CN102015755A - 用于抑制微生物细胞的疫苗和疫苗组分 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖用于产生抗体的来自微生物细胞的组分，包括肽、包含这些肽的多肽，编码这些肽或多肽的多核苷酸，以及针对这些肽、多肽或多核苷酸的抗体。本发明还涉及用于产生这些肽、多肽、多核苷酸和抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还涵盖使用一种或多种公开的肽、多肽、多核苷酸、抗体、表达载体和宿主细胞检测、靶向和抑制微生物细胞，尤其是产甲烷菌细胞的方法和组合物，尤其是疫苗组合物。

Description

用于抑制微生物细胞的疫苗和疫苗组分
相关申请
本申请要求2007年9月25日提交的美国申请号60/975,104，2007年9月22日提交的美国申请号60/989,840和2007年11月22日提交的美国申请号60/989,841的优先权，将上述所有的内容整体纳入本文作参考。
技术领域
本发明涉及用于产生抗体的来自微生物细胞的组分，包括肽、包含这些肽的多肽，编码这些肽或多肽的多核苷酸，以及针对这些肽、多肽或多核苷酸的抗体。本发明还涉及用于产生这些肽、多肽、多核苷酸和抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及使用一种或多种公开的肽、多肽、多核苷酸、抗体、表达载体和宿主细胞检测、靶向和抑制微生物细胞，尤其是产甲烷菌细胞的方法和组合物，尤其是疫苗组合物。
发明背景
在新西兰，农业活动是温室气体排放的主要来源。因此，减少农业温室气体排放对于新西兰完成京都议定书的义务是重要的。议定书要求在首次承诺期(2008-2012)结束前温室气体减排至1990年水平。为此，农业部门和新西兰政府成立了田园温室气体研究联合会(PGGRC)寻求降低新西兰的农业温室气体排放的方法。
PGGRC活动的一个重要部分是研究减少来自新西兰放牧反刍动物的甲烷排放量。出于两个原因，减少反刍动物甲烷排放量具有商业利益。首先，不履行京都议定书承诺将迫使政府购买碳排放额度。目前预计该项将花费三亿五千万美金。第二，甲烷的产生导致瘤胃中产生的总能量损耗8-12％。可利用这种能量来提高反刍动物的生产性能。
甲烷在瘤胃中由称为产甲烷菌的微生物产生，这种微生物属于古细菌(Archaea)界广古菌门(euryarchaeota)的一部分。多数产甲烷菌依靠CO2和H2作为它们唯一的能量来源，但是一些能使用乙酸或甲基化合物生长。瘤胃中中存在多种不同属的产甲烷古菌，但是甲烷短杆菌属中的种，尤其是反刍甲烷短杆菌(M.ruminantium)和史氏甲烷短杆菌(M.smithii)被认为是新西兰反刍动物中主要的产甲烷菌，反刍甲烷短杆菌目前是PGGRC基金资助基因组测序项目的研究对象。该项目第一次对于瘤位产甲烷菌的基因组进行测序，旨在对甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)的生物学建立更好的理解，以发现抑制甲烷产生的靶点。
减少瘤胃中甲烷产生需要抑制产甲烷菌或使其甲烷生成通路失活。一种抑制甲烷产生的方法是鉴定抑制产甲烷菌细胞的特异性分子。可通过(例如)使用靶向产甲烷菌的试剂达到这种目的。在一种方法中，可制备疫苗来靶向微生物细胞。因此，鉴定可用于抗微生物疫苗的微生物细胞的组分，特别是细胞表面组分，包括肽和多肽以及相关的多核苷酸和抗体可能有用。
发明内容
本发明涉及分离的反刍甲烷短杆菌(M.ruminantium)的肽、多肽和多核苷酸，尤其是反刍甲烷短杆菌的细胞表面组分，以及表达载体、宿主细胞、抗体和其使用方法，如本文详述。
本发明具体涉及一种分离的肽，其包含，例如，选自SEQ ID NO：1-702的一个氨基酸序列的至少一个片段。在一个特定方面，所述肽包含SEQ IDNO：45-260和332-702中任何一项的氨基酸序列的至少一个片段。在另一方面，所述肽包含SEQ ID NO：10-17中任何一项的氨基酸序列的至少一个片段。在另一方面，例如，所述肽是包含具有SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的至少一个氨基酸序列的片段。
本发明具体涉及一种分离的多肽，其包含，例如，选自SEQ ID NO：1-702的至少一个氨基酸序列。在一个特定方面，所述多肽包含SEQ ID NO：45-260和332-702中任一项的氨基酸序列。另一方面，所述多肽包含SEQ IDNO：10-17中任一项的氨基酸序列。在另一方面，例如，所述多肽是包含具有SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的至少一个氨基酸序列的片段。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包含至少一种肽的编码序列。在一个方面，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：1-702的氨基酸序列的至少一个片段的编码序列。在一个特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：45-260和332-702中任一项的至少一个片段的编码序列。在一个特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：10-17中任一项的至少一个片段的编码序列。在另一方面，所述多核苷酸包含某编码序列的片段，该编码序列编码，例如，具有SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的至少一个氨基酸序列。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包含至少一种多肽的编码序列。在一个方面，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO：1-702的至少一个氨基酸序列的编码序列。在一个特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：45-260和332-702中任一项的编码序列。在一个特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：10-17中任一项的编码序列。在另一方面，所述多核苷酸包含某编码序列的片段，该编码序列编码，例如，具有SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的至少一个氨基酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含，例如，选自SEQ ID NO：703-1373的核酸序列。在一个具体方面，所述多核苷酸包含核酸序列SEQ ID NO：703-710。在另一方面，所述多核苷酸是某片段或寡核苷酸，其包含例如，含有SEQ ID NO：703-710、737-931和1003-1373中任一项编码的胞外结构域的核酸序列。此外，本发明包括一种分离的多核苷酸或其片段，该多核苷酸或其片段能与SEQ ID NO：703-1373中任一核酸序列杂交。本发明还包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有任一所述核酸序列的互补物、反向互补物、反向序列或其片段。
本发明还涉及一种包含本发明多核苷酸的表达载体。在一个方面，所述表达载体包含选自SEQ ID NO：1-702的氨基酸序列的至少一个片段的编码序列。在一个特定方面，所述表达载体包含SEQ ID NO：45-260和332-702中至少一项的至少一个片段的编码序列。在另一方面，所述表达载体包含SEQ ID NO：10-17中至少一项的至少一个氨基酸序列的编码序列。在另一方面，所述表达载体包含具有SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的至少一个氨基酸序列的编码序列。
本发明还涉及包含至少一种表达载体的宿主细胞，例如微生物宿主细胞。
本发明具体涉及本文所述的肽、多肽或多核苷酸的抗体。在某些方面，所述抗体针对选自SEQ ID NO：1-702的氨基酸序列。在另外方面，所述抗体针对选自SEQ ID NO：10-17、45-260和332-702的多肽序列的至少一个片段。在一个特定方面，所述抗体与选自SEQ ID NO：10-17中任一项的多肽序列的至少一个片段结合。在另一方面，所述抗体与选自SEQ ID NO：45-260和332-702中任一项中的多肽序列的至少一个片段结合。在另一方面，所述抗体与包含NO：10-17、45-260和332-702中任一项的胞外结构域的肽或多肽的至少一个片段结合。另一方面，所述抗体包括与至少一种细胞抑制剂形成的一种或多种融合物或偶联物，所述细胞抑制剂包括例如，抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗体和抗体片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文详述的其他抗生素。
本发明还涉及例如SEQ ID NO：1-702中至少一项的修饰的肽或多肽，其包括如本文所述的生物学活性变化形式、片段、变体和衍生物。还涉及编码这些修饰的肽或多肽的多核苷酸，以及所公开多核苷酸的变化形式、片段、变体和衍生物；用这些修饰的肽、多肽或多核苷酸产生的抗体；包含这些多核苷酸的表达载体以及包含这些载体的宿主细胞。其它还涉及修饰的抗体，包括本文所述的生物学活性变化形式、片段、变体和衍生物。在具体方面，本发明的组合物和方法使用这些修饰的肽、多肽、多核苷酸、抗体或对应的表达载体或宿主细胞。
本发明涉及一种组合物，其包含分离的肽或多肽，如SEQ ID NO：1-702中至少一项。还涉及一种组合物，其包含分离的多核苷酸，如SEQ IDNO：703-1373中至少一项。本发明还涉及一种组合物，其包含例如针对本文公开的肽、多肽或多核苷酸序列的抗体。本发明还涉及一种组合物，该组合物包含表达载体或包含表达载体的宿主细胞。所述组合物可包含本文所述的生物学活性变化形式、片段、变体和衍生物中的任何一种。所述组合物可包含至少一种细胞抑制剂(如，作为融合物或偶联物)，并可配制成(例如)药物组合物，具体是疫苗组合物。
本发明还涉及作为按照所公开方法靶向和/或抑制微生物细胞，特别是产甲烷菌细胞的试剂盒的一部分的本发明组合物。该试剂盒包括：a)至少一种本文所列的组合物；以及b)任选地包括，用其(例如)靶向细胞或抑制产甲烷菌或其他微生物的细胞生长或复制的使用说明书。
本发明还涉及一种产生肽或多肽，例如，SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段的方法，该方法包括：a)在适合肽或多肽表达条件下培养表达载体或含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种肽或多肽的编码序列的至少一部分；以及b)从培养物中回收所述肽或多肽。在某些具体方面，所述肽或多肽包含选自SEQ ID NO：1-702的至少一个氨基酸序列或其修饰序列。
本发明还涉及一种产生抗体，例如，SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段的抗体的方法，该方法包括：a)在适合抗体或抗体片段表达的条件下培养表达载体或含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种抗体或抗体片段的编码序列的至少一部分；以及b)从培养物中回收该氨基酸序列。在某些具体方面，所述抗体或抗体片段针对选自SEQ ID NO：1-702的至少一个氨基酸序列或其修饰序列。在另一方面，如本文详述，通过给予宿主动物产生抗体。
本发明还涉及一种产生抗体，例如，针对SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段的抗体的方法，所述抗体包括与至少一种细胞抑制剂形成的融合物或偶联物。这种方法包括：a)在适合表达抗体或抗体片段的条件下培养表达载体或包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种抗体或抗体片段的编码序列；b)与抗体或抗体片段形成融合物或偶联物(例如，通过表达融合序列或与细胞抑制剂化学偶联)；和c)回收所述融合物或偶联物。
在特定方面，所述抗体针对SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段或其修饰序列。另一方面，所述细胞抑制剂选自抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗体和抗体片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文详述的其他抗生素。在另一方面，如本文详述，通过给予宿主动物产生抗体，然后偶联。
此外，本发明涉及一种抑制微生物细胞(如抑制其生长或复制)，具体是产甲烷菌细胞的方法，该方法包括：将细胞接触抗体或抗体片段，例如针对SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段的抗体，或抗体融合物或偶联物，或任何修饰抗体。作为另一种方法，通过给予本文所述的疫苗组合物抑制细胞。
本发明还涉及一种抑制微生物细胞(如抑制其生长或复制)，具体是产甲烷菌细胞的方法，该方法包括：a)任选产生或分离至少一种本文所述抗体；以及b)将所述细胞与所述抗体接触。在特定方面，所述抗体针对SEQ IDNO：1-702中任一项的至少一个片段或其修饰序列。在某些方面，所述抗体还包含至少一种以融合物或偶联物形式连接的细胞抑制剂。在其它方面，以组合物如疫苗组合物的形式将所述抗体给予对象。
此外，本发明涉及一种抑制微生物细胞(如抑制其生长或复制)，具体是产甲烷菌细胞的方法，该方法包括：a)任选产生或分离至少一种本文所述的肽或多肽；b)将所述肽或多肽给予对象以诱导对它的免疫应答。在一个具体方面，所述肽或多肽包含选自SEQ ID NO：1-702的至少一个氨基酸序列或其修饰序列。在其它方面，以组合物如疫苗组合物的形式将所述肽或多肽给予对象。
本发明还涉及一种检测和/或测定多肽，尤其是细胞表面多肽或对应肽或多核苷酸水平的方法，所述方法包括：1)将来自对象的样品与针对多肽(如SEQ ID NO：1-702中任一项的至少一个片段或其修饰序列)或者对应的肽或多核苷酸(如SEQ ID NO：703-1373中任一项的至少一个片段或其修饰序列)的抗体接触；2)测定与样品中对应多肽、肽或多核苷酸形成的抗体复合物的存在或水平。此类方法还可用于检测和/或测定微生物细胞，具体是产甲烷菌细胞的水平。
本发明还涉及一种检测和/或测定多核苷酸，具体是编码细胞组分的多核苷酸的水平的方法，该方法包括：1)将来自对象的样品与互补多核苷酸(如与SEQ ID NO：703-1373中任一项互补的序列或其修饰序列)接触；以及2)测定与样品中多核苷酸形成的杂交复合物的出现或水平。此类方法还可用于检测和/或测定微生物细胞，具体是产甲烷菌细胞的水平。
在特定方面，本发明的方法使用体内或体外表达组件。在其它方面，所述方法使用重组、合成或半合成方法或内源性方法产生的肽、多肽、多核苷酸或抗体。
本发明的其它方面和实施方式如下文所述。
附图简要说明
用本发明特定实施方式和附图作为参考对本发明进行描述。
图1A-1C：甲烷杆菌基因组比较(图1A)；反刍甲烷短杆菌基因组统计数据(图1B)；预测参与甲烷杆菌目细菌的甲烷生成的基因(图1C)。
图2.疫苗接种方案。
图3.使用反刍甲烷短杆菌细胞壁制剂和根据反刍甲烷短杆菌mtr和表面蛋白设计的肽进行疫苗接种后绵羊的抗体应答。
图4.用于产生抗体的肽序列。
图5A-5B：选择用于产生抗体的ORF：核苷酸序列(图5A)；氨基酸序列(图5B)。
图6A-6C：由反刍甲烷短杆菌鉴定的编码甲烷生成途径酶的ORF：注释(图6A)；核苷酸序列(图6B)；氨基酸序列(图6C)。
图7A-7C：由反刍甲烷短杆菌鉴定的细胞表面蛋白的ORF：注释(图7A)；核苷酸序列(图7B)；氨基酸序列(图7C)。
图8A-8C：由反刍甲烷短杆菌鉴定的编码外泌多糖生物合成的ORF：注释(图8A)；核苷酸序列(图8B)；氨基酸序列(图8C)。
图9A-9C：由反刍甲烷短杆菌鉴定的含有跨膜结构域的ORF：注释(图9A)；核苷酸序列(图9B)；氨基酸序列(图9C)。
具体实施方式
定义
术语“抗体”应理解为最广泛的可能含义，并意于包含完整的单克隆抗体和多克隆抗体。也意于覆盖抗体片段和衍生物，只要其显示生物学活性。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fc、Fab、Fab’和Fab2片段和Fab表达文库。
抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何种类，它们之间的差异在于分子中重链的特性。它们也包括亚类，如IgG1、IgG2和其它。轻链可以是κ链或λ链。本文提到抗体时包括所有类、亚类和类型。还包括嵌合抗体，例如对于不止一种来源如一种或多种小鼠、人或反刍动物序列具有特异性的单克隆抗体或其片段。还包括羊驼抗体或纳米抗体。应理解，本文中提到“抗体”或任何类似术语包括完整抗体，及其任何片段、变化形式、衍生物或变体。
如本文所述，“改变的”编码肽、多肽或抗体的核酸序列包括那些具有不同的核苷酸缺失、插入或取代，得到编码相同或功能等同序列的多核苷酸的核酸。编码的肽、多肽或抗体也可以是“改变的”，并包含氨基酸残基的缺失、插入或取代，产生沉默改变并得到功能等同的序列。只要生物学活性(如细胞结合、膜结合)或免疫原性/免疫学活性得以保留，可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性相似的基础上，有意进行氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；具有亲水性值相似的不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷胺酰胺，丝氨酸和苏氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。
如本文所用“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、蛋白质或抗体序列及其任何片段，并且指任何天然产生的、重组的、合成或半合成的分子。本发明序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250个氨基酸，优选至少5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200或200-250个氨基酸。序列保持该氨基酸序列的生物学活性(例如对细胞生长和/或增殖的影响)或免疫原性/免疫学活性。“氨基酸序列”和类似术语不限于与全长分子有关的完整的天然氨基酸序列，还包括它们的任何片段、变化形式、衍生物和变体。
本文所用“扩增”指产生核酸序列的其它拷贝，通常使用本发明熟知的聚合酶链反应(PCR)技术操作(Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler(1995)《PCR引物，实验室手册，冷泉港出版社，纽约普莱恩维尤》(PCR Primer，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY))。
如本文所用术语“生物学活性”或“功能性”指保持天然产生序列的一种或多种结构、免疫原性或生物化学功能(如细胞结合、膜结合)的肽或多肽。
本文所用术语“细胞抑制剂”或“抑制剂” 指降低或阻碍微生物细胞，尤其是产甲烷菌细胞生长或复制的试剂。细胞抑制剂可用于降低或阻碍如细胞分裂。抑制剂可减少或阻断例如DNA合成、RNA合成、蛋白质合成或翻译后修饰。抑制剂也可降低或阻断参与甲烷生成通路的酶的活性。抑制剂还可靶向细胞，以便免疫系统组件识别。抑制细胞还包括细胞杀伤和细胞死亡，例如通过裂解、凋亡、坏死等实现。有用的抑制剂包括但不限于：如本文详述的抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗体和抗体片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素。
本文所用术语“互补的”或“互补性”指在允许的盐和温度条件下多核苷酸通过碱基配对自然结合。对于序列A-G-T，互补序列是T-C-A，反向互补是A-C-T而反向序列是T-G-A。两条单链分子间的互补性可以是部分的，即仅有一些核酸结合，或者为完全互补，即当单链分子间存在完全互补性时。核酸链间的互补程度对于核酸链间杂交的效率和强度有显著性影响。这对于依赖核酸链结合的扩增反应以及PNA分子的设计和使用尤其重要。
本文所用术语“衍生物”指肽、多肽或抗体的编码核酸或与之互补的核酸的化学修饰形式。此类修饰包括例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。在优选方面，核酸衍生物编码的肽、多肽或抗体保持天然分子的生物学活性或免疫原性/免疫学活性。衍生的肽、多肽或抗体是通过糖基化、peg化或任何相似过程修饰的多肽，它保留了其来源序列的一种或多种生物学功能(如细胞结合、膜结合)或免疫原性/免疫学活性。
本文所用术语“同源”指一定程度的互补性。可以是部分同源(即，相同性小于100％)或完全同源(即，100％相同)。使用功能性术语“基本同源”指代至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。可在低严谨性条件下使用杂交实验(例如，Southern或northern印迹，溶液杂交等)检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本同源的序列或杂交探针在低严谨性条件下将竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说低严谨性条件允许非特异性结合；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(选择性)相互作用。
如本文所用术语“杂交”指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。
本文所用“插入”或“加入”指对氨基酸或核苷酸序列进行改变，与天然产生的分子相比，导致加入一个或多个氨基酸残基或核苷酸。
本文所用“产甲烷菌”指产生甲烷气体的微生物，包括甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter)、甲烷微菌(Methanomicrobium)、甲烷杆菌(Methanobacterium)和甲烷八叠球菌(Methanosarcina)。具体的产甲烷菌包括但不限于：反刍甲烷短杆(Methanobrevibacter ruminantium)(即M1菌株或菌株DSM1093)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、酸性甲烷短杆菌(Methanobrevibacteracididurans)、巢氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter thaueri)、布氏甲烷杆菌(Methanobacterium bryantii)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、马尔堡甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter marburgensis)、沃氏甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter wolfeii)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaerastadtmanae)、运动甲烷微菌(Methanomicrobium mobile)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、布氏拟甲烷球菌(Methanococcoides burtonii)和泰氏甲烷叶菌(Methanolobustaylorii)。所有产甲烷菌的属和种均在此术语涵盖范围内。
本文所用“微生物细胞”指天然产生或遗传修饰的微生物细胞，包括古细菌如产甲烷菌、嗜盐微生物和嗜酸嗜热菌，以及真细菌，如蓝藻、螺旋体、变形细菌以及革兰阳性和革兰阴性细菌。
术语“修饰的”指如本文所述的更改的序列和序列片段、变体和衍生物。
本文所用“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸序列、寡核苷酸或其片段，以及天然、重组、合成或半合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并可代表正义或反以链，或者编码或非编码区。本发明的序列优选包含至少12、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、300、450、600、750个核苷酸，优选至少15-30、30-60、60-90、90-120、120-150、150-300、300-450、450-600或600-750个核苷酸或至少1000个核苷酸或至少1500个核苷酸。应理解的是本文中每一处提及“核酸序列”或“核苷酸序列”将包括天然、全长序列，及其任何互补序列、片段、变化形式、衍生物或变体。
术语“寡核苷酸”指至少6、8、10、12、15、18、21、25、27、30或36个核苷酸或至少12-36个核苷酸或至少15-30个核苷酸的核酸序列，可用于PCR扩增、测序或杂交实验。如本文所用，“寡核苷酸”基本等同于“扩增物”、“引物”、“寡聚物”以及“探针”，如本领域通常定义的那样。
本文中所用单数或复数形式的术语“多核苷酸”一般指任何核酸序列，例如，任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA。包括但不限于：单链和双链DNA，包括单链和双链区的DNA，单链和双链RNA以及包括单链和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子(可为单链或(更典型的)双链或包含单链和双链区)。也包括含有RNA或DNA或者RNA和DNA的三链区。具体说，包括mRNA、cDNA和基因组DNA及其任何片段。该术语包括含有一个或多个修饰碱基如含氚碱基或非常见碱基如肌苷的DNA和RNA。本发明的多核苷酸可涵盖编码或非编码序列，或正义或反义序列或iRNA如siRNA。应理解的是本文中每一处提及“多核苷酸”或类似术语将包括全长序列，及其任何互补序列、片段、变化形式、衍生物或变体。
本文所用“肽”或“多肽”指本发明的分离的肽或多肽，其获自任何物种，优选微生物，以及任何天然、合成、半合成或重组的来源。具体说，本发明的肽或多肽可获自产甲烷菌细胞，如甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)细胞，具体是反刍甲烷短杆菌或史氏甲烷短杆菌细胞。对于重组产生，本发明的肽或多肽可获自微生物或真核细胞，例如大肠杆菌(Escherichia)、链球菌(Streptomyces)、芽孢杆菌(Bacillus)、沙门菌(Salmonella)、酵母、昆虫细胞如果蝇细胞、动物细胞如COS和CHO细胞或植物细胞。应理解的是本文中每一处提及“肽”或“多肽”将包括全长序列，及其任何片段、变化形式、衍生物或变体。
本文所用“肽核酸”或“PNA”指反义分子或抗-基因试剂，其包含通过肽主链连接的碱基。
本文所用术语“反刍动物”指具有瘤胃作为特殊类型消化器官的动物。反刍动物包括但不限于：牛、绵羊、山羊、水牛、糜鹿、羚羊、北美驯鹿和鹿。
本文所用术语“严谨条件”或“严谨性”指核酸、盐和温度限定的杂交条件。这些条件为本领域所熟知，可更改这些条件以鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。参见例如Sambrook，J.等(1989)《分子克隆，实验室手册》冷泉港出版社，纽约普莱恩维尤(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY)，以及Ausubel，F.M.等(1989)新编分子生物学实验指南，约翰韦利森出版社，纽约(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，NY)。数种包含低或高严谨性的相等条件取决于以下因素，如序列的长度和特性(DNA、RNA、碱基组成)、靶点特性(DNA、RNA、碱基组成)、环境(在溶液中或固定于固体基材上)、盐和其它成分(如甲酰胺、硫酸右旋糖苷和/或聚乙二醇)的浓度和反应温度(例如，从低于探针解链温度5℃至低于解链温度约20℃-25℃的范围内)。可改变一种或多种因素以产生不同于或等同于上述条件的低或高严谨性。
术语“对象”包括人或非人动物。非人动物包括但不限于：鸟类和哺乳动物，如反刍动物，具体是小鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛和马。
本文所用术语“基本纯化”或“分离”指从细胞、重组或合成环境中移出的核酸或氨基酸序列，并且至少至少60％，优选75％并最优选至少90％或至少99％不含它们在其环境中相关联的其它组分。已鉴定到“分离的”多核苷酸和多肽，并与它们的自然状态相关联的至少一种污染物分子分离。因此，应理解，分离的多核苷酸和多肽是不同于它们的天然形式或天然定位的形式。还应理解，“分离的”不一定反应纯化序列的准确程度(如具体百分率)。
本文所定义“转化”指外源DNA进入并改变接受细胞的过程。可使用本领域所熟知多种方法在天然或人工条件下进行转化。转化可依赖将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞的任何已知方法。基于需转化的宿主细胞类型选择方法，可包括但不限于病毒感染、电穿孔、热休克、脂质转染和粒子轰击。此类“转化”细胞包括稳定转化细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。它们还包括在限定时间期间瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
本文所用“疫苗”包括用于刺激对象的免疫应答的所有组分和组合物。在这方面尤其有用的是亚基疫苗，包括肽疫苗，以及载体疫苗、核酸疫苗和可食用的疫苗。可利用疫苗建立或增强对抗原，尤其是微生物抗原的免疫应答。在特定方面，疫苗包含引起宿主保护发应，如抗体形成、T辅助细胞和T细胞应答的抗原。疫苗还可包含抗体，例如，用于被动免疫。
如本文所用的肽、多肽或抗体的“变体”指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。改变变体多核苷酸的一个或多个核苷酸。变体可导致“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似结构或化学特性，如用异亮氨酸取代亮氨酸。更少见的，变体可导致“非保守性”变化，如用色氨酸替换甘氨酸。类似的小变异还可包括氨基酸缺失或插入或两者均有。使用本领域熟知计算机程序如LASERGENE软件(DNASTAR)可发现如何确定可对哪一氨基酸取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫原性/免疫学活性的指南。
本发明还包括保留至少一种生物学活性(如细胞结合、膜结合)或免疫原性/免疫学活性的变体。优选的变体是具有基本相同或功能等同序列的变体，例如与公开序列至少80％和更优选至少90％序列相同的变体。最优选的变体是与本文公开序列具有至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的变体。如下所述通过对需比较的两条序列比对、确定比对部分的相同残基数目、除以本发明(查询)序列总残基数并乘以100，从而确定相同性百分数。有用的比对程序是AlignX(载体NTI)。
发明详述
甲烷在反刍动物前肠中由产甲烷菌产生，它是瘤胃系统中碳的终末还原产物。已对甲烷产生通路的多个步骤进行了阐述，主要来自于对非瘤胃产甲烷菌的研究，但是尚不了解对于使产甲烷菌在瘤胃中生长和持续存在的适应性。反刍甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)是新西兰反刍动物体内主要的产甲烷菌。如本文所述，已经对反刍甲烷短杆菌的基因组进行测序，显示大小约3.0Mb，GC含量为33.68％。已经鉴定出甲烷生成通路的所有组件，并且将这些基因序列与热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)和斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)的基因序列进行比较，结果表明在甲烷杆菌中甲烷生成基因的组织是保守的(图1C)。基因组中包含很多大表面蛋白，这些蛋白的特征表明它们可介导与其它瘤胃微生物的结合。在本发明的不同方面，可以使用鉴定的多核苷酸和多肽作为在瘤胃中抑制产甲烷菌和/或甲烷生成的手段，并进一步阐明反刍甲烷短杆菌在甲烷形成中的作用。尤其有用的是公开的鉴定为参与甲烷生成的组分(图6A-6C)、细胞表面组分(图7A-7C)、参与外泌多糖生物合成的组分(图8A-8C)、具有跨膜结构域的组分(图9A-9C)的核苷酸和多肽，以及用于产生抗体的多核苷酸和多肽(图5A-5B)。
肽、多肽和多核苷酸
本发明包括肽和多肽，包括含有至少SEQ ID NO：1-702中至少一种或其片段、变体和衍生物的那些多肽。可表达本发明的肽和多肽并用于不同的实验以测定其生物学活性。这些肽和多肽可用于大规模合成和分离实验方案，例如，用于商业生产。可使用此类肽和多肽产生抗体，以分离相应的氨基酸序列和对氨基酸序列水平进行定量测定。这些肽和多肽可用于靶向和抑制微生物细胞，尤其是产甲烷菌细胞的疫苗。这些肽和多肽也可用于制备抑制这类细胞生长和复制的抗体。本发明的肽和多肽也可用作组合物，例如药物组合物，特别是疫苗组合物。在特定方面，缓释瘤胃装置可与本发明的肽、多肽、抗体和组合物(如药物组合物，特别是疫苗组合物)联用。
本发明的肽包含选自下组的至少一个序列：(a)包含选自SEQ IDNO：1-702或其片段、变体或衍生物的一个氨基酸序列的至少一个片段的肽；(b)包含至少一个选自SEQ ID NO：1-702和其片段、变体的氨基酸序列的功能性结构域的肽；以及(c)包含选自SEQ ID NO：1-702或其变体或衍生物的至少一个氨基酸序列的至少一定数目的毗连残基的肽。在一个实施方式中，本发明包括含有SEQ ID NO：1-9中至少一个氨基酸序列的分离的肽。所有这些序列统称本发明的肽。
本发明多肽包含选自下组的至少一个序列：(a)包含至少一个选自SEQID NO：1-702或其片段、变体或衍生物的氨基酸序列的多肽；(b)包含至少一个选自SEQ ID NO：1-702和其片段、变体的氨基酸序列的功能性结构域的多肽；以及(c)包含选自SEQ ID NO：1-702或其变体或衍生物的至少一个氨基酸序列的至少一定数目的毗连残基的多肽。在一个实施方式中，本发明包括含有SEQ ID NO：1-9中至少一个氨基酸序列的分离的肽。所有这些序列统称本发明的多肽。
本发明也包括一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：1-702的肽或多肽。本发明的分离的多核苷酸还可用于对或多或少的相关细胞表面组分进行基因组作图、物理作图和基因克隆。通过本领域熟知技术如狭缝印迹技术或微阵列技术，可使用根据本发明多核苷酸设计的探针在细胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何生物体中检测基因的存在和表达模式。使用本发明多核苷酸设计的引物可用于测序和PCR扩增。本发明多核苷酸可用于制备疫苗所用的表达载体和宿主细胞，以靶向和抑制微生物细胞，特别是产甲烷菌细胞。本发明还包括多核苷酸在产生抑制此类细胞生长或复制的抗体中的应用。本发明的多核苷酸也可用作组合物，例如药物组合物，特别是疫苗组合物。在特定方面，缓释瘤胃装置可与本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞和组合物(如药物组合物，特别是疫苗组合物)联用。
本发明多核苷酸包含选自下组的至少一个序列：(a)包含至少一个选自SEQ ID NO：1-702或其片段或变体的氨基酸序列的编码序列的序列；(b)至少一个选自SEQ ID NO：1-702或其片段或变体的氨基酸序列的编码序列的互补序列、反向序列以及反向互补序列；(c)至少一个选自SEQ ID NO：1-702或其片段或变体的氨基酸序列的编码序列中所含的开放阅读框；(d)至少一个选自SEQ ID NO：1-702或其片段或变体的氨基酸序列的编码序列的功能性结构域；(e)含有至少一个选自SEQ ID NO：1-702或其变体的氨基酸序列的编码序列的至少一定数目的毗连残基的序列；和(f)包含SEQ IDNO：703-1373中任一项的至少一定数目的毗连核苷酸的序列。还提供寡核苷酸探针和引物及其变体。所有这些多核苷酸、寡核苷酸探针和引物在本文中统称为本发明的多核苷酸。
本领域熟练技术人员应当理解的是，作为遗传密码简并性的结果，可产生大量本发明肽或多肽的编码核苷酸序列，其中某些序列与任何已知和天然产生的基因的核苷酸序列同源性很小。因此，本发明考虑到各个和每个可能的核苷酸序列变异，这些变异可通过根据可能密码子选择密码子组合而产生。根据应用于天然产生的氨基酸序列的标准三联遗传密码产生这些组合，所有此类变异都被视作已具体公开。
编码肽或多肽或其片段或变体的核苷酸序列优选在适当选择的肽条件或严谨条件下能够与天然产生序列的核苷酸序列杂交。然而，具有优势的是产生编码肽或多肽或者其片段或衍生物的、具有明显不同密码子使用的核苷酸序列。根据宿主使用特定密码子的频率，可选择密码子以提高特定原核或真核宿主中的肽或多肽表达速率。改变肽或多肽及其衍生物的编码核苷酸序列而不改变编码的氨基酸序列的其它原因包括产生具有更有利特性，如比天然产生序列产生的转录物具有更长半衰期的RNA转录物。
本发明还包括完全通过合成化学产生编码肽或多肽，或其片段或变体的DNA序列或其片段。在合成序列产生后，利用本领域熟知试剂，可将其插入到任何可用的表达载体和细胞系统中。而且，可使用合成化学在编码肽或多肽，或其任何变体或片段的序列中引入突变。本发明还包括在如Wahl，G.M和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152：399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；Methods Enzymol.152：507-511)所教导的各种严谨条件下，能与要求权利的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，尤其是SEQ ID NO：703-1373中显示的那些序列。
本领域熟知并常用的DNA测序方法可用于实践本发明的任何实施方式。这类方法可使用如DNA聚合酶I的克列诺片段，SEQUENASE(美国生物化学集团(U.S.Biochemical Corp.)，俄亥俄州克里富兰)(U.S.BiochemicalCorp，Cleveland，OH)，Taq聚合酶(珀金埃尔默)(Perkin Elmer)，热稳定T7聚合酶(安法马西亚生物技术公司，新泽西州皮斯卡塔韦)(AmershamPharmacia Biotech Piscataway，NJ)，或者聚合酶和校对核酸外切酶的组合，如生命技术公司(Life Technologies)(马里兰州盖瑟斯堡)销售的ELONGASE扩增系统中找到的那些。优选地，该方法通过机器自动化进行，如汉密尔顿微型实验室2200(Hamilton Micro Lab 2200)(内华达州雷诺汉密尔顿)(Hamilton，Reno，NV)，派而特热循环仪(Peltier Thermal Cycler)(PTC200；MJ研究公司，麻省沃特敦)(MJ Research，Watertown，MA)；ABI催化仪(ABI Catalyst)以及373和377DNA测序仪(珀金埃尔默)(Perkin Elmer)或基因组测序仪20TM(罗氏诊断公司)(Roche Diagnostics)。
可使用部分核苷酸序列并使用本领域所知方法将编码肽或多肽的核酸序列延伸，以检测上游序列如启动子和调节元件。例如，可使用的一种方法“位点限制性”PCR使用通用引物以获取与已知基因座相邻的未知序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2：318-322)。具体说，在接头序列引物和已知区域特异性引物存在的条件下对基因组DNA进行首次扩增。然后对扩增序列进行第二轮PCR，其中使用相同的接头引物和在第一引物内的另一特异性引物。用合适的RNA聚合酶对每一轮PCR产物进行转录，用逆转录酶进行测序。
市售毛细管电泳系统可用于分析测序或PCR产物的核苷酸序列的大小或对其进行确认。具体说，毛细管测序可使用可流动聚合物进行电泳分离，激光激发的四种不同荧光染料(每种对应一种核苷酸)，用电荷耦合器件照相机检测发射波长。使用合适的软件(如基因组分型和序列导航者，珀金埃尔默公司)(GENOTYPER and Sequence NAVIGATOR，Perkin Elmer)可将输出/光强度转化为电信号，从上样到计算机分析和电子数据显示均可在计算机控制下进行。毛细管电泳尤其优选用于对特定样品中少量存在的小片段DNA进行测序。
在本发明的另一实施方式中，编码肽或多肽的多核苷酸或其片段可用于重组DNA分子以在合适宿主细胞中指导肽或多肽或其片段或变体的表达。由于遗传编码的固有简并性，可产生编码基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，这些序列可用于克隆和表达肽或多肽。可使用本领域通常所知方法对本发明的核苷酸序列进行工程改造以根据多种原因改变氨基酸编码序列，包括但不限于为了改变克隆、加工和/或基因产物表达而进行的变化。可使用通过随机片段化进行的DNA改组以及对基因片段和合成寡核苷酸的PCR组装对核苷酸序列进行工程改造。例如，可使用定位诱变插入新的限制性位点，改变糖基化形式，改变密码子偏好，引入突变等等。
在本发明的另一实施方式中，可将天然、修饰或重组的编码肽或多肽的核酸序列连接至异源序列以编码融合蛋白。例如，编码可被市售抗体识别的嵌合序列可能是有用的。也可工程改造融合蛋白使其在本发明的肽或多肽和异源蛋白序列间含有切割位点，以便于切割并纯化该肽或多肽，与异源部分分离。
在另一实施方式中，可使用本领域熟知化学方法合成完整或部分形式的肽或多肽编码序列(参见Caruthers，M.H.等(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，可使用合成氨基酸序列或其片段的化学方法产生多肽本身。例如，可使用多种固相合成技术(Roberge，J.Y.等(1995)Science 269：202-204；Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)进行多肽合成，使用例如ABI 431A肽合成仪(珀金埃尔默公司)进行自动合成。可用化学方法合成肽或多肽的各种片段，并用化学方法组合产生全长分子。
可用制备型高效液相色谱分离新合成的肽或多肽(如，Creighton，T.(1983)蛋白质结构和分子原则，WH富瑞曼公司，纽约(Proteins Structuresand Molecular Principles，WH Freeman and Co.，New York，NY))。通过氨基酸分析和测序可确认合成的肽或多肽的组成(如，埃得曼降解步骤(Edmandegradation procedure；Creighton)，同上)。此外，肽或多肽或其任何部分的氨基酸序列可在直接合成中更改和/或通过化学方法与来自其它蛋白质或其部分的序列组合以产生变体分子。
为了表达生物学活性肽或多肽，可将编码该序列或功能等同物的核苷酸序列插入合适的表达载体，即包含插入序列转录和翻译必需元件的载体。可用本领域熟练技术人员熟知的方法构建包含肽或多肽编码序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。Sambrook，J.等(1989)《分子克隆，实验室手册》冷泉港出版社，纽约普莱恩维尤(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY)，以及Ausubel，F.M.等(1989)新编分子生物学实验指南，约翰韦利森出版社，纽约(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，NY)对此类技术进行了描述。
可使用多种表达载体/宿主系统包含并表达本发明肽或多肽的编码序列。它们包括但不限于：微生物体如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；病毒表达载体(如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或细菌表达载体(如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞；或动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括英骏公司(Invitrogen)的pET、pRSET、pTrcHis2和pBAD质粒；诺瓦基公司(Novagen)的pET和pCDF质粒以及西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的DirectorTM质粒。对于产甲烷菌，有用的质粒包括但不限于pME2001、pMV15和pMP1。所用表达载体或宿主细胞并不限制本发明。
“控制元件”和“调节序列”是载体的非翻译区-增强子、启动子、5′和3′非翻译区--它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能不同。根据所使用载体系统和宿主，可使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆进细菌系统时，可使用诱导型启动子，如BLUESCRIPT噬菌粒(司查塔基公司，加州拉霍亚)(Stratagene，LaJolla，CA)或pSPORT1质粒(生命技术公司)(Life Technologies)的杂交lacZ启动子等。可在昆虫细胞中使用杆状病毒多角体蛋白启动子。可将来源于植物细胞基因组(如，热休克、RUBISCO和存储蛋白质基因)的启动子或增强子或来自于植物病毒的启动子或增强子(如病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。
在细菌系统中，可根据肽或多肽的指定应用对许多表达载体进行选择。例如，当需要大量肽或多肽时，可使用指导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。此类载体包括但不限于：多功能大肠杆菌克隆和表达载体如BLUESCRIPT(司查塔基公司)，其中可将多肽编码序列连接入载体，与β-半乳糖苷酶的氨基末端Met和后续7个残基在相同读框内，从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。
也可采用pGEX载体(普洛麦格公司，威斯康星州麦迪逊)(Promega，Madison，WI)表达肽或多肽与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并容易通过以下方法由裂解细胞纯化：吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。可设计此类系统产生的蛋白质以使其包含肝素、凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，从而使感兴趣的克隆的肽或多肽可按需从GST部分释放出来。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用包含组成型或诱导型启动子的多种载体，如α因子、醇氧化酶和PGH。参见Ausubel等(同上)和Grant等(1987)Methods Enzymol.153：516-544的综述。
也可使用特异性起始信号达到更有效的翻译本发明肽或多肽编码序列的目的。此类信号包括ATG启动密码子和相邻序列。当肽或多肽编码序列、其起始密码子和上游序列插入到合适表达载体的情况下，无需另外的转录或翻译控制信号。然而，当仅插入编码序列或其片段时，需提供外源的翻译控制信号包括ATG起始密码子。而且，起始密码子应当位于正确的阅读框中，以保证完整插入物的翻译。外源翻译控制元件和起始密码子可有多种天然或合成来源。通过包括适合所用特定细胞体系的增强子可增强表达效率，如文献中所述(Schaff，D.等，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-162)。
此外，可根据宿主细胞株调节插入序列表达或以所期望的方式加工表达的肽或多肽的能力对其进行选择。此类序列的修饰包括但不限于：乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。也可使用切割肽或多肽“前体”形式的翻译后加工以利于正确的插入、折叠和/或功能。可从美国典型培养物保藏中心(马里兰州贝塞斯达)(American Type Culture Collection(ATCC；Bethesda，MD)获取具有特定细胞机器或翻译后活性的特征性机制的不同宿主细胞，选择以保证正确的序列修饰和加工。具体宿主细胞包括但不限于：产甲烷菌细胞，如产甲烷短杆菌细胞，具体说，反刍甲烷短杆菌或史氏甲烷短杆菌细胞。感兴趣的宿主细胞还包括例如，红酵母(Rhodotorula)、短梗霉菌(Aureobasidium)、酿酒酵母(Saccharomyces)、掷孢酵母(Sporobolomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)和黄杆菌(Flavobacterium)；或其它此类有机体如埃希菌(Escherichia)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽胞杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)等。特定的宿主细胞包括尤其适于本发明使用的大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、变青链霉菌(Streptomyces lividans)等。
数种技术可将核酸引入体外培养的真核细胞中。它们包括化学方法(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：7413 7417(1987)；Bothwell等，真核基因克隆和分析方法(Methods for Cloning and Analysis ofEukaryotic Genes)，编，约翰和巴特勒出版公司，麻省波士顿(Jones andBartlett Publishers Inc.，Boston，Mass.)(1990)；Ausubel等，分子生物学简明实验方案(Short Protocols in Molecular Biology)，约翰韦利森公司，纽约(JohnWiley and Sons，New York，NY)(1992)；以及Farhood，Annal.NY Acad.Sci.，716：23 34(1994))，使用原生质体(Bothwell，同上)或电脉冲(Vatteroni等，Mutn.Res.，291：163169(1993)；Sabelnikov，Prog.Biophys.Mol.Biol.，62：119152(1994)；Bothwell等，同上；以及Ausubel等，同上)，使用减毒病毒(Davis等，J.Virol.1996，70(6)，3781 3787；Brinster等J.Gen.Virol.2002，83(Pt 2)，369 381；Moss，Dev.Biol.Stan.，82：55 63(1994)；以及Bothwell等，同上)，以及物理方法(Fynan等，Int J Immunopharmacol.1995年2月；17(2)：79-83；Johnston等，Meth.Cell Biol.，43(Pt A)：353 365(1994)；Bothwell等，同上；以及Ausubel等，同上)。
可通过以下方法将核酸成功递送至动物组织：使用阳离子脂质体(Watanabe等，Mol.Reprod.Dev.，38：268 274(1994))，直接将裸露的DNA或RNA注射入动物肌肉组织(Robinson等，Vacc.，11：957 960(1993)；Hoffman等，Vacc.12：1529 1533(1994)；Xiang等，Virol.，199：132 140(1994)；Webster等，Vacc.，12：1495 1498(1994)；Davis等，Vacc.，12：1503 1509(1994)；Davis等，Hum.Molec.Gen.，2：1847 1851(1993)；Dalemans等，AnnNY Acad.Sci.1995，772，255 256.Conry等，Cancer Res.1995，55(7)，1397-1400)和胚胎(Naito等，Mol.Reprod.Dev.，39：153 161(1994)；和Burdon等，Mol.Reprod.Dev.，33：436 442(1992))，肌肉内注射自我复制的RNA疫苗(Davis等，J Virol 1996，70(6)，3781 3787；Balasuriya等，Vaccine 2002，20(1112)，1609 1617)或者用“基因枪”技术皮内注射DNA(Johnston等，同上)。
用蛋白质特异性多克隆或单克隆抗体检测和测定本发明肽或多肽表达的各种实验方案为本领域所知。例子包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫(RIA)和荧光激活的细胞分选(FACS)。可使用与肽或多肽上两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体进行双位点单克隆免疫实验，也可使用竞争结合实验。这些和其它实验参见Hampton，R.等(1990；血清学方法，实验室手册(Serological Methods，a laboratory Manual)，APS出版社，明尼苏达州圣保罗)以及Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)等。
本领域熟练技术人员了解多种标记和偶联技术，可用于多种核酸和氨基酸实验。产生标记的杂交或PCR探针用于检测多核苷酸相关序列的方法包括寡核苷酸标记、缺口平移、末端标记或使用标记核苷酸进行PCR扩增。或者，可将肽或多肽或其任何片段或变体的编码序列克隆入载体用于产生mRNA探针。此类载体为本领域所知并可购得，可在加入合适RNA聚合酶如T7、T3或SP6以及标记的核苷酸后用于体外合成RNA探针。可利用安法马西亚生物技术公司、普洛麦格公司和美国生物化学公司(AmershamPharmacia Biotech，Promega and US Biochechemical)生产的多种市售试剂盒进行这些步骤。易于检测的合适报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光物质、化学发光物质或发色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
可在适于表达和从培养物中回收肽或多肽的条件下，培养表达载体或用表达载体转化的宿主细胞。培养物可包含体外或体内表达组件。体外表达组件包括兔网织红细胞裂解物、大肠杆菌裂解物和麦芽提取物的体外表达组件，例如，英骏公司(Invitrogen)的ExpresswayTM或RiPs系统，英特龙生物技术公司(iNtRON Biotechnology)的GenelatorTM系统，诺瓦基公司(Novagen)的EcoProTM或STP3TM系统，普洛麦格公司(Promega)的快速偶联系统和凯杰公司(QIAGEN)的EasyXpress系统。产自培养物的肽或多肽可以是分泌的或细胞内包含的多肽，这取决于序列和/或所用载体。在某些特定方面，可设计编码肽或多肽的表达载体使其包含指导肽或多肽通过原核或真核细胞膜分泌的信号序列。
其它构建物可包含利于肽或多肽纯化的氨基酸结构域。此类结构域包括但不限于：可在固化金属上进行纯化的金属螯合结构域如组氨酸-色氨酸(如6X-HIS)模块，可在固定免疫球蛋白上进行纯化的蛋白质A结构域，以及在扩展/亲和纯化系统(因缪耐斯集团，华盛顿州西雅图)(Immunex Corp.，Seattle，WA)中所用结构域。可用的表位标签包括HA、VSV-G、V5、HSV、GST、GFP、MBP、GAL4和β-半乳糖苷酶。有用的质粒包括含有生物素标签的质粒(如，普洛麦格公司的PinPointTM质粒)，含有钙调蛋白结合蛋白的质粒(如司查塔基公司的pCAL质粒)，含有链霉亲和素结合肽的质粒(如司查塔基公司的InterPlayTM质粒)，含有c-myc或
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标签的质粒(如西格玛奥德里奇公司的免疫沉淀质粒)或含有组氨酸标签的质粒(如凯杰公司的QIAExpress质粒)。
为了利于纯化，表达载体可包含可切割的接头序列，如Xa因子或肠激酶(英骏公司，加州圣地亚哥)的特异性接头序列。例如，载体在纯化结构域和肽或多肽间可包含一个或多个接头。一种此类表达载体能够用于表达包含本发明肽或多肽的融合蛋白，并提供编码硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前6组氨酸残基的核酸。组氨酸残基利于在IMAC(固定金属离子亲和色谱柱，如Porath，J等(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281所述)上纯化，而肠激酶切割位点则提供一种从融合蛋白中纯化肽或多肽的方法。Kroll，D.J.等(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)提供了关于包含融合蛋白的载体的讨论。
抗体和疫苗
可使用本领域通常所知的方法产生本发明的抗体。具体说，可根据已知方法使用纯化的肽、多肽或多核苷酸产生抗体。此类抗体可包括但不限于：多克隆、单克隆、嵌合和单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。尤其优选将中和抗体(即抑制功能的那些抗体)与疫苗一起使用。
为了产生抗体，可将具有免疫原性的肽、多肽、多核苷酸或其任何片段注射入不同的宿主，包括山羊、兔、大鼠、人等，以进行免疫。根据宿主种类，可使用不同的佐剂以提高免疫应答。此类佐剂包括但不限于：福氏佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝和表面活性物质如溶血卵磷脂、普流罗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝素和二硝基酚。用于人的佐剂中，尤其优选BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
用于诱导抗体的肽、多肽或片段优选具有包含至少5个氨基酸，更优选10个氨基酸的氨基酸序列。优选的是，它们与天然蛋白质氨基酸序列的一部分相同，以及它们可包含小的天然产生分子的完整氨基酸序列。可将氨基酸短臂与另一蛋白质如钥孔血蓝素以及抗嵌合分子的抗体的短臂融合。
使用通过连续培养细胞系产生抗体分子的任何技术制备单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV杂交瘤技术(Kohler，G.等(1975)Nature 256：495-497；Kozbor，D.等(1985)J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote，R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-2030；Cole，S.P.等(1984)Mol.Cell Biol.62：109-120)。
此外，也可使用为产生“嵌合抗体”开发的技术，如将小鼠抗体基因和人抗体基因组合以获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison，S.L.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855；Neuberger，M.S.等(1984)Nature 312：604-608；Takeda，S.等(1985)Nature 314：452-454)。或者，可通过本领域所知方法改进用于产生单链抗体的技术，以产生特异性单链抗体。具有相关特异性但独特型组成不同的抗体可通过随机组合免疫球蛋白文库的链改组产生(Burton D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：11120-3)。
本发明相关领域的技术人员理解术语“双抗体”和“三抗体”。存在包含重链可变结构域(VH)通过短肽接头与轻链可变结构域(VL)连接的分子，该短肽接头太短以至相同链上的两个结构域间无法配对。这促使与一条或多条其它链的互补结构域配对，并促进形成具有两个或多个功能性抗原结合位点的二聚体或三聚体分子。所得的抗体分子可以是单特异性或多特异性的(如，双抗体的情况下具有双重特异性)。使用本发明涉及领域的标准方法，如Todorovska等(在癌症靶向中双抗体、三抗体和四抗体的设计和应用(Design and application of diabodies，triabodies and tetrabodies for cancertargeting).J.Immunol.Methods.2001年2月1日；248(1-2)：47-66)所述，从两种或多种抗体产生此类抗体分子。
也可通过在淋巴细胞群中诱导体内产生或通过如文献所述方法筛选免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂板块产生抗体(Orlandi，R.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86：3833-3837；Winter，G.等(1991)Nature 349：293-299)。
也可产生包含特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于：可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段，以及通过还原F(ab′)2片段的二硫桥产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库以快速简便的鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse，W.D.等(1989)Science254：1275-1281)。
可使用不同免疫实验来筛选鉴定具有结合特异性的抗体。本领域熟知使用具有确定特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争结合或免疫放射实验的多种实验方法。此类免疫实验通常包括测定肽、多肽或多核苷酸和其特异性抗体间形成的复合物。优选使用与两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体的双位点单克隆免疫实验，但也可使用竞争性结合实验(Maddox，同上)。
本文所述抗体具有靶向和/或抑制细胞的能力，还可作为载体分子用于将其它抑制剂分子递送入微生物细胞。将化合物偶联至氨基酸的化学方法已经得以很好的发展，可将多种不同的分子类型与抗体连接。最常见的偶联方法依赖于游离氨基(α-氨基或Lys)、巯基(Cys)或羧酸基团(Asp、Glu或α-羧基)的存在。可使用偶联方法通过羧基-或氨基-末端残基将抗体连接至细胞抑制剂。在一些情况下，序列包含多个可与所选化学物质进行反应的残基。可使用该方法生产包含多于一种细胞抑制剂的多聚物。或者，可缩短或选择抗体，使反应性残基位于序列的氨基或羧基末端。
例如，在多肽合成中可使用N-α-Fmoc-Nε-1-(4，4-二甲基-2，6二氧代环亚己-1-基-3-甲基丁基)-L-赖氨酸，将报告分子如荧光素特异性掺入到赖氨酸残基(Ono等，1997)。合成后用肼处理去除4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己-1-基，偶联5-和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。因此，通过在多肽序列中包含赖氨酸残基，然后与合适的衍生化细胞抑制剂反应，能够完成抑制剂分子与抗体的偶联。
还可使用EDC(盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)或碳二亚胺偶联方法。碳二亚胺可激活天门冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基基团，以及羧基末端基团，使其成为伯胺偶联的反应性位点。将活化的抗体与细胞抑制剂混合以产生最终的偶联物。如果细胞抑制剂首先被活化，那么EDC法将通过N末端α胺并且可能通过Lys侧链中的胺(如果存在的话)偶联细胞抑制剂。
间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)是异双功能试剂，可通过半胱氨酸将抗体连接于细胞抑制剂。半胱氨酸残基的硫醇基团参与偶联。如果所选序列不包含Cys，通常将Cys残基放置于N-或C-末端以便在高度控制条件下连接抗体与细胞抑制剂。出于合成的目的，将半胱氨酸置于抗体的N末端是有帮助的。MBS尤其适合用于本发明。
戊二醛可用作通过其氨基将两个化合物连接的双功能偶联试剂。戊二醛在抗体和细胞抑制剂之间提供了高度灵活的间隔物，以利于呈现。戊二醛是反应性非常高的化合物，与Cys、Tyr和His进行有限程度的反应。当多肽在其氨基末端仅包含一个游离氨基时，戊二醛偶联方法尤其有用。当抗体包含不止一个游离氨基时，可形成大型多聚复合物。
在一个方面，本发明的抗体可融合于(如通过框内克隆)或连接于(如通过化学偶联)细胞抑制剂，如抗微生物试剂。其中包括抗微生物肽，例如杀菌/通透性增加蛋白、阳离子抗微生物蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白和犬科抗菌肽(cathelicidins)(如来自中性粒细胞，参见例如Hancock和Chapple，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43：1317-1323；Ganz和Lehrer，1997，Curr.Opin.Hematol.4：53-58；Hancock等，1995，Adv.Microb.Physiol.37：135-175)。抗微生物肽还包括防御素(如，来自上皮细胞或中性粒细胞)和血小板杀微生物蛋白(参见例如，Hancock和Chapple，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43：1317-1323)。其它抗微生物肽包括但不限于：短杆菌肽S、杆菌肽、多粘菌素B、鲎素、白细胞抗菌肽(bactenecin)(如，牛白细胞抗菌肽)，牛蛙皮肤抗菌肽(ranalexin)、天蚕素A(cecropin A)、尹杜抗菌肽(indolicidin)(如牛尹杜抗菌肽)和乳酸链球菌素(如细菌乳酸链球菌素)。
抗微生物试剂还包括离子载体(ionophores)，它利于离子(如钠)的穿越脂质屏障如细胞膜进行传播。尤其适合本发明的两个离子载体化合物是RUMENSINTM(礼来公司)(Eli Lilly)和拉沙里菌素(Lasalocid)(罗氏公司)(Hoffman LaRoche)。其它离子载体包括但不限于：盐霉素、阿伏霉素、阿瑞辛(aridcin)和阿克拉宁(actaplanin)。其他抗微生物剂包括青霉素、莫能菌素TM和阿奇霉素、甲硝唑、链霉素、卡那霉素和青霉素，以及β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素、新生霉素、利福平和氟喹诺酮(参见例如Horn等，2003，Applied Environ.Microbiol.69：74-83；Eckburg等，2003，Infection Immunity 71：591-596；Gijzen等，1991，Applied Environ.Microbiol.57：1630-1634；Bonelo等，1984，FEMS Microbiol.Lett.21：341-345；Huser等，1982，Arch.Microbiol.132：1-9；Hilpert等，1981，Zentbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.1 Abt Orig.C 2：21-31)。
尤其有用的抑制剂是阻断或干扰甲烷生成的化合物，包括溴代乙磺酸，如，2-溴代乙磺酸(BES)或其盐，例如钠盐。钼酸钠(Mo)是硫酸还原抑制剂，可与溴代乙磺酸一起使用。其它抗甲烷生成化合物包括但不限于：硝酸、甲酸、甲基氟、三氯甲烷、水合氯醛、亚硫酸钠、乙烯和不饱和烃、乙炔，脂肪酸如亚油酸，顺式油酸，饱和脂肪酸，如山萮酸(behenic)和硬脂酸，以及陆马嗪(lumazine)(例如，2，4-二羟基蝶啶)。其它化合物包括3-溴丙磺酸盐(BPS)、丙炔酸和2-丁炔酸乙酯。
抗微生物剂还包括裂解酶，包括噬菌体溶菌酶、内溶素、溶菌酶、溶素、噬菌体溶素、溶肠壁素、胞壁质酶和病毒溶素。有用的酶具有水解细菌细胞壁中特定键的能力。特定的裂解酶包括但不限于：葡萄糖苷酶，它水解肽聚糖中氨基糖(如N-乙酰基胞壁酸和N-乙酰基葡糖胺)间的糖苷键；酰胺酶，它切割多糖链和交联肽之间的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸的酰胺连接；以及内肽酶，它水解肽间连接(如，半胱氨酸内肽酶)，和内异肽酶，它攻击来自甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)的产甲烷菌的假胞壁质。
此外，PNA也包括作为抗微生物试剂。PNA是肽-核酸杂交物，其中磷酸主链被获自N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单位的非手性中性主链取代(参见例如优卡生物科学系列(Eurekah Bioscience Collection)。人端粒酶的PNA和寡核苷酸抑制剂(PNA and Oligonucleotide Inhibitors of HumanTelomerase).G.Gavory和S.Balasubramanian，兰登生物科学公司(LandesBioscience)，2003)。通过亚甲羰基连接将A、G、T、C碱基连接于主链的氨基氮上(P.E.Nielsen等，Science 1991.254：1497-1500；M.Egholm等，Nature 1993.365：566-568)。PNA以高特异性与互补序列结合，并且相对类似的DNA或RNA，PNA具有更高亲合力(M.Egholm等，同上)。与对应的DNA/DNA或DNA/RNA双链体相比，PNA/DNA或PNA/RNA杂交物具有更高的热稳定性(M.Egholm等，同上)。由于非天然酰胺主链不被核酶或蛋白酶识别，因而PNA还具有高的化学和生物学稳定性(V.Demidov等，Biochem Pharmacol 1994.48：1310-1313)。通常PNA的长度至少为5个碱基，并包含末端赖氨酸。可将PNA PEG化以进一步延长其寿命(Nielsen，P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8：53-63)。
在一个具体方面，可将本发明抗体融合或连接于其它抗体或其片段。加入的抗体或抗体片段可靶向微生物细胞，或者特别是产甲烷菌细胞，或一种或多种细胞组件。例如，可靶向细胞表面蛋白质，如胞外受体。在某些方面，可利用对象中特异性表达的序列，如人或反刍动物序列工程改造所述抗体或抗体片段。还包括嵌合抗体，例如对于不止一种来源如一种或多种小鼠、人或反刍动物序列具有特异性的单克隆抗体或其片段。还包括羊驼抗体或纳米抗体。
本发明的抗体在靶向微生物细胞，具体说是产甲烷菌细胞中尤其有用。在某些方面，可利用该抗体与细胞壁或膜连接或结合，和/或抑制细胞的生长或复制。同样，可利用该抗体瞬时或长期与细胞连接，或介导细胞的死亡或吞噬，和/或裂解。为了实现靶向，可将微生物细胞与抗体接触，如本文详述，抗体可分离自宿主有机体，或产自表达载体和/或宿主细胞，或来自于合成或半合成化学方法。或者也可通过给予宿主有机体本文所公开的肽、多肽或多核苷酸使宿主有机体本身产生应答，从而产生抗体。应当理解的是，本发明抗体，以及对应的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、肽和多肽可用于靶向多种微生物，例如，反刍甲烷短杆菌和史氏甲烷短杆菌，前者是反刍动物中的主要产甲烷菌，后者是人体的主要产甲烷菌。在特定方面，将抗体、或对应多核苷酸、表达载体、宿主细胞、肽或多肽以本文详述的组合物形式，通过(例如)缓释瘤胃装置递送至对象。
在多种方面，可将本发明的试剂(例如一种或多种肽、多肽、多核苷酸和抗体)包含到组合物，例如，药物组合物，尤其是疫苗组合物中。该组合物包含，例如：a)分离的肽或其变化形式、片段、变体或衍生物；b)分离的肽或其变化形式、片段、变体或衍生物；c)分离的多核苷酸或其变化形式、片段、变体或衍生物；d)包含该多核苷酸的表达载体；e)包含该表达载体的宿主细胞；或(f)抗体或其变化形式、片段、变体或衍生物。根据公开的方法，本发明的组合物可专门包装为试剂盒的一部分，用于靶向和/或抑制微生物细胞，尤其是产甲烷菌细胞。该试剂盒包括至少一种本文所列组合物；以及用于靶向产甲烷菌或其它微生物细胞，或抑制其细胞生长或复制的使用说明。
对于疫苗，可使用多种方法增强抗原的免疫原性，例如，通过使用抗原颗粒、抗原聚合物和聚合；乳化剂；抗原微胶囊；杀死的细菌或细菌产物；化学佐剂和细胞因子；以及使抗原靶向抗原递呈细胞的试剂(综述参见Paul，基础免疫学(Fundamental Immunology)，1999，林普科特瑞文出版社，纽约(Lippincott-Raven Publishers，New York，NY)，1392-1405)。
可使用明矾沉淀使抗原颗粒化。使用氢氧化铝或磷酸铝，使所研究的抗原掺入到不溶性凝胶样沉淀中，或者通过静电作用与预先形成的凝胶结合。可对抗原进行轻度热聚集。还可使用显示自我组装的抗原。脂质体、病毒体和免疫染色复合物(ISCOM)也可用于形成颗粒。
为了促进聚合，非离子型嵌段共聚物可用作结合抗原的佐剂添加物，例如聚合物或聚氧丙烯以及聚氧乙烯。在森太公司(Syntex)(SAF-1，Syntex佐剂制剂1(Syntex Adjuvant Formulation-1))以及瑞比化学公司(RibiChemical Co.)生产的复合佐剂制剂组分中均可找到这些物质。甘露糖聚合物(如甘露聚糖)或β1-3葡萄糖聚合物(如葡聚糖)可以相似方法运用(OkawaY，Howard CR，Steward MW.用甘露聚糖偶联肽免疫小鼠后在小鼠体内产生抗肽的抗体(Production of anti-peptide antibody in mice followingimmunization of mice with peptides conjugated to mannan).J ImmunolMethods 1992；142：127-131；Ohta M，Kido N，Hasegawa T，等甘露聚糖侧链对于脂多糖佐剂功能的贡献(Contribution of the mannan side chains to theadjuvant action of lipopolysaccharides).Immunology 1987；60：503-507)。
可使用多种试剂进行乳化，包括油包水乳剂，如福氏佐剂(如福氏不完全佐剂)或其它包含表面活性剂稳定的小水滴的混合物，例如在矿物油或其它油如角鲨烷的连续相中的二缩甘露醇一油酸。另一方案使用水包油乳剂，例如MF5963(希龙公司(Chiron))，或包含鲨烯油滴、乳化剂吐温80和司盘85的混合物、以及化学免疫调节剂如胞壁酰二肽衍生物，如胞壁酰三肽-磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)的其它混合物(Valensi J-PM，Carlson JR，Van NestGA.用含MF59油剂和其它高级佐剂的三价流感疫苗免疫Balb/c小鼠后的全身细胞因子特征(Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized withtrivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advancedadjuvants).J Immunol 1994；153：4029-4039)。也可以混合物形式使用少量的聚山梨酯80和失水山梨醇三油酸酯。作为另一个例子，可使用SAF-165(森太公司(Syntex))或其它含有普罗流尼克L121、角鲨烯和吐温80的水包油混合物。
微胶囊，具体是可生物降解的微胶囊，可用于制备控释疫苗(ChangTMS.包含酶激素、疫苗和其它生物材料的可生物降解、半透性微胶囊(Biodegradable，semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones，vaccines and other biologicals).J Bioeng 1976；1：25-32；Langer R.大分子缓释聚合物：在一步法免疫中的用途(Polymers for the sustained release ofmacromolecules：their use in a single step method of immunization)MethodsEnzymol 1981；73：57-75)。氰基丙烯酸酯是另一种形式的可生物降解聚合物。例如，聚(2-氰基丙烯酸丁酯)可用作口服免疫的佐剂(O’Hagan DT，Palin KJ，Davis SS.聚(2-氰基丙烯酸丁酯)颗粒作为口服免疫的佐剂(Poly(butyl-2-cyanoacrylate)particles as adjuvants for oral immunization).Vaccine1989；7：213-216)。微胶囊可用于疫苗的粘膜给药。尤其适合的是极小的颗粒(纳米颗粒)。可通过肠衣聚合物对抗胃内消化，需要的话可用增加肠吸收的物质包衣。
除了杀死的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，还可使用多种细菌作为佐剂。当杀死的细菌制备物本身具有高度抗原性时，佐剂特性则扩展至共同给予的抗原。有用的有机体包括百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)以及巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。还可使用细菌的肽和脂质组分。示范性组分包括乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，或胞壁酰二肽(MDP)(Ellouz F，Adam A，CiorbaruR，Lederer E.细菌肽聚糖佐剂活性的必需结构(Minimal structuralrequirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans).BiochemBiophys Res Commun 1974；59：1317-1325)，MDP(莫拉丁酯)(Chedid L，Parant MA，Audibert FM等，新合成的无致热性胞壁酰二肽的生物学活性(Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid ofpyrogenicity)Infect Immun 1982；35：417-424)，苏氨酰MDP(Allison AC，Byars NE.一种选择性引起保护性抗体同种型的形成和细胞介导免疫的佐剂制剂(An adjuvant formulation that selectively elicits the formation ofantibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity).J ImmunolMethods 1986；95：157-168)以及MTP-PE。脂质佐剂可包含革兰阴性细菌，如大肠杆菌(Escherichia)、沙门菌(Salmonella)和假单胞菌(Pseudomonas)的LPS内毒素。在某些方案中，可对脂质A结构进行化学修饰以降低毒性但保留佐剂特性，例如单磷酰脂质A(MPL)(强生集团(Johnson AG)，Tomai M，Solem L，Beck L，Ribi E.无毒单磷酰脂质的表征(Characterization ofnon-toxic monophosphoryl lipid).Rev Infect Dis 1987；9：S512)。
可使用多种化学品作为佐剂，包括多核苷酸，如聚-I:C和聚-A:U，维生素D3、硫酸葡聚糖、菊糖、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDA)、阿夫立定(avridine)、类似甘露聚糖的糖聚合物以及海藻糖二霉菌酸酯(Morein B，
Figure GPA00001075274700321
-Bengtsson K，Cox J.现代佐剂：功能方面(Modern adjuvants：functional aspects)，Kaufmann SHE编，疫苗开发概念(Concepts in vaccinedevelopment).Berlin：Walter de Gruyter，1996：243-263)。也包括聚膦嗪(最早作为环式促进剂引入)和利什曼原虫(Leishmania)蛋白LeIF。细胞因子也可用作佐剂，例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF和IFN-γ。
为了靶向抗原递呈细胞，可使用C3d结构域、Fc结构域以及CTB结构域(Dempsey PW，Allison MED，Akkaraju S，Goodnow CC，Fearon DT.补体C3d作为分子佐剂：连接先天和后天免疫(C3d of complement as amolecular adjuvant：bridging innate and acquired immunity.Science1996；271：348-350)；Sun J-B，Holmgren J，Czerkinsky C.霍乱毒素B亚基：引起外周免疫耐受的有效跨粘膜载体-递送系统(Cholera toxin B subunit：anefficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheralimmunological tolerance.Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：10795-10799)；SunJ-B，Rask C，Olsson T，Holmgren J，Czerkinsky C.通过服用与霍乱毒素B亚基偶联的髓磷脂碱性蛋白治疗实验性自身免疫脑脊髓炎(Treatment ofexperimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic proteinconjugated to cholera toxin B subunit).Proc Natl Acad Sci USA1996；93：7196-7201)。
还可使用粘膜递送专用佐剂，如CT、LT和破伤风毒素的C片段(ElsonCJ，Ealding W.霍乱毒素粘膜刺激后小鼠体内广泛的全身和粘膜免疫(Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulationwith cholera toxin).J Immunol 1984；132：2736-2743；Holmgren J，Lycke N，Czerkinsky C.霍乱毒素和霍乱B亚基作为口腔粘膜佐剂和抗原载体系统(Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigenvector systems).Vaccine 1993；11：1179-1184；Clements JD，Hartzog NM，Lyon FL.大肠杆菌不耐热肠毒素的佐剂活性以及对于小鼠中诱导对非相关蛋白抗原口服耐受性的影响(Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labileenterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelatedprotein antigens).Vaccine 1988；6：269-277；Gomez-Duarte OG，Galen J，Chatfield SN，Rappuoli R，Eidels L，Levine MM.在伤寒沙门菌CVD 908疫苗菌株中表达与白喉毒素羧基末端融合的破伤风毒素C片段(Expression offragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheriatoxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain).Vaccine1995；13：1596-1602)。
治疗和诊断
本发明的肽、多肽、多核苷酸以及抗体被认为具有健康益处。在特定方面方面，靶向产甲烷菌的疫苗可用于恢复以甲烷形式从个体流失的能量。因此，本发明涉及上述任何方法所用的与药学上可接受载体联用的药物组合物(特别是疫苗组合物)。此类药物组合物可包含肽、多肽或抗体和细胞抑制剂的组合。或者，药物组合物可包含本文详述的多核苷酸、表达载体或宿主细胞。可单独给予该组合物或与至少一种其它药剂，如稳定化合物联合给予，可利用任何无菌的生物相容性药学载体，包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖和水给与该组合物。该组合物可单独给予对象或与其它药剂、药物(如抗微生物药物)或激素联合给予。
除了活性成分，这些药物组合物还可包含合适的药学上可接受的载体，包括利于将活性化合物加工成药学可用制剂的赋形剂和辅助剂。在最新版的雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Maack Publishing Co.，Easton，PA))可找到制剂和给药技术的更多细节。本发明使用的药物组合物可通过任何途径给予，包括但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠方式。
可使用本领域熟知的药学上可接受的载体，以口服给药合适剂量，配制用于口服给药的药物组合物。此类载体使药物组合物可以配制为片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬剂等，便于对象摄取。可通过以下方法获得口服用途的药物制剂：将活性化合物与固定赋形剂混合，任选将所得混合物研磨，在加入合适的辅助剂后将该混合物加工成颗粒，获得片剂或糖衣剂芯体。合适的赋形剂是糖或蛋白质填充物，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻米、土豆或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素或羧甲基纤维素钠；胶质物，包括阿拉伯胶和黄芪胶；以及蛋白质如明胶和胶原。需要的话，可加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，如藻酸钠。
可口服使用的其它药物制剂包括明胶制成的压接(push-fit)胶囊，以及明胶和包衣剂(coating)(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。压接胶囊可包含与填充剂或粘合剂，如乳糖或淀粉；润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁以及任选稳定剂混合的活性组分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于含有或不含稳定剂的合适液体，如脂肪油、液体或液体聚乙二醇中。糖衣剂芯体可与合适的包衣剂，如浓缩糖溶液联合使用，其中还可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣剂包衣中，用于标示产品或表征活性化合物的量，即剂量。
可用水性溶液，优选生理相容性缓冲液，如汉克斯溶液、林格溶液或生理缓冲盐水配制适合胃肠道外给药的药物制剂。水性注射悬液可包含增加悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖苷。此外，活性化合物的悬液可制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。也可使用非脂质聚阳离子氨基酸聚合物进行递送。悬液可任选包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度以制备高浓缩溶液的试剂。对于局部或鼻腔给药，在制剂中使用适合要渗透的特定屏障的渗透剂。本领域通常了解此类渗透剂。
本发明的药物组合物可以本领域所知方式制造，如，通过常规的混合、溶解、造粒、制造糖衣剂、水飞、乳化、包胶、包封或冻干工艺的方法。可以盐的形式提供药物组合物，所述盐可用多种酸形成，包括但不限于：盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。在水性或其它质子溶剂中盐比对应的游离碱形式更易于溶解。在其它情况下，优选制剂可以是包含下列任何或所有成分的冻干粉末：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5，在使用前与缓冲液组合。药物组合物制备后，可将其放置于合适的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于本发明组合物的给药，此标签可包含给药量、频率和方法。
适用于本发明的药物组合物包括包含有效量活性组分以达到预期目的的组合物。对于任何化合物，最初可在细胞实验中，如微生物细胞或具体说，在产甲烷菌细胞中，或在动物模型中，通常是小鼠、兔、狗或猪或反刍动物如绵羊、牛、鹿或山羊中估计治疗有效剂量。还可使用动物模型确定合适的浓度范围和给药途径。此类信息还可用于确定有用的给药剂量或途径。通常给药剂量可以是0.1-100,000微克，甚至总剂量约为1g，这取决于给药途径。文献中提供了有关具体剂量和递送方法的指南，本领域实施人员可获得这些指南。与递送多肽相比，本领域熟练技术人员将使用不同制剂递送多核苷酸。相似地，肽、多肽、多核苷酸或抗体的递送对于特定细胞、病症、位置等而言是不同的。
实施者根据需要治疗对象相关的因素确定准确剂量。对剂量和给药进行调整以提供足够水平的活性试剂或维持所需效果。需要考虑的因素包括疾病状况的严重性、对象的总体健康状况、年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、联合用药、对治疗的反应敏感性以及耐受/响应。根据特定制剂的半衰期和清除率，长效药物组合物可每3-4天，每周或每两周给予一次。可将该组合物与本文所述一种或多种其它抗微生物试剂，包括抗甲烷生成化合物(例如溴乙基磺酸)、抗体或抗体片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或其它抗生素共同给予。共同给药可同时或依次进行，或者可用重复给药替代。
本发明组合物(如药物组合物)尤其有用的是缓释配方或原理。例如，瘤胃内装置包括但不限于：新西兰埃格瑞饲料公司(Agri-Feeds Ltd.，NewZealand)时间胶囊TM丸范围，最初由新西兰爱吉研究公司开发(AgResearchLtd.，New Zealand)，如WO 95/19763和NZ 278977所公开的，以及新西兰奥克兰的纽法姆公司的分支机构纽法姆健康和科学公司的CAPTEC(Nufarm Health&Sciences，a division of Nufarm Ltd.，Auckland，NewZealand)，如AU 35908178，PCT/AU81/100082和Laby等，1984，Can.J.Anim.Sci.64(增刊)337-8所公开的，将所有这些参考文献纳入本文作参考。作为特定的例子，该装置可包括弹簧和柱塞，迫使组合物穿过同末端的孔。
作为另一实施方式，本发明涉及作为水补充物的组合物如进水组合物，和食物补充剂如反刍动物饲料组分，用于上述任何方法。在特定方面，食物补充剂包含至少一种可食用的植物材料以及本发明的肽或多肽。或者，食物补充剂包含至少一种可食用的植物材料以及本文公开的肽或多肽，或编码本文公开的肽或多肽的多核苷酸，例如，表达载体或含有表达载体的宿主细胞的形式。具体说，组合物还包含与所得序列融合或连接的细胞抑制剂。优选的植物材料包括干草、草、谷物或粗磨粉中的任一种，例如，豆科干草、禾本科干草、玉米青贮、禾本青贮、豆科青贮、玉米粒、燕麦、大麦、酿酒谷物、啤酒谷物、大豆粗磨粉和棉籽粗磨粉。具体说，禾本青贮可用作反刍动物的食物组合物。可对植物材料进行遗传改造，使其包含本发明的一种或多种组分，如一种或多种多肽或肽、多核苷酸或载体。
在另一实施方式中，特异性结合本发明肽、多肽或多核苷酸的抗体可在监测微生物水平的实验种用于测定该微生物，尤其是产甲烷菌的存在。同上所述可以相同的方法制备用于诊断目的的抗体。诊断实验包括使用抗体和标签检测人体体液或细胞或组织提取物中肽或多肽的方法。可使用修饰或未修饰的抗体，通过共价或非共价方式将报告分子与其结合进行标记。可使用本领域所知的多种不同的报告分子，上文对其中几个进行了描述。
本领域已知用于测量肽、多肽或多核苷酸水平的多种实验方案(如ELISA、RIA、FACS)，为诊断微生物，尤其是产甲烷菌的存在或水平提供了基础。通过在适合形成复合物的条件下将来自正常对象如正常人或反刍动物的体液或细胞提取物与抗体组合，从而确定正常或标准水平。利用各种方法可对标准复合物的形成量进行定量，但优选分光光度法。将对象、对照和治疗样品(如来自疫苗接种对象的样品)中表达的肽、多肽或多核苷酸的量与标准值进行比较。标准值和对象值之间的偏差确定了用于测定微生物存在或水平的参数。
在本发明的另一实施方式中，通过使用特定杂交和/或扩增技术，可将多核苷酸用于诊断目的。可使用的多核苷酸包括寡核苷酸、互补RNA和DNA分子和PNA。多核苷酸可用于检测或定量测定样品中的基因表达，其中表达与微生物的存在或水平相关。可使用诊断实验区分微生物水平的不存在、存在和改变，并在治疗干预中监测水平。
在一个方面，可利用与PCR探针的杂交鉴定核酸序列，尤其是基因组序列，其编码本发明的肽或多肽。无论探针产生于高度特异性的区域，如5’调节区的10个独特核苷酸，或者较低特异性的区域，如3′编码区，探针的特异性以及杂交或扩增的严谨性(最大、高、中等或低)将决定该探针是否仅仅识别天然产生的序列、等位基因或相关序列。探针也可用于检测相关序列，并应该优选包含来自任何编码序列的至少50％核苷酸。本发明的杂交探针可以是DNA或RNA，并来源于核苷酸序列SEQ ID NO：703-1373或其互补或修饰序列，或来自于包含天然产生序列的启动子和增强子元件的基因组序列。
用于产生特异性DNA杂交探针的方法包括将核酸序列克隆入载体以产生mRNA探针。本领域了解此类载体，它们可购得，并且通过加入合适的RNA聚合酶和合适的标记核苷酸可将它们用于体外合成RNA探针。可通过多种报告基团对杂交探针进行标记，这些报告基团例如放射性核素如32P或35S，或酶标记，如通过亲和素/生物素偶联系统偶联至探针的碱性磷酸酶等。多核苷酸可用于Southern或northern分析，点印迹或其它基于膜的技术；用于PCR技术；或者用于试纸条、狭缝、ELISA实验或微阵列，用来自对象活检的液体或组织检测微生物的存在和水平。本领域熟知此类定性或定量的方法。
在一个特定方面，核酸序列可用于各种标准方法标记的实验，并在适合杂交和/或扩增的条件下加入来自对象的液体或组织。孵育合适的时间后，洗涤样品，对信号进行定量并与标准值比较。如果受试样品的信号量与可比较的对照样品的信号量相比发生了显著的改变，那么样品中出现核苷酸序列水平的改变表明微生物的出现或水平。还可使用此类实验评价特定疫苗接种方案在动物研究、临床实验或者监测对象治疗中的效果。
为了提供微生物出现或水平的诊断基础，需确定表达的正常或标准特征。通过在适合杂交和/或扩增的条件下，将来自正常对象的体液或细胞提取物与多核苷酸或其片段混合，来完成这项实验。通过比较获自正常对象的值与获自使用已知量基本纯化多核苷酸的实验中的值，可对标准水平进行定量。可将来自正常样品的标准值与来自针对微生物生长进行治疗的对象的值进行比较。利用标准值和对象值之间的偏差测定微生物的存在或水平。
一旦鉴定了微生物并开始了疫苗接种方案，则在常规基础上进行重复的杂交和/或扩增实验以评价相对于正常对象中观察到的表达水平，对象中的表达水平是否开始降低。来自连续实验的结果可用于显示疫苗接种在数天至数月的效果。
由核酸序列设计的寡核苷酸的特定诊断用途可包括使用PCR。此类寡聚体可以是化学合成、酶学方法产生或体外产生的。寡聚体优选由两个核苷酸序列组成，一个为正义方向(5′-＞3′)，另一个为反义方向(3′-＞5′)，在为鉴定具体基因或条件的优化条件下使用。在用于检测和/或定量测定紧密相关的DNA或RNA序列的较低严谨性条件下，使用相同的两种寡聚物，巢式寡聚物集合或寡聚物简并库。
可用于定量测定表达的方法包括放射性标记或生物素化核苷酸，对照核酸共扩增以及可通过插值获得实验结果插值的标准曲线(Melby，P.C.等(1993)J.Immunol.Methods，159：235-244；Duplaa，C.等(1993)Anal.Biochem.229-236)。可通过以ELISA形式进行实验加快多个样品的定量速度，其中感兴趣的寡聚物以各种稀释度出现，通过分光光度法或比色法进行快度定量。
在另外的实施方式中，源自本发明所述任何多核苷酸的寡核苷酸或更长的片段可用作微阵列中的靶点。可使用微阵列同时监测大量基因的表达水平(产生转录物图像)，并鉴定遗传变体、突变和多态性。可使用该信息确定基因功能，了解疾病的遗传学基础，诊断疾病，开发并监测治疗剂活性。在一个实施方式中，根据本领域所知方法制备和使用微阵列，如PCT申请WO 95/11995(Chee等)，Lockhart，D.J.等(1996；Nat.Biotech.14：1675-1680)以及Schena，M.等(1996；Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619)所述。
在一个方面，可使用化学偶联步骤和喷墨打印应用设备，如PCT申请WO 95/251116(Baldeschweiler等)所述在微阵列表面合成寡核苷酸。在另一方面，可使用类似于斑点或狭缝印迹的“网状”阵列(HYBRIDOT设备，生命科技公司(Life Technologies))，利用真空系统、热、UV、机械或化学连接步骤将cDNA片段或寡核苷酸安置和连接至基材表面。在另一方面，可手工或利用可获得的设备、材料或机器(包括多道移液器或机器人仪器；布林克曼公司，韦斯特伯里，纽约州(Brinkmann，Westbury，N.Y.))生产阵列，该阵列可包括例如24、48、96、384、1024、1536或6144或更多个点或孔(如多孔板)，或从2-1,000,000的任何倍数，以便充分利用市售仪器。
为了用微阵列进行样品分析，从生物制品中抽提多核苷酸。可从任何体液(血液、尿液、唾液、痰、胃液等)，培养细胞，活检物或其它组织制备物中获取生物样品。为了生产探针，使用抽提自样品的多核苷酸产生与阵列上核酸互补的核酸序列。如果微阵列由cDNA组成，则反义RNA是合适的探针。因此，在一个方面，使用mRNA产生cDNA，进而在荧光核苷酸存在下用cDNA产生片段或反义RNA探针。将这些荧光标记的探针与微阵列孵育，以使探针序列与微阵列的cDNA寡核苷酸杂交。在另一方面，用作探针的核酸序列可包含使用杂交技术领域熟知的限制酶、PCR技术和寡聚物标记试剂盒(安法马西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech))产生的多核苷酸、片段和互补或反义序列。
在本发明的另一实施方式中，可利用本发明的肽或多肽、或其功能性或免疫原性片段或寡肽通过任何药物筛选技术筛选化合物文库。此类筛选所用片段可在溶液中游离，附加于固体支持物、携带于细胞表面或定位于细胞内部。可检测肽或多肽和受试物间的结合复合物的形成。
公开的PCT申请WO 84/03564描述了一种药物筛选技术，它可用于高通量筛选对感兴趣肽或多肽具有合适亲和力的化合物。在该方法中，在固体基质如塑料针或一些其它表面上合成大量不同的小受试化合物。受试化合物与肽或多肽或其片段反应，然后洗涤。然后利用本领域熟知方法检测结合的肽或多肽。还可将纯化的肽或多肽直接包被在板上，用于上述药物筛选技术。或者，可使用非中和抗体捕获肽并将其固定到固体支持物上。
在另一项技术中，可使用竞争性药物筛选实验，其中能够结合肽或多肽的中和抗体与受试化合物特异性竞争结合所述肽或多肽。以此方式，可使用该抗体检测与该抗体具有相同的一个或多个抗原结合位点的受试化合物的存在。
实施例
本文所述实施例用以解释本发明的实施方式。其它实施方式、方法和分析类型在分子诊断领域的一般技术人员技术范围内，无需在此赘述。其它本领域范围内的实施方式也应作为本发明的一部分。
实施例1：基因组大小估测
反刍甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)菌株M1T(DSM1093)生长于BY+培养基中(基本培养基，Joblin等，1990)，该培养基由[g/l]NaCl(1)、KH2PO4(0.5)、(NH4)2SO4(0.25)、CaCL2.2H2O(0.13)、MgSO4.7H2O(0.2)、K2HPO4(1)、澄清反刍液(300ml)、dH2O(360ml)、NaHCO3(5)、刃天青(0.2ml)、L-盐酸半胱氨酸(0.5)、酵母提取物(2)以及巴赫微量元素溶液(10ml)(加入微量元素；Balch等，1979)组成，由(g/l)三乙酸腈(1.5)、MgSO4.7H2O(3)、MnSO4.H2O(0.5)、NaCl(1)、FeSO4.7H2O(0.1)、CoCl2.6H2O(0.1)、CaCl2.2H2O(0.1)、ZnSO4.7H2O(0.1)、CuSO4.5H2O(0.01)、AlK(SO4)2.12H2O(0.01)、H3BO3(0.01)、Na2MoO4.2H2O(0.01)、NiSO4.6H2O(0.03)、Na2SeO3(0.02)和Na2WO4.2H2O(0.02)组成。在液氮中冷冻细胞团并用预冷的无菌研钵和杵研磨，抽提基因组DNA。将细胞匀浆液包埋于琼脂糖塞中，后续操作在栓中进行以减少对基因组DNA的物理剪切。用限制性核酸内切酶进行消化，用脉冲场电泳(PFGE)分离DNA片段。
实施例2：DNA克隆和测序
安进科生物科学公司(美国麻省)(Agencourt Biosciences Corporation(Massachusetts，USA))使用随机鸟枪克隆方案(Fleischmann等，1995)，马克基因公司(美国马里兰州洛克维尔)(Macrogen Corporation(Rockville，MD，USA))使用焦磷酸测序对反刍甲烷短杆菌的基因组DNA进行测序。简单的说，通过随机物理破坏基因组DNA和电泳分离片段在大肠杆菌中构建反刍甲烷短杆菌的DNA文库。从凝胶中回收40Kb范围内的大片段，并用于产生大的插入f粘粒文库。回收2-4kb范围的DNA片段并用于产生小的插入质粒文库。培养大和小的插入文库所得的克隆，回收其f粘粒或质粒DNA并用高通量测序技术进行测序。对足够数量的克隆进行测序以达到对反刍甲烷短杆菌基因组理论上8倍的覆盖。通过对随机剪切的基因组DNA片段进行焦磷酸测序获得额外的序列覆盖度(马克基因集团(MacrogenCorporation))，最终理论基因组覆盖度达到约10倍。
实施例3：序列组装和注释
比对DNA序列以找到交叠序列，并利用帕拉赛基因组组装者(ParacelGenome Assembler)(帕拉赛公司，加利福尼亚州，美国)(Paracel Inc，CA，USA)和Staden软件包(Staden等，1998)，与来自标准和反向PCR的序列组合组装成毗连序列(毗连群)。使用开放阅读框(ORF)寻找器GLIMMER(基因定位插值马尔可夫模型ER)(Gene Locator Interpolated Markov Model ER，Delcher等，1999)分析毗连群，利用缺口BLAST(基础本地比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul等，1997)在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的非冗余核苷酸和蛋白质数据库中对每一ORF进行分析。
通过以随机方式人工连接来自8倍草图噬菌体序列的毗连群产生“假分子”，并提交给基因组研究所(The Institute for Genomic Research)(TIGR，美国华盛顿特区)(TIGR，DC，USA)进行自动注释。用GLIMMER对来自10倍焦磷酸测序组装的毗连群再次进行分析，并且用GAMOLA(复杂现场Blast DNA序列全局注释(Global Annotation of Multiplexed On-site BlastedDNA sequences)；Altermann和Klaenhammer，2003)对ORF进行自动注释。随后对自动注释进行人工校验。利用直系同源蛋白聚类(COG)数据库，根据功能对ORF分类(阈值1e-02)(Tatusov等，2001)。
分别利用全局和局部比对(http://pfam-wustl.edu)以及标准和片段模式TIGRFAM HMM模型(http://www.tigr.org/TIGRFAMs)(阈值1e-02)，使用PFAM HMM和TIGRFAM文库通过HMMER(http://hmmer.wustl.edu)对蛋白基序进行确定。用TRNASCAN-SE鉴定tRNA(Lowe和Eddy，1997)，用KODON软件包(应用数学公司，美国得克萨斯州奥斯汀)(Applied Maths，Austin，TX，USA)和REPUTER(Kurtz和Schleiermacher，1999)鉴定核苷酸重复。用GENEWIZ构建基因组图谱(Jensen等，1999)。利用内部开发的软件(PathwayVoyager；Altermann和Klaenhammer，2005)，从预测的反刍甲烷短杆菌ORF组和KEGG(京都基因与基因组百科全书)(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，Kanehisa等，2004)在线数据库重建通路。
实施例4：测序结果和分析
通过限制性酶消化基因组DNA和通过PFGE测定片段大小进行反刍甲烷短杆菌基因组大小的估测，表明单条染色体大小约2.5-2.9Mb。大和小插入克隆的初始测序(6倍草图覆盖)以及将序列组装为毗连群表明基因组中40Kb的区域出现频率非常高(over-represented)(＞20倍)，特别是在小插入物文库中。可能的原因是在用于DNA抽提的培养物的生长过程中，高拷贝数的质粒(尽管没有鉴定到染色体外DNA)或溶原性细菌噬菌体复制。因为这种巨大序列偏向，所以仅对大插入克隆进行再次测序(2倍理论基因组覆盖)，从Sanger测序中产生最终的8倍覆盖。将8倍草图阶段(phase)序列组装为通过105个支架连接的756个毗连群。进一步进行焦磷酸测序，以实现额外约10倍的覆盖，将这些序列掺入组装物使毗连群的数目降至27。使用反向和长范围PCR技术的后续缺口连接过程使毗连群数目降至14。
该14-毗连群序列的合并长度表明，该基因组略大(2,920,443bp)于PFGE估计的大小(图1A)，显著大于其最接近的亲缘菌史氏甲烷短杆菌(M.smithii)(1.9Mb)。32.7％的％G+C接近反刍甲烷短杆菌菌株的报道范围27.5％-31.6％(Balch等，1979)。序列分析预测到2672个ORF，图1B报道蛋白质家族命中(TIGRFam和PFam)和直向同源组类群(COG)的总数。这里列出了预测参与由H2+CO2和甲酸生成甲烷的所有基因(图1C和图6A-6C)。然而，反刍甲烷短杆菌的草图序列缺少甲基辅酶还原酶II(mcr II或mrt)系统。在其它产甲烷菌中，mcrII类群编码甲基CoM还原酶I酶的同工酶，它在H2分压较高的生长条件下上调(Reeve等，1997)。H2在瘤胃中快速使用，不会累积至高水平，因此反刍甲烷短杆菌似乎能适应只通过mcr I系统利用低水平的H2。
将反刍甲烷短杆菌的基因组草图与密切相关的史氏甲烷短杆菌和热自养甲烷嗜热杆菌(Mt.thermoautotrophicus)进行比较，发现数个不同区域。一些基因差异编码富天冬酰胺/苏氨酸大蛋白家族的非常大的表面蛋白，它们可含有在瘤胃环境中可能介导与表面或其它微生物相互作用的CPOMP和DUF11重复序列(分别是衣原体多态性外膜蛋白和未知功能结构域)(参见图7A-7C)。在斯氏甲烷球形菌(Ms.stadtmanae)和史氏甲烷短杆菌基因组编码的大表面蛋白中均找到相似的重复序列(Samuel等，2007)。
先前报道反刍甲烷短杆菌产生荚膜(Smith和Hungate，1958)，并且序列分析表明它编码超过50个参与外泌多糖合成和运输的基因(糖基转移酶(GT)、其它转移酶、差向异构酶和转运蛋白)，证明它利用多糖修饰其表面(参见图8A-8C)。反刍甲烷短杆菌具有至少30种糖基转移酶(6种GT1、21种GT2、2种GT4以及1种GT66；参见图8A-8C)，史氏甲烷短杆菌则有28种(1种GT1、22种GT2、4种GT4以及1种GT66)，斯氏甲烷球形菌有41种(2种GT1、26种GT2、12种GT4以及1种GT66)(Samuel等，2007；Fricke等，2006；Coutinho和Henrissat，1999)。这些有机体使用相对大量的基因编码表面多糖，表明这是它们在胃肠道环境中存活的重要因素。
核苷酸重复分析表明在反刍甲烷短杆菌基因组中存在至少两个间隔物散在直接重复(Spacer Interspersed Direct Repeat)(SPIDR)区。SPIDR是由异源序列间隔的相同单元形成的核苷酸重复(通常少于40nt)，在原核细胞中首次鉴定到该序列(Jansen等，2002)。反刍甲烷短杆菌的SPIDR I具有独特的遗传排列，由侧接含有相关cas基因簇的17kb区域的两个相同重复结构构成。在多种产甲烷菌的基因组中找到了相似的重复结构。詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)包含18个拷贝的多拷贝重复核苷酸元件(Bult等，1996)，它们由长(391-425bp)重复片段、后接多达25个短(27-28bp)重复片段组成，短重复片段本身被31-51bp的独特序列间隔开。斯氏甲烷球形菌的基因组包含某一30bp元件重复59次的4.8Kb区域(Fricke等，2006)。热自养甲烷嗜热杆菌包含两个扩展重复(大小为3.6和8.6kb)，它们含有372-bp的重复序列，后接被长34-38bp的独特序列间隔开的47和124个拷贝的相同30bp重复序列(Smith等，1997)。这些SPIDR的生物学功能未知，但目前的假设推测此系统是真核小干扰RNA系统的功能类似物，代表了根据反义RNA原理对抗外源复制子的防御系统(Jansen等，2002；Haft等，2005；Godde和Bickerton，2006；Makarova等，2006)。
反刍甲烷短杆菌基因组还编码许多经预测编码具有跨膜结构域的蛋白质的0RF，因此预计这些蛋白质具有暴露于细胞表面的区域(图9A、9B和9C)。
实施例5：抗体产生与测试
制备反刍甲烷短杆菌的细胞壁：在液氮下冷冻细胞团并用预冷的无菌研钵和杵研磨，制备反刍甲烷短杆菌的细胞壁。经细磨的细胞重悬于胰蛋白酶磷酸缓冲液(40mg胰蛋白酶/200ml 0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.9)中并在37℃孵育2小时。然后将该制备物在4℃下48,000g离心30分钟，用无菌蒸馏水洗涤所得团块两次，并冷冻干燥。
抗体制备：从反刍甲烷短杆菌的基因组序列中鉴定出九条预测位于细胞外部的肽序列，选作潜在抗原。合成这些肽，每种5mg(英骏公司(Invitrogen))，并用质谱鉴定其纯度。肽及其编码序列如图4所示。全长核酸和氨基酸序列如图5所示。每种肽取2mg(未偶联)用于ELISA，取3mg与钥孔血蓝素(KLH)偶联用于免疫动物。
疫苗接种程序如图2所述，并按照如下步骤进行。每次免疫使用一只绵羊(1-3岁)，并在第0天预放血得到2-5ml免疫前血清。然后在第0天通过10-15个部位皮内(ID)注射CFA(完全福氏佐剂)配制的200μg未偶联肽进行初次免疫。在第14天通过10-15个部位皮内(ID)注射IFA(不完全福氏佐剂)配制的200μg LH-肽，在第28天通过10-15个部位注射CFA配制的200μg KLH-肽。在第56、70、84、98和112天，再在10-15个部位皮内(ID)注射IFA配制的200μg KLH-肽5次。在第42、56、84和112天进行4次验血(2-5ml)。在标准程序结束时进行生产性放血，以获取约1,000ml抗血清。
通过酶联免疫吸附实验(ELISA)，使用高结合96孔中结合于固相的肽-GGG(山羊γ球蛋白)(0.1μg/100μl/孔)测定抗体滴度。首先将血清稀释50倍，然后进行2倍连续稀释。通过使405nm处OD值等于0.2的稀释因数估计值计算ELISA滴度，其获自连续稀释曲线的非线性回归分析。使用HRP偶联的第二抗体和ABTS底物进行检测。
绵羊对疫苗接种的抗体反应如图3所示。所有绵羊血清在第6周时的滴度至少为免疫前的32倍(1∶1600)。最具抗原性的制备物是mtrD肽，它所产生的滴度是免疫前水平的1024倍。免疫原性最弱的制备物是mtrE肽、ORF508和ORF819表面蛋白肽。反刍甲烷短杆菌细胞壁制备物诱导理想的抗体应答(是免疫前水平的256-倍)，尽管进行数次加强注射，但这种应答维持不超过15周。
抗体与反刍甲烷短杆菌细胞的结合：使用ELISA实验测定与反刍甲烷短杆菌细胞结合的抗体，步骤如下：用反刍甲烷短杆菌全细胞(含40μl细胞的碳酸钠缓冲液2ml)和反刍甲烷短杆菌胞浆蛋白质组分包被MaxiSorpELISA板(Nunc)。用含1％w/v酪蛋白的PBS吐温20对血清样品进行1/20稀释(25μl加入475μl稀释剂)，并在室温孵育1小时。用PBS吐温20洗涤板6次。包括阴性对照血清，该对照血清获自未吃过初乳的绵羊。
用于检测的偶联物是驴抗绵羊/山羊IgG HRP(斯罗泰克(Serotec)公司产品，批次号061005星号88P)，在每孔中加入50μl的1/5000稀释物(2μl加入10ml稀释剂)。然后加入3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物(50μl/孔)，室温下避光孵育反应15分钟。然后加入终止液(0.05M H2SO4，50μl/孔)并在450nm读板。
反刍甲烷短杆菌生长抑制测试：在无氧罩中融化免疫血清样品，10个样品中各取0.1ml加入1.5ml微量离心管中。在无氧罩中室温下开盖孵育混合物(1ml)过夜以去除任何溶解氧。免疫前血清用作阴性对照。在无氧罩中，将组合的血清样品(0.3ml)加入含5ml正在生长的反刍甲烷短杆菌培养物的亨格特管中，一式三份进行实验。将气体(80％H2和20％CO2)泵入亨格特管中，并将培养物置于39℃摇床孵育(100rpm)。用分光光度计测定600nm的OD，并通过气相色谱测定氢的使用和甲烷的产生，从而监测产甲烷菌的生长。
ELISA实验表明产自每一抗原的抗体与固定于微孔板上的反刍甲烷短杆菌细胞结合。抗体在体外能够与反刍甲烷短杆菌细胞结合，但加入反刍甲烷短杆菌培养物的单个抗体制备物不能抑制产甲烷菌生长或者降低甲烷产量。然而，包含来自10种不同抗原抗血清的汇集样品的制备物似乎在加入反刍甲烷短杆菌培养物时增加了细胞的聚集。
实施例6：概述
选择反刍甲烷短杆菌进行基因组测序是因为它在各种饲养条件下的反刍动物瘤胃中广泛存在(基于培养和分子检测数据)，容易获得培养物，易于进行实验室常规培养以及可获得关于这种有机体的大量的前期研究数据和背景文献。已经为反刍甲烷短杆菌内大量基因指定功能，从而对瘤胃内此种有机体的生活方式进行详细描述。反刍甲烷短杆菌对简单底物(H2+CO2，甲酸)的依赖性以及它通过表面蛋白和外泌多糖与瘤胃环境的相互作用是重要的抑制靶点。相似地，SPIDR有可能用于特异性靶向反刍甲烷短杆菌，以及有助于确定基因功能的遗传学操纵。这些序列数据阐明了此种生物体的代谢机制和它与其它微生物相互作用的方式，并且指出产甲烷菌中的保守性系统和组件，可对这些系统和组件进行灭活以消除或减少瘤胃中形成的甲烷。
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将上述说明书提及的所有公开物和专利全文纳入本文作参考。如果参考上述说明书中提及具有已知等同形式的内容，那么将这些等同形式也纳入本文，就好像在本文中单独列出那样。虽然已结合具体的优选实施方案对本发明作了描述，但应了解，如权利要求所述，本发明不应过分地受限于这些具体实施方案。应当理解的是在不背离本发明的构思和范围的情况下，可对本发明作进一步的修改。

Claims (62)

1.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列。
2.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：10-17的氨基酸序列。
3.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：18-44的氨基酸序列。
4.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：45-260的氨基酸序列。
5.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：261-331的氨基酸序列。
6.一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：332-702的氨基酸序列。
7.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列具有90％相同性。
8.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：10-17的氨基酸序列具有90％相同性。
9.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：18-44的氨基酸序列具有90％相同性。
10.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：45-260的氨基酸序列具有90％相同性。
11.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：261-331的氨基酸序列具有90％相同性。
12.一种分离的多肽，其与选自SEQ ID NO：332-702的氨基酸序列具有90％相同性。
13.一种分离的多肽或肽，其包含选自SEQ ID NO：10-17的氨基酸序列的胞外区。
14.一种分离的多肽或肽，其包含选自SEQ ID NO：45-260的氨基酸序列的胞外区。
15.一种分离的多肽或肽，其包含选自SEQ ID NO：332-702的氨基酸序列的胞外区。
16.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列。
17.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：10-17的氨基酸序列。
18.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：18-44的氨基酸序列。
19.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：45-260的氨基酸序列。
20.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：261-331的氨基酸序列。
21.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：332-702的氨基酸序列。
22.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：10-17的氨基酸序列的胞外区。
23.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：45-260的氨基酸序列的胞外区。
24.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：332-702的氨基酸序列的胞外区。
25.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：703-710的核苷酸序列。
26.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：711-736的核苷酸序列。
27.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：737-931的核苷酸序列。
28.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：932-1002的核苷酸序列。
29.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1003-1373的核苷酸序列。
30.一种分离的多核苷酸，其与权利要求16-29中任一项所述的多核苷酸互补。
31.一种编码权利要求1-12中任一项所述多肽的载体。
32.一种编码权利要求13-15中任一项所述多肽或肽的载体。
33.一种包含权利要求16-30中任一项所述多核苷酸的载体。
34.一种包含权利要求31-33中任一项所述载体的宿主细胞。
35.如权利要求34所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是原核细胞。
36.如权利要求35所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是大肠杆菌。
37.如权利要求34所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是产甲烷菌。
38.如权利要求37所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌。
39.一种偶联物分子，其包含权利要求1-12中任一项所述多肽。
40.一种偶联物分子，其包含权利要求13-15中任一项所述的多肽或肽。
41.一种融合分子，其包含权利要求1-12中任一项所述多肽。
42.一种融合分子，其包含权利要求13-15中任一项所述的多肽或肽。
43.一种与权利要求1-12中任一项所述多肽结合的抗体或抗体片段。
44.一种与权利要求13-15中任一项所述多肽或肽结合的抗体或抗体片段。
45.如权利要求43或44所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段是多克隆的。
46.如权利要求43或44所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段是单克隆的。
47.一种偶联物分子，其包含权利要求43-46中任一项所述的抗体或抗体片段。
48.如权利要求47所述的偶联物分子，其特征在于，所述分子还包含抗甲烷生成化合物、信号序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
49.一种融合分子，其包含权利要求43-46中任一项所述的抗体或抗体片段。
50.如权利要求49所述的融合分子，其特征在于，所述分子还包含抗甲烷生成化合物、信号序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
51.一种包含权利要求43-46中任一项所述抗体的药物组合物。
52.一种包含权利要求39、40、47和48中任一项所述偶联物分子的药物组合物。
53.一种包含权利要求41、42、49和50中任一项所述融合分子的药物组合物。
54.一种靶向产甲烷菌细胞以便鉴定、分离或抑制的方法，所述方法包括：a)任选地产生或分离权利要求43-46中任一项所述的抗体或抗体片段；和b)将所述细胞与所述抗体或抗体片段相接触。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌菌株M1T(DSM1093)。
57.一种靶向产甲烷菌细胞以便鉴定、分离或抑制的方法，所述方法包括：a)任选地产生或分离权利要求47或48所述的偶联物分子；和b)将所述细胞与所述偶联物分子相接触。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌菌株M1T(DSM1093)。
60.一种靶向产甲烷菌细胞以便鉴定、分离或抑制的方法，所述方法包括：a)任选地产生或分离权利要求49或50所述的融合分子；和b)将所述细胞与所述融合分子相接触。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述细胞是反刍甲烷短杆菌菌株M1T(DSM1093)。
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