado es uno que está modificado por glicosilación, pegilación, o cualquier proceso similar que retiene una o más función biológica (por ejemplo, asociación celular, asociación membranal) o actividad inmunogenética/inmunológica de la secuencia a partir de la cual deriva.

El término "homología", como se usa en la presente, se refiere a un grado de complementariedad. Puede existir homología parcial (es decir, menos de 100% de identidad) u homología completa (es decir, 100% de identidad). Una secuencia parcialmente complementaria que inhibe al menos parcialmente una secuencia idéntica a partir de la hibridación de un ácido nucleico blanco se menciona usando el término funcional “sustancialmente homóloga”. La inhibición de hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia objetivo se puede examinar usando un ensayo de hibridación (por ejemplo, Manchado Sourthern o Manchado Northern, hibridación de solución y similares) bajo condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia sustancialmente homóloga o sonda de hibridación compite e inhibe la fijación de una secuencia completamente homóloga a la secuencia objetivo bajo condiciones de baja rigurosidad. Esto no significa que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la fijación no específica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la fijación de dos secuencias, una a la otra, sea una interacción específica (es decir, selectiva).

El término "hibridación", como se usa en la presente, se refiere a cualquier proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se fija con una cadena complementaria a través de la formación de pares de base.

Una "inserción" o "adición", como se usa en la presente, se refieren a un cambio en una secuencia de aminoácido o nucleótido que genera la adición de uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, a comparación con la molécula de ocurrencia natural.

Un “metanógeno”, como se usa en la presente, se refiere a microbios que producen gas metano, que incluye Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium y Methanosarcina. Los metanógenos específicos incluyen, mas no se limitan a, Methanobrevibacter ruminantium (es decir, cepa M1, o cepa DSM1093), Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium fonvicicum, Methanothermobacter mart)urgensis, Methanothenvobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina bariteri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii, y Methanolobus tayloqi. Todos los géneros y especies de metanógenos están comprendidos por este término.

Las células “microbianas” como se usa en la presente, se refieren a células microbianas de ocurrencia natural o genéticamente modificadas tales como metanógenos, halóreinos, y termoacidófilos, y eubacterias, tales como cianobacteria, espiroquetas, proteobacterias, así como también bacterias Gram positiva y Gram negativa.

El término “modificado” se refiere a secuencias alteradas y a fragmentos de secuencias, variantes, y derivados, tal como se describe en la presente.

"Secuencia de ácido nucleico" o “secuencia de nucleótido” como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de un polinucleótido, oligonucleótido, o fragmentos de los mismos, y a ADN o ARN de origen natural, recombinante, sintético o semisintético, que puede ser monocatenario o bicatenario, y puede representar cadena sentido o antisentido, o regiones codificadoras o no codificadoras. Las secuencias de la invención, preferentemente, comprenden al menos 12, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 nucleótidos, preferentemente al menos 15 a 30, 30 a 60, 60 a 90, 90 a 120, 120 a 150, 150 a 300, 300 a 450, 450 a 600, o 600 a 750 nucleótidos, o al menos 1000 nucleótidos, o al menos 1500 nucleótidos. Se entiende que cada referencia a una “secuencia de ácido nucleico” o “secuencia de nucleótido”, en la presente, incluye la secuencia nativa de longitud completa, así como también cualquier complemento, fragmento, alteración, derivado o variante de la misma.

El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de al menos 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30 ó 36 nucleótidos, o al menos 12 a 36 nucleótidos, o al menos 15 a 30 nucleótidos, que se pueden usar en ensayos de amplificación, secuenciación o hibridación de PCR. Como se usa en la presente, el oligonucleótido es sustancialmente equivalente a los términos "amplímeros", "cebadores", "oligómeros" y "sondas" como se definen comúnmente en el arte.

El término “polinucleótido”, cuando se usa en singular o plural, por lo general se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, cualquier poliribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Esto incluye, sin limitaciones, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. También se incluyen regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN, o bien, tanto ARN como ADN. Se incluyen en forma específica mARN, cADN, y ADN genómicos, y cualquier fragmento de los mismos. El término incluye ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas, tales como bases tituladas, o bases inusuales, tales como inosina. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias codificadoras o no codificadoras, o secuencias sentido o antisentido, o iARN tales como siARN. Se entiende que cada referencia a un “polinucleótido” o término similar, en la presente, incluye las secuencias de longitud completa así como también cualquier complemento, fragmento, alteración, derivado o variante de las mismas.

Un “péptido” y “polipéptido”, como se usa en la presente, se refiere a los péptidos o polipéptidos aislados de la invención obtenidos de cualquier especie, preferentemente microbiana, de cualquier fuente ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante. En forma específica, un péptido o polipéptido de la invención se puede obtener de células metanógenas, tales como células Methanobrevibacter, en particular, células M. ruminantium o M. smithii. Para la producción recombinante, un péptido o polipéptido de la invención se puede obtener de células microbianas o eucarióticas, por ejemplo, Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, levadura, células de insectos tales como Drosophila, células de animales tales como células de COS y CHO, o células vegetales. Debe entenderse que cada referencia a un “péptido” o “polipéptido”, en la presente, incluye la secuencia de longitud completa, así como también cualquier fragmento, alteración, derivado o variante de la misma.

"Ácido nucleico peptídico" o “PNA” como se usa en la presente, se refiere a una molécula antisentido o agente anti— génico que comprende bases enlazadas por una estructura peptídica.

El término “rumiante”, como se usa en la presente, se refiere a animales que tienen un rumen como tipo especial de órgano digestivo. Los rumiantes incluyen, mas no se limitan a, ganado vacuno, ovejas, cabras, búfalos, alces, antílopes, caribú y ciervos.

Los términos "condiciones rigurosas" o "rigurosidad" como se usa en la presente, se refieren a las condiciones para hibridación como se definen para el ácido nucleico, sal y temperatura. Estas condiciones son las que se conocen en el arte y pueden alterarse con el propósito de identificar o detectar idénticas o relacionadas secuencias de polinucleótidos. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y otros (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, y Ausubel, F. M. y otros (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Las numerosas condiciones equivalentes que comprenden rigurosidad baja o alta dependen de factores tales como longitud y naturaleza de la secuencia (ADN, ARN, composición base), naturaleza del blanco (ADN, ARN, composición base), entorno (en solución o inmovilizada sobre un substrato sólido), concentración de sales y otros componentes (por ejemplo, formamida, sulfato de dextrano y/o polietilenglicol), y temperatura de las reacciones (por ejemplo, en un rango de aproximadamente 5 °C por debajo de la temperatura de fusión de la sonda a aproximadamente 20 °C a 25 °C por debajo de la temperatura de fusión). Uno o más factores pueden variar a fin de generar condiciones de rigurosidad baja o alta diferentes a las de la lista anterior, pero equivalentes a las mismas. El término “sujeto” incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen, mas no se limitan a, aves y mamíferos, tales como rumiantes, y en particular, ratones, conejos, gatos, perros, cerdos, ovejas, cabras, vacas y caballos.

Los términos “sustancialmente purificada” o “aislada” como se usa en la presente, se refieren a secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que se extraen de su ambiente celular, recombinante o sintético, y son al menos 60% libres, preferentemente 75% libres, y más preferentemente al menos 90% libres o al menos 99% libres de otros componentes con los cuales están asociadas en su ambiente. Los polinucleótidos y polipéptidos “aislados” han sido identificados y separados de al menos una molécula contaminante con la cual están asociados en su estado natural. En consecuencia, debe entenderse que los polinucleótidos y polipéptidos aislados están en una forma que difiere de la forma o determinación en la que se encuentran en la naturaleza. Debe apreciarse que “aislados” no necesariamente refleja el punto exacto (por ejemplo, un porcentaje específico) al cual la secuencia ha sido purificada.

"Transformación" como se define en la presente, describe un proceso por el cual el AND exógeno entra y cambia una célula receptora. Puede suceder bajo condiciones naturales o artificiales usando varios métodos que se conocen en el arte. La transformación puede basarse en cualquier método conocido de inserción de secuencias foráneas de ácido nucleico en una célula huésped procariótica o eucariótica. El método se selecciona sobre la base del tipo de célula huésped que se transforma y puede incluir, mas no se limita a, infección virósica, electroporación, choque por calor, lipofección y bombardeo de partículas. Dichas células "transformadas" incluyen células establemente transformadas en las cuales el ADN insertado es capaz de réplica ya sea como plásmido de réplica autónoma o como parte del cromosoma huésped. También incluyen células que expresan en forma transitoria el ADN o ARN insertado durante períodos limitados de tiempo.

“Vacunas”, como se usa en la presente, incluye todos los componentes y composiciones para estimular la respuesta inmune en un sujeto. En este sentido, son particularmente útiles las vacunas de subunidades, incluyendo vacunas de péptidos, y también vacunas de vectores, vacunas de ácido nucleico y vacunas comestibles. Las vacunas se pueden usar para establecer o fortalecer una respuesta inmune a un antígeno, particularmente un antígeno microbiano. En aspectos particulares, las vacunas comprenden antígenos que evocan reacciones protectoras del huésped, por ejemplo, respuestas a formación de anticuerpo, células T y T auxiliares. Las vacunas también pueden comprender anticuerpos, por ejemplo, para inmunización pasiva.

Una "variante" de un péptido, polipéptido o anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos que es alterada por uno o más aminoácidos. Una variante de polinucleótido es alterada por uno o más nucleótidos. Una variante puede generar cambios "conservadores", en donde un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares, por ejemplo, reemplazo de leucina con isoleucina. Con menos frecuencia, una variante puede generar cambios "no conservadores", por ejemplo, reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores análogas también pueden incluir extracciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. La orientación para determinar qué residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o extraer sin abolir la actividad biológica o inmunogénica/inmunológica se puede encontrar usando los programas de computación que se conocen en el arte, por ejemplo, el programa LASERGENE (DNASTAR).

La invención también incluye variantes que retienen al menos una actividad biológica (por ejemplo, asociación celular, asociación membranal) o actividad inmunogénica/inmunológica. Una variante preferida es la que tiene sustancialmente la misma secuencia o una funcionalmente equivalente, por ejemplo, que tiene al menos 80%, y más preferentemente al menos 90%, de identidad de secuencia con respecto a una secuencia revelada. Una variante más preferente es la que tiene al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia revelada en la presente. El porcentaje de identidad se determina al alinear las dos secuencias a compararse como se describe a continuación, determinar los números de residuos idénticos en la porción alineada, dividir ese número por el número total de residuos en la secuencia inventiva (cuestionada), y multiplicar el resultado por 100. Un programa útil de alineamiento es AlignX (Vector NTI).

El metano es producido en el intestino anterior de los rumiantes por los metanógenos que actúan como reductores terminales de carbono en el sistema ruminal. La vía de metanogénesis de múltiples pasos está bien dilucidada, principalmente a partir del estudio de metanógenos no ruminales, pero las adaptaciones que permiten que los metanógenos se formen y persistan en el rumen no se entienden bien. El Methanobrevibacter ruminantium es un metanógeno prominente en los rumiantes de Nueva Zelanda. Como se describe en la presente, el genoma de M. ruminantium ha sido secuenciado e ilustrado como de aproximadamente 3,0 Mb en tamaño con un contenido de GC del 33,68%. Todos los componentes de la vía de metanogénesis han sido identificados, y la comparación de estas secuencias con aquellas de Methanobactehum thennoautotrophicum y Methanosphaera stadtmanae indica que la organización génica de metanogénesis se conserva en Methanobectariales (FIG. 1C.). El genoma contiene muchas proteínas de superficie larga, con características que indican que pueden mediar la asociación con otros microbios ruminales. En varios aspectos de la invención, los polinucleótidos y polipéptidos identificados se pueden usar como un medio para inhibir metanógenos y/o metanogénesis en el rumen, y para dilucidar además el rol de M. ruminantium en la formación de metano. Son particularmente útiles los polinucleótidos y polipéptidos descritos, identificados como componentes implicados en la metanogénesis (FIGS. 6A-6C), como componentes de superficie celular (FIGS. 7A-7C), como componentes implicados en la biosíntesis de exopolisacáridos (FIGS. 8A-8C), como componentes con dominios de extensión en membrana (FIGS. 9A-9C), así como también los polinucleótidos y polipéptidos usados para producción de anticuerpos (FIGS. 5A-5B).

Péptidos, polipéptidos y polinucleótidos

La invención incluye péptidos y polipéptidos, incluyendo aquellos que comprenden al menos una de las SEC ID No:1-702, y fragmentos, variantes y sus derivados. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden ser expresados y usados en varios ensayos para determinar su actividad biológica. Los péptidos y polipéptidos pueden ser usados para protocolos de aislamiento y síntesis a gran escala, por ejemplo, para producción comercial. Dichos péptidos y polipéptidos pueden usarse para elevar anticuerpos, para aislar las correspondientes secuencias de aminoácidos, y para determinar en forma cuantitativa los niveles de las secuencias de aminoácidos. Los péptidos y polipéptidos pueden ser usados para vacunas para dirigir e inhibir células microbianas, especialmente células metanógenas. Los péptidos y polipéptidos también pueden ser usados para preparar anticuerpos para inhibir el crecimiento o réplica de dichas células. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención también se pueden usar como composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, especialmente composiciones de vacunas. En aspectos particulares, los dispositivos ruminales de liberación lenta se pueden usar junto con los péptidos, polipéptidos, anticuerpos y composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas, especialmente composiciones de vacunas) de la invención.

Los péptidos de la presente invención comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) péptidos que comprenden al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos; (b) péptidos que comprenden un dominio funcional de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, y fragmentos y variantes de los mismos; y (c) péptidos que comprenden al menos un número especificado de residuos contiguos de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o variantes o sus derivados. En una modalidad, la invención incluye un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEC ID No:1-9. Todas estas secuencias se refieren en forma colectiva en la presente como péptidos de la invención.

Los polipéptidos de la presente invención comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) polipéptidos que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC iD No:1-702, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos; (b) polipéptidos que comprenden un dominio funcional de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, y fragmentos y variantes de los mismos; y (c) polipéptidos que comprenden al menos un número especificado de residuos contiguos de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o variantes o sus derivados. En una modalidad, la invención incluye un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEC ID No:1-9. Todas estas secuencias se refieren en forma colectiva en la presente como polipéptidos de la invención.

La invención también incluye un polinucleótido aislado que codifica un péptido o polipéptido de las SEC ID No:1-702. Los polinucleótidos aislados de la presente invención tienen utilidad en mapeo de genoma, en mapeo físico y en clonación de genes de componentes de superficie celular más o menos relacionados. Las sondas diseñadas usando los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para detectar la presencia y examinar los patrones de expresión de los genes en cualquier organismo que tiene secuencias de ADN y ARN suficientemente homólogas en sus células, usando técnicas que se conocen en el arte, tales como técnicas de slot blot o análisis por microdisposición. Los cebadores diseñados usando los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para secuenciación y amplificaciones de PCR. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para preparar vectores de expresión y células huésped para vacunas para dirigir e inhibir células microbianas, especialmente células metanógenas. La invención incluye además el uso de los polinucleótidos para la producción de anticuerpos para inhibir el crecimiento o réplica de dichas células. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden usar como composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, especialmente composiciones de vacunas. En aspectos particulares, los dispositivos ruminales de liberación lenta se pueden usar junto con los polinucleótidos, vectores, células huésped, y composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas, especialmente composiciones de vacunas) de la invención.

Los polinucleótidos de la presente invención comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) secuencias que comprenden una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o fragmentos o variantes de las mismas; (b) complementos, secuencias reversas, y complementos reversos de una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o fragmentos o variantes de los mismos; (c) marcos abiertos de lectura contenidos en la secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, y sus fragmentos y variantes; (d) dominios funcionales de una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, y fragmentos y variantes de los mismos; y (e) secuencias que comprenden al menos un número especificado de residuos contiguos de una secuencia codificadora para al menos a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID No:1-702, o variantes de las mismas; y (f) secuencias que comprenden al menos un número especificado de nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEC ID No:703-1395. También se proveen cebadores y sondas de oligonucleótidos, y sus variantes. Todos estos cebadores y sondas de polinucleótidos y oligonucleótidos se mencionan en la presente de manera colectiva, como polinucleótidos de la invención.

Será apreciado por los expertos en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, se pueden formar una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos o polipéptidos de la invención, algunos de ellos con mínima homología con respecto a las secuencias de nucleótidos de cualquier gen conocido y de ocurrencia natural. Por consiguiente, la invención contempla cada una y todas las posibles variaciones de la secuencia de nucleótidos que podría formarse seleccionando combinaciones basadas en elecciones de codones posibles. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético de tripletes estándar aplicado a las secuencias de aminoácidos de ocurrencia natural, y todas dichas variaciones deben considerarse tal como se revelan en forma específica.

Las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos o polipéptidos, o sus fragmentos o variantes, son preferentemente capaces de hibridarse a la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ocurrencia natural bajo condiciones apropiadamente seleccionadas del péptido o rigurosidad. No obstante, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican un péptido o polipéptido, o su fragmento o derivado, que poseen un uso de codones sustancialmente diferente. Los codones pueden seleccionarse para incrementar la proporción a la cual la expresión del péptido o polipéptido se realiza en un huésped procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones particulares se utilizan por el huésped. Otras razones para alterar en forma sustancial la secuencia de nucleótidos que codifica péptidos o polipéptidos y sus derivados sin alterar las secuencias de aminoácidos codificadas incluye la producción de transcriptos de ARN que tienen propiedades más deseables, tales como vida media mayor, que los transcriptos producidos a partir de la secuencia de ocurrencia natural.

La invención también incluye producción de secuencias de ADN, o fragmentos de las mismas, que codifican los péptidos o polipéptidos, o sus fragmentos o variantes, enteramente por química sintética. Después de la producción, la secuencia sintética puede ser insertada en cualquiera de los muchos vectores de expresión y sistemas celulares disponibles usando reactivos que se conocen en el arte. Asimismo, la química sintética puede ser usada para introducir mutaciones en una secuencia que codifica un péptido o polipéptido, o cualquier variante o fragmento de la misma. También están comprendidas por la presente invención las secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridarse a las secuencias de nucleótidos reivindicadas, y en particular, aquellas de las SEC iD No:703-1395, bajo varias condiciones de rigurosidad como lo enseñan Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

Los métodos para secuenciación de ADN son conocidos y generalmente están disponibles en el arte y se pueden usar para llevar a la práctica las modalidades de la invención. Los métodos pueden emplear enzimas tales como fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq polimerasa (Perkin Elmer), T7 polimerasa termoestable, Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), o combinaciones de polimerasas y exonucleasas de corrección tales como las que se encuentran en el sistema de amplificación ELONGASE comercializado por Life Technologies (Gaithersburg, MD). Preferentemente, el proceso está automatizado con máquinas tales como la Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) secuenciadores de ADN ABI Catalyst y 373 y 377 (Perkin Elmer) o el Genoma Sequencer 20® (Roche Diagnostics).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos o polipéptidos se pueden extender usando una secuencia de nucleótidos parcial y empleando varios métodos conocidos en el arte para detectar secuencias ascendentes tales como elementos promotores y regulatorios. Por ejemplo, un método que puede ser empleado, PCR de "sitio de restricción", use cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida adyacente a un locus o sitio conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). En particular, el ADN genómico se amplifica primero en presencia del cebador a una secuencia de enlace y un cebador específico a la región conocida. Las secuencias amplificadas se someten luego a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador de enlace y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y secuencian usando transcriptasa reversa.

Los sistemas de electroforesis capilar que están comercialmente disponibles se pueden usar para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de productos de PCR o secuenciación. En particular, la secuenciación capilar puede emplear polímeros fluibles para separación electroforética, cuatro tinturas fluorescentes diferentes (una para cada nucleótido) que se activan por láser, y detección de las longitudes de onda emitidas por una cámara de dispositivo acoplado por carga. La intensidad de producción/luz se puede convertir a señal eléctrica usando programa de computación apropiado (por ej. GENOTYPER y Secuencia NAVIGATOR, Perkin Elmer) y el proceso completo, desde la carga de muestras hasta el análisis por computadora y visualización de datos electrónicos, puede ser controlado por computadora. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de pequeñas partes de ADN que podrían estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular.

En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos o fragmentos de los mismos que codifican péptidos o polipéptidos pueden ser usados en moléculas ADN recombinante para dirigir expresión de los péptidos o polipéptidos, o fragmentos o variantes de los mismos, en células huésped apropiadas. Debido a la inherente degeneración del código genético, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos, o una funcionalmente equivalente, pueden ser producidas, y estas secuencias se pueden usar para clonar y expresar péptidos o polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden diseñar usando métodos generalmente conocidos en el arte a fin de alterar secuencias que codifican aminoácidos por una variedad de razones, que incluyen mas no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. El barajado de ADN por fragmentación aleatoria y re-ensamblado por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para diseñar las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis sitio-dirigida se puede usar para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, introducir mutaciones y así sucesivamente.

En otra modalidad de la invención, las secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes que codifican péptidos o polipéptidos pueden estar ligadas a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, puede ser útil para codificar una secuencia quimérica que puede ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. Una proteína de fusión también puede ser diseñada para contener un sitio de clivaje localizado entre el péptido o polipéptido de la invención y la secuencia de proteína heteróloga, para que el péptido o polipéptido pueda ser clivado o purificado lejos de la fracción heteróloga.

En otra modalidad, las secuencias que codifican péptidos o polipéptidos pueden ser sintetizadas, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos que se conocen en el arte (véase, Caruthers, M. H. y otros (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. y otros (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). En forma alternativa, el polipéptido en sí mismo puede ser producido usando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos, o un fragmento de la misma. Por ejemplo, la síntesis del polipéptido se puede realizar usando varias técnicas de fase sólida (Roberge, J. Y. y otros (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) y la síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando el ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Varios fragmentos de péptidos o polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente en forma separada y combinados usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.

El péptido o polipéptido sintetizado en forma nueva puede ser aislado mediante cromatografía líquida de alto funcionamiento (por ejemplo, Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman y Co., New York, NY). La composición de los péptidos o polipéptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; Creighton, supra). Además, la secuencia de aminoácidos del péptido o polipéptido, o cualquier parte de la misma, se puede alterar durante síntesis directa y/o combinada usando métodos químicos con secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de las mismas, para producir una variante de molécula.

A fin de expresar un péptido o polipéptido biológicamente activo, las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias o equivalentes funcionales, se pueden insertar un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora insertada. Los métodos que son conocidos para los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican el péptido o polipéptido y elementos apropiados de control transcripcional y traduccional. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook, J. y otros (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, y Ausubel, F. M. y otros (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY.

Una variedad de vectores de expresión/sistemas huésped pueden usarse para contener y expresar secuencias que codifican los péptidos o polipéptidos de la invención. Estas incluyen, mas no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vector fágico, plásmido o cósmido de expresión de ADN recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores virales de expresión (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores virales de expresión (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor CaMV, del inglés cauliflower mosaic virus; virus del mosaico de tabaco o t Mv , del inglés tobacco mosaic virus) o con vectores bacterianos de expresión (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Para las bacterias, los plásmidos útiles incluyen plásmidos pET, pRSET, pTrcHis2, y pBAD de Invitrogen, plásmidos pET y pCDF de Novagen, y plásmidos Director® de Sigma-Aldrich. Para los metanógenos, los plásmidos útiles incluyen, mas no se limitan a, pME2001, pMV15, y pMP1. La invención no se limita por el vector de expresión o célula huésped empleados.

Los "elementos de control" o "secuencias regulatorias" son aquellas regiones no traducidas de los reforzadores de vectores, promotores y regiones no traducidas 5' y 3' que interactúan con proteínas de células huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema vector y huésped utilizados, se puede utilizar cualquier número de elementos adecuados de transcripción y traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se realiza clonación de sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como promotor de lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, CA) o plásmido pSPORTI (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus puede ser utilizado en células de insectos. Los promotores o reforzadores derivados de los genomas de células vegetales (por ejemplo, choque por calor, RUBISCOl, y genes de proteínas de almacenamiento) o de virus vegetales (por ejemplo, promotores virales o secuencias líderes) pueden ser clonados en el vector.

En sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión dependiendo del uso destinado para el péptido o polipéptido. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de péptido o polipéptido, se pueden usar vectores que dirigen altos niveles de expresión de proteínas de fusión que son fácilmente purificadas. Dichos vectores incluyen, mas no se limitan a, la clonación multifuncional de E. coli y vectores de expresión tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica un polipéptido puede estar ligada en el vector en marco con secuencias para Met amino-terminal y los 7 residuos subsiguientes de p-galactosidasa para que una proteína híbrida sea producida; pIN vectors (Van Heeke, G. y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares.

Los vectores pGEX (Promega, Madison, WI) también pueden ser usados para expresar péptidos o polipéptidos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorción a microesferas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas formadas en dichos sistemas pueden ser diseñadas para incluir sitio de clivajes de heparina, trombina, o factor Xa proteasa para que el péptido o polipéptido clonado de interés pueda ser liberado de la fracción de GST a voluntad. En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se puede usar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisión, véase Ausubel y otros (supra) y Grant y otros (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

Las señales específicas de iniciación también se pueden usar para alcanzar traducción más eficiente de las secuencias que codifican los péptidos o polipéptidos de la invención. Dichas señales incluyen el codón de iniciación de ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde las secuencias que codifican un péptido o polipéptido, su codón de iniciación, y secuencias ascendentes se insertan en el vector de expresión apropiado, puede que no se necesite control transcripcional o traduccional adicional. No obstante, en los casos donde sólo una secuencia codificadora, o un fragmento de la misma, es insertado, las señales de control de traducción exógenas que incluyen el codón de iniciación de ATG deberían ser provistas. Además, el codón de iniciación debería estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de todo el inserto. Los elementos de traducción exógeno y codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión se puede reforzar mediante la inclusión de reforzadores que son apropiados para el sistema celular particular que se usa, tal como los descritos en las publicaciones (Scharf, D. y otros (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).

Asimismo, una cepa de célula huésped se puede elegir por su habilidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o el proceso del péptido o polipéptido expresado en la forma deseada. Dichas modificaciones de la secuencia incluyen, mas no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento post-traducción que cliva una forma "prepro" del péptido o polipéptido se puede usar para facilitar la correcta inserción, réplica y/o función. Las diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos de actividades post-traducción están disponibles del American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) y se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la secuencia. Las células huésped específicas incluyen, mas no se limitan a, células metanógenas, tales como células Methanobrevibacter, en particular, M. ruminantium, o células M. smithii. Las células huésped de interés incluyen, por ejemplo, Rhodotorula, Aureobasidium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Pseudomonas, Erwinia y Flavobacterium; u otros organismos tales como Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Streptomyces, y similares. Las células huésped específicas incluyen Escherichia coli, que es particularmente adecuada para uso con la presente invención, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, y similares.

Existen varias técnicas para introducir ácido nucleico en células eucarióticas cultivadas in vitro. Estas incluyen métodos químicos (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell y otros, Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones y Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1900), Ausubel y otros, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, New York, NY (1992); y Farhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:2334 (1994)), uso de protoplastos (Bothwell, supra) o pulsos eléctricos (Vatteroni y otros, Mutn. Res., 291:163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell y otros, supra; y Ausubel y otros, supra), uso de virus atenuados (Davis y otros, J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster y otros J. Gen. Virol. 2002, 83(R 2), 369381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:5563 (1994); y Bothwell y otros, supra), así como también métodos físicos (Fynan y otros, Int J Immunopharmacol. 1995 Feb;17(2):79-83; Johnston y otros, Meth. Cell Biol., 43(R A):353365 (1994); Bothwell y otros, supra; y Ausubel y otros, supra).

El suministro exitoso de ácido nucleico al tejido animal se puede lograr mediante liposomas catiónicos (Watanabe y otros, Mol. Reprod. Dev., 38:268274 (1994)), inyección directa de ADN o ARN desnudo en tejido del músculo animal (Robinson y otros, Vacc., 11:957 960 (1993); Hoffman y otros, Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang y otros, Virol., 199:132 140 (1994); Webster y otros, Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis y otros, Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis y otros, Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans y otros Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, y otros Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400), y embriones (Naito y otros, Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); y Burdon y otros, Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)), inyección intramuscular de vacunas de ARN de auto réplica (Davis y otros, J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasunya y otros Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617) o inyección intradérmica de ADN usando tecnología del acelerador de partículas o ”gene-gun” (Johnston y otros, supra).

Una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de los péptidos o polipéptidos de la invención, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína son conocidos en el arte. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima o ELISA (del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay), radioinmunoensayo (RIA), y selección de células activada por fluorescencia o fAc S (del inglés, fluorescence activated cell sorting). Un inmunoensayo de dos sitios, de base monoclonal, se puede usar con anticuerpos monoclonales reactivos a dos epitopos no interfirientes en el péptido o polipéptido, pero un ensayo de fijación competitivo también se puede usar. Estos y otros ensayos se describen, entre otros, en Hampton, R. y otros (1990; Serological Methods, A laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) y Maddox, D. E. y otros (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).

Una gran variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden usar en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir hibridación o sondas de PCR marcadas para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcación, traslado de mella, marcación final o amplificación de PCR usando un nucleótido marcado. En forma alternativa, las secuencias que codifican los péptidos o polipéptidos, o cualquier fragmento o variante del mismo, se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de mARN. Dichos vectores son conocidos en el arte, se encuentran comercialmente disponibles y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro por adición de una ARN polimerasa apropiada tales como T7, t 3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden realizar usando una variedad de equipos comercialmente disponibles de Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical. Las moléculas informantes o marcadores, que se pueden usar para facilidad de detección, incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como también sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Los vectores de expresión o células huésped transformadas con vectores de expresión se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación del péptido o polipéptido del cultivo. El cultivo puede comprender componentes para expresión in vitro o in vivo. Los componentes de expresión in vitro incluyen aquellos para lisados de reticulocitos de conejo, lisados de E. coli, y extractos de germen de trigo, por ejemplo, sistemas Expressway® o RiPs de Invitrogen, sistemas Genelator® de iNtRON Biotechnology, sistemas EcoPro® o STP3® de Novagen, sistemas TNT® Quick Coupled de Promega, y sistemas EasyXpress® de QIAGEN. El péptido o polipéptido producido del cultivo puede estar segregado o contenido en forma intracelular dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. En aspectos particulares, los vectores de expresión que codifican un péptido o polipéptido pueden estar diseñados para contener secuencias de señal que dirigen secreción del péptido o polipéptido a través de una membrana celular procariótica o eucariótica.

Otras construcciones pueden incluir un dominio de aminoácidos que facilitan la purificación del péptido o polipéptido. Dichos dominios incluyen, mas no se limitan a, de dominios quelación de metal tales como histidina-triptófano (por ejemplo, 6X-HIS (SEC ID NO. 1396)) módulos que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en sistema de purificación de afinidad/extensión FLAG® (immunex Corp., Seattle, WA). Los marcadores de epítopos útiles incluyen 3XFLAG®, HA, VSV-G, V5, HSV1 GST, GFP, MBP, Ga L4, y p-galactosidasa. Los plásmidos útiles incluyen aquellos que comprenden un marcador de biotina (por ejemplo, plásmidos PinPoint® de Promega), proteína de fijación de calmodulina (por ejemplo, plásmidos pCAL de Stratagene), péptido de fijación de estreptavidina (por ejemplo, plásmidos InterPlay® de Stratagene), un c-myc o marcador FLAg ® (por ejemplo, plásmidos de inmunoprecipitación de Sigma-Aldrich), o un marcador de histidina (por ejemplo, plásmidos QIAExpress® de QIAGEN).

Para facilitar la purificación, los vectores de expresión pueden incluir secuencias de enlace clivables tales como las específicas de Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA). Por ejemplo, el vector puede incluir uno o más enlazadores entre el dominio de purificación y el péptido o polipéptido. Dicho vector de expresión provee expresión de una proteína de fusión que comprende un péptido o polipéptido de la invención y un ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina SEC ID NO. 1396 que preceden a una tioredoxina o un sitio de clivaje de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en cromatografía por afinidad de ión metálico inmovilizado o IMAC (del inglés, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) como se describe en Porath, J. y otros (1992) Prot. Exp. Purif.

3: 263-281) mientras que el sitio de clivaje de enteroquinasa provee un medio de purificación del péptido o polipéptido a partir de la proteína de fusión. Una discusión de los vectores que contienen proteínas de fusión se encuentra en Kroll, D. J. y otros (1993; ADN Cell Biol. 12:441-453).

Anticuerpos y vacunas

Los anticuerpos de la invención se pueden producir usando métodos que por lo general son conocidos en el arte. En particular, los péptidos, polipéptidos o polinucleótidos purificados se pueden usar para producir anticuerpos de acuerdo con métodos conocidos. Dichos anticuerpos pueden incluir, mas no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos o de una cadena, fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos de neutralización, (es decir, aquellos que inhiben función) son especialmente preferibles para uso con vacunas.

Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar varios huéspedes, incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, humanos, y otros, mediante inyección con un péptido, polipéptido, polinucleótido o cualquiera de sus fragmentos que tenga propiedades inmunogénicas. Dependiendo de las especies huésped, se pueden usar varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, mas no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa y dinitrofenol. Entre los adyuvantes usados en humanos, son especialmente preferibles los BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Es preferible que los péptidos, polipéptidos o fragmentos usados para inducir anticuerpos tengan una secuencia de aminoácidos que comprende al menos cinco aminoácidos y más preferentemente al menos 10 aminoácidos. También es preferible que sean idénticos a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural y que puedan contener la secuencia de aminoácidos entera de una pequeña molécula de ocurrencia natural. Los tramos cortos de aminoácidos se pueden fusionar con aquellos de la otra proteína tales como hemocianina de lapa y anticuerpo producido contra la molécula quimérica.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando cualquier técnica que provee la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, mas no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de célula-B humana y la técnica de EBV-hibridoma (Kohler, G. y otros (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. y otros (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. y otros (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S. P. y otros (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120).

Asimismo, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", por ejemplo, se puede usar combinación de genes de anticuerpos de ratón y genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison, S. L. y otros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.

81:6851-6855; Neuberger, M.S. y otros (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. y otros (1985) Nature 314:452-454). En forma alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena pueden ser adaptadas, usando métodos conocidos en el arte, para producir anticuerpos de una sola cadena específicos. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica distinta, pueden ser generados por barajado de cadena de bibliotecas de inmunoglobina combinatoria al azar (Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3).

Las personas versadas en el arte con el cual se relaciona la invención entenderán los términos “bicuerpos” y “tricuerpos”. Estas son moléculas que comprenden un dominio variable de cadena pesada o VH (del inglés, heavy chain variable domain) conectado a un dominio variable de cadena ligera o VL (del inglés, light chain variable domain) por enlazador peptídico corto que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. Esto promueve la formación de pares con los dominios complementarios de una o más cadenas adicionales e impulsa la formación de moléculas diméricas o triméricas con dos o más sitios de fijación de antígeno funcionales. Las moléculas de anticuerpos resultantes pueden ser monoespecíficas o multiespecíificas (por ejemplo, biespecífica en el caso de los bicuerpos). Dichas moléculas de anticuerpos pueden ser creadas a partir de dos o más anticuerpos usando la metodología estándar en el arte con el cual se relaciona la invención; por ejemplo, como se describe por Todorovska y otros (Design and application of dibodies, tribodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66).

Los anticuerpos también se pueden producir al inducir producción in vivo en la población de linfocitos o detectar bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de fijación altamente específica como se revela en las publicaciones (Oriandi, R. y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. y otros (1991) Nature 349:293-299).

Los fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de fijación específicos también pueden ser generados. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, mas no se limitan a, los fragmentos F(ab')2 que pueden ser producidos por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. En forma alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab para permitir la fácil y rápida identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse, W. D. y otros (1989) Science 254:1275-1281).

Varios inmunoensayos pueden ser usados para evaluaciones de detección para identificar anticuerpos que tienen especificidad de fijación. Numerosos protocolos para fijación competitiva o ensayos inmunorradiométricos usando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas se conocen en el arte. Dichos inmunoensayos por lo general implican la medición de formación de complejos entre un péptido, polipéptido o polinucleótido y su anticuerpo específico. Un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivo a dos epitopos no interfirientes es preferible, pero también se puede emplear un ensayo de fijación competitiva (Maddox, supra).

Los anticuerpos como se describen en la presente tienen la habilidad de dirigir y/o inhibir células y también son útiles como moléculas portadoras para el suministro de moléculas inhibidoras adicionales en células microbianas. La química para acoplar los compuestos a los aminoácidos está bien desarrollada, y un número de diferentes tipos moleculares se podría enlazar a los anticuerpos. Los métodos de acoplamiento más comunes dependen de la presencia de grupos amino (alfa-amino o Lys), sufhidrilo (Cys), o de ácido carboxílico (Asp, Glu, o alfa-carboxilo) libres. Los métodos de acoplamiento se pueden usar para enlazar el anticuerpo al inhibidor celular mediante el residuo carboxi-terminal o amino-terminal. En algunos casos, una secuencia incluye múltiples residuos que pueden reaccionar con la química elegida. Esto se puede usar para producir multímeros, que comprenden más de un inhibidor celular. En forma alternativa, el anticuerpo se puede acortar o elegir de manera tal que los residuos reactivos se localicen ya sea en el término amino o bien en el término carboxilo de la secuencia.

Por ejemplo, una molécula informante tal como fluoresceína se puede incorporar en forma específica a un residuo de lisina (Lys) (Ono y otros, 1997) usando N-a-Fmoc-N£-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden-3-metilbutil)-L-lisina durante la síntesis del polipéptido. Después de la síntesis, los ésteres succinimidilo 5 - y 6-carboxifluoresceina se pueden acoplar después de que se extrae 4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno por tratamiento con hidrazina. Por consiguiente, el acoplamiento de una molécula inhibidora al anticuerpo se puede lograr por inclusión de un residuo de lisina a la secuencia de polipéptidos, luego reacción con un inhibidor celular adecuadamente derivado.

También se puede usar el método de acoplamiento de carbodiimida o EDC (hidrocloruro de 1 -e til-3 -(3 -dimetilaminopropil) carbodiimida). Las carbodiimidas pueden activar los grupos carboxílicos de cadena lateral de ácido aspártico y glutámico así como también el grupo carboxilo-terminal para hacer de ellos sitios reactivos para acoplamiento con aminas primarias. El anticuerpo activado se mezcla con el inhibidor celular para producir el conjugado final. Si el inhibidor celular es activado primero, el método de EDC acopla el inhibidor celular a través de la alfa amina N-terminal y posiblemente a través de la amina en la cadena lateral de Lys, si está presente en la secuencia. El éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) es un reactivo heterobifuncional que se puede usar para enlazar un anticuerpo a inhibidores celulares por cisteínas (Cys). El acoplamiento tiene lugar con el grupo tiol de residuos de cisteína. Si la secuencia elegida no contiene Cys es común ubicar un residuo de Cys en los extremos N o C para obtener fijación altamente controlada del anticuerpo al inhibidor celular. Para los propósitos de síntesis, puede ser útil que la cisteína se coloque en el extremo N del anticuerpo. El MBS es particularmente adecuado para uso con la presente invención.

El glutaraldehído se puede usar como reactivo de acoplamiento bifuncional que enlaza dos compuestos a través de sus grupos amino. El glutaraldehído provee un espaciador altamente flexible entre el anticuerpo e inhibidor celular para presentación favorable. El glutaraldehído es un compuesto muy reactivo y reacciona con Cys, Tyr, y His hasta un punto limitado. El método de acoplamiento de glutaraldehído es particularmente útil cuando un polipéptido contiene solamente un grupo amino libre en su extremo amino. Si el anticuerpo contiene más de un grupo amino libre, se pueden formar grandes complejos multiméricos.

En un aspecto, los anticuerpos de la invención se pueden fusionar (por ejemplo, por clonación en marco) o enlazar (por ejemplo, por acoplamiento químico) a inhibidores celulares tales como agentes antimicrobianos. Se incluyen entre estos péptidos antimicrobianos, por ejemplo, proteína de incremento de permeabilidad/bactericida, proteínas antimicrobianas catiónicas, lisozimas, lactoferrinas y catelicidinas (por ejemplo, de neutróreinos; véase, por ejemplo, Hancock y Chappie, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323; Ganz y Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol.

4:53-58; Hancock y otros, 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135-175). Los péptidos antimicrobianos además incluyen defensinas (por ejemplo, de neutróreinos o células epiteliales) y proteínas microbiocidas plaquetarias (véase, por ejemplo, Hancock y Chappie, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323). Los péptidos antimicrobianos adicionales incluyen, mas no se limitan a, gramicidina S, bacitracina, polimixina B, taquiplesina, bactenecina (por ejemplo, bactenecina de ganado), ranalexina, cecropina A, indolicidina (por ejemplo, indolicidina de ganado), y nisina (por ejemplo, nisina bacteriana).

También se incluyen agentes antimicrobianos como ionóferos, que facilitan la transmisión de un ion (tal como sodio), a través de una barrera lipídica tal como una membrana celular. Dos compuestos ionóferos particularmente adecuados para esta invención son RUMENSIN® (Eli Lilly) y Lasalocid (Hoffman LaRoche). Otros ionóferos, mas no se limitan a, salinomicina, avoparcina, aridcina y actaplanina. Otros agentes antimicrobianos incluyen Monensin® y azitromicina, metronidazola, estreptomicina, canamicina y penicilina, así como también, en general, 13-lactamos, aminoglucósidos, macrólidos, cloramfenicol, novobiocina, rifampina y fluoroquinolonas (véase, por ejemplo, Horn y otros, 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74-83; Eckburg y otros, 2003, Infection Immunity 71:591-596; Gijzen y otros, 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630-1634; Bonelo y otros, 1984, FEMS Microbiol. Lett. 21:341-345; Huser y otros, 1982, Arch. Microbiol. 132:1-9; Hilpert y otros, 1981, Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21-31).

Los inhibidores particularmente útiles son los compuestos que bloquean o interfieren con metanogénesis, incluyendo ácido bromoetansulfónico, por ejemplo, ácido 2 - bromoetansulfónico (BES) o una sal del mismo, por ejemplo, una sal sódica. El molibdato (Mo) de sodio es un inhibidor de reducción de sulfato y puede ser usado con ácido bromoetansulfónico. Otros compuestos anti-metanogénesis incluyen, mas no se limitan a, nitrato, formato, fluoruro de metilo, cloroformo, hidrato de cloral, sulfito de sodio, etileno e hidrocarburos insaturados, acetileno, ácidos grasos tales como ácido linoleico y cis-oleico, ácidos grasos saturados tales como ácido behénico y esteárico y, también lumazina (por ejemplo, 2,4-pteridindiona). Los compuestos adicionales incluyen 3-bromopropansulfonato (BPS), ácido propiónico y 2-butanoato de etilo.

También se incluyen como agentes antimicrobianos las enzimas líticas, incluyendo lisozima del fago, endolisina, lisozima, lisina, lisina del fago, muralisina, muramidasa y virolisina. Las enzimas útiles exhiben la habilidad para hidrolizar enlaces específicos en la pared celular bacteriana. Las enzimas líticas particulares incluyen, mas no se limitan a, glucosaminidasas, que hidrolizan los enlaces glucosídicos entre los amino azúcares (por ejemplo, ácido N -acetilmurámico y N-acetilglucosamina) del peptidoglicano, amidasas, que clivan el enlace N-acetilmuramoil-L-alanina amida entre la cadena de glicano y el péptido de enlace cruzado, y endopeptidasas, que hidrolizan el enlace del interpéptido (por ejemplo, cisteína endopeptidasas) y endoisopeptidasas que atacan pseudomureína de los metanógenos de la familia Methanobacteriaceae.

Además, los PNAs están incluidos como agentes antimicrobianos. Los PNAs son híbridos péptido-ácido nucleico en los cuales la estructura de fosfato ha sido reemplazada por una estructural aquiral y neutral formada de unidades N -(2-aminoetil)-glicina (véase, por ejemplo, Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotides Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory y S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003). Las bases A, G, T, C se unen al amino nitrógeno en la estructura mediante enlaces de metilencarbonilo (P.E. Nielsen y otros, Science 1991.254: 1497­ 1500; M. Egholm y otros, Nature 1993. 365: 566-568). Los PNA fijan secuencias complementarias con alta especificidad y mayor afinidad en relación con ADN o ARN análogo (M. Egholm y otros, supra). Los híbridos PNA/ADN o PNA/ARN también exhiben mayor estabilidad térmica comparada con las duplas ADN/ADN o ADN/ARN correspondientes (M. Egholm y otros, supra). Los PNA también poseen estabilidad química y biológica alta, debido a la estructura de amida no natural que no es reconocida por nucleasas o proteasas (V. Demidov y otros, Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313). Por lo general, los PNAs son al menos de 5 bases de longitud, e incluyen una lisina terminal. Los PNAs pueden ser pegilados para extender adicionalmente su tiempo de via (Nielsen, P. E. y otros (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

En un aspecto particular, los anticuerpos de la invención se pueden fusionar o enlazar a otros anticuerpos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos o fragmentos del anticuerpos agregados pueden ser dirigidos a células microbianas, o particularmente células metanógenas, o uno o más componentes celulares. Por ejemplo, proteínas de superficie celular, por ejemplo, receptores extracelulares, se pueden dirigir. En ciertos aspectos, los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo se pueden diseñar con secuencias que están expresadas en forma específica en sujetos, por ejemplo, secuencias de rumiantes o de humanos. También se incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que son específicos a más de una fuente, por ejemplo, una o más secuencias de ratón, humano o rumiante. Además se incluyen los anticuerpos o nanocuerpos de camélidos.

Los anticuerpos de la invención encuentran particular uso en dirigir a célula microbiana, en particular, una célula metanógena. En ciertos aspectos, los anticuerpos se pueden usar para asociarse o enlazarse con la pared celular o membrana y/o inhibir el crecimiento o réplica de la célula. Como tal, los anticuerpos se pueden usar para la adhesión transitoria o extendida a la célula, o para mediar la secuestración o asimilación de la célula, y/o lisis. Para efectuar la dirección, la célula microbiana se puede poner en contacto con un anticuerpo aislado de un organismo huésped, o producido por vectores de expresión y/o células huésped, o química sintética o semisintética como se describe en detalle en la presente. En forma alternativa, los anticuerpos pueden estar producidos por el organismo huésped en sí mismo en respuesta a la administración o los péptidos, polipéptidos o polinucleótidos descritos en la presente. Se entiende que los anticuerpos de la invención, así como también los polinucleótidos, vectores de expresión, células huésped, péptidos y polipéptidos correspondientes se pueden usar para dirigir varios microbios, por ejemplo, Methanobrevibacter ruminantium, que es el metanógeno principal en los rumiantes, y Methanobrevibacter smithii, que es el metanógeno principal en los humanos. En aspectos particulares, los anticuerpos, o polinucleótidos, vectores de expresión, células huésped, péptidos o polipéptidos correspondientes se suministran a los sujetos como una composición descrita en detalle en la presente, por ejemplo, a través del uso de un dispositivo ruminal de liberación lenta.

En varios aspectos, los agentes de la invención (por ejemplo, uno o más péptidos, polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos) pueden estar incluidos en una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, y especialmente una composición de vacuna. La composición comprende, por ejemplo: a) un péptido aislado, o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo; b) un polipéptido aislado, o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo; c) un polinucleótido aislado, o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo; d) un vector de expresión que comprende este polinucleótido; e) una célula huésped que comprende este vector de expresión; o (f) un anticuerpo, o una alteración, fragmento, variante o derivado del mismo. Las composiciones de la invención se pueden incorporar en forma específica como parte de los equipos para dirigir y/o inhibir células microbianas, especialmente células metanógenas, de acuerdo con los métodos descritos. Los equipos comprenden al menos una composición como se establece en la presente e instrucciones para uso en targeting células o inhibir crecimiento celular o réplica, para metanógenos u otros microbios.

Para las vacunas, se puede usar un número de enfoques para incrementar inmunogenecidad de antígenos, por ejemplo, mediante el uso de partículas de antígenos; polímeros de antígenos y polimerización; agentes de emulsión; microencapsulación de antígenos; productos bacterianos y bacterias exterminadas; adyuvantes químicos y citoquinas; y agentes para dirigir antígenos a células que presentan antígenos (revisiones en Paul, Fundamental Immunology, 1999, Lippincott-Raven Publishers, New York, Ny , p. 1392-1405).

Para reducir antígenos en partículas, se puede usar precipitación de alumbre. Con el uso de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, el antígeno en cuestión se incorpora en un precipitado insoluble tipo gel o bien se enlaza a gel preformado por interacciones electrostáticas. Los antígenos se pueden someter a agregado de calor suave, los antígenos que exhiben auto-ensamblado también se pueden usar. Los liposomas, virosomas y complejos de inmunotinción o ISCOMs (del inglés immunostaining complexes) también son útiles para formar particulados.

Para promover la polimerización, los copolímeros de bloqueo no iónicos se pueden usar como aditivos a adyuvantes, por ejemplo, polímeros o polioxipropileno y polioxietileno, con los cuales el antígeno puede estar asociado. Estos se encuentran como componentes de formulaciones adyuvantes complejas por Syntex (SAF-1, Syntex Adjuvant Formulation-1) y Ribi Chemical Co. Los polímeros carbohidratos de manosa (por ejemplo, manán) o de (31 —3 glucosa (por ejemplo, glucano) se pueden usar en forma similar (Okawa Y, Howard CR, Steward MW. Production of anti— peptide antibody in mice following immunization of mice with peptides conjugated to mannan. J Immunol Methods 1992;142:127-131; Ohta M, Kido N, Hasegawa T, y otros. Contribution of the mannan side chains to the adjuvant action of lipopolysaccharides. Immunology 1987;60:503-507).

Varios agentes se pueden usar para emulsión, emulsiones agua en aceite, tales como coadyuvantes de Freund (por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund), u otras mezclas que comprenden gotas diminutas de agua estabilizada por un agente tensioactivo tal como monooleato de manida en una fase continua de aceite mineral u otros aceites, tales como escualano. Un enfoque alternativo es usar emulsiones aceite en agua, tales como MF5963 (Chiron), u otras mezclas que comprenden gotas de aceite de escualeno y una mezcla de agentes de emulsión TWEEN80 y SPAN85, e inmunomoduladores químicos tales como los dipéptidos de muramilo o derivados, por ejemplo, muramil tripéptido-fosfatidil etanolamina (Mt P-PE) (Valensi J-PM, Carlson JR, Van Nest GA. Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized with trivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advanced adjuvants. J Immunol 1994;153:4029-4039). Pequeñas cantidades de polisorbato 80 y trioleato de sorbitano también se pueden usar en las mezclas. Como otro ejemplo, se puede usar SAF-165 (Syntex), u otras mezclas aceite en agua que comprenden Pluronic L121, escualeno y TWEEN80.

Las microcápsulas, en particular, microcápsulas biodegradables, se pueden usar para preparar vacunas de liberación controlada (Chang TMS. Biodegradable, semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones, vaccines and other biologicals. J Bioeng 1976;1:25-32; Langer R. Polymers for the sustained release of macromolecules: their use in a single step method of immunization. Methods Enzymol 1981;73:57-75). Los cianoacrilatos son otra forma de polímeros biodegradables. Por ejemplo, se puede usar poli(butil-2-cianoacrilato) como adyuvante para partículas de inmunización oral (O'Hagan DT, Palin KJ, Davis SS. Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral immunization. Vaccine 1989;7:213-216). Las microcápsulas son útiles para la administración en mucosas de vacunas. Las partículas de tamaño muy pequeño (nanopartículas) son particularmente adecuadas. La digestión en el estómago se puede contrarrestar por polímeros entéricos revestidos, y el revestimiento con sustancias que incrementan la absorción intestinal, según se necesite.

Varias bacterias, que no sean las M. tuberculosis exterminadas, pueden usarse como adyuvantes. Si bien la preparación de bacterias exterminadas es en sí misma altamente antigénica, las propiedades del adyuvante se extienden al antígeno co-administrado. Los organismos útiles incluyen Bordetella pertussis, Corynebacterium parvum, y Nippostrongylus brasiliensis. Los componentes peptídicos y lipídicos de las bacterias también pueden ser utilizados. Los componentes ejemplificativos incluyen acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, o muramil dipéptido (MDP) (Ellouz F, Adam A, Ciorbaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans. Biochem Biophys Res Commun 1974;59:1317-1325), MDP (murabutida) (Chedid L, Parant MA, Audibert FM, y otros. Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid of pyrogenicity. Infect Immun 1982;35:417-424), treonil MDP (Allison a C, Byars NE. An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity. J Immunol Methods 1986;95:157-168), y MTP-PE. Los adyuvantes lipídicos pueden comprender endotoxinas LPS de bacteria gram negativa, tal como Escherichia, Salmonella, y Pseudomonas. En ciertos enfoques, la estructura A lipídica se puede modificar químicamente para reducir la toxicidad pero retener su capacidad adyuvante, por ejemplo, en cuanto a monofosforil lipido A (MPL) (Johnson AG, Tomai M, Solem L, Beck L, Ribi E. Characterization of non-toxic monophosphoryl lipid. Rev Infect Dis 1987;9:S512).

Varios químicos se pueden usar como adyuvantes, incluyendo polinucleótidos, tales como poli-I:C y poli-A:U, vitamina D3, sulfato de dextrano, inulina, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), avridina, polímeros carbohidratos similares a manano y trehalosa dimicolato (Morein B, Lovgren-Bengtsson K, Cox J. Modern adjuvants: funcional aspects. En: Kaufmann SHE, ed. Concepts in vaccine development. Berlin: Walter de Gruyter, 1996:243-263). También se incluyen polifosfazinas (inicialmente introducidas como agentes de promoción de liberación lenta) y una proteína Leishmania, LelF. Las citoquinas también se pueden usar como adyuvantes, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF y IFN-g.

Para dirigir células que presentan antígenos, se pueden usar los dominios C3d, dominios Fc y dominios CTB (Dempsey PW, Allison MED, Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT. C3d of complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science 1996;271:348-350; Sun J-B, Holmgren J, Czerkinsky C. Cholera toxin B subunit: an efficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:10795-10799; Sun J-B, Rask C, Olsson T, Holmgren J1 Czerkinsky C. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin B subunit. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7196-7201).

También se pueden usar adyuvantes específicos para suministro a la mucosa, por ejemplo, CT, LT, y Fragmento C de toxina tetánica (Elson CJ, Ealding W. Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J Immunol 1984;132:2736-2743; Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine 1993;11:1179-1184; Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL. Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelated protein antigens. Vaccine 1988;6:269-277; Gomez-Duarte OG, Galen J, Chatfield SN, Rappuoli R, Eidels L, Levine Mm . Expression of fragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheria toxin in Salmonella typhi c Vd 908 vaccine strain. Vaccine 1995; 13: 1596-1602).

Terapéuticos y diagnósticos

Se considera que los péptidos, polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención tienen beneficios para la salud. En aspectos particulares, las vacunas que dirigen metanógenos se pueden usar para restaurar energía al sujeto, que generalmente se pierde como metano. En consecuencia, la invención se relaciona con una composición farmacéutica (especialmente una composición de vacuna) junto con un portador farmacéuticamente aceptable, para uso con cualquiera de los métodos establecidos anteriormente. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender un péptido, polipéptido o anticuerpo en combinación con un inhibidor celular. En forma alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un polinucleótido, vector de expresión o célula huésped como se describe en detalle en la presente. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente más, tales como compuesto de estabilización, que se pude administrar en cualquier portador farmacéutico estéril, biocompatible, que incluye, mas no se limita a, salina, salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto en forma individual o en combinación con otros agentes, drogas (por ejemplo, drogas antimicrobianas) u hormonas.

Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Otros detalles sobre técnicas para formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención se pueden administrar por cualquier número de vías, que incluyen, mas no se limitan a, forma oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual o rectal.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular usando portadores farmacéuticamente aceptables que se conocen en el arte en dosificaciones adecuadas para administración oral. Dichos portadores permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, leches, suspensiones, y similares, para ingesta del sujeto. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante combinación de compuestos activos con excipiente sólido, en forma opcional moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después agregando auxiliares adecuados, de ser deseado, para obtener núcleos de tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son agentes de relleno de carbohidrato o proteína, tales como azúcar, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa u otros vegetales; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; gomas, incluyendo arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden agregar agentes de desintegración o solubilización, tales como polivinilpirrolidona con enlaces cruzados, agar, ácido algínico, o una de sus sales, tal como alginato de sodio.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar en forma oral incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina, así como también cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener ingredientes activos mezclados con un agente de relleno o de unión, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, en forma opcional, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquidos o polietilénglicol líquido con o sin estabilizadores. Los núcleos de grageas se pueden usar junto con revestimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden comprender goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Las tinturas o pigmentos se pueden agregar a los revestimientos de las tabletas o grageas para identificación del producto o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, dosificación.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Además, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones oleosas apropiadas para inyección. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintético, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Los polímeros amino policatiónicos no lipídicos también se pueden usar para suministro. En forma opcional, la suspensión también puede contener estabilizadores o activos adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para administración tópica o nasal, agentes apropiados de penetración de la barrera particular por ser permeada se usan en esta formulación. Dichos agentes de penetración son, en general, conocidos en el arte.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de manera conocida en el arte, por ejemplo, por medio procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, entrampamiento o liofilización. La composición farmacéutica puede estar provista como una sal y se puede formar con muchos ácidos que incluyen, mas no se limitan a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros solventes protónicos que son las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquier de los siguientes, o todos: 1-50 mM de histidina, 0,1%-2% de sucrosa y 2-7% de manitol, a un rango de pH de 4,5 a 5,5, que está combinado con tampón antes del uso. Después de que las composiciones farmacéuticas se hayan preparado, pueden ser colocadas en un contenedor apropiado y rotuladas para tratamiento de una condición indicada. Para la administración de una composición de la invención, dicha rotulación debería incluir cantidad, frecuencia y método de administración.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para alcanzar el propósito destinado. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente en ensayos celulares, por ejemplo, en células microbianas o, en particular, en células metanógenas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos, o en especies rumiantes tales como ovejas, ganado, ciervos y cabras. El modelo animal también se puede usar para determinar el rango de concentración y vía de administración apropiados. Dicha información se puede usar luego para determinar las dosis y vías de administración útiles. Las cantidades de dosificación normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La orientación en cuanto a las dosificaciones y métodos de suministro particulares está provista en las publicaciones y por lo general está disponible a las personas de conocimiento en el arte. Los expertos en la técnica emplean diferentes formulaciones para los polinucleótidos que para los polipéptidos. En forma similar, el suministro de péptidos o polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos será específico a células, condiciones, ubicaciones particulares, etc.

La dosificación exacta será determinada por el médico, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para brindar niveles suficientes del agente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la severidad del estado de la enfermedad, salud general del sujeto, edad, peso y género, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación o combinaciones de droga, sensibilidad por reacción y tolerancia/respuesta a terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga actuación se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la tasa de vida media y eliminación de la formulación particular. Las composiciones se pueden coadministrar con uno o más agentes antimicrobianos adicionales, que incluyen compuestos antimetanogénesis (por ejemplo, ácido bromoetansulfónico), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos antimicrobianos y otros antibióticos como se describe en detalle en la presente. La coadministración puede ser simultánea o secuencial, o puede alternarse con administración repetida.

Son particularmente útiles para las composiciones de la invención (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) los mecanismos o fórmulas de liberación lenta. Por ejemplo, los dispositivos intrarruminales incluyen, mas no se limitan a, rango Time Capsule Bolus® por Agri-Feeds Ltd., Nueva Zelanda, originalmente desarrollado en Ag Research Ltd., Nueva Zelanda, como se revela en WO 95/19763 y NZ 278977, y CAPTEC por Nufarm Health & Sciences, una división de Nufarm Ltd., Auckland, Nueva Zelanda, como se revela en AU 35908178, PCT/AU81/100082, y Laby y otros, 1984, Can. J. Anim. Sci. 64 (Suppl.), 337-8, que se incorporan a modo de referencia en la presente. Como un ejemplo particular, el dispositivo puede incluir un resorte y émbolo que fuerza la composición contra un orificio en el extremo de un barril.

Como modalidad adicional, la invención se relaciona con una composición para suplemento de agua, por ejemplo, composición embebedora, o suplemento alimenticio, por ejemplo, componente alimenticio para rumiante, para uso con cualquiera de los métodos discutidos con anterioridad. En aspectos particulares, el suplemento alimenticio comprende al menos un material vegetal que es comestible, y un péptido o polipéptido de la invención. En forma alternativa, el suplemento alimenticio comprende al menos un material vegetal que es comestible, y un polipéptido o péptido, o un polinucleótido que codifica un péptido o polipéptido revelado en la presente, por ejemplo, como un vector de expresión o célula huésped que comprende el vector de expresión. En particular, la composición además incluye un inhibidor celular, fusionado o enlazado a la secuencia resultante. el material vegetal preferido incluye cualquiera de heno, césped, grano, o harina, por ejemplo, heno leguminoso, pasto, silaje de maíz, silaje de pasto, silaje de legumbres, granos de maíz, avena, cebada, granos de destiladores, granos cerveceros, harina de soja y harina de semilla de algodón. En particular, el silaje de pasto es útil como composición de alimento para rumiantes. El material vegetal puede ser genéticamente modificado para contener uno o más componentes de la invención, por ejemplo, uno o más polipéptidos o péptidos, polinucleótidos o vectores.

En otra modalidad, los anticuerpos que fijan los péptidos, polipéptidos, o polinucleótidos de la invención en forma específica se pueden usar para determinar la presencia de microbios, especialmente metanógenos, o en ensayos para monitorear los niveles de dichos microbios. Los anticuerpos útiles para propósitos de diagnóstico se pueden preparar de la misma manera que los descritos con anterioridad. Los ensayos de diagnóstico incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar un péptido o polipéptido en fluidos del cuerpo humano o extractos de células o tejidos. Los anticuerpos se pueden usar con o sin modificación, y se pueden marcar al unirlos, ya sea en forma covalente o no covalente, con una molécula informante. Una gran variedad de moléculas informantes que se conocen en el arte se pueden usar, varias de las cuales se describieron con antelación.

Una variedad de protocolos para medir los niveles de un péptido, polipéptido o polinucleótido se conocen en el arte (por ejemplo, ELISA, RIA y FACS), y brindan una base para el diagnóstico de presencia o niveles de un microbio, especialmente un metanógeno. Los niveles estándares o normales establecidos al combinar fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, por ejemplo, humanos o rumiantes normales, con el anticuerpo bajo condiciones adecuadas para formación de complejos. La cantidad de formación de complejos estándar puede ser establecida mediante varios métodos, pero preferentemente por medios fotométricos. Las cantidades del péptido, polipéptido o polinucleótido expresado en un sujeto, control y muestras tratadas (por ejemplo, muestras de sujetos vacunados) se comparan con los valores estándares. La desviación entre valores de sujeto y estándares establece los parámetros para determinar la presencia o niveles del microbio.

En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos se pueden usar para propósitos de diagnóstico usando técnicas de hibridación y/o amplificación. Los polinucleótidos se pueden usar para incluir oligonucleótidos, moléculas complementarias de ARN y ADN y PNA. Los polinucleótidos se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión génica en muestras en las que la expresión puede correlacionarse con la presencia o niveles de un microbio. El ensayo de diagnóstico se puede usar para distinguir entre la ausencia, presencia y alteración de niveles de microbios y para monitorear niveles durante intervención terapéutica.

En un aspecto, la hibridación con sondas de PCR se puede usar para identificar secuencias de ácido nucleico, especialmente secuencias genómicas, que codifican los péptidos o polipéptidos de la invención. La especificidad de la sonda, ya sea que esté hecha de una región altamente específica, por ejemplo, 10 nucleótidos únicos en la región regulatoria 5', o una región menos específica, por ejemplo, en la región codificadora 3' y la rigurosidad de la hibridación o amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinará si la sonda identifica sólo las secuencias de ocurrencia natural, alelos o secuencias relacionadas. Las sondas también se pueden usar para la detección de secuencias relacionadas y deberían contener preferentemente al menos 50% de los nucleótidos de cualquiera de las secuencias codificadoras. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser ADN o ARN y derivar de la secuencia de nucleótidos de las SEC ID No:703-1395, o complementos, o secuencias modificadas de las mismas, o de secuencias genómicas, que incluyen elementos promotores y reforzadores de la secuencia de ocurrencia natural.

Los medios para producir sondas de hibridación específicas para ADNs incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico en vectores para la producción de sondas de mARN. Dichos vectores son conocidos en el arte, están comercialmente disponibles y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de ARN polimerasas apropiadas y los nucleótidos marcados apropiados. Las sondas de hibridación se pueden marcar mediante una variedad de grupos informantes, por ejemplo, radionúclidos tales como 32P o 35S, o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda por sistemas de acoplamiento avidina/biotina y similares. Los polinucleótidos se pueden usar en Southern o Northern dot blot, u otras tecnologías basadas en membrana; en tecnologías de PCR; o en varilla medidora, pines, ensayos ELISA, o microensayos que usan fluidos o tejidos de biopsias del sujeto para detectar la presencia o niveles de un microbio. Dichos métodos cualitativos o cuantitativos son conocidos en el arte.

En un aspecto particular, las secuencias de ácido nucleico pueden ser útiles en varios ensayos marcados por métodos estándares, y agregadas a un fluido o tejido de muestra de un sujeto bajo condiciones adecuadas para hibridación y/o amplificación. Después de un período adecuado de incubación, la muestra se lava y la señal se cuantifica y compara con un valor estándar. Si la cantidad de señal en la muestra de evaluación se altera en forma significativa con respecto a la de la muestra de control comparable, la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos en la muestra indica la presencia o niveles de los microbios. Dichos ensayos también se pueden usar para evaluar la eficacia de un régimen de vacunación particular en estudios de animales, en pruebas clínicas o en monitoreos del tratamiento de un sujeto.

Para brindar una base para el diagnóstico de la presencia o niveles de un microbio, se establece un perfil normal o estándar para expresión. Esto se puede lograr combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, con un polinucleótido o un fragmento del mismo, bajo condiciones adecuadas para hibridación y/o amplificación. Los niveles estándares se pueden cuantificar comparando los valores obtenidos de sujetos normales con los de un experimento donde se usa una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores estándares obtenidos de muestras normales se puede comparar con valores obtenidos de muestras de sujetos tratados por crecimiento microbiano. La desviación entre valores estándares y del sujeto se utilizan para establecer la presencia o niveles del microbio.

Una vez que el microbio se identifica, y se inicia un protocolo de vacunación, los ensayos de hibridación y/o amplificación se pueden repetir sobre una base regular para evaluar si el nivel de expresión en el sujeto comienza a reducirse con respecto al observado en el sujeto normal. Los resultados obtenidos de los ensayos sucesivos se pueden usar para mostrar la eficacia de vacunación en un período que oscila entre varios días y meses.

Los usos particulares del diagnóstico para oligonucleótidos diseñado de las secuencias de ácido nucleico pueden implicar el uso de PCR. Dichos oligómeros pueden ser químicamente sintetizados, generados enzimáticamente o producidos in vitro. Los oligómeros consisten preferentemente de dos secuencias de nucleótidos, una con orientación sentido (5'.fwdarw.3') y otra con la orientación antisentido (3'.fwdarw.5'), empleadas bajo condiciones optimizadas para la identificación de un gen o condición específica. Los mismos dos oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o hasta un grupo degenerado de oligómeros se pueden emplear bajo condiciones estrictas para detección y/o cuantificación de secuencias de ADN o ARN íntimamente relacionadas.

Los métodos que también se pueden usar para cuantificar la expresión incluyen radiomarcación o biotinilación de nucleótidos, coamplificación de un ácido nucleico de control y curvas estándares en las cuales los resultados experimentales están interpolados (Melby, P. C. y otros (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. y otros (1993) Anal. Biochem. 229-236). La velocidad de cuantificación de múltiples muestras se puede acelerar realizando el ensayo en formato ELISA donde el oligómero de interés se presenta en varias diluciones y una respuesta espectrofotométrica o colorimétrica brinda rápida cuantificación.

En otras modalidades, los oligonucleótidos o fragmentos más largos derivados de cualquiera de los polinucleótidos como se describen en la presente se pueden usar como blancos en un microensayo. El microensayo se puede usar para monitorear el nivel de expresión de grandes números de genes en forma simultánea (para producir una imagen transcripta), y para identificar variantes, mutaciones y polimorfismos genéticos. Esta información se puede usar para determinar la función génica, para entender la base genética de la enfermedad, para diagnosticar la enfermedad, y para desarrollar y monitorear las actividades de los agentes terapéuticos. En una modalidad, el microensayo se prepara y utiliza de acuerdo con los métodos conocidos en el arte tales como los descritos en la solicitud PCT WO95/11995 (Chee y otros), Lockhart, D. J. y otros (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) y Schena, M. y otros (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619).

En un aspecto, los oligonucleótidos se pueden sintetizar sobre la superficie del microensayo usando un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta, tales como los descritos en la solicitud PCT WO 95/251116 (Baldeschweiler y otros). En otro aspecto, una disposición "cuadriculada" análoga a un dot o slot blot (aparato HYBRIDOT, Life Technologies) se puede usar para disponer y enlazar oligonucleótidos o fragmentos de cADN a la superficie de un sustrato usando procedimientos de enlace químico o mecánico, UV, térmico, o sistema de vacío. En otro aspecto más, una disposición se puede realizar a mano o usando dispositivo, materiales y maquinas disponibles (incluyendo pipetores multicanal o instrumentos robóticos; Brinkmann, Westbury, N.Y.) y pueden incluir, por ejemplo, 24, 48, 96, 384, 1024, 1536, o 6144 manchas o pocillos (por ejemplo, como una placa multipocillo), o más, o cualquier otra forma múltiple de 2 a 1.000.000 que se presta al uso eficiente de instrumentación comercialmente disponible.

A fin de realizar análisis de muestras usando las microdisposiciones, los polinucleótidos se extraen de una muestra biológica. Las muestras biológicas se pueden obtener a partir de cualquier fluido corporal (sangre, orina, saliva, flema, jugos gástricos, etc.), células cultivadas, biopsias, u otras preparaciones de tejidos. Para producir sondas, los polinucleótidos extraídos de la muestra se usan para producir secuencias de ácido nucleico que son complementarias a los ácidos nucleicos en la micro-disposición. Si la micro-disposición consiste en cADN, los ARN antisentido son sondas apropiadas. Por consiguiente, en un aspecto, se usa mARN para producir cADN que, a su vez, y en presencia de nucleótidos fluorescentes, se usa para producir fragmentos o sondas de ARN antisentido. Estas sondas marcadas en forma fluorescente se incuban con la microdisposición para que las secuencias de sondas se hibriden a los oligonucleótidos de cADN de la microdisposición. En otro aspecto, las secuencias de ácido nucleico usadas como sondas pueden incluir polinucleótidos, fragmentos y secuencias complementarias o antisentido producidas usando enzimas de restricción, tecnologías PCR y equipos de oligomarcación (Amersham Pharmacia Biotech) conocidos en el campo de la tecnología de hibridación.

En otra modalidad de la invención, los péptidos o polipéptidos de la invención o fragmentos u oligopéptidos funcionales o inmunogénicos de los mismos, se pueden usar para análisis de detección de bibliotecas de compuestos en cualquier variedad de técnicas de identificación de drogas. El fragmento empleado en dicho análisis de detección puede estar libre en solución, unido a un soporte sólido, ajustado a una superficie celular o localizado intracelularmente. La formación de complejos de fijación, entre el péptido o polipéptido y el agente que se evalúa, puede ser medida.

Una técnica para detección de drogas que se puede usar brinda una detección de funcionamiento alta de los compuestos que tienen afinidad de fijación adecuada al péptido o polipéptido de interés como se describe en la solicitud publicada PCT WO84/03564. En este método, grandes números de diferentes compuestos de evaluación pequeños se sintetizan sobre un substrato sólido, tales como pines de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de evaluación se hacen reaccionar con el péptido o polipéptido, o fragmentos de los mismos, y se lavan. El péptido o polipéptido fijado luego se detecta por métodos que se conocen en el arte. El péptido o polipéptido purificado también se pueden revestir directamente sobre placas para uso en las técnicas de análisis de detección de drogas que anteceden. En forma alternativa, los anticuerpos no neutralizadores se pueden usar para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.

En otra técnica, se puede usar ensayos de detección de droga competitiva en los cuales los anticuerpos de neutralización capaces de fijar el péptido o polipéptido en forma específica compiten con un compuesto de evaluación para fijarse al péptido o polipéptido. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de un compuesto de evaluación que comparte uno o más sitios de fijación de antígeno con el anticuerpo.

Ejemplos

Los ejemplos como se describen en la presente son a fines de ilustración de las modalidades de la invención. Otras modalidades, métodos y tipos de análisis están dentro del alcance del conocimiento de las personas versadas en el arte del diagnóstico molecular y no necesitan describirse en detalle en la presente. Otras modalidades dentro del alcance del arte se consideran parte de esta invención.

Ejemplo 1: Estimación del tamaño del genoma

Se cultivó Methanobrevibacter ruminantium, cepa M1T (DSM1093), en medio BY+ (medio basal, Joblin y otros, 1990) que consiste en [g/l] NaCl (1), KH2PO4 (0,5), (NH4)2SO4 (0,25), CaCl2.2H2O (0,13), MgSO4.7H2O (0,2), K2HPO4 (1), fluido aclarado del rumen (300 ml) dH2O (360 ml), NaHCO3 (5), resazurina (0,2 ml) L-cisteína-HCl (0,5), extracto de levadura (2), y solución de oligoelementos de Balch (10 ml) (oligoelementos agregados; Balch y otros, 1979) que consiste en (g/l) ácido nitrilotriacético (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4.H2O (0,5), NaCl (1), FeSO4.7H2O (0,1), CoCl2.6H2O (0,1), CaCl2.2H2O (0,1), ZnSO4.7H2O (0,1), CuSO4.5H2O (0,01), AlK(SO4)2.12H2O (0,01), H3BO3 (0,01), Na2MoO4.2H2O (0,01), NiSO4.6H2O (0,03), Na2SeO3 (0,02), y Na2WO4.2H2O (0,02). El ADN genómico se extrajo congelando pellets celulares bajo N2 líquido y molido mediante mano y mortero esterilizado pre-congelado. Los homogenatos celulares se embebieron en bloques de agarosa y se llevaron a cabo manipulaciones subsiguientes en los bloques para que el hecho de compartir físicamente el ADN genómico sea reducido. Las digestiones se realizaron con endonucleasas de restricción y los fragmentos de ADN se separaron usando electroforesis en gel de campo pulsado o PFGE (del inglés, pulsed-field gel electrophoresis).

Ejemplo 2: secuenciación y clonación de ADN

El ADN del genoma M. ruminantium fue secuenciado por Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA) usando un enfoque de clonación aleatoria shotgun (Fleischmann y otros, 1995) y por Macrogen Corporation (Rockville, MD, USA) usando pirosecuenciación. En forma breve, las bibliotecas de AND de M. ruminantium fueron construidas en Escherichia coli mediante interrupción física aleatoria de AND genómico y separación de fragmentos por electroforesis en gel. Los fragmentos grandes en el rango de 40 Kb se retiraron del gel y se usaron para generar una biblioteca fósmida de insertos grandes. Un de fragmento de ADN en el rango de 2 a 4 Kb fue recuperado y usado para generar una biblioteca plásmido de insertos pequeños. Los clones generados de ambas bibliotecas de insertos grandes y pequeños se cultivaron, y su ADN fósmido o plásmido se recuperó y secuenció usando tecnología de secuenciación de alto funcionamiento. Un número suficiente de clones fueron secuenciados para brindar una cobertura teórica de 8 replicaciones del genoma M. ruminantium. La cobertura de secuencia adicional se obtuvo por piro­ secuenciación de fragmentos de ADN genómico compartido aleatoriamente (Macrogen Corporation) a una cobertura teórica final del genoma de aproximadamente 10 replicaciones.

Ejemplo 3: Anotación y ensamblado de secuencia

Las secuencias ADN se alinearon para encontrar superpociones de secuencias y ensamblarlas en secuencias contiguas (contig) usando Paracel Genoma Assembler® (Paracel Inc, CA, USA) y el equipo de Staden (Staden y otros, 1998) en combinación con la secuencia de PCRs tantos estándares como inversas. Las contigs se analizaron por localizador de marco abierto de lectura (ORF) GLIMMER (del inglés, Gene Locator Interpolated Markov Model Er , Delcher y otros, 1999) y cada ORF se analizó por BLAST espaciado (del inglés, Basic Local Alignment Search Tool (Altschul y otros, 1997) con respecto a la base de datos de proteínas y nucleótidos no redundantes del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Las contigs de la secuencia de fase de 8 replicaciones se unieron al azar por enlace artificial de las secuencias para generar “pseudomolécula” y se depositaron en el Institute for Genomic Research (TIGR, DC, USA) para autoanotación. Las contigs ensambladas de la piro-secuenciación de 10 replicaciones que se volvieron a analizar usando GLIMMER y ORFs fueron auto-anotadas usando GAMOLA (del inglés, Global Annotation of Multiplexed On-site Blasted ADN sequences; Altermann y Klaenhammer, 2003). Las anotaciones automatizadas fueron posteriormente verificadas manualmente. Los ORFs fueron categorizados por función usando la base de datos de los grupos de proteínas ortólogas o COG (del inglés, clusters of orthologous proteins) (umbral 1e-02) (Tatusov y otros, 2001).

Los motivos proteicos fueron determinados por HMMER (protocolo de transferencia de hipertexto://hmmer.wustl.edu) usando bibliotecas PFAM HMM y TIGRFAM, con alineamiento global y local (protocolo de transferencia de hipertexto://pfam.wustl.edu) y modelos estándares y de modo de fragmento TIGRFAM HMMs (protocolo de transferencia de hipertexto://world wide web.tigr.org/TIGRFAMs) respectivamente (umbral 1e-02). Se identificaron tARNs usando TARNSCAN-SE (Lowe y Eddy, 1997) y se identificaron repeticiones de nucleótido usando el programa de computación KODON (Applied Maths, Austin, Tx , USA) y REPUTER (Kurtz y Schleiermacher, 1999). Las visualizaciones de los atlas genómicos se construyeron usando GENEWIZ (Jensen y otros, 1999). Las reconstrucciones de la vía de los ORF de M. ruminantium se llevaron a cabo junto con la base de datos en línea de la KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas, Kanehisa y otros, 2004) usando programas de computación domésticos (PathwayVoyager; Altermann y Klaenhammer, 2005).

Ejemplo 4: Análisis y resultados de secuenciación

La estimación del tamaño del genoma M. ruminantium por digestión de enzima de restricción de ADN genómico y medición del tamaño de los fragmentos vía PFGE, indicaron un cromosoma único de aproximadamente 2,5-2,9 Mb. La secuenciación inicial de clones de insertos grandes y pequeños (cobertura básica de 6 replicaciones) y ensamblado de la secuencia en contigs indicaron que una región de 40 Kb del genoma fue altamente superrepresentado (>20 replicaciones), particularmente dentro de la biblioteca de insertos pequeños. Esto posiblemente se debió a un plásmido de número de copia alto (aunque no ha sido identificado ADNs extracromosomales) o un bacteriófago lisogénico que se había replicado durante el crecimiento del cultivo usado para extracción de ADN. A causa de esta gran disposición de la secuencia, se llevó a cabo secuenciación adicional (cobertura teórica del genoma de 2 replicaciones) para solamente los clones de inserto grande que formaron una cobertura final de 8 replicaciones de secuenciación Sanger.

La secuencia primaria de 8 replicaciones se ensambló en 756 contigs que se ligaron por medio de 105 andamiajes. La pirosecuenciación adicional se llevó a cabo a una cobertura adicional de ~10 replicaciones y la incorporación de estas secuencias en el ensamblado hizo que el número de contig cayera a 27. Los cierres de espacios posteriores usando técnicas de PCR de rango largo e inverso redujeron el número de contig a 14.

La longitud combinada de la secuencia de 14-contig indica que el genoma es levemente mayor (2.920.443 bp) que el tamaño estimado por PFGE (FIG. 1A) y significativamente mayor que su pariente más cercano, M. smithii (1,9 Mb). El % G+C de 32,7 es cercano al rango informado de 27,5% a 31,6% para cepas de M. ruminantium (Balch y otros, 1979). El análisis de la secuencia predice 2672 ORF y el número total de hits con respecto a familias de proteínas (TIGRFam y PFam) y conjuntos de grupos ortólogos o c Og (del inglés Clusters Orthologous Groups) se informan en la FIG. 1 B. Todos los genes destinados a ser implicados en metanogénesis deH2 CO2 y formato están presentes (FIG. 1C; y FIGS. 6A-6C). No obstante, la secuencia primaria de M. ruminantium carece de un sistema de metil coenzima reductasa II (mcr II o mrt). En otros metanógenos, el grupo mcr II codifica una isoenzima de la enzima metil CoM reductasa I que se regular en forma ascendente durante el crecimiento a presiones parciales altas de H2 (Reeve y otros, 1997). H2 se usa rápidamente en el rumen y no se acumula a altos niveles, de manera que M. ruminantium parece adaptarse para usar bajo niveles de H2 via el sistema mcr I solamente.

La comparación del genoma M. ruminantium primario con el M. smithii y Mt. thermoautotrophicus íntimamente relacionado revela varias regiones de diferencia. Algunas de las diferencias génicas codifican proteínas de superficie muy grande de una familia de proteínas grande rica en asparagina/treonina que pueden contener secuencias de repetición de CPOMP y DUF11 (del inglés, chlamydial polymorphic outer membrane proteins, and domain of unknown function, respectivamente) que posiblemente medien interacciones con superficies u otros microorganismos en el medio ambiente del rumen (ver FIGS. 7A-7C). Las secuencias de repetición similares también se encuentran en proteínas de superficie grande codificadas en los genomas de Ms. stadtmanae y M. smithii (Samuel y otros, 2007). Se ha informado anteriormente que M. ruminantium produce una cápsula (Smith y Hungate, 1958) y el análisis de secuencia muestra que codifica más de 50 genes (glicosil transferasas (GT), otras transferasas, epimerasas y transportadores) implicados en la síntesis y exportación de exopolisacáridos que confirman que viste su superficie con polisacáridos (véase, FIGS. 8A-8C). M. ruminantium tiene al menos 30 glicosiltransferasas (6 GT1, 21 g T2, 2 GT4 y 1 GT66; ver FIGS. 8A-8C) comparada con las 28 en M. smithii (1 GT1; 22 GT2; 4 GT4 y 1 GT66) y 41 en M. stadtmanae (2 GT1; 26 GT2; 12 GT4 y 1 g T66) (Samuel y otros, 2007; Fricke y otros, 2006; Coutinho y Henrissat, 1999). Este es un número relativamente grande de genes dedicados a codificar los polisacáridos de la superficie por estos organismos y sugiere que es un factor importante para la supervivencia en ambientes gastrointestinales.

El análisis de repetición de nucleótidos reveló la presencia de al menos dos regiones de repetición directas intraesparcidas por espaciador o SPIDR (del inglés, Spacer Interspersed Direct Repeats) en el genoma de M. ruminantium. Los SPIDRs son repeticiones del nucleótido (usualmente menos de 40 nt) realizadas a partir de unidades idénticas separadas por secuencias heterólogas y se caracterizaron primero en procariontes (Jansen y otros, 2002). La SPIDR de M. ruminantium I tiene un arreglo genético único que consiste de dos estructuras de repeticiones idénticas que flanquean una región de 17 kb rodeando un grupo de cas-genes asociados. Se han encontrado estructuras de repeticiones similares en varios genomas de metanógeno. Methanocaldococcus jannaschii contiene 18 copias de un elemento nucleótido repetitivo multicopia (Bult y otros, 1996) que consiste de un segmento de repetición largo (391­ 425 bp) seguido de 25 segmentos de repetición cortos (27-28 bp) que se separan a sí mismos por 31 a 51 bp de secuencia única. El genoma de Ms. stadtmanae contiene una región de 4,8 Kb en la cual un elemento de 30 bp se repite 59 veces (Fricke y otros, 2006). Mt. thermoautotrophicus contiene dos repeticiones extendidas (3,6 y 8,6 kb en tamaño) que contienen una secuencia de repetición de 372 bp, seguida de 47 y 124 copias de la misma secuencia de repetición de 30 bp separada por secuencias únicas de 34 a 38 bp en longitud (Smith y otros, 1997). La función biológica de estos SPIDRs es desconocida, aunque una hipótesis actual especula que este sistema es un análogo funcional de los sistema de ARN de interferencia de eucariótica pequeña y representa un sistema de defensa contra replicones foráneos que funciona sobre el principio de ARN antisentido (Jansen y otros, 2002; Haft y otros, 2005; Godde y Bickerton, 2006; Makarova y otros, 2006).

El genoma de M. ruminantium también codifica un gran número de ORFs destinados a codificar proteínas con dominios de extensión en membrana, que consecuentemente se espera que contengan regiones que están expuestas sobre la superficie celular (FIGS. 9A, 9b y 9C).

Ejemplo 5: Producción y evaluación de anticuerpos

Preparación de paredes celulares de M. ruminantium: las paredes celulares de M. ruminantium fueron preparadas congelando pellets celulares bajo N2 líquido y moliendo a través del uso de mano y mortero esterilizado precongelado. Las células finamente molidas fueron resuspendidas en tampón de tripsina-fosfato (40 mg de tripsina/200 ml de 0,1 M de tampón fosfato, pH 7,9) e incubadas a 37 °C durante 2 horas. La preparación luego se centrifugó a 48,000 g durante 30 minutos a 4 °C, y el pellet resultante se lavó dos veces con H2O destilada estéril y se secó por congelamiento.

Producción de anticuerpos: nueve secuencias de péptidos que fueron destinadas a localizarse en forma externa a la célula fueron identificadas de la secuencia del genoma de M. ruminantium y seleccionadas como antígenos potenciales. Cinco miligramos de cada uno de esos péptidos fueron sintetizados (Invitrogen) y su pureza se chequeó por espectroscopia en masa. Los péptidos y sus secuencias codificadoras se muestran en la FIG. 4. El ácido nucleico y secuencias de aminoácidos completos se muestran en la FIG. 5. Dos miligramos de cada péptido permanecieron sin conjugarse para ELISA y 3 mg fue conjugado a hemocianina de lapa (KLH) para inmunización del animal.

El programa de vacunación se resume en la FIG. 2 y se procede como sigue. Cada inmunización usó una oveja (1-3 años de vida) que se presangró para obtener 2-5 ml de suero preinmune el día 0. A esto le siguieron inyecciones intradérmicas (ID) primarias de 200 Dg de péptido conjugado en adyuvante completo de Freund o CFA (del inglés, Complete Freund's Adjuvant) a 10-15 sitios el día 0. Las inyecciones intradérmicas (ID) de 200 Dg del KLH-péptido en adyuvante incompleto de Freund o IFA (del inglés, Incomplete Freund's Adjuvant) a 10-15 sitios se realizaron el día 14 y 200 Dg de KLH-péptido en CFA a 10-15 sitios el día 28. Cinco inyecciones intradérmicas (ID) adicionales de 200 Dg de KLH-péptido en IFA a 10-15 sitios se realizaron los días 56, 70, 84, 98 y 112. Cuatro sangrados para evaluación (2-5 ml) se realizaron los días 42, 56, 84 y 112. Un sangrado de producción que arrojó aproximadamente 1.000 ml de antisuero se realizó al final del protocolo estándar.

El título del anticuerpo se determinó con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima o ELISA con péptido-GGG (goat gamma globulin o gammaglobulina de cabra) fijado en fase sólida (0,1 pg/100 pl/pocillo) en placas de 96 pocillos de alta fijación. El suero se diluyó primero 50 veces y luego se volvió a diluir en diluciones de series de 2. El título de ELISA se calculó como el factor de dilución estimado que generó OD a 405 nm de 0,2 y derivó de análisis de regresión no lineal de la curva de dilución en serie. La detección se obtuvo usando un anticuerpo secundario conjugado de HRP y substrato de ABTS.

Las respuestas del anticuerpo de oveja a vacunación se ilustran en la FIG. 3. Todo el suero de la oveja tuvo títulos a 6 semanas que fueron al menos 32 veces mayores que la preimmunización (1:1600). La preparación mas antigénica fue la de péptido mtrD que tuvo un título 1024 veces mayor que el nivel de pre-inmunización. Las preparaciones menos inmunogénicas fueron el péptido mtrE, péptidos de proteína de superficie de ORF508 y ORF819. La preparación de la pared celular de M. ruminantium indujo una respuesta buena a anticuerpo (256 veces superior que los niveles pre-inmunes) pero esto no se sostuvo más de 15 semanas a pesar de los varios refuerzos.

Fijación del anticuerpo a células M. ruminantium: se usó un ensayo ELISA para medir la fijación del anticuerpo a células M. ruminantium como sigue. Las placas para ELISA de MaxiSorp (Nunc) fueron revestidas con células totales de M. ruminantium (40 pl de células en 2 ml de tampón de carbonato sódico) y con fracciones de proteína citosólica de M. ruminantium. Las muestras de suero fueron diluidas 1/20 (25 pl en 475 pl de diluyente) en PBS Tween 20 con un contenido de 1% p/v de caseína e incubadas e temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó 6 veces con PBS Tween 20. Se incluyó un suero de control negativo, obtenido de una oveja que no había recibido calostro al nacer. Para la detección, el conjugado usado fue asno anti oveja/cabra IgG HRP (Lote 061005 Star 88P por Serotec) y 50 pl de una dilución 1/5000 (2 pl en 10 ml de diluyente) se agregó a cada pocillo. El substrato de 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB) fue luego agregado (50 pl/pocillo) y la reacción fue incubada a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Luego se agregó solución de detención (0,05 M de H2SO4, 50 pl/pocillo) y la placa se leyó a 450 nm.

Evaluación de inhibición de crecimiento de M. ruminantium: las muestras de suero inmune se descongeladas en la cubierta anaeróbica, y 0,1 ml de cada una de las 10 muestras se colocó en un tubo microcentrífugo de 1,5 ml. La mezcla (1 ml) se incubó a temperatura ambiente con la tapa abierta en la cubierta anaeróbica toda la noche para extraer cualquier oxígeno disuelto. El suero pre-inmune sirvió como control negativo. La muestra de suero combinada (0,3 ml) fue agregada en 5 ml de cultivo de M. ruminantium en tubos Hungate por triplicado en la cubierta anaeróbica. Se bombeó has (80% de H2 y 20% de CO2) en los tubos Hungate y los cultivos se incubaron a 39°C en un agitador (100 rpm). El crecimiento de metanógenos se monitoreó para medir OD a 600 nm con un espectrofotómetro y por determinación de cromatógrafo de gas de uso de hidrógeno y producción de metano.

Los ensayos ELISA mostraron que los anticuerpos generados de cada uno de los antígenos fijados a células M. ruminantium se ajustaron a placas de microtítulos. Se mostró que los anticuerpos se fijan a células M. ruminantium in vitro, aunque las preparaciones de anticuerpo individuales agregadas a cultivos de M. ruminantium no inhibieron el crecimiento de metanógenos o redujeron la cantidad de metano formado. No obstante, una preparación que consistía en muestras agrupadas de antisuero de cada uno de los 10 diferentes antígenos pareció incrementar la agregación celular cuando se agregó a cultivos de M. ruminantium.

Ejemplo 6: Panorama general

Se eligió Methanobrevibacter ruminantium para secuenciación genómica a causa de su prevalencia en el rumen bajo una variedad de condiciones dietarias (basadas en datos de detección molecular y cultivo), la disponibilidad de los cultivos, su disponibilidad a crecimiento rutinario en laboratorio y la cantidad relativamente grande de estudios previos y publicaciones antecedentes disponibles para este organismo. Un número significativo de los genes en M. ruminantium ha sido asignado con una función y ha, por consiguiente, permitido una imagen detallada del estilo de vida del organismo en el rumen. La dependencia de M. ruminantium sobre substratos simples (H2 CO2, formato) y su interacción con el medio ambiente del rumen a través de proteínas y exopolisacáridos de superficie son importantes blancos para inhibición. En forma similar, se promete a través de SPIDRs de dirección específica de M. ruminantium y manipulaciones genéticas futuras que ayuden a determinar la función genética. Los datos de las secuencias evidencian el metabolismo de este organismo y cómo interactúa con otros microbios, y apunta a sistemas y componentes conservados entre los metanógenos que pueden ser inactivados para evitar o reducir la formación de metano en el rumen.

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Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la memoria descriptiva que antecede se incorporan en la presente a modo de referencia. Cuando se hace referencia en la presente descripción a números enteros que tienen equivalentes conocidos de los mismos, esos equivalentes están incorporados en la presente como si estuvieran individualmente estipulados. Aunque la invención ha sido descrita en relación con modalidades preferentes específicas, deberá entenderse que la invención tal como se reivindica no debería estar indebidamente limitada a dichas modalidades específicas. Se advierte que se puede realizar otras modificaciones a la invención como se describe en la presente sin alejarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado de SEC ID No:641, o un polipéptido o fragmento de SEC ID No:641 que comparte al menos el 90 % de identidad de secuencia con al menos 10 aminoácidos contiguos de SEC ID No:641 y un adyuvante.

2. Una composición de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es una molécula conjugada o de fusión.

3. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para el uso en la vacunación de un rumiante contra Methanobrevibacter ruminantium.

4. Una composición de vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque el rumiante se selecciona del grupo que consiste en ganado, ovejas, cabras, búfalo, alce, antílope, caribú y ciervo.