BRPI0817312B1 - Métodos de inibição de uma célula metanógena, e composição farmacêutica - Google Patents

Métodos de inibição de uma célula metanógena, e composição farmacêutica Download PDF

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Li Dong
Kong Zhanhao
Rose Schofield Linley
Dey Debjit
Mary Tootill Catherine
Sang Carrie
Diana Moon Christina
Hendricus Janssen Petrus
Trevor Attwood Graeme
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Description

(54) Título: MÉTODOS DE INIBIÇÃO DE UMA CÉLULA METANÓGENA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA (51) Int.CI.: C07K 14/01; C07H 21/04; C12N 7/01 (30) Prioridade Unionista: 22/11/2007 US 60/989,840, 22/11/2007 US 60/989,841, 25/09/2007 US 60/975,104 (73) Titular(es): PASTORAL GREENHOUSE GAS RESEARCH LIMITED (72) Inventor(es): ERIC HEINZ ALTERMANN; SINEAD LEAHY; ROBERT STARR RONIMUS; DONG LI; ZHANHAO KONG; LINLEY ROSE SCHOFIELD; DEBJIT DEY; CATHERINE MARY TOOTILL; CARRIE SANG; CHRISTINA DIANA MOON; PETRUS HENDRICUS JANSSEN; GRAEME TREVOR ATTWOOD; WILLIAM JOHN KELLY
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS
DE INIBIÇÃO DE UMA CÉLULA METANÓGENA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. No. 60/975.104, depositado em 25 de setembro de 2007, Pedido U.S. No. 60/989.840, depositado em 22 de novembro de 2007, e Pedido U.S. No. 60/989.841, depositado em 22 de novembro de 2007, os conteúdos de todos os quais são, desse modo, incorporados aqui por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a composições e a métodos para distribuição de moléculas inibitórias em células microbiais, em particular, células de metanogênio. Especificamente, a invenção se refere a peptídeos e polipeptídeos de sinal compreendendo estes peptídeos, bem como poli15 nucleotídeos que codificam estes peptídeos ou polipeptídeos. A invenção também se refere a vetores de expressão e células hospedeiras para produção destes peptídeos ou polipeptídeos. A invenção se refere adicionalmente a métodos para detecção, direcionamento, permeabilização e inibição de células microbiais, especialmente células de metanogênio, usando os peptídeos ou polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores de expressão e células hospedeiras descritos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Na Nova Zelândia, a atividade agrícola conta com a maioria de emissões de gás de estufa. Portanto, a redução de emissões agrícolas de ga25 ses de estufa é importante para encontrar as obrigações da Nova Zelândia sob o Protocolo de Kyoto. O Protocolo requer redução de gases de estufa aos níveis de 1990 pelo final do primeiro período de cometimento (2008-2012). Para esta finalidade, os grupos do setor agrícola e o governo da Nova Zelândia estabeleceram a Pastoral Greenhouse Gas Research Consortium (PGGRC) para identificar meios para redução das emissões de gás de estufa agrícola da Nova Zelândia.
Uma parte importante das atividades do PGGRC foi a pesquisa
Petição 870170073527, de 29/09/2017, pág. 6/12 na redução de emissões de metano dos ruminantes de pasto da Nova Zelândia. A mitigação de emissões de metano de ruminantes tem interesse comercial por duas razões. Em primeiro lugar, a falha em satisfazer os compromissos sob o Protocolo de Quioto forçará o governo a comprar créditos de carbono. Estima-se atualmente que isto custe US$ 350 milhões. Em segundo lugar, a produção de metano resulta na perda de 8 a 12% da energia bruta produzida no rúmen. Esta energia pode ser usada, em vez disso, para melhorar a produtividade do ruminante.
Metano é produzido no rúmen por micróbios chamados metanógenos que são parte do filo Euryarchaeota dentro do reino Archaea. A maioria dos metanógenos cresce em CO2 e H2 como sua única fonte de energia, mas alguns podem usar compostos acetato ou metila para crescimento. Vários gêneros diferentes de archaea metanogênicos existem no rúmen, mas acredita-se que espécies do gênero Methanobrevibacter, especialmente M. ruminantium e M. smithii sejam os metanógenos predominantes em ruminantes da Nova Zelândia. M. ruminantium é atualmente o objeto de um projeto de sequenciamento de genoma consolidado pelo PGGRC. O projeto é o primeiro sequenciamento de genoma de um metanógeno de rúmen e pretende construir uma melhor compreensão da biologia do Methanobrevibacter para descobrir alvos para inibição da formação de metano.
Redução de produção de metano no rúmen requer a inibição de metanógenos ou a inativação de sua via de metanogênese. Um meio de inibição da produção de metano é entregar moléculas inibitórias específicas em células metanógenas. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pelo uso de agentes, tais como bacteriófago, que especificamente visam metanógenos. Vários fagos foram caracterizados para metanógenos de não-rúmen, mas não houve nenhuma descrição publicada de fago capaz de infectar ou lisar metanógenos de rúmen. Por isso, seria altamente vantajoso identificar fagos que têm a capacidade de infectar células metanógenas e/ou entregar inibidores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção caracteriza um fago <pmru isolado, incluindo uma par3 tícula de fago e/ou genoma de fago, produzido inteiro ou em parte, bem como polinucleotídeos e polipeptídeos isolados do fago como descrito em detalhes neste pedido.
A invenção também caracteriza um polipeptídeo isolado compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácido de fago selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69. Em um aspecto particular, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:2 a 5 e 62 a 68. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:63. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um fragmento, por exemplo, compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácido que se estende dos resíduos 32 a 186 da SEQ ID NO:63.
A invenção caracteriza adicionalmente um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de codificação de pelo menos um polipeptídeo de fago. Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende uma sequência de codificação de peio menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69. Em um aspecto particular, o polinucleotídeo compreende uma sequência de codificação de uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:2 a 5 e 62 a 68. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo compreende uma sequência de codificação da SEQ ID NO:63. Em outro aspecto, o polinucleotídeo compreende um fragmento de uma sequência de codificação, por exemplo, pelo menos uma sequência de aminoácido que se estende dos resíduos 32 a 186 da SEQ ID NO:63.
Em um aspecto adicional, a invenção caracteriza um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico de fago selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142. Em um aspecto particular, o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:75 a 78 e 135 a 141, ou é particularmente, SEQ ID NO:136. Em outro aspecto, o polinucleotídeo é um fragmento ou um oligonucleotídeo compreendendo, por exemplo, a sequência de ácido nucleico que se estende dos nucleotídeos 94 a 558 da SEQ ID NO: 136. Além disso, a invenção engloba um polinucleotídeo isolado, ou fragmento do mesmo, que hibridiza qualquer uma das sequências de ácido nucleico das SEQ ID NO:74 a 142. A invenção engloba ainda um polinucleotídeo isolado compreendendo o complemento, complemento reverso, sequência reversa, ou fragmentos dos mesmos, de qualquer uma das sequências de ácido nucleico.
A invenção caracteriza um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de codificação de pelo menos um polipeptídeo de fago. Em um aspecto, o vetor de expressão compreende uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69. Em um aspecto particular, o vetor de expressão compreende uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido das SEQ ID NO.2 a 5 e 62 a 68. Em um aspecto adicional, o vetor de expressão compreende uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:63. Em outro aspecto, o vetor de expressão compreende uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido que se estende dos resíduos 32 a 186 da SEQ ID NO:63.
Como um aspecto específico, a invenção caracteriza um vetor de expressão que produz o fago <pmru, inteiro ou em parte, como descrito em detalhes neste pedido. Em particular, o vetor de expressão pode produzir partículas de fago, um genoma de fago, ou fago modificado, incluindo quaisquer alterações, derivados, variantes ou fragmentos dos mesmos.
A invenção também caracteriza uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira microbiana, compreendendo pelo menos um vetor de expressão.
A invenção caracteriza especificamente um anticorpo construído por um polipeptídeo ou polinucleotídeo como descrito neste pedido. Em certos aspectos, o anticorpo é dirigido a pelo menos uma sequência polipeptídíca selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou uma sequência modificada das mesmas. Em aspectos alternativos, o anticorpo é construído por pelo menos um fragmento de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, ou um complemento, ou sequência modificada das mesmas. Em outro aspecto, o anticorpo inclui uma ou mais fusões ou conjugados com pelo menos um inibidor celular, por exemplo, compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, peptídeos antimicrobianos e outros antibióticos como descrito em detalhes neste pedido.
A invenção caracteriza adicionaimente polipeptídeos modificados de fago, por exemplo, para pelo menos uma das SEQ ID NO:1 a 69, incluindo alterações, fragmentos, variantes e derivados biologicamente ativos, descritos neste pedido. A invenção adicionaimente caracteriza anticorpos modificados, por exemplo, dirigidos a pelo menos uma das SEQ ID NO:1 a 69, incluindo alterações, fragmentos, variantes, e derivados biologicamente ativos, descritos neste pedido. Também são caracterizados polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos modificados, bem como alterações, fragmentos, variantes, e derivados dos polinucleotídeos descritos, vetores de expressão compreendendo estes polinucleotídeos, e células hospedeiras compreendendo estes vetores. Em aspectos específicos, as composições e os métodos da invenção empregam estes polinucleotídeos ou polipeptídeos modificados, ou vetores de expressão ou células hospedeiras correspondentes.
Além disso, a invenção caracteriza os polipeptídeos de fago, por exemplo, pelo menos um das SEQ ID NO:1 a 69 ou sequências modificadas das mesmas, que inclui fusões ou conjugados com pelo menos um inibidor celular, por exemplo, compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucleicos peptídicos, peptídeos antimicrobianos, e outros antibióticos como descrito em detalhes neste pedido.
A invenção caracteriza uma composição compreendendo um polipeptídeo isolado, por exemplo, pelo menos um das SEQ ID NO:1 a 69, ou uma sequência modificada das mesmas. A invenção adicionaimente caracteriza uma composição compreendendo um anticorpo, por exemplo, diri6 gido a pelo menos um das SEQ ID NO:1 a 69, ou sequência modificada das mesmas. Também é caracterizada uma composição compreendendo um polinucleotídeo isolado, por exemplo, pelo menos um das SEQ ID NO:74 a 142, ou um complemento ou sequência modificada das mesmas. Ainda é caracterizada uma composição que inclui um vetor de expressão, ou célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão, conforme a invenção. A composição pode incluir qualquer uma das alterações, fragmentos, variantes, e derivados biologicamente ativos descritos neste pedido. As composições podem incluir pelo menos um inibidor celular (por exemplo, como uma fusão ou conjugado), e podem ser formuladas, por exemplo, como composições farmacêuticas ou como suplementos alimentares, em particular, componentes alimentares para ruminantes.
A invenção também caracteriza uma composição da invenção como parte de um conjunto para visar e/ou inibir células microbianas, especialmente células metanógenas, conforme os métodos descritos. Os conjuntos compreendem: a) pelo menos uma composição como estabelecida neste pedido; e b) opcionalmente, instruções de uso, por exemplo, no direcionamento de células ou inibição de crescimento celular ou replicação de metanógenos ou outros micróbios. A invenção caracteriza um método para produzir um fago, o método compreendendo: a) cultura de um vetor de expressão ou célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão, que compreende pelo menos parte do genoma de fago sob condições adequadas para a produção do fago; e b) recuperação do fago da cultura. Em aspectos particulares, o fago compreende pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou sequências modificadas das mesmas. Em aspectos adicionais, o fago compreende pelo menos um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, ou sequências modificadas das mesmas.
A invenção também caracteriza um método para produzir um polipeptídeo de fago, o método compreendendo: a) cultura de um vetor de expressão ou célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão, que compreende pelo menos parte de uma sequência de codificação de pelo menos um polipeptídeo de fago sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo; e b) recuperação do polipeptídeo da cultura. Em aspectos particulares, o polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou sequências modificadas das mesmas.
A invenção caracteriza adicionalmente um método para produzir um polipeptídeo de fago, por exemplo, para pelo menos um das SEQ ID NO:1 a 69, compreendendo uma fusão ou UM conjugado com pelo menos um inibidor celular, por exemplo, compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucléicos peptídicos, peptídeos antimicrobianos, e outros antibióticos como descrito em detalhes neste pedido. Tal método compreende: a) cultura de um vetor de expressão ou célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão, que compreende uma sequência de codificação de pelo menos um polipeptídeo de fago sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo; b) formação da fusão de fago ou conjugado (por exemplo, pela expressão da sequência fusionada ou conjugação química ao inibidor celular); e c) recuperação da fusão ou conjugado. Em aspectos particulares, o polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou sequências modificadas das mesmas. Além disso, a invenção caracteriza um método de inibição (por exemplo, inibição do crescimento ou replicação) de uma célula microbiana, especialmente, uma célula metanógena, compreendendo: a) opcionalmente, produção ou isolamento de pelo menos um polipeptídeo de fago; e b) contato da célula com o polipeptídeo de fago. Em um aspecto particular, o polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou uma sequência modificada das mesmas.
Como uma característica adicionada, a invenção engloba um método de inibição (por exemplo, inibição do crescimento ou replicação) de uma célula microbiana, especialmente, uma célula metanógena, compreendendo: a) opcionalmente, produção ou isolamento de pelo menos um poli8 peptídeo de fago, que compreende ainda pelo menos um inibidor celular; e
b) contato da célula com o polipeptídeo de fago. Em um aspecto particular, o polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou uma sequência modificada das mesmas.
A invenção também caracteriza um método de detecção e/ou medida dos níveis de um fago, ou um polipeptídeo ou polinucleotídeo de fago correspondente, compreendendo: 1) contato de com uma amostra de um indivíduo com um anticorpo construído para um polipeptídeo de fago (por exemplo, pelo menos um das SEQ ID NO:1 a 69, ou sequência modificada das mesmas) ou um polinucleotídeo correspondente; e 2) determinação da presença ou dos níveis do complexo de anticorpo formado com o polipeptídeo ou polinucleotídeo na amostra. Tais métodos também podem ser usados para detecção e/ou medida dos níveis de uma célula microbiana, em particular, uma célula metanógena.
A invenção caracteriza, também, um método de detecção e/ou medida dos níveis de um fago, ou um polinucleotídeo de fago correspondente (por exemplo, uma sequência de codificação de fago), compreendendo: 1) contato de uma amostra de um indivíduo com um polinucleotídeo complementar (por exemplo, uma sequência complementar a qualquer uma das SEQ ID NO:74 a 142, ou sequência modificada das mesmas); e 2) determinação da presença ou dos níveis do complexo de hibridização formado com o polinucleotídeo de fago na amostra. Tais métodos também podem ser usados para detecção e/ou medida dos níveis de uma célula microbiana, em particular, uma célula metanógena.
Em aspectos particulares, os métodos da invenção utilizam componentes de expressão in vivo ou in vitro. Em outros aspectos, os métodos empregam polipeptídeos produzidos por meios recombinantes, sintéticos, ou semissintéticos, ou polipeptídeos produzidos por meios endógenos.
Outros aspectos e modalidades da invenção são descritos neste pedido abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Esta invenção é descrita com referência a modalidades específicas das mesmas e com referência às figuras.
FIGURAS 1A-1B. Pró-fago (pmru de M. ruminantium mostrando sequências de sítio de integração putativas attL e attR (FIGURA 1A), e módulos funcionais de fago predito e estrutura gênica (FIGURA 1B).
Figura 1C: Indução de fago usando ar estéril (estresse por oxigênio).
Figura 1D: Indução de fago inicial usando Mitomicina C.
Figura 1E: Eletroforese em gel de agarose de amplicons de PCR de M. ruminantium induzido e não induzido (desafio com oxigênio). Colunas 2 e 4: marcador em escada de DNA de 1 kb por Invitrogen. Colunas 1 e 3 representam PCRs usando par de iniciadores R1F-L2R em DNA isolado de culturas de M. ruminantium induzidas e não-induzidas, respectivamente. FIGURA 2. Anotação e comentários da região de leitura aberta do pró-fago (pmru.
Figura 3. Anotação, função predita e comentários da região de leitura aberta de pró-fago (pmru.
Figura 4A-4B. Informação de sequência de pró-fago (pmru de M. ruminantium, incluindo codificação de sequências de fago (pmru (FIGURA 4A), e sequências de aminoácido de fago (pmru (FIGURA 4B).
Figura 5. Alinhamento de sequência da ORF 2058 de fago (pmru com PeiP de M. marburgensis e PeiW de M. wolfeii.
Figura 6: Logo de sequência proteica de sequências de peptídeos sinal de M. ruminantium criado usando LogoBar, mostrando o sinal consenso principal.
Figura 7: Efeito inibitório da ORF 2058 em células de M. ruminantium em repouso.
Figura 8: Efeito inibitório da ORF 2058 no crescimento celular de M. ruminantium e produção de metano.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Sequências de ácido nucléico alteradas que codificam polipép10 tídeos de fago, como usado neste pedido, incluem aquelas com deleções, inserções, ou substituições de nucleotídeos diferentes resultando em um polinucleotídeo que preferencialmente codifica os mesmos polipeptídeos ou funcionalmente equivalentes. O polipeptídeo ou anticorpo codificado também pode ser alterado e conter deleções, inserções, ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma modificação silenciosa e resultam em um polipeptídeo funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser feitas com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou natureza antipática dos resíduos enquanto a atividade biológica (por exemplo, associação celular, permeabilização celular ou lise celular) ou atividade imunológica (por exemplo, um ou mais sítios de ligação a anticorpo) do polipeptídeo é conservada. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados podem incluir ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados podem incluir lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar não- carregados tendo valores de hidrofilicidade similares podem incluir leucina, isoleucina e valina, glicina e alanina, asparagina e glutamina, serina e treonina, e fenilalanina e tirosina.
Sequência de aminoácido, como usado neste pedido, refere-se a um sequência de oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou proteína, e qualquer fragmento dos mesmos, e de ocorrência natural, moléculas recombinantes, sintéticas ou semissintéticas. As sequências da invenção compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200, ou 200 a 250, ou 250 a 4000 aminoácidos, e, preferencialmente, conservam a atividade biológica (por exemplo, associação celular, permeabilização celular ou lise celular) ou atividade imunológica (por exemplo, um ou mais sítios de ligação a anticorpo) da sequência original. Onde sequência de aminoácido é relatada neste pedido referindo-se a uma sequência de aminoácido de uma molécula de polipeptídeo que ocorre naturalmente, sequência de aminoácido, e termos semelhantes, não são destinados a limitar a sequência de aminoácido para a sequên11 cia de aminoácido completa, original associada à molécula completa.
Amplificação, como usado neste pedido, refere-se à produção de cópias adicionais de uma sequência de ácido nucleico e é geralmente realizada usando tecnologias de reação de polimerase em cadeia (PCR) bem conhecidas na técnica (Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).
O termo anticorpo deve ser entendido no senso mais amplo possível e é destinado a incluir anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais intactos. Também é destinado a cobrir fragmentos e derivados de anticorpos contanto que exibam a atividade biológica desejada. Anticorpos englobam moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que especificamente se ligam a (imunorreagem com) um antígeno. Estas incluem, mas não são limitadas a policlonais, monoclonais, quiméricas, cadeia única, fragmentos Fc, Fab, Fab’, e Fab2, e uma biblioteca de expressão de Fab.
Moléculas de anticorpo relacionadas a qualquer uma das classes de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferenciam entre si pela natureza da presente cadeia pesada na molécula. Estas incluem subclasses também, tais como lgG1, lgG2 e outras. A cadeia leve pode ser uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda. Referência neste pedido a anticorpos inclui uma referência a todas as classes, subclasses e tipos. Também são incluídos anticorpos quiméricos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos que são específicos para mais de uma fonte, por exemplo, uma ou mais sequências de camundongo, de ser humano ou de ruminantes. Estão ainda incluídos anticorpos camelídeos ou nanocorpos. Será entendido que cada referência a anticorpos ou qualquer termo semelhante, neste pedido inclui anticorpos intactos, bem como quaisquer fragmentos, alterações, derivados ou variantes dos mesmos.
Os termos biologicamente ativo ou funcional, como usados neste pedido, referem-se a uma sequência polipeptídica que conserva uma ou mais funções estruturais, imunológicas ou bioquímicas (por exemplo, associação celular, permeabilização celular ou lise celular).
Os termos inibidor celular ou inibidor, como usados neste pedido, referem-se a agentes que reduzem ou bloqueiam o crescimento ou a replicação de células microbianas, especialmente células metanógenas. Um inibidor celular pode atuar para reduzir ou bloquear, por exemplo, a divisão celular. Um inibidor pode reduzir ou bloquear, por exemplo, síntese de DNA, síntese de RNA, síntese proteica ou modificações pós-traducionais. Um inibidor também pode reduzir ou bloquear a atividade de enzimas envolvidas na via de metanogênese. Um inibidor também pode visar uma célula de reconhecimento por componentes do sistema imune. A inibição de uma célula também inclui extermínio celular e morte celular, por exemplo, a partir de lise, apoptose, necrose, etc. Inibidores úteis incluem, mas não são limitados a compostos antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), anticorpos e fragmentos de anticorpo, enzimas líticas, ácidos nucléicos peptídicos, peptídeos antimierobianos, e outros antibióticos como descrito em detalhes neste pedido.
Os termos complementar ou complementaridade, como usados neste pedido, referem-se à ligação natural de polinucleotídeos sob condições permissivas de sal e de temperatura por pareamento de bases. Para a sequência A-G-T, a sequência complementar é T-C-A, o complemento reverso é A-C-T e a sequência reversa é T-G-A. A complementaridade entre duas moléculas de fita simples pode ser parcial, na qual somente alguns ácidos nucléicos se ligam, ou pode ser completa quando complementaridade total existe entre as moléculas de fita simples. O grau de complementaridade entre fitas de ácido nucléico tem efeitos significantes sobre a eficiência e à força da hibridização entre fitas de ácido nucléico. Isto é de particular importância em reações de amplificação, que dependem de ligação entre fitas de ácidos nucléico e no desenho e uso de moléculas de PNA.
O termo derivado, como usado neste pedido, refere-se à modificação química de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de fago, ou ácido nucléico complementar a isso. Tais modificações incluem, por e13 xemplo, a substituição de hidrogênio por um grupo alquila, acila ou amino. Em aspectos preferenciais, um derivado de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que conserva a função biológica ou imunológica da molécula natural. Um polipeptídeo derivado é aquele que é modificado por glicosilação, peguilação ou qualquer processo similar que conserva uma ou mais funções biológicas (por exemplo, associação celular, permeabilização celular ou lise celular) ou função imunológica da sequência da qual foi derivado.
O termo homologia, como usado neste pedido, refere-se a um grau da complementaridade. Pode haver homologia parcial (isto é, identidade I) ou homologia completa (isto é, identidade de 100%). Uma sequência parcialmente complementar que pelo menos parcialmente inibe uma sequência idêntica de hibridizar a um ácido nucleico alvo é referida usando o termo funcional substancialmente homólogo. A inibição da hibridização da sequência completamente complementar à sequência-alvo pode ser examinada usando um ensaio de hibridização (Southern ou northern blot, hibridização de solução e similares) sob condições de baixa estringência. Uma sequência substancialmente homóloga ou sonda de hibridização competirão e inibirão a ligação de uma sequência completamente homóloga à sequência-alvo sob condições de baixa estringência. Isto não deve dizer que condições de baixa estringência são tais que a ligação não-específica é permitida; condições de baixa estringência requerem que a ligação de duas sequências a uma outra seja uma interação específica (isto é, seletiva).
O termo hibridização, como usado neste pedido, refere-se a qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se liga a uma fita complementar através do pareamento de bases.
Uma inserção ou adição, como usado neste pedido, refere-se a uma modificação em uma sequência de aminoácido ou nucleotídica resultante na adição de um ou mais resíduos de aminoácido ou nucleotídeos, respectivamente, quando comparada a uma molécula que ocorre naturalmente.
Um metanógeno, como usado neste pedido, refere-se a micróbios que produzem o gás metano, os quais incluem Methanobrevibacter,
Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium e Methanosarcina. Metanógenos específicos incluem, mas não são limitados a, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii, e Methanolobus taylorii. Todos os gêneros e espécies de metanógenos são englobados por este termo.
Células microbianas, como usado neste pedido, referem-se a células microbianas que ocorrem naturalmente ou geneticamente modificadas incluindo arqueobactérias, tais como metanógenos, halófilos e termoacidófilos, e eubactérias, tais como cianobactérias, espiroquetas, proteobactérias, bem como bactérias gram positivas e gram negativas.
O termo modificado refere-se a sequências alteradas e fragmentos de sequência, variantes e derivados, como descrito neste pedido.
Sequência de ácido nucléico ou sequência nucleotídica, como usado neste pedido, referem-se a uma sequência de um polinucleotídeo, oligonucleotídeo ou fragmentos das mesmas, e a DNA ou RNA de origem natural, recombinante, sintética, ou semissintética que pode ser fita simples ou dupla, e pode representar a fita antissenso ou senso, e regiões codificante ou não codificante. As sequências da invenção ainda mais preferencialmente incluem sequências de codificação de polipeptídeo que compreendem pelo menos 12, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 15 a 30, 30 a 60, 60 a 90, 90 a 120, 120 a 150, 150 a 300, 300 a 450, 450 a 600, ou 600 a 750 nucleotídeos, ou pelo menos 1000 nucleotídeos, ou pelo menos 1500 nucleotídeos. Será entendido que cada referência a uma sequência de ácido nucléico ou sequência nucleotídica neste pedido, incluirá a sequência original, completa, bem como quaisquer complementos, fragmentos, alterações, derivados, ou variantes, da mesma.
O termo oligonucleotídeo refere-se a uma sequência de ácido nucléico compreendendo pelo menos 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30, ou 36 nucleotídeos, ou pelo menos 12 a 36 nucleotídeos, ou pelo menos 15 a 30 nucleotídeos, que podem ser usados, por exemplo, em ensaios de amplificação por PCR, sequenciamento ou hibridização. Como usado neste pedido, o oligonucleotídeo é substancialmente equivalente aos termos amplímeros, iniciadores, oligômeros, oligos e sondas, como comumente definido na técnica.
Polipeptídeo, como usado neste pedido, refere-se aos polipeptídeos isolados da invenção obtidos de qualquer espécie, preferencialmente microbiana, de qualquer fonte se natural, sintética, semissintética ou recombinante. Especificamente, um polipeptídeo de fago pode ser obtido de células metanógenas, tais como células de Methanobrevibacter, em particular, células de M. ruminantium, ou M. smithii. Para produção recombinante, um polipeptídeo da invenção pode ser obtido de células microbianas ou eucarióticas, por exemplo, Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, levedura, células de inseto, tais como Drosophila, células animais, tais como células COS e CHO, ou células vegetais. Será entendido que cada referência a um polipeptídeo, neste pedido, incluirá a sequência original, completa, bem como quaisquer fragmentos, alterações, derivados ou variantes da mesma.
O termo polinucleotídeo, quando usado no singular ou plural, geralmente refere-se a qualquer sequência de ácido nucléico, por exemplo, qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou DNA ou RNA modificado. Isto inclui, sem restrição, DNA de fita simples e dupla, DNA incluindo regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla, e RNA incluindo regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que pode ser fita simples ou, mais tipicamente, fita dupla ou incluir regiões de fita simples e dupla. Também estão incluídas regiões de fita tripla compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Especificamente estão incluídos mRNAs, cDNAs e DNAs genômicos, e quaisquer fragmentos dos mesmos. O termo inclui DNAs e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas, tais como bases tritiadas, ou bases não usuais, tais como inosina. Os polinucleotídeos da invenção podem englobar sequências codificantes ou não codificantes, ou sequências senso ou antissenso, ou iRNAs, tais como siRNAs. Será entendido que cada referência a um polinucleotídeo ou termo semelhante, neste pedido, incluirá as sequências completas bem como quaisquer complementos, fragmentos, alterações, derivados ou variantes da mesma.
Ácido nucleico peptídico ou PNA como usado neste pedido, refere-se a uma molécula antissenso ou agente antigênico que compreende bases ligadas através de um esqueleto peptídico.
O termo ruminante, como usado neste pedido, refere-se a animais que têm um rúmen como um tipo especial de órgão digestivo. Ruminantes incluem, mas não são limitados a gado, ovelha, cabras, búfalo, alce americano, antílope, caribu e cervo.
Os termos condições estringentes ou estringência, como usados neste pedido, referem-se às condições de hibridização como definido pelo ácido nucleico, sal e temperatura. Estas condições são bem conhecidas na técnica e podem ser alteradas a fim de identificar ou detectar sequências polinucleotídicas idênticas ou relacionadas. Ver, por exemplo, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, e Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Numerosas condições equivalentes compreendendo baixa ou alta estringência dependem de fatores, tais como o comprimento e a natureza da sequência (DNA, RNA, composição de bases), natureza do alvo (DNA, RNA, composição de bases), ambiente (em solução ou imobilizado em um substrato sólido), concentração de sais e outros componentes (por exemplo, formamida, sulfato de dextrano e/ou polietilenoglicol), e temperatura das reações (dentro de uma faixa de aproximadamente 5°C abaixo da temperatura de fusão da sonda a aproximadamente 20°C a 25°C abaixo da temperatura de fusão). Um ou mais fatores poderão ser variados para gerar condições de baixa ou de alta estringência diferente de, mas equivalente às condições listadas acima.
O termo indivíduo inclui animais humanos e não- humanos. Animais não-humanos incluem, mas não são limitados a pássaros e mamífe17 ros, tais como ruminantes, e em particular, camundongos, coelhos, gatos, cães, porcos, ovelhas, cabras, vacas e cavalos.
Os termos substancialmente purificadas ou isoladas como usados neste pedido, referem-se a sequências nucléicas ou de aminoácido que são removidas de seu ambiente celular, recombinante ou sintético, e são pelo menos 60% livres, preferencialmente 75% livres, e ainda mais preferencialmente pelo menos 90% livres ou pelo menos 99% livres de outros componentes com os quais estejam associadas em um ambiente celular, recombinante ou sintético.
Transformação como definido neste pedido, descreve um processo pelo qual DNA exógeno entra e modifica uma célula recipiente. Pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na técnica. Transformação pode depender de qualquer método conhecido para inserção de sequências de ácido nucléico estranhas em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. O método é selecionado com base no tipo de célula hospedeira que é transformada e pode incluir, mas não é limitado a, infecção viral, eletroporação, choque térmico, lipofecção, e bombardeio de partícula. Tais células transformadas incluem células estavelmente transformadas nas quais o DNA inserido é capaz de replicação como um plasmídeo de replicação autônoma ou como parte do cromossomo hospedeiro. Também incluem células que transitoriamente expressam DNA ou RNA inseridos por períodos de tempo limitados.
Uma variante de um polipeptídeo, como usado neste pedido, refere-se a uma sequência de aminoácido que é alterada por um ou mais aminoácidos. Um polinucíeotídeo variante é alterado por um ou mais nucleotídeos. Uma variante pode resultar em modificações conservativas, em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, substituição da leucina por isoleucina. Mais raramente, uma variante pode resultar em modificações não-conservativas, por exemplo, substituição de uma glicina por um triptofano. Variações menores análogas também podem incluir deleções ou inserções de aminoácido, ou ambas. Orientação na determinação de que resíduos de aminoácido podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem eliminar a atividade biológica ou imunológica pode ser encontrado usando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, programa LASERGENE (DNASTAR).
A invenção também engloba variantes que conservam pelo menos uma atividade biológica (por exemplo, associação celular, permeabilização celular ou lise celular) ou atividade imunológica do polipeptideo. Uma variante preferencial é aquela que tem substancialmente a mesma ou uma sequência funcionalmente equivalente, por exemplo, pelo menos 80%, e mais preferencialmente pelo menos 90%, de identidade de sequência a uma sequência descrita. Uma variante mais preferencial é aquela que tem identidade de sequência de pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9% a uma sequência descrita neste pedido. A porcentagem de identidade é determinada pelo alinhamento das duas sequências a serem comparadas como descrito abaixo, determinação do número de resíduos idênticos na porção alinhada, divisão daquele número pelo número total de resíduos na sequência inventiva (questionada), e multiplicação do resultado por 100. Um programa de alinhamento útil é AlignX (Vector NTI).
Descrição da invenção
O metano é produzido no trato digestório superior de ruminantes por metanógenos que atuam como redutores terminais do carbono no sistema de rúmen. A via de metanogênese multietapa é bem elucidada, principalmente a partir do estudo de metanógenos de não rúmen, mas as adaptações que permitem aos metanógenos crescer e persistir no rúmen não são bem entendidas. Methanobrevibacter ruminantium é um metanógeno proeminente em ruminantes da Nova Zelândia. Como descrito neste pedido, o genoma de M. ruminantium foi sequenciado e mostrado como aproximadamente 3,0 Mb em tamanho com um conteúdo GC de 33,68%. Como um achado inesperado, foi encontrado que o genoma de M. ruminantium incluía uma sequência de pró-fago (designada (pmru) com módulos funcionais distintos que codificam integração do fago, replicação e empacotamento de DNA, proteínas de capsídeo, lise e funções de conversão lisogênicas.
O fago de M. ruminantium foi identificado durante o sequenciamento de alto rendimento, quando foi encontrado que uma região de 30 a 40 kb do genoma era superrepresentada nos clones sequenciados. Isto sugeriu que uma parte do genoma estava presente em número de cópias superior ao normal, e poderia ser atribuído à replicação de um fago residente. A região superrepresentada foi investigada e detalhada com análises por bioinformática das regiões de leitura aberta preditas apresentadas indicadas que continham genes semelhantes a fago. Foi mostrado que uma região de baixo GC encontrada na extremidade distal da sequência de fago (conversão lisogênica) abriga um sistema de modificação de DNA predito por enxofre (dnd) que poderia fornecer modificação adicional do DNA hospedeiro ou estranho. A sequência de pró-fago de M. ruminantium é descrita em detalhes neste pedido. Em vários aspectos da invenção, os polinucleotídeos e polipeptídeos de pró-fago podem ser usados como um meio para inibir metanógenos e/ou metanogênese no rúmen, e elucidar ainda o papel de M. ruminantium na formação de metano.
A invenção engloba então polipeptídeos de fago, incluindo aqueles compreendendo pelo menos uma das SEQ ID NO:1 a 69, e fragmentos, variantes e derivados das mesmas. A invenção também engloba o uso destes polipeptídeos para visar e inibir células microbianas, especialmente células metanógenas. A invenção engloba ainda o uso de polipeptídeos para inibição do crescimento ou replicação de tais células. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser expressos e usados em vários ensaios para determinar sua atividade biológica. Os polipeptídeos podem ser usados para síntese em larga escala e protocolos de isolamento, por exemplo, para produção comercial. Tais polipeptídeos podem ser usados para construir anticorpos, isolar sequências de aminoácido correspondentes, e determinar quantitativamente os níveis das sequências de aminoácido. Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados como composições, por exemplo, composições farmacêuticas, e como suplementos alimentares, por exemplo, componentes de alimentos para ruminantes. Os polipeptídeos da presente invenção também têm benefícios de saúde. Em aspectos relacio20 nados à saúde, os inibidores de metanógenos podem ser usados para restituir a energia ao indivíduo que é normalmente perdida como metano. Em aspectos particulares, dispositivos ruminais de liberação lenta podem ser usados em conjunto com os polipeptídeos, e composições (por exemplo, composições farmacêuticas e suplementos alimentares) da invenção.
Os polipeptídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) polipeptídeos compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou fragmentos, variantes, ou derivados das mesmas; (b) polipeptídeos compreendendo um domínio funcional de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, e fragmentos e variantes das mesmas; e (c) polipeptídeos compreendendo pelo menos um número especificado de resíduos contíguos de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou variantes ou derivados das mesmas. Em uma modalidade, a invenção engloba um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido de pelo menos uma das SEQ ID NO:1 a 69. Todas estas sequências são coletivamente referidas neste pedido como os polipeptídeos da invenção.
A invenção também engloba polinucleotídeos que codificam pelo menos um polipeptídeo de fago, incluindo aqueles das SEQ ID NO:1 a 69, e fragmentos, variantes, e derivados das mesmas. A invenção também engloba o uso destes polinucleotídeos para preparar vetores de expressão e células hospedeiras para visar e inibir células microbianas, especialmente células metanógenas. A invenção engloba ainda o uso dos polinucleotídeos para inibição do crescimento ou replicação de tais células. Os polinucleotídeos isolados da presente invenção também têm utilidade no mapeamento do genoma, no mapeamento físico e na clonagem de genes de fagos mais ou menos relacionados. Sondas desenhadas usando os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usadas para detectar presença e examinar os padrões de expressão de genes em qualquer organismo que tem sequências de DNA e RNA suficientemente homólogas em suas células, usando técnicas que são bem conhecidas na técnica, tal como técnicas de slot blot ou análise de microarranjo. Iniciadores desenhados usando os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para seqüenciamento e amplificações por PCR. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser usados como composições, por exemplo, composições farmacêuticas, e como suplementos alimentares, por exemplo, componentes de alimentos para ruminantes. Os polinucleotídeos da presente invenção também têm benefícios de saúde. Para tais benefícios, os polinucleotídeos podem ser apresentados como vetores de expressão ou células hospedeiras compreendendo vetores de expressão. Em aspectos particulares, dispositivos ruminais de liberação lenta podem ser usados em conjunto com os polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras e composições (por exemplo, composições farmacêuticas e suplementos alimentares) da invenção. Os polinucleotídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) sequências compreendendo uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou fragmentos ou variantes das mesmas; (b) complementos, sequências reversas, e complementos reversos de uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou fragmentos ou variantes das mesmas; (c) regiões de leitura aberta contidas na sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, e seus fragmentos e variantes; (d) domínios funcionais de uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, e fragmentos e variantes das mesmas; e (e) sequências compreendendo pelo menos um número especificado de resíduos contíguos de uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69, ou variantes das mesmas. Em uma modalidade, a invenção engloba um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de ami22 noácido selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:1 a 69.
Os polinucleotídeos da presente invenção compreendem pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) sequências compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, ou fragmentos ou variantes das mesmas; (b) complementos, sequências reversas, e complementos reversos de uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, ou fragmentos ou variantes das mesmas; (c) regiões de leitura aberta contidas na sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, e seus fragmentos e variantes; (d) domínios funcionais de uma sequência de codificação de pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, e fragmentos e variantes das mesmas; e (e) sequências compreendendo pelo menos um número especificado de resíduos contíguos de pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO:74 a 142, ou variantes das mesmas. Sondas e iniciadores oligonucleotídicos e suas variantes obtidas de qualquer uma das sequências descritas também são fornecidos. Todos estes polinucleotídeos e oligonucleotídeos são coletivamente mencionados neste pedido, como polinucleotídeos da invenção.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que em consequência da degeneração do código genético, uma grande quantidade de sequências nucleotídicas que codificam os polipeptídeos da invenção, algumas carregando homologia mínima às sequências nucleotídicas de qualquer gene conhecido e que ocorre naturalmente, pode ser produzida. Dessa forma, a invenção contempla toda ou cada variação possível da sequência nucleotídica que pode ser feita pela seleção de combinações com base em escolhas de códon possíveis. Estas combinações são feitas conforme o código genético bacteriano tripleto padrão quando aplicadas a sequências de aminoácido que ocorrem naturalmente, e tais variações devem ser consideradas como sendo especificamente descritas.
Sequências nucleotídicas que codificam os polipeptídeos de fago, ou seus fragmentos ou variantes, são preferencialmente capazes de hibridizar à sequência nucleotídica da sequência que ocorre naturalmente sob condições de estringência apropriadamente selecionadas. Entretanto, pode ser vantajoso produzir sequências nucleotídicas que codificam um polipeptídeo, ou seu fragmento ou derivado, possuindo um uso de códon substancialmente diferente. Códons podem ser selecionados para aumentar a taxa na qual a expressão do polipeptídeo ocorre em um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular conforme a frequência com a qual códons particulares são utilizados pelo hospedeiro. Por exemplo, códons podem ser otimizados para expressão em E. coli conforme métodos conhecidos. Outras razões para alterar substancialmente os polipeptídeos de codificação de sequência nucleotídica e seus derivados sem alterar as sequências de aminoácido codificadas incluem a produção de transcritos de RNA que têm propriedades mais desejáveis, tal como uma maior meia-vida, do que transcritos produzidos a partir da sequência que ocorre naturalmente.
A invenção também engloba a produção de sequências de DNA, ou fragmentos das mesmas, que codifica os polipeptídeos, ou seus fragmentos ou variantes, inteiramente pela química sintética. Após produção, a sequência sintética pode ser inserida em qualquer dos muitos vetores de expressão e sistemas celulares disponíveis usando reagentes que são bem conhecidos na técnica. Além disso, química sintética pode ser usada para introduzir mutações em uma sequência que codifica um polipeptídeo, ou quaisquer variantes ou fragmento da mesma. Também são englobadas pela invenção sequências polinucleotídicas que são capazes de hibridizar às sequências nucleotídicas reivindicadas, e em particular, aquelas mostradas nas SEQ ID NO:74 a 149, ou seus complementos, sob várias condições de estringência como ensinado em Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) e Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507511).
Métodos para sequenciamento de DNA que são bem conhecidos e geralmente disponíveis na técnica e podem ser usados para praticar algu24 ma das modalidades da invenção. Os métodos podem empregar tais enzimas como o fragmento Klenow de DNA polimerase I, SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq polimerase (Perkin Elmer), T7 polimerase termoestável de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), ou combinações de polimerases e exonucleases de correção, tais como aquelas encontradas no Sistema de Amplificação ELONGASE vendido por Life Technologies (Gaithersburg, MD). Preferencialmente, o processo é automatizado com máquinas, tais como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), Ciclador Térmico Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) Sequenciadores de DNA ABI Catalyst e 373 e 377 (Perkin Elmer), ou Sequenciador de Genoma 20® (Roche Diagnostics).
As sequências de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos podem ser estendidas utilizando uma sequência nucleotídica parcial e empregando vários métodos conhecidos na técnica para detectar sequências a montante, tais como promotores e elementos reguladores, e elementos a jusante, tais como terminadores e estruturas não-codificantes de RNA. Por exemplo, um método que pode ser empregado, PCR de sítio de restrição, usa iniciadores universais para recuperar a sequência desconhecida adjacente a um locus conhecido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318322). Em particular, DNA genômico é primeiro amplificado na presença do iniciador para uma sequência ligante e um iniciador específico para a região conhecida. As sequências amplificadas então são submetidas a um segundo ciclo de PCR com o mesmo iniciador ligante e outro iniciador específico interno ao primeiro. Produtos de cada ciclo de PCR são transcritos com uma RNA polimerase apropriada e sequenciados usando transcriptase reversa.
Outro método útil é PCR inversa, também chamada IPCR (ver, por exemplo, Ochman H, Gerber AS, Hartl DL. Genetics. 1988 Nov; 120 (3):621-3). PCR inversa pode ser empregada quando somente uma sequência interna de DNA alvo é conhecida. O método de PCR inversa inclui uma série de digestões e autoligações com DNA que é cortado por uma endonuclease de restrição. Este corte resulta em uma sequência conhecida em qualquer extremidade de sequências desconhecidas. Conforme este méto25 do, DNA alvo é suavemente cortado em fragmentos menores de várias quilobases pela digestão por endonuclease de restrição. Autoligação então é induzida sob baixas concentrações que fazem o esqueleto de fosfato reformar e produzir um produto de ligação de DNA circular. DNA-alvo é então digerido por restrição com uma endonuclease conhecida. Isto gera um corte dentro da sequência interna conhecida que gera um produto linear com sequências terminais conhecidas. Este produto então pode ser usado para PCR padrão conduzida com iniciadores complementares às sequências internas conhecidas.
Sistemas de eletroforese capilar que estão comercialmente disponíveis podem ser usados para analisar o tamanho ou confirmar a sequência nucleotídica de sequenciamento ou produtos de PCR. Especialmente, o sequenciamento capilar pode empregar polímeros dispersíveis para separação eletroforética, quatro corantes fluorescentes diferentes (um para cada nucleotídeo) que são ativados por laser e detecção dos comprimentos de onda emitidos por uma carga acoplada a uma câmera. A intensidade de produção/luz pode ser convertida em sinal elétrico usando programa apropriado (por exemplo, GENOTYPER e Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) e o processo inteiro de carregamento de amostras para análise computacional e exibição de dados eletrônicos pode ser controlado por computador. Eletroforese capilar é especialmente preferencial para o sequenciamento de pequenas partes de DNA que poderiam estar presentes em quantidades limitadas em uma determinada amostra.
Recentemente, o pirossequenciamento emergiu como uma me25 todologia de sequenciamento útil. Ver, por exemplo, Ronaghi, M. et al. 1996. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242: 84-89; Ronaghi, M. et al. 1998. A sequencing method base ón real-time pyrophosphate. Science 281: 363-365; Ronaghi, M. et al. 1999. Analysis of secondary structures in DNA by pyrosequencing. Anal. Biochem.
267: 65-71; Ronaghi 2001. Genoma Res. Vol. 11, Issue 1, 3-11; Nyrén The history of pyrosequencing. Methods Mol Biol. 2007; 373:1-14. Pirossequenciamento tem as vantagens de exatidão, flexibilidade, processamento parale26 lo e pode ser facilmente automatizado. Além disso, a técnica dispensa a necessidade de iniciadores marcados, nucleotídeos marcados e eletroforese em gel. Conforme este método, a poiimerase catalisa a incorporação de nucleotídeos em uma cadeia de ácido nucleico. Em consequência da incorporação, moléculas de pirofosfato são liberadas e posteriormente convertidas por sulfurilase em ATP. A luz é produzida na reação com luciferase durante a qual uma molécula de luciferina é oxidada. Após cada adição nucleotídica, uma etapa de lavagem é realizada para permitir adição iterativa. Os nucleotídeos são continuamente degradados pela enzima degradante de nucleotídeo permitindo adição do nucleotídeo subsequente. O pirossequenciamento foi com sucesso aplicado como uma plataforma de sequenciamento de larga escala, incluindo análise genômica e metagenômica (ver, por exemplo, The Genome Sequencer FLX® de 454 Life Sciences/Roche).
O Sistema SOLiD® também foi desenvolvido para sequenciamento (ver, por exemplo, Applied Biosystems. Application Fact Sheet for the SOLID® System. Foster City, CA). Esta metodologia é baseada na ligação sequencial de oligonucleotídeos marcados com corante a fragmentos de DNA cionalmente amplificados ligados a contas magnéticas. Neste método, a sequência de DNA é gerada pela medida de ligação em série. A reação de ligação é baseada em reconhecimento de sonda, sem adição sequencial, e é, por isso, menos propensa à acumulação de erros. A natureza da química praticamente elimina a possibilidade de falsas inserções ou deleções. A etapa de ligação e o tratamento com fosfatase de sondas não ligadas previnem defasagem. Além disso, após sete ciclos de ligação, o iniciador original é retirado do molde e um novo iniciador é hibridizado para começar a questionar na posição n-1. O uso desta fase de reiniciar permite a redução do ruído sistêmico e permite leituras de comprimentos mais longos. Além disso, duas bases de codificação são usadas para discriminar entre erros de medida ao contrário de polimorfismos verdadeiros. Modificações em uma posição única são identificadas como erros randômicos e podem ser removidas pelo programa na análise de dados. Como uma plataforma analítica, SOLID® System tem aplicações em sequenciamento em larga escala, expressão ge27 nica digital, estudos de ChIP e metilação, e é particularmente útil para detectar variação genômica. Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos ou fragmentos dos mesmos que codificam polipeptídeos podem ser usados em moléculas de DNA recombinante para dirigir expressão dos polipeptídeos, ou fragmentos ou variantes dos mesmos, em células hospedeiras apropriadas. Devido à degeneração inerente do código genético, outras sequências de DNA que codificam substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácido funcionalmente equivalente podem ser produzidas, e estas sequências podem ser usadas para clonar e expressar polipeptídeos de fago. As sequências nucleotídicas da presente invenção podem ser projetadas usando métodos geralmente conhecidos na técnica a fim de alterar sequências que codificam o aminoácido por uma variedade de causas, incluindo, mas não limitadas a alterações que modificam a clonagem, processamento, e/ou expressão do produto gênico. Mistura de DNA por fragmentação randômica e remontagem por PCR de fragmentos gênicos e oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados para projetar as sequências nucleotídicas. Por exemplo, a mutagênese sítio-dirigida pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, preferência por códon de modificação, introdução de mutações e similares.
Em outra modalidade da invenção, as sequências de ácido nucleico naturais, modificadas, ou recombinantes que codificam polipeptídeos podem ser ligadas a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, pode ser útil codificar uma sequência quimérica que pode ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser projetada para conter um sítio de divagem localizado entre o polipeptídeo da invenção e a sequência proteica heteróloga, para que o polipeptídeo possa ser clivado e purificado longe da porção heteróloga.
Em outra modalidade, sequências que codificam polipeptídeos podem ser sintetizadas, inteiras ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers, Μ. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Hom, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 22528
232). Alternativamente, o próprio polipeptídeo pode ser produzido usando métodos químicos para sintetizar a sequência de aminoácido, ou fragmento da mesma. Por exemplo, a síntese polipeptídica pode ser realizada usando várias técnicas em fase sólida (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) e síntese automatizada pode ser alcançada, por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer). Vários fragmentos de polipeptídeos podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos para produzir a molécula completa.
O polipeptídeo recentemente sintetizado pode ser isolado pela cromatografia líquida de alto desempenho preparativa (por exemplo, Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principies, WH Freeman and Co, New York, NY). A composição dos polipeptídeos sintéticos pode ser confirmada por análise ou sequenciamento de aminoácido (por exemplo, o procedimento de degradação de Edman; Creighton, supra). Adicionalmente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, ou qualquer parte da mesma, pode ser alterada durante a síntese direta e/ou usando métodos químicos combinados com sequências de outras proteínas, ou qualquer parte das mesmas, para produzir uma molécula variante.
A fim de expressar polipeptídeos biologicamente ativos, as sequências nucleotídicas que codificam o polipeptídeo ou equivalentes funcionais, podem ser inseridas no vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para transcrição e tradução da sequência de codificação inserida. Métodos que são bem conhecidos aos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências que codificam o polipeptídeo e elementos de controle transcricionais e traducionais apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, e Ausubel, F. M. et al. (2007) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY.
Uma variedade de sistemas de expressão vetor/hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar sequências que codificam os polipeptídeos da invenção. Estes incluem, mas não são limitados a microorganismos, tais como bactérias transformadas com fago recombinante, plasmídeo ou vetores de expressão de DNA cosmidial; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão virais (por exemplo, baculovírus); sistemas celulares vegetais transformados com vetores de expressão virais (por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. Para bactérias, os plasmídeos úteis incluem plasmídeos pET, pRSET, pTrcHis2, e pBAD de Invitrogen, plasmídeos pET e pCDF de Novagen, e plasmídeos Director® de Sigma-Aldrich. Para metanógenos, plasmídeos úteis incluem, mas não são limitados a pME2001, pMV15, e pMP1. Em particular, Escheríchia coli pode ser usada com o vetor de expressão pET. A invenção não é limitada pelo vetor de expressão ou célula hospedeira empregada.
Os elementos de controle ou sequências reguladoras são aquelas regiões não-traduzidas do vetor--intensificadores, promotores, regiões não-traduzidas 5’ e 3’~que interagem com as proteínas celulares do hospedeiro para realizar transcrição e tradução. Tais elementos podem variar em sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer grupo de elementos transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, pode ser usado. Por exemplo, quando clonando em sistemas bacterianos, promotores induzíveis, tais como promotor híbrido lacZ do fagemídeo BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, CA) ou plasmídeo pSPORTI (Life Technologies) e similares podem ser usados. O promotor de poli-hedrina de baculovírus pode ser usado em células de inseto. Promotores ou intensificadores derivados dos genomas de células vegetais (por exemplo, genes de proteína de choque térmico, RUBISCO, e de armazenamento) ou de vírus vegetais (por exemplo, promotores virais ou sequências líderes) podem ser clonados no vetor.
Em sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser selecionados dependendo do uso destinado para o polipeptídeo. Por exemplo, quando grandes quantidades de polipeptídeo são necessárias, vetores que direcionam expressão de alto nível de proteínas de fusão que são prontamente purificadas podem ser usados. Tais vetores incluem, mas não são limitados à clonagem multifuncional de E. coli e a vetores de expressão, tais como BLUESCRIPT (Stratagene), no qual a sequência que codifica um polipeptídeo pode ser ligada no vetor em estrutura com sequências para a Met amino-terminal e 7 resíduos subsequentes de β-galactosidase para que uma proteína híbrida seja produzida; vetores pino (Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); e similares.
Vetores pGEX (Promega, Madison, Wl) também podem ser usados para expressar os polipeptídeos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de lisados celulares pela adsorção em contas de glutationa-agarose seguidas pela eluição na presença de glutationa livre. Proteínas feitas em tais sistemas podem ser desenhadas para incluir sítios de divagem por protease de heparina, trombina ou fator Xa para que o polipeptídeo cionado de interesse possa ser liberado a partir da porção GST à vontade. Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, diversos vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis, tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH podem ser usados. Para revisões, ver Ausubel et al. (supra) e Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544. Sinais de iniciação específicos também podem ser usados para alcançar a tradução mais eficiente de sequências que codificam os polipeptídeos da invenção. Tais sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Em casos onde sequências que codificam um polipeptídeo, seu códon de iniciação, e sequências a montante são inseridas no vetor de expressão apropriado, nenhum sinal controle transcricional ou traducional adicional pode ser necessário. Entretanto, em casos onde somente sequência de codificação, ou fragmento dá mesma, é inserida, sinais de controle traducionais exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser fornecidos. Além disso, o códon de inicia31 ção deve estar na região de leitura correta para assegurar a tradução do inserto inteiro. Elementos traducionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de intensificadores que são apropriados para o sistema celular particular que é usado, tal como aqueles descritos na literatura (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162). Além disso, uma linhagem de célula hospedeira pode ser escolhida pela sua capacidade de modular a expressão das sequências inseridas ou processar o polipeptídeo expresso de maneira desejada. Tais modificações de sequência incluem, mas não são limitadas à acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Processamento póstraducional que cliva uma forma pré-pró do polipeptídeo também pode ser usado para facilitar inserção, dobra e/ou função correta. Células hospedeiras diferentes que têm maquinário celular específico e mecanismos característicos de atividades pós-traducionais estão disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) e podem ser escolhidas para assegurar a modificação correta e o processamento da sequência. Células hospedeiras específicas incluem, mas não são limitadas a células metanógenas, tais como células de Methanobrevibacter, em particular, células de M. ruminantium, ou M. smithii. Células hospedeiras de interesse incluem, por exemplo, Rhodotorula, Aureobasidium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Pseudomonas, Erwinia e Flavobacterium, ou tais outros organismos como Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Streptomyces e similares. Células hospedeiras específicas incluem Escherichia coli, que é particularmente ajustada para uso com a presente invenção, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thurihgiensis, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans e similares.
Há várias técnicas para introduzir ácidos nucleicos em células eucarióticas cultivadas in vitro. Estas incluem métodos químicos (Felgner et al., Proc Natl. Acad. Sei., USA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell et al., Méthods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds, Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992); e Farhood, An32 nal. NY Acad. Sei., 716:23 34(1994)), uso de protoplastos (Bothwell, supra) ou pulsos elétricos (Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119152 (1994); Bothwell et al., supra; e Ausubel et al., supra), uso de vírus atenuados (Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. General. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); e Bothwell et al. Supra), bem como métodos físicos (Fynan et al., supra; Johnston et al., Meth. Cell Biol., 43 (Pt A):353 365 (1994); Bothwell et al., supra; e Ausubel et al., supra).
A entrega bem-sucedida de ácidos nucléicos ao tecido animal pode ser alcançada por lipossomas catiônicos (Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)), injeção direta de DNA ou RNA nu em tecido de músculo animal (Robinson et al., Vacc., 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sei. 1995, 772, 255256. Conry, et al. Câncer Res. 1995, 55 (7), 1397-1400), e embriões (Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); e Burdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)), injeção intramuscular de vacinas de RNA autorreplicante (Davis et al., J Virol 1996, 70 (6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20 (11 12), 1609 1617) ou injeção intradérmica de DNA usando tecnologia de arma gênica (Johnston et al., supra). Uma variedade de protocolos para detecção e medida da expressão dos polipeptídeos da invenção, usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para a proteína é conhecida na técnica. Exemplos incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e sorteamento celular ativado por fluorescência (FACS). Um imunoensaio com base em monoclonal de dois sítios pode ser usado com anticorpos monoclonais reativos a dois epitopos não interferentes no polipeptídeo, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser usado. Estes e outros ensaios são descritos, entre outros lugares, em Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) e Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).
Uma ampla variedade de marcações e técnicas de conjugação é conhecida pelos versados na técnica e pode ser usada em vários ensaios dé ácido nucleico e de aminoácido. Meios para produzir hibridização ou sondas de PCR marcadas para detectar sequências relacionadas a polinucleotídeos incluem oligomarcação, tradução por corte, marcação da extremidade ou amplificação por PCR usando um nucleotídeo marcado. Alternativamente, as sequências que codificam os polipeptídeos, ou quaisquer fragmentos ou variantes das mesmas, podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis, e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro pela adição de uma RNA polimerase apropriada, tal como T7, T3, ou SP6 e nucleotídeos marcados. Estes procedimentos podem ser conduzidos usando uma variedade de conjuntos comercialmente disponíveis de Amersham Pharmacia Biotech, Promega, e US Biochemical. Moléculas repórteres ou marcações adequadas, que podem ser usadas para facilidade de detecção, incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogênicos bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas e similares. Vetores de expressão ou células hospedeiras transformadas com vetores de expressão podem ser replicados sob condições adequadas para a expressão e a recuperação do polipeptídeo da cultura. A cultura pode compreender componentes da expressão in vivo ou in vitro. Componentes de expressão in vitro incluem aqueles para lisados de reticulócito de coelho, lisados de E. coli e extratos de germe de trigo, por exemplo, sistemas Expressway® ou RiPs de Invitrogen, sistemas Genelator® da iNtRON Biotechnology, sistemas EcoPro® ou STP3® de Novagen, sistemas TNT® Quick Coupled de Promega e sistemas EasyXpress de QIAGEN. O polipeptídeo produzido a partir da cultura pode ser secretado ou contido intracelularmente dependendo da sequência e/ou vetor usado. Em aspectos particulares, vetores de expressão que codificam um polipeptídeo de fago podem ser desenhados para conter sequências sinal que direcionam a secreção do polipeptídeo através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica. Outras construções podem incluir um domínio de aminoácido que facilitará a purificação do polipeptídeo. Tais domínios incluem, mas não são limitados a peptídeos quelantes metálicos, tais como módulos histidinatriptofano (por exemplo, 6X-HIS (SEQ ID NO: 150)) que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação de extensão/afinidade FLAG® (Immunex Corporation, Seattle, WA). Marcações de epitopo úteis incluem 3XFLAG®, HA, VSV-G, V5, HSV, GST, GFP, MBP, GAL4, e β-galactosidase. Plasmídeos úteis incluem aqueles compreendendo uma marcação de biotina (por exemplo, plasmídeos PinPoint® de Promega), proteína de ligação à calmodulina (por exemplo, plasmídeos pCAL de Stratagene), peptídeo de ligação à estreptavidina (por exemplo, plasmídeos InterPlay® de Stratagene), uma marcação c-myc ou FLAG® (por exemplo, plasmídeos de imunoprecipitação de Sigma-Aldrich), ou marcação de histidina (por exemplo, plasmídeos de QIAExpress de QIAGEN).
Para facilitar a purificação, os vetores de expressão podem incluir sequências ligantes cliváveis, tais como aquelas específicas para Factor Xa ou enteroquinase (Invitrogen, San Diego, CA). Por exemplo, o vetor pode incluir um ou mais ligantes entre o domínio de purificação e o polipeptídeo. Tal vetor de expressão fornece a expressão de uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção e um ácido nucléico que codifica 6 resíduos de histidina que precedem um sítio de clivagem de tiorredoxina ou de enteroquinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação em IMAC (cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado como descrito em Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) enquanto o sítio de clivagem de enteroquinase fornece um meio para purificar o polipeptídeo da proteína de fusão. Uma discussão de vetores que contêm proteínas de fusão é fornecida em Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).
Anticorpos da invenção podem ser produzidos usando métodos que são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, para uso em técnicas de purificação ou diagnosticas. Em particular, polipeptídeos ou polinucleotídeos podem ser usados para produzir anticorpos conforme protocolos geralmente conhecidos. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos e de cadeia única, fragmentos Fab, e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab. Anticorpos de neutralização, (isto é, aqueles que inibem a função) são especialmente preferenciais para uso com a invenção. Para a produção de anticorpos, vários hospedeiros incluindo cabras, coelhos, ratos, camundongos, humanos e outros, podem ser imunizados pela injeção com um polipeptídeo, polinucleotídeo, ou qualquer fragmento dos mesmos que tenham propriedades imunogênicas. Dependendo das espécies de hospedeiro, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a, Freund, géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, e substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) e dinitrofenol. Entre adjuvantes usados em humanos, BCG (bacilos Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são especialmente preferenciais.
É preferencial que os polipeptídeos ou os fragmentos usados para induzir anticorpos tenham uma sequência de aminoácido compreendendo pelo menos cinco aminoácidos e mais preferencialmente pelo menos 10 aminoácidos. É também preferencial que sejam idênticos a uma porção da sequência de aminoácido da proteína natural, e possam conter a sequência de aminoácido inteira de uma pequena molécula que ocorre naturalmente. Estiramentos curtos de aminoácidos podem ser fusionados com aqueles de outra proteína, tais como hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) e anticorpo produzido contra a molécula quimérica. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando qualquer técnica que fornece a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura. Estas incluem, mas não são limitados a técnica de hibridoma, a técnica de hibridoma de célula B humana, e a técnica de EBV-hibridoma (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80:2026-2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120). Anticorpos também po36 dem ser produzidos pela indução da produção in vivo na população de linfócitos ou pelo rastreamento de bibliotecas ou painéis de imunoglobulina de reagentes de ligação altamente específicos como descrito na literatura (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86:3833-3837; Winter, G. et al.
(1991) Nature 349:293-299).
Além disso, técnicas podem ser usadas para a produção de anticorpos quiméricos, por exemplo, a combinação de genes de anticorpo para obter uma molécula com especificidade a antígeno e atividade biológica apropriadas (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81:68516855; Neuberger, M.S. et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454). Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas, usando métodos conhecidos na técnica, para produzir anticorpos de cadeia única específicos. Anticorpos com a especificidade relacionada, mas de composição idiotípica distinta, podem ser gerados pela mistura de cadeia de bibliotecas de imunoglobina combinatórias randômicas (Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. 88:11120-3).
Aqueles versados na técnica à qual a invenção se relaciona apreciarão os termos diacorpos e triacorpos. Estes são moléculas que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) unido a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante peptídico curto que é curto o suficiente para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Isto promove pareamento com os domínios complementares de uma ou mais cadeias e estimula a formação de moléculas diméricas ou triméricas com dois ou mais sítios de ligação a antígenos funcionais. As moléculas de anticorpo resultantes podem ser monoespecificas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas em caso de diacorpos). Tais moléculas de anticorpo podem ser construídas a partir de dois ou mais anticorpos usando metodologia padrão na técnica à qual a invenção se relaciona; por exemplo, como descrito por Todorovska et al. (Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for câncer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2):47-66).
Fragmentos de anticorpo que contêm sítios de ligação específicos também podem ser gerados. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não são limitados aos fragmentos F(abj2 que podem ser produzidos pela digestão por pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes dissulfeto de fragmentos F(ab’)2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada (Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:12751281).
Vários imunoensaios podem ser usados para rastreamento para identificar anticorpos tendo especificidade de ligação. Numerosos protocolos para ensaios de ligação competitiva ou imunorradiométricos usando anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios tipicamente envolvem a medida da formação de complexo entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo e seu anticorpo específico. Um imunoensaio baseado em monoclonal de dois sítios, utilizando anticorpos monoclonais reativos a dois epitopos nãointerferentes é preferencial, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser empregado (Maddox, supra).
Os polipeptídeos de fago descritos neste pedido têm a capacidade de visar, permeabilizar, e/ou inibir células e são também úteis como moléculas veículo para entrega de moléculas inibitórias adicionais em células microbianas. A química para ligação de compostos a aminoácidos é bem desenvolvida e diversos tipos de moléculas diferentes podem ser ligadas aos polipeptídeos. Os métodos de ligação mais comuns dependem da presença de grupos amino (alfa-amino ou Lys), sulfidrila (Cys), ou ácidos carboxilicos (Asp, Glu, ou alfa-carboxila) livres. Métodos de ligação podem ser usados para ligar o polipeptídeo ao inibidor celular através do resíduo carbóxi- oú amino-terminal. Em alguns casos, uma sequência inclui múltiplos resíduos que podem reagir com a química escolhida. Isto pode ser usado para produzir multímeros, compreendendo mais de um inibidor celular. Alternativamerite, o polipeptídeo pode ser encurtado ou escolhido para que os resíduos rea38 tivos sejam localizados na terminação amino ou carboxila da sequência.
Por exemplo, uma molécula repórter, tal como fluoresceína pode ser especificamente incorporada em um resíduo de lisina (Ono et al., 1997) usando A/-a-Fmoc-/\/£--1-(4,4-dimetil-2,6 dioxociclo-hex-1-ilideno-3-metilbutil)lisina durante a síntese polipeptídica. Na síntese seguinte, 5- e 6-carboxifluoresceína succinimidil ésteres podem ser ligados após 4,4-dimetil-2,6 dioxociclo-hex-1 -ilideno ser removido pelo tratamento com hidrazina. Por isso, a ligação de uma molécula inibitória ao polipeptídeo de fago pode ser realizada pela inclusão de um resíduo de lisina à sequência polipeptídica, então reação com um inibidor celular apropriadamente derivatizado.
EDC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida) ou o método de ligação de carbodiimida também pode ser usado. Carbodiimidas podem ativar grupos carboxílicos da cadeia lateral do ácido aspártico e glutâmico bem como o grupo carboxil-terminal para torná-los sítios reativos para ligação com aminas primárias. Os polipeptídeos ativados são misturados com o inibidor celular para produzir o conjugado final. Se o inibidor celular for ativado primeiro, o método EDC ligará o inibidor celular através da alfa amina N-terminal e possivelmente através da amina na cadeia lateral da Lys, se presente na sequência.
Éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS) é um reagente heterobifuncional que pode ser usado para ligar polipeptídeos a inibidores celulares através de cisteínas. A ligação realiza-se com o grupo tiol de resíduos cisteína. Se a sequência escolhida não contiver Cys é comum colocar um resíduo Cys no N- ou C-terminal para obter ligação altamente controlada do polipeptídeo ao inibidor celular. Para fins de síntese, pode ser útil para a cisteína ser colocada no N-terminal do polipeptídeo. MBS é particularmente ajustado para uso com a presente invenção.
Glutaraldeído pode ser usado como um reagente de ligação bifuncional que liga dois compostos através de seus grupos amino. Glutaraldeído fornece um espaçador altamente flexível entre o polipeptídeo e inibidor celular para apresentação favorável. Glutaraldeído é um composto muito reativo e reagirá com Cys, Tyr e His até uma extensão limitada. O método de ligação por glutaraldeído é particularmente útil quando um polipeptídeo contém somente um grupo amino livre único em seu terminal amino. Se o polipeptídeo contiver mais de um grupo amino livre, grandes complexos multiméricos podem ser formados.
Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção podem ser fusionados (por exemplo, pela clonagem em estrutura) ou ligados (por exemplo, pela ligação química) a inibidores celulares, tais como agentes antimicrobianos. Incluído entre estes estão peptídeos antimicrobianos, por exemplo, proteína de aumento da permeabilidade/bactericida, proteínas antimicrobianas catiônicas, lisozimas, lactoferrinas e catelicidinas (por exemplo, de neutrófilos; ver, por exemplo, Hancock e Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323; Ganz and Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:53-58; Hancock et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135-175). Peptídeos antimicrobianos incluem ainda defensinas (por exemplo, de células epiteliais ou neutrófilos) e proteínas plaquetárias microbiocidas (ver, por exemplo, Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:13171323).Peptídeos antimicrobianos adicionais incluem, mas não são limitados a gramicidina S, bacitracina, polimixina B, taquiplesina, bactenecina (por exemplo, bactenecina de gado), ranalexina, cecropina A, indolicidina (por e20 xemplo, indolicidina de gado), e nisina (por exemplo, nisina bacteriana
Também incluídos como agentes antimicrobianos estão ionóforos, que facilitam a transmissão de um íon, (tal como sódio), através de uma barreira lipídica, tal como uma membrana celular. Dois compostos ionóforos particularmente ajustados a esta invenção são o RUMENSIN® (Eli Lilly) e
Lasalocid (Hoffman LaRoche). Outros ionóforos incluem, mas não são limitados a salinomicina, avoparcina, aridcina e actaplanina. Outros agentes antimicrobianos incluem penicilina, Monensin® e azitromicina, metronidazol, estreptomicina, canamicina, e penicilina, bem como, geralmente, β-lactamas, aminoglicosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, novobiocina, rifanpina e fluo30 roquinolonas (ver, por exemplo, Hom et al., 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74-83; Eckburg et al., 2003, Infection Immunity 71:591-596; Gijzen et aí., 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630-1634; Bonelo et al., 1984, FEMS
Microbiol. Lett. 21:341-345; Huser et al., 1982, Arch. Microbiol. 132:1-9; Hilpertetal., 1981, Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21-31).
Inibidores particularmente úteis são compostos que bloqueiam ou interferem na metanogênese, incluindo ácido bromoetanossulfônico, por exemplo, ácido 2-bromoetanossulfônico (BES) ou um sal do mesmo, por exemplo, um sal de sódio. Molibdato de sódio (Mo) é um inibidor da redução de sulfato, e pode ser usado com ácido bromoetanossulfônico. Outros compostos antimetanogênese incluem, mas não são limitados a nitrato, formiatò, fluoreto de metila, clorofórmio, hidrato de cloral, sulfito de sódio, etileno e hidrocarbonetos não-saturados, acetileno, ácidos graxos tais como ácido linoléico e cis-oleico, ácidos graxos saturados, tais como ácido behênico e esteárico, e, também lumazina (por exemplo, 2,4-pteridinediona). Compostos adicionais incluem 3-bromopropanossulfonato (BPS), ácido propinoico, e 2butinoato de etila.
Ainda incluídos como agentes antimicrobianos estão enzimas líticas, incluindo lisozima de fago, endolisina, lisozima, lisina, lisina de fago, muralisina, muramidase e virolisina. Enzimas úteis exibem a capacidade de hidrolisar ligações específicas na parede celular bacteriana. Enzimas líticas particulares incluem, mas não são limitadas a, glicosaminidases, que hidrolisam as ligações glicosídicas entre açúcares amino (por exemplo, ácido Nacetilmurâmico e N-acetilglicosamina) do peptidoglicano, amidases, que clivam a ligação de amida N-acetilmuramoil-L-alanina entre a fita de glicano e o peptídeo de ligação cruzada, e endopeptidases, que hidrolisam a ligação interpeptídica (por exemplo, cisteína endopeptidases) e endoisopeptidases que atacam pseudomureína de metanógenos da família Methanobacteriacaea.
Os polipeptídeos codificados por ORF 2058 ou ORF 2055, descritos em detalhes aqui e abaixo, são úteis como enzimas líticas específicas para metanógenos de rúmen. As enzimas nativas podem ser preparadas a partir de células de M. ruminantium recentemente lisadas por <pmru. Alternativamente, ORF 2058 ou ORF 2055 podem ser clonados em um vetor de expressão e expressas em um hospedeiro heterólogo, tal como Escherichia coli. Isto foi realizado anteriormente com PeiP e PeiW e foi mostrado que as proteínas recombinantes eram ativas contra paredes celulares de Methanothermobacter sob condições redutoras (Luo et al., 2002). Enzimas líticas de ORF 2058 ou ORF 2055 ou qualquer outra enzima lítica podem ser usadas em composições, por exemplo, como um aditivo alimentar para ruminantes ou podem ser incorporadas em uma cápsula de liberação lenta ou dispositivo em bolus para a entrega ao longo de um período de tempo maior dentro do rúmen. As enzimas líticas podem ser usadas em combinação ou sequencialmente com outro inibidor(es) metanógeno para evitar a adaptação dos metanógenos do hospedeiro e resistência às enzimas. Mutações randômicas e/ou direcionadas nas enzimas também podem ser usadas para evitar a adaptação. Os componentes interruptores líticos/lisogênicos (por exemplo, ORF 1981 e ORF 1986-ORF 1983) podem ser usados de uma maneira similar como as enzimas líticas.
Adicionalmente, PNAs estão incluídos como agentes antimicrobianos. PNAs são híbridos de peptídeo-ácidos nucléicos nos quais o esqueleto de fosfato foi substituído por um esqueleto aquiral e neutro feito de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina (ver, por exemplo, Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003). As bases A, G, T, C são ligadas ao nitrogênio amino no esqueleto através de ligações metilenocarbónila (P.E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568). PNAs ligam-se a sequências complementares com alta especificidade, e afinidade mais alta em relação a DNA ou RNA análogo (M. Egholm et al., supra). Híbridos de PNA/DNA ou PNA/RNA também exibem estabilidade térmica mais alta em comparação com dúplexes DNA/DNA ou DNA/RNA correspondentes (M. Egholm et al., supra). PNAs também possuem alta estabilidade química e biológica, devido ao esqueleto de amida não-natural que não é reconhecido por nucleases ou proteases (V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313). Tipicamente, PNAs têm pelo menos 5 bases em tamanho, e incluem uma lisina terminal. PNAs podem ser pegilados para estender ainda seu tempo de vida (Nielsen,
Ρ. Ε. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63). Em um aspecto particular, os polipeptídeos da invenção podem ser fusionados (por exemplo, pela clonagem em estrutura) ou ligados (por exemplo, por ligação química) a inibidores celulares, tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser dirigidos a células microbianas, ou particularmente células metanógenas, ou um ou mais componentes celulares. Por exemplo, proteínas de superfície celular, por exemplo, receptores extracelulares, podem ser visadas. Incluídas estão moléculas de imunoglobulina e porções das moléculas imunologicamente ativas da imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que especificamente se liga a (imunorreage com) um antígeno. Os polipeptídeos da invenção encontram particular uso no direcionamento de uma célula microbiana, em particular, uma célula metanógena. Em certos aspectos, os polipeptídeos podem ser usados para associar-se ou ligar-se à parede celular ou membrana, permeabilizar a célula e/ou inibir crescimento ou replicação da célula. Como tal, os polipeptídeos podem ser usados para ligação transiente ou estendida à célula, ou penetrar a parede celular ou membrana e/ou acumular-se no ambiente intracelular. É entendido que os polipeptídeos de fago, bem como polinucleotídeos correspondentes, vetores de expressão, células hospedeiras e anticorpos da invenção, podem ser usados para visar vários micróbios, por exemplo, Methanobrevibacter ruminantium, que é o principal metanógeno em ruminantes, e Methanobrevibacter smithii, que é o principal metanógeno em seres humanos. Para efetuar o direcionamento, a célula microbiana pode ser contatada com o polipeptídeo de fago como isolado de uma ou mais fontes naturais, ou produzido por vetores de expressão e/ou células hospedeiras, ou química sintética ou semissintética como descrito em detalhes neste pedido. Para permeabilização aumentada, o polipeptídeo pode ser fusionado ou ligado a uma ou mais sequências de sinal (sequência consenso predita: [ML] KKKK[K]{0,1 }X{0,9}[IL][IFL][IL] [IL][IS] [LlA]X{0,4}[LIVF][LIAV][LI][ILV][LAIV][ILFV][LIVF][SAL][ILV][GSA][AS][VAI][SA] A, (SEQ ID NO: 151), ver FIGURA 6). Ver também Pérez-Bercoff, Â., Koch, J. and Burglin, T.R. (2006) LogoBar: bar graph visualization of protein logos with gaps. Bioinformatics 22, 112-114. Em aspectos particulares, o polipeptídeo é entregue a indivíduos como composição descrita em detalhes neste pedido, por exemplo, através do uso de um dispositivo de liberação lenta para ruminantes. Em certas modalidades, o polipeptídeo é fusionado ou ligado a um inibidor celular, por exemplo, um composto antimetanogênese (por exemplo, ácido bromoetanossulfônico), um anticorpo ou fragmento de anticorpo, enzima lítica, ácido nucléico peptídico, peptídeo antimicrobiano ou outro antibiótico. O inibidor polipeptídico é entregue a indivíduos como uma composição para inibir o crescimento e/ou a replicação de células microbianas, em particular, células metanógenas. A composição compreende, por exemplo: a) um fago isolado, partícula de fago, genoma de fago, ou alteração, fragmento, variante, ou derivado do mesmo; b) um polipeptídeo de fago isolado, ou uma alteração, fragmento, variante, ou derivado do mesmo; c) um polinucleotídeo isolado, ou uma alteração, fragmento, variante, ou derivado do mesmo; d) um vetor de expressão compreendendo este polinucleòtídeo; ou e) uma célula hospedeira compreendendo este vetor de expressão. As composições da invenção podem ser especificamente empacotadas como parte de conjuntos de direcionamento, permeabilização, e/ou inibição de células microbianas, especialmente células metanógenas, conforme os métodos descritos. Os conjuntos compreendem pelo menos uma composição como estabelecida neste pedido e instruções de uso em direcionamento ou permeabilização celular, ou inibição de crescimento celular ou replicação, para metanógenos ou outros micróbios.
Como uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se a uma composição farmacêutica em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso com qualquer um dos métodos discutidos acima. Tais composições farmacêuticas podem compreender um polipeptídeo de fago, em combinação com um inibidor celular. Alternativamente, as composições farmacêuticas podem compreender um vetor de expressão ou célula hospedeira como descrito em detalhes neste pedido. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como composto estabilizante, que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril, biocompatível, incluindo, mas não limitado à solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um indivíduo sozinhas, ou em combinação com outros agentes, fármacos (por exemplo, fármacos antimicrobianos) ou hormônios.
Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Detalhes adicionais de técnicas de formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA). As composições farmacêuticas utilizadas nesta invenção podem ser administradas por qualquer grupo de vias incluindo, mas não limitadas a meios, orais, intravenosos, intramusculares, intraarteriais, intramedulares, intratecais, intraventriculares, transdérmicos, subcutâneos, intraperitoneais, intranasais, enterais, tópicos, sublinguais ou retais.
Composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para a administração oral. Tais veículos permitem às composições farmacêuticas serem formuladas como pastilhas, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões particuladas, suspensões e similares, para a ingestão pelo indivíduo. Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da combinação de compostos ativos com excipiente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante, e processando da mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou drágeas. Excipientes adequados são agentes de enchimento de carboidrato ou proteicos, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, tal como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose de sódio; gomas incluindo arábica e tragacanto; e proteínas, tais como gelatina e colá45 geno. Se desejado, agentes de desintegração ou solubilização podem ser adicionados, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico, ou sal do mesmo, tal como alginato de sódio.
Preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas duras de gelatina, bem como cápsulas seladas macias feitas da gelatina e um revestimento, tal como glicerol ou sorbitol. Cápsulas duras podem conter ingredientes ativos misturados com um enchedor ou ligantes, tais como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem estar dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordurosos, líquido, ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizadores. Núcleos de drágeas podem ser usados em conjunto com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concentradas, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drágeas para identificação do produto ou caracterizar a quantidade do composto ativo, isto é, dosagem.
Formulações farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou salina fisiologicamente tamponada. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Solventes lipofílicos ou veículos adequados incluem óleos gordurosos, tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácido graxo sintético, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Polímeros amino policatiônicos não lipídicos também podem ser usados para entrega. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropriados para a barreira particular a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser produzidas de uma maneira que é conhecida na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drágea, abrasamento, emulsificação, encapsulamento, captura ou liofilização. A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada por muitos ácidos, incluindo mas não limitada a clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros protônicos que são formas de base livre correspondentes. Em outros casos, a preparação preferencial pode ser um pó liofilizado que pode conter algum ou todo dos seguintes: histidina 1 a 50 mM, sacarose 0,1% a 2% e manitol 2 a 7%, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com o tampão antes do uso. Depois que as composições farmacêuticas tiverem sido preparadas, podem ser colocadas em um recipiente apropriado e etiquetadas para o tratamento de uma condição indicada. Para administração de uma composição da invenção, tal etiquetamento incluiría quantidade, frequência e método da administração.
Composições farmacêuticas adequadas para uso na invenção incluem composições em que os ingredientes ativos são contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o objetivo desejado. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios celulares, por exemplo, em células microbianas, ou em particular, em células metanógenas, ou em modelos animais, normalmente camundongos, coelhos, cães ou porcos, ou em espécies ruminantes, tais como ovelhas, gado, cervos e cabras. O modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Tal informação então pode ser usada para determinar doses e vias de administração úteis. Quantidades de dosagem normais podem variar de 0,1 a
100.000 microgramas, até uma dose total de aproximadamente 1 g, ou mais, dependendo da via de administração. Orientação quanto a dosagens particulares e métodos de entrega é fornecida na literatura e geralmente disponível para profissionais na técnica. Aqueles versados na técnica empregarão dife5 rentes formulações para polinucleotídeos do que para polipeptídeos. Similarmente, a entrega de polinucleotídeos ou de polipeptídeos será específica para células, condições, localizações particulares, etc.
Produtos terapêuticos baseados em fago são conhecidos, e métodos de produção de tais composições são publicados na técnica. Produtos terapêuticos de fago foram descritos, por exemplo, para visar Stafilococcus (por exemplo, S. aureus), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Escherichia (por exemplo, E. coli), Klebsiella (por exemplo, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis scleromatis e K. pneumonia), Proteus, Salmonella, Shigella (ver, por exemplo, Carlton, R.M. (1999). Archivum Immunologiae et Therapi.15 ae Experimentalis, 47: 267-274; Liu, J. et al. (2004). Nat. Biotechnol. 22, 185191; Projan, S. (2004). Nat. Biotechnol. 22, 167-168; Sulakvelidze, A., Alavidze, Z. and Morris, J. G. (2001). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45 (3): 649-659; Weber-Dabrowska, Mulczyk, M. and Gorski, A. (2000). Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 48: 547-551. Terapias de fago têm vantagens inerentes sobre antimicrobianos tradicionais, em que fagos são altamente específicos e não afetam a microflora normal do corpo humano; o fago não infecta células eucarióticas, e não tem nenhum efeito colateral sério conhecido; o fago pode localizar o sítio de infecção; e o fago pode replicar exponencialmente, portanto os tratamentos necessitam somen25 te de uma pequena dose e são geralmente de baixo custo (ver, por exemplo, Sulakvelidze et al., supra). Para revisão atual, ver Fischetti VA, Nelson D, Schuch R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nat Biotechnol. 2006 Dec; 24 (12):1508-11. Produtos terapêuticos com base em peptídeo e polipeptídeo também foram descritos, por exemplo, para deni30 leucina, difitox, octreotídeo, vapreotídeo, lanreotídeo, peptídeos de série RC3940, decapeptila, lupron, zoladex, cetrorelix (ver, por exemplo, Lu et al., 2006, AAPS J 8:E466-472), hemocidinas, estafopaínas (ver, por exemplo,
Dubin et al., 2005, Acta Biochemica Polonica, 52:633-638), bem como indolicidina, defensinas, lantibióticos, microcidina B17, histatinas e maganina (ver, por exemplo, Yeaman and Yount, 2003, Pharmacol Rev 55:27-55). Orientação geral para produtos terapêuticos de peptídeo e polipeptídeo também pode ser encontrada em Degim et al., 2007, Curr Pharm Des 13:99-117 e Shai et al., 2006, Curr Prot Pept Sei, 7:479-486. Fármacos baseados em peptídeo recentemente aprovados incluem Hematide® (agente estimulante de eritropoiese com base no peptídeo sintético, Affymax, Inc.) Exenatide (exendina-4 sintética, Amylin/Eli Lilly), Natrecor (nesiritida, peptídeo natriuréti10 co, Seios), Plenaxis (abarelix, Praecis Pharmaceuticals), e SecreFlo (secretina, Repligen).
A dosagem exata será determinada pelo profissional, à luz de fatores relacionados ao indivíduo que necessita do tratamento. Dosagem e administração são ajustadas para fornecer níveis suficientes do agente ativo .15 ou manter o efeito desejado. Fatores que podem ser considerados incluem a severidade do estado da doença, a saúde geral do indivíduo, idade, peso, e gênero do indivíduo, dieta, tempo, e frequência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reação, e tolerância/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de longa duração podem ser administradàs a càda 3 ou 4 dias, a cada semana, ou uma vez a cada duas semanas dependendo da meia-vida e taxa de depuração da formulação particular.
Particularmente útil para as composições da invenção (por exemplo, composições farmacêuticas) são fórmulas ou mecanismos de liberação lenta. Por exemplo, dispositivos intrarruminais incluem, mas não são limitados a, Time Capsule® Bolus range por Agri-Feeds Ltd., Nova Zelândia, originalmente desenvolvida por AgResearch Ltd., Nova Zelândia, como descrito em WO 95/19763 e NZ 278977, e CAPTEC por Nufarm Health & Sciences, uma divisão de Nufarm Ltd., Auckland, Nova Zelândia, como descrito em AU 35908178, PCT/AU81/100082, e Laby et al., 1984, Can. J. Anim. Sei.
64 (Suppl)., 337-8, todos os quais são incorporados por referência neste pedido. Como um exemplo particular, o dispositivo pode incluir uma mola e êmbolo que forçam a composição contra um buraco na extremidade de um cilindro.
Como uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se a uma composição para um suplemento de água, por exemplo, composição molhada, ou suplemento alimentar, por exemplo, componente alimentar para ruminante, para o uso com qualquer um dos métodos discutidos acima. Em aspectos particulares, o suplemento alimentar compreende pelo menos um material vegetal que é comestível, e um peptídeo ou polipeptídeo da invenção. Alternativamente, o suplemento alimentar compreende pelo menos um material vegetal que é comestível, e um polipeptídeo ou peptídeo, ou um polinucleotídeo que codifica um peptídeo ou polipeptídeo descrito neste pedido, por exemplo, como um vetor de expressão ou célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão. Em particular, a composição inclui ainda um inibidor celular, como fusionado ou ligado à sequência resultante. O material vegetal preferencial inclui qualquer um de feno, grama, grão, ou farinha, por exemplo, feno de legume, feno de grama, ensilagem de milho, ensilagem de grama, ensilagem de legume, grão de milho, aveia, cevada, grão de destilarias, grão de cervejaria, farinha de soja, e farinha de semente de algodão. Em particular, ensilagem de grama é útil como uma composição alimentar para ruminantes. O material vegetal pode ser geneticamente modificado para conter um ou mais componentes da invenção, por exemplo, um ou mais polipeptídeos ou peptídeos, polinucleotídeos ou vetores.
Em outra modalidade, os anticorpos que são construídos para polipeptídeos ou os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para determinar a presença de micróbios, especialmente metanógenos, ou em ensaios para monitorar níveis de tais micróbios. Os anticorpos úteis para fins diagnósticos podem ser preparados da mesma maneira que aqueles descritos acima. Ensaios diagnósticos incluem métodos que utilizam o anticorpo e uma marcação para detectar um polipeptídeo em fluidos corporais humanos ou extratos de células ou tecidos. Os anticorpos podem ser usados com ou sem modificação, e podem ser marcados ligando-os, covalentemente ou não covalentemente, a uma molécula repórter. Uma ampla variedade de moléculas repórteres que são conhecidas na técnica pode ser usada, vários das quais são descritas acima.
Uma variedade de protocolos para medir níveis de um polipeptídeo ou polinucleotídeo é conhecida na técnica (por exemplo, ELISA, RIA, FACS, e blots, tais como Southern, Northern, Western blots), e fornece uma base para determinar a presença ou níveis do micróbio, especialmente um metanógeno. Níveis normais ou padrão estabelecidos pela combinação de fluidos corporais ou extratos celulares tomados de indivíduos normais, por exemplo, seres humanos ou ruminantes normais, com o anticorpo sob condições adequadas para formação do complexo. A quantidade da formação de complexo padrão pode ser quantificada por vários métodos, mas preferencialmente por meios fotométricos. Quantidades de polipeptídeo ou polinucleotídeo expressas em amostras controle e tratadas do indivíduo (por exemplo, amostras de indivíduos tratados) são comparadas com os valorespadrão. Desvio entre os valores padrão e objeto estabelece os parâmetros para determinar a presença ou níveis do micróbio.
Em uma modalidade particular da invenção, os polinucleotideos podem ser usados para fins diagnósticos usando técnicas de hibridização e/ou amplificação particulares. Os polinucleotideos que podem ser usados incluem oligonucleotídeos, moléculas de RNA e DNA complementares, e PNAs. Os polinucleotideos podem ser usados para detectar e quantificar expressão gênica em amostras nas quais a expressão pode ser correlacionada com a presença ou os níveis de um micróbio. O ensaio diagnóstico pode ser usado para distinguir entre ausência, presença e alteração de níveis de micróbio, e monitorar níveis durante a intervenção terapêutica.
Em um aspecto, a hibridização com sondas de PCR pode ser usada para identificar sequências de ácido nucleico, especialmente sequências genômicas, que codificam os polipeptídeos da invenção. A especificidade da sonda, se é feita de uma região altamente específica, por exemplo, 10 nucleotídeos únicos na região reguladora 5’, ou região menos específica, por exemplo, na região de codificação 3’, e a estringência da hibridização ou amplificação (máxima, alta, intermediária, ou baixa) determinará se a sonda identifica sequências somente que ocorrem naturalmente, alelos, ou se51 quências relacionadas. As sondas também podem ser usadas para detecção de sequências relacionadas, e devem conter preferencialmente pelo menos
50% dos nucleotídeos de alguma das sequências de codificação. As sondas de hibridização da invenção objeto podem ser de DNA ou RNA e derivadas da sequência nucleotídica das SEQ ID NO:74 a 142, ou complementos, ou sequências modificadas das mesmas, ou de sequências genômicas incluindo promotor, elementos intensificadores e íntrons da sequência que ocorre naturalmente.
Meios para produzir sondas de hibridização específicas para 10 DNAs incluem a clonagem de sequências de ácido nucléico em vetores para a produção de sondas de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, comercialmente disponíveis, e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro por meio de adição de RNA polimerases apropriadas e os nucleotídeos marcados apropriados. Sondas de hibridização podem ser mar,15 cadas por uma variedade de grupos repórteres, por exemplo, radionuclídeos tais como 32P ou 35S, ou marcações enzimáticas, tais como fosfatase alcalina ligada à sonda através de sistemas de ligação avidina/biotina e similares. Os polinucleotídeos podem ser usados em análise por Southern ou Northern, dot blot, ou outras tecnologias baseadas em membrana; em tecnolò20 gias de PCR; ou em ensaios de sonda, pino, ELISA, ou microarranjos que utilizam fluidos ou tecidos de biópsias objeto para detectar a presença ou níveis de um micróbio. Tais métodos qualitativos ou quantitativos são bem conhecidos na técnica.
Em um aspecto particular, as sequências de ácido nucléico po25 dem ser úteis em vários ensaios marcados por métodos-padrão, e adicionadas a um fluido ou amostra de tecido de um indivíduo sob condições adequadas para hibridização e/ou amplificação. Após um período de incubação adequado, a amostra é lavada e o sinal é quantificado e comparado com um valor padrão. Se a quantidade do sinal na amostra teste for significativamen30 te alterada daquela de uma amostra controle comparável, a presença de níveis alterados de sequências nucleotídicas na amostra indica a presença ou os níveis do micróbio. Tais ensaios também podem ser usados para ava52 liar a eficácia de um regime de tratamento particular em estudos animais, em testes clínicos, ou no monitoramento do tratamento de um indivíduo.
A fim de fornecer uma base para diagnóstico da presença ou níveis de um micróbio, um perfil normal ou padrão para a expressão é estabelecido. Isto pode ser realizado pela combinação de fluidos corporais ou extratos celulares tomados de indivíduos normais, com um polinucleotídeo ou um fragmento do mesmo, sob condições adequadas para hibridização e/ou amplificação. Níveis- padrão podem ser quantificados pela comparação dos valores obtidos de indivíduos normais com aqueles de um experimento onde uma quantidade conhecida de um polinucleotídeo substancialmente purificado é usada. Valores padrão obtidos de amostras normais podem ser comparados com valores obtidos de amostras de indivíduos tratados para crescimento microbiano. Desvio entre valores- padrão e objeto é usado para estabelecer a presença ou níveis do micróbio. Uma vez que o micróbio é identificado e um protocolo de tratamento é iniciado, ensaios de hibridização e/ou amplificação podem ser repetidos em uma base regular para avaliar se o nível de expressão no indivíduo começa a reduzir em relação ao que é observado no indivíduo normal. Os resultados obtidos de ensaios sucessivos podem ser usados para mostrar a eficácia do tratamento durante um período variando de diversos dias a meses.
Usos diagnósticos particulares de oligonucleotídeos desenhados a partir das sequências de ácido nucleico podem envolver o uso de PCR. Tais oligômeros podem ser quimicamente sintetizados, gerados enzimaticamente, ou produzidos in vitro. Oligômeros consistirão preferencialmente de duas sequências nucleotídicas, uma com orientação senso (5’.->.3’) e outra com orientação antissenso (3’.->.5’), empregados sob condições otimizadas para identificação de uma sequência nucleotídica ou condição específicas. Os mesmos dois oligômeros, conjuntos aninhados de oligômeros, ou até um agrupamento degenerado de oligômeros podem ser empregados sob condições menos estringentes para detecção e/ou quantificação de sequências de RNA ou DNA estreitamente relacionadas.
Métodos que também podem ser usados para quantificar ex53 pressão incluem radiomarcação ou biotinilação de nucleotídeos, coamplificação de um ácido nucléico controle, e curvas padrão nas quais os resultados experimentais são interpolados (Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). A velocidade de quantificação de múltiplas amostras pode ser acelerada pela corrida do ensaio em um formato ELISA onde o oligômero de interesse é apresentado em várias diluições e uma resposta espectrofotométrica ou colorimétrica fornece quantificação rápida.
Em modalidades adicionais, oligonucleotídeos ou fragmentos maiores derivados de qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste pedido podem ser usados como alvos em um microarranjo. O microarranjo pode ser usado para monitorar o nível de expressão de grandes quantidades de genes simultaneamente (para produzir uma imagem do transcrito), e identificar variantes, mutações e polimorfismos genéticos. Esta informação pode ser usada para determinar a função gênica, entender a base genética da doença, diagnosticar a doença, e desenvolver e monitorar atividades de agentes terapêuticos. Em uma modalidade, o microarranjo é preparado e usado de acordo com os métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos no pedido de patente PCT WO 95/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) e Schena, M. et al. (1996; Proc: Natl. Acad. Sei. 93: 10614-10619). Em um aspecto, os oligonucleotídeos podem ser sintetizados na superfície do microarranjo usando um procedimento de ligação químico e um aparelho de aplicação de jato de tinta, tal como aquele descrito no pedido de patente PCT WO 95/251116 (Baldeschweiler et al.). Em outro aspecto, um arranjo gridded análogo a um dot ou slot blot (aparelho HYBRIDOT, Life Technologies) pode ser usado para arranjar e ligar fragmentos de cDNA ou oligonucleotídeos à superfície de um substrato usando um sistema a vácuo, procedimentos de ligação térmica, por UV, mecânica ou química. Ainda em outro aspecto, um ensaio pode ser produzido à mão ou pelo uso de dispositivos disponíveis, materiais e máquinas (incluindo pipetadores multicanal ou instrumentos robóticos; Brinkmann, Westbury, N.Y.) e pode incluir, por exemplo, 24, 48, 96, 384, 1024, 1536, ou 6144 pon54 tos ou poços (por exemplo, como uma placa multipoço), ou mais, ou qualquer outro múltiplo de 2 a 1.000.000 que se presta ao uso eficiente da instrumentação comercialmente disponível.
A fim de conduzir a análise da amostra usando os microarranjos, 5 polinucleotídeos são extraídos de uma amostra biológica. As amostras biológicas podem ser obtidas de qualquer fluido corporal (sangue, urina, saliva, fleuma, sucos gástricos, etc.), células cultivadas, biópsias ou outras preparações teciduais. Para produzir sondas, os polinucleotídeos extraídos da amostra são usados para produzir sequências de ácido nucléico que são complementares aos ácidos nucléicos no microarranjo. Se o microarranjo consistir em cDNAs, RNAs antissenso são sondas apropriadas. Por isso, em um aspecto, o mRNA é usado para produzir cDNA que, por sua vez e na presença de nucleotídeos fluorescentes, é usado para produzir fragmentos ou sondas de RNA antissenso. Estas sondas fluorescentemente marcadas .15 são incubadas com o microarranjo para que as sequências de sonda hibridizem aos oligonucleotídeos de cDNA do microarranjo. Em outro aspecto, as sequências de ácido nucléico usadas como sondas podem incluir polinucleotídeos, fragmentos, e sequências complementares ou antissenso produzidas usando enzimas de restrição, tecnologias de PCR e conjuntos de oligomar20 cação (Amersham Pharmacia Biotech) bem conhecido na área da tecnologia de hibridização.
Em outra modalidade da invenção, os polipeptídeos da invenção ou fragmentos funcionais ou imunogênicos ou oligopeptídeos dos mesmos, podem ser usados para rastrear bibliotecas de compostos em qualquer uma de uma variedade de técnicas de rastreamento de fármaco. O fragmento empregado em tal rastreamento pode estar livre em solução, fixado a um suporte sólido, carregado em uma superfície celular ou localizado intracelularmente. A formação de complexos de ligação, entre o polipeptídeo e o agente que é testado, pode ser medida.
Uma técnica de rastreamento de fármaco que pode ser usada fornece rastreamento de alto rendimento de compostos tendo afinidade de ligação adequada ao polipeptídeo de interesse como descrito no pedido de patente PCT WO 84/03564 publicado. Neste método, grandes quantidades de pequenos compostos de teste diferentes são sintetizados em um substrato sólido, tal como pinos plásticos ou alguma outra superfície. Compostos de teste são reagidos com o polipeptídeo, ou fragmentos do mesmo e lavados. O polipeptídeo ligado então é detectado por métodos bem conhecidos na técnica. O polipeptídeo purificado também pode ser revestido diretamente em placas para uso nas técnicas de rastreamento de fármaco acima mencionadas. Alternativamente, anticorpos não neutralizantes podem ser usados para capturar o polipeptídeo e imobilizá-lo em um suporte sólido.
Em outra técnica, pode-se usar ensaios de rastreamento de fármaco competitivos nos quais anticorpos de neutralização capazes de ligarse ao polipeptídeo especificamente compete com um composto teste para ligação ao polipeptídeo. Desta maneira, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de um composto teste que compartilha um ou mais sítios de ligação ao antígeno com o anticorpo.
EXEMPLOS
Os exemplos descritos neste pedido são para fins de ilustrar modalidades da invenção. Outras modalidades, métodos e tipos de análises estão dentro do escopo de pessoas versadas na técnica de diagnóstico molecular e não precisam ser descritos em detalhes acerca disto. Outras modalidades dentro do escopo da técnica são consideradas sendo parte desta invenção.
EXEMPLO 1: Estimativa do tamanho do genoma
A cepa M1T de Methanobrevibacter ruminantium (DSM1093) foi cultivada em meio BY+ (meio basal, Joblin et al., 1990) que consiste em [g/l] NaCI (1), KH2PO4 (0,5), (NH4)2SO4 (0,25), CaCI2.2H2O (0,13), MgSO4.7H2O (0,2), K2HPO4 (1), fluido de rúmen clarificado (300 ml), dH2O (360 ml), NaHCO3 (5), resazurina (0,2 ml), L-cisteína-HCI (0,5), extrato de levedura (2), e solução de elementos traço de Balch (10 ml) (elementos traço adicionados; Balch et al., 1979) que consiste em (g/l) ácido nitrilotriacético (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4. H2O (0,5), NaCI (1), FeSO4.7H2O (0,1), CoCI2.6H2O (0,1), CaCI2 (0,1), ZnSO4.7H2O (0,1), CuSO4.5H2O (0,01), AIK(SO4)2.12H2O (0,01), H3BO3 (0,01), Na2MoO4.2H2O (0,01), NiSO4.6H20 (0,03), Na2SeO3 (0,02), e Na2Wo4.2H2O (0.02). DNA genômico foi extraído pelo congelamento de precipitados celulares em N2 líquido e trituração usando um recipiente de trituração e pilão pré-resfriados esterilizados. Homogenatos celulares foram embutidos em pinos de agarose e manipulações subsequentes foram realizadas nos pinos para reduzir o corte físico de DNA genômico. Digestões foram realizadas com endonucleases de restrição e fragmentos de DNA foram separados usando eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). EXEMPLO 2: Clonagem e sequenciamento de DNA
DNA do genoma de M. ruminantium foi sequenciado por Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA) usando uma abordagem de clonagem shotgun randômica (Fleischmann et al., 1995) e por Macrogen Corporation (Rockville, MD, USA) usando pirossequenciamento. Resumidamente, as bibliotecas de DNA de M. ruminantium foram construídas em Escherichia coli por rompimento físico randômico de DNA genômico e separação de fragmentos por eletroforese em gel. Grandes fragmentos na faixa de 40 Kb foram recuperados do gel e usados para gerar uma grande biblioteca de inserção de fosmídeo. Fragmentos de DNA na faixa de 2 a 4 Kb foram recuperados e usados para gerar uma pequena biblioteca de inserção de plasmídeo. Clones resultantes a partir de bibliotecas de inserção tanto grandes como pequenas foram cultivados, e seu DNA plasmidial ou fosmidial foi recuperado e sequenciado usando tecnologia de sequenciamento de alto rendimento. Um número suficiente de clones foi sequenciado para dar uma cobertura teórica de 8 vezes do genoma de M. ruminantium. Pirossequenciamento foi realizado em fragmentos de DNA genômicos randomicamente cortados para fornecer uma cobertura teórica final de 10 vezes.
EXEMPLO 3: Montagem de sequência e anotação de pró-fago
Sequências de DNA foram alinhadas para encontrar sobreposições de sequência e montadas em sequências contíguas (contig) usando Paracel Genome Assembler (Paracel Inc, CA, USA) e o pacote Staden (Staden et al., 1998) em combinação com sequência tanto de PCRs padrão quanto reversas. Contigs foram analisados usando o localizador de região de leitura aberta (ORF) GLIMMER (Localizador Gênico do Modelo de Markov Interpolado ER, Delcher et al., 1999) e cada ORF foi analisado por BLASTP lacunado (Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica (Altschul et al., 1997) contra nucleotídeo não redundante e bancos de dados proteicos do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os contigs da sequência de fase de rascunho de 8 vezes foram ligados randomicamente pela ligação artificial de sequências para gerar uma pseudomolécula e submetidos a The Institute for Genomic Research (TIGR, DC, USA) para autoanotação. Os contigs montados a partir de pirossequenciamento de 10 vezes foram reanalisados usando GLIMMER e ORFs foram autoanotadas usando GAMOLA (Observação Global de sequências de DNA submetidas a Blast em local Multiplexadas; Altermann and Klaenhammer, 2003). ORFs foram categorizadas pela função usando o banco de dados de grupos de proteínas ortólogas (COG) (limiar 1e-02) (protocolo de transferência de hipertexto://world wide web. web.pnas.org/cgi/content/full/102/11/3906; Tatusov et al., 2001).
Motivos proteicos foram determinados por HMMER (protocolo de transferência de hipertexto://hmmer.wustl.edu) usando bibliotecas PFAM HM e TIGRFAM, com alinhamento global e local (protocolo de transferência de hipertexto://pfam.wustl.edu) e modelos TIGRFAM HMMs modo padrão e fragmento (protocolo de transferência de hipertexto:// world wide web.tigr.org/TIGRFAMs) respectivamente (limiar 1e-02). tRNAs foram identificados pelo uso de TRNASCAN-SE (Lowe and Eddy, 1997) e repetições nucleotídicas foram identificadas usando o pacote de programas KODON (Applied Maths, Austin, TX, USA) e REPUTER (Kurtz and Schleiermacher, 1999). Anotações automatizadas foram posteriormente verificadas manualmente. A visualização de atlas do genoma foi construída usando GENEWIZ (Jensen et al., 1999) e as estruturas de dados subjacentes foram geradas por algoritmos desenvolvidos internamente personalizados. Reconstruções da via predita do ORFeoma de M. ruminantium foram realizadas em conjunto com o banco de dados em tempo real KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al. 2004) usando programa desenvolvido inter58 namente (PathwayVoyager; Altermann and Klaenhammer, 2005).
EXEMPLO 4: Resultados e análise do sequenciamento
Estimativa de tamanho do genoma de M. ruminantium por digestão por enzima de restrição de DNA genômico e medida de fragmentos através de PFGE, indicaram um cromossomo único de aproximadamente 2,5 a 2,9 Mb. O sequenciamento inicial de grandes e pequenos clones de inserção (cobertura de rascunho de 6 vezes) e reunião da sequência em contigs indicou que uma região de 40 Kb do genoma foi altamente super-representada (> 20 vezes), particularmente dentro da pequena biblioteca de inserção. Isto foi devido possivelmente a um alto número de cópias de plasmídeo (embora nenhum DNA extracromossômico tenha sido identificado) ou um bacteriófago lisogênico que foi replicado durante o crescimento da cultura usada para extração de DNA. Por causa deste grande viés de sequência, sequenciamento adicional foi realizado (cobertura de genoma teórica de 2 vezes) para pequenos clones de inserção somente produzindo uma cobertura final de 8 vezes por sequenciamento de Sanger. A sequência de fase de rascunho de 8 vezes foi reunida em 756 contigs que foram ligados através de 105 estruturas. Pirossequenciamento adicional foi realizado para uma cobertura adicional de ~10 vezes e incorporação destas sequências na reunião resultou no número de contig reduzido para 27. Fechamento de lacuna subsequente usando técnicas de PCR de faixa longa e inversa reduziu o número de contig para 14, com um restante mal reunido.
Durante a fase de sequenciamento de alto rendimento, um viés foi observado na cobertura de sequência em direção a uma região (~50Kb) de conteúdo significativamente mais alto de G+C imediatamente adjacente a uma região de baixo G+C (~12Kb). Análise da sequência genômica através de GAMOLA e GeneWiz levou à descoberta de uma região de alto GC proeminente localizada imediatamente adjacente a um grande aumento de baixo GC. Análises detalhadas da região de alto G+C revelaram a presença de produtos gênicos com similaridades a uma integrase relacionada a fago, a grande subunidade de terminase de fago, uma proteína portal de fago, uma proteína de capsídeo de fago, e uma peptidase predita que atua como lisina de fago (FIGURA 3). Estes produtos gênicos foram usados como pontos da âncora para estrutura total do pró-fago predito de M. ruminantium, designado (pmru. Com base em análises de estruturas secundárias de DNA, os sítios de integração de fago prováveis attL e attR foram identificados (FIGURA 1A). A integração de fago no sítio att parece ter interrompido uma proteína de membrana putativa codificada pelas ORFs 1980 e 2069, e este gene pode abrigar o sítio de integração original do genoma de fago de (pmru, attB.
A estrutura geral (FIGURA 1B) e sequência de DNA (FIGURA 4A) de (pmru foram determinadas com base na estrutura modular comumente reconhecida de genomas de fago combinados com similaridades a base de dados de sequência e funcionais. Ver, por exemplo, Altermann E, Klein JR, Henrich B. Primary structure of the genome of the Lactobacillus gasseri temperate bacteriophage (phi)adh. Gene. 1999 Aug 20;236 (2):333-46; Desiere F, Lucchini S, Canchaya C, Ventura M, Brüssow H. Antonie Van Leeuwenhoek. Comparative genomics of phages and prophages in lactic acid bactéria. 2002 Aug; 82 (1-4):73-91. O ORFeoma do fago (pmru predito foi com sucesso classificado em módulos que codificam integração de fago, replicação e empacotamento de DNA, proteínas estruturais de fago, e um cassete de lise, e aproximadamente 40% das ORFs de fago foram funcionalmente caracterizadas. Uma estrutura semelhante a terminador em uma grande região não-codificante (244 pb), flanqueada por um grande número de repetições diretas e indiretas e determinada dentro do módulo de replicação de DNA foi caracterizada como uma origem putativa de replicação de DNA. Vários genes dentro da sequência genômica do fago foram preditos na fita antissenso e estes coincidiram com as regiões de baixo GC. Deve ser determinado se estes genes inativam função de fago ou indicam má reunião dentro do genoma de fago.
A região de baixo GC entre lisina e attR do fago predito, foi encontrado abrigando um sistema de modificação por enxofre em DNA, dnd (degradação durante a eletroforese), incluindo uma DNA adenina metiltransferase m6 de restrição tipo II e um regulador transcricional provavelmente sendo específico para o sistema dnd. Além disso, estruturas de RNA não codificante foram identificadas tanto dentro como flanqueando o genoma de fago. Dentro do módulo de replicação de DNA predito, um rbcL foi identificado. rbcL representa um elemento de estabilização de RNA em 5’UTR de Chlamydomonas reinhardtii. Acredita-se que a família esteja envolvida na estabilização do gene rbcL que codifica para a grande subunidade de ribulose1,5-bisfosfato carboxilase. Mutações nesta família podem levar a uma aceleração de 50 vezes na degradação do transcrito.
Flanqueando o genoma de fago, três estruturas de intron do grupo I foram identificadas. íntrons catalíticos grupo I são grandes ribozimas de auto-splicing. Catalisam sua própria excisão de precursores de mRNA, tRNA e rRNA em uma ampla faixa de organismos. A estrutura secundária principal consiste em 9 regiões pareadas (P1-P9). Estas dobram-se essencialmente em dois domínios - o domínio P4-P6 (formado do empilhamento das hélices P5, P4, P6 e P6a) e o domínio P3-P9 (formado das hélices P8, P3, P7 e P9). O aumento da estrutura secundária desta família representa somente este núcleo conservado. íntrons catalíticos do grupo I muitas vezes têm longas ORFs inseridas em regiões de alça. Estas estruturas de RNA não-codificante são localizadas nas regiões não-codificantes entre a montante de ORF 1980 (SEQ ID NO:74), a jusante de ORF 2065 (SEQ ID NO:141) e attR e a montante de ORF 2069 (SEQ ID NO: 142).
EXEMPLO 5A: Genes de fago
A descoberta de uma sequência de pró-fago dentro da sequência de genoma de M. ruminantium foi inesperada. Não houve relatos prévios da cepa M1 de Methanobrevibacter ruminantium (DSM 1093) sendo suscetível a fago lítico ou lisogênico, embora tenha havido relatos de fagos sendo identificados em outras espécies de Methanobrevibacter (Baresi e Bertani, 1984; Knox and Harris, 1986). A sequência do pró-fago <pmru é significativamente mais alta no conteúdo G+C do que o genoma circundante de M. ruminantium sugerindo que seja originado de outro organismo. Os níveis observados de homologia não sugerem um hospedeiro óbvio do qual se originou, e indica que cpmru é diferente de qualquer outro fago encontrado até agora. A sequência de DNA de <pmru é inserida dentro de uma proteína de membrana de M. ruminantium predita e é flanqueada de sequências de DNA com estruturas secundárias compatíveis com sítios attL e attR. Apesar da falta de homologia forte a outras proteínas conhecidas, todas as características de módulo funcionais de um fago podem ser identificadas dentro da sequência de (pmru. Uma característica interessante da sequência é uma região de baixo G+C na extremidade 3’ que mostra homologia a proteínas envolvidas em um sistema de modificação por enxofre de DNA (dnd). Estes genes são localizados a montante do sítio de ligação attR de (pmru e por isso foram provavelmente trazidos no genoma de M. ruminantium durante a integração do fago. A região codifica diversas ORFs associadas a dnd (dnd 1, 2, e 3), e uma subunidade metilase Tipo II junto com um regulador transcricional putativo. O fenótipo dnd sensibiliza seu DNA à degradação durante a eletroforese. Análises das respectivas funções de ORF dnd sugeriram uma incorporação de enxofre ou uma substância contendo enxofre no genoma dos hospedeiros. Também foi descoberto que o fenótipo Dnd existe em DNA de espécies bacterianas comuns de origem variável e habitat diverso. Grupos gênicos similarmente organizados foram encontrados em vários genomas bacterianos que representam gêneros diferentes e em eDNA de organismos marinhos, sugerindo tal modificação como um fenômeno comum. Uma coincidência entre o fenótipo Dnd e modificação de DNA por enxofre foi demonstrada ocorrendo em vários genomas bacterianos representativos pelos experimentos de marcação por (35)S in vivo (Zhou X, He X, Liang J, Li A, Xu T, Kieser T, Helmann JD, Deng Z. A novel DNA modification by sulphur. Mol Microbiol. 2005 Sep; 57(5):1428-38).
Sistemas R\M tipo II são ainda mais simples e ainda mais prevalentes. Em vez de trabalhar como um complexo, a metiltransferase e a endonuclease são codificadas como duas proteínas separadas e atuam independentemente. Não há nenhuma especificidade proteica. Ambas as proteínas reconhecem o mesmo sítio de reconhecimento, e por isso competem por atividade. A metiltransferase atua como um monômero, metilando o dúplex uma fita por vez. A endonuclease atua como um homodímero, que facilita a divagem de ambas as fitas. A divagem ocorre em uma posição definida per62 to ou dentro da sequência de reconhecimento. Neste ponto é pouco claro como a funcionalidade predita atua em conjunto com o sistema dnd. Ainda, é claro que o fago tem utilidade como um veículo de entrega gênica. Em particular, a região de conversão lisogênica pode ser usada como o lócus da substituição gênica.
É provável que o sistema dnd seja transportado a M. ruminantium pelo fago. Como tal, o papel do sistema dnd de <pmru na proteção ou modificação de DNA de M. ruminantium ou estranho é desconhecido. Outra característica interessante da sequência de (pmru é o número de ORFs codificadas na fita antissenso. Estas ORFs correspondem a regiões de baixo GC e têm combinações de BLAST fracas a proteínas de uma variedade de organismos. Isto pode sugerir que estes genes tenham sido acumulados dentro do genoma de (pmru desde sua integração em M. ruminantium. Não é claro se estas ORFs representam um acúmulo contínuo de inserções que podem levar consequentemente a inativação e domesticação do fago ou se (pmru for totalmente ativo.
Um gene de (pmru de particular interesse para a mitigação de metano é ORF2058 localizado no cassete de lise. ORF 2058 é observada como uma peptidase e tem uma combinação de Família Proteica (Pfam) (Escore:-13,7, valor E:0,00054) a proteínas da família Peptidase C39. Estas proteínas são cisteína peptidases e são parte do maior clã de CA peptidases como definido pela base de dados de peptidase MEROPS (Rawlings et al., 2006). A família de peptidase C39 está associada normalmente a transportadores ABC e função como proteases de maturação durante a exportação e o processamento de bacteriocinas. O clã CA peptidase também inclui cisteína endopeptidases virais, tais como endoisopeptidases arqueofágicas C71 que clivam os peptídeos de ligação cruzada da parede celular de arquea. As paredes celulares de arquea metanogênica que pertence à família Methanobacteriales contêm cadeias paralelas de pseudomureína, um polímero de ácido /V-acetil-L-talosaminurínico reticulado por peptídeo. As endoisopeptidases pseudomureína C71 são capazes de clivar o peptídeo de parede celular de ligação cruzada de arquea e lisar as células.
Com base na posição e sintenia com a endoisopeptidase pseudomureína de fago ψΜ2 de Methanothermobacter marburgensis (FIGURA 3), ORF 2058 pode ter um papel como um gene lisina de metanógeno que codifica a enzima lítica envolvida na lise celular antes da liberação da progênie do fago. O alinhamento de ORF 2058 com PeiP de M. marburgensis e PeiW de M. wolfeii (FIGURA 5) mostra baixa homologia total entre as proteínas. Entretanto há conservação dos resíduos histidina e ácido aspártico envolvidos na tríade catalítica de endoisopeptidases e um resíduo de cisteína em ORF 2058 é posicionado próximo à cisteína conservada de PeiP e PeiW que compõe o terceiro sítio conservado da tríade catalítica (Makarova et al., 1999, Luo et al., 2002). Além disso, o motivo Gly-His-Tyr que circunda o resíduo His catalítico em PeiP e PeiW também é encontrado em ORF 2058. Esta observação indica que ORF 2058 é um gene lisina de (pmru que funciona para lisar células de M. ruminantium durante o ciclo lítico do fago. As diferenças observadas entre ORF 2058 e PeiP e PeiW podem refletir a ligação cruzada do peptídeo de parede celular de arquea diferente e por isso especificidade pelo substrato peptidase.
EXEMPLO 5B: Indução de fago
A cepa M1Tde Methanobrevibacter ruminantium (DSM1093) foi cultivada em meio BY+ (meio basal, Joblin et al., 1990) que consiste em [g/l] NaCI (1), KH2PO4 (0,5), (NH4)2SO4 (0,25), CaCI2.2H2O (0,13), MgSO4.7H2O (0,2), K2HPO4 (1), fluido de rúmen clarificado (300 ml), dH2O (360 ml), NaHCO3 (5), resazurina (0,2 ml), L-cisteína-HCI (0,5), extrato de levedura (2), e solução de elementos traço de Balch (10 ml) (elementos traço adicionados; Balch et al., 1979) que consiste em (g/l) ácido nitrilotriacético (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4.H2O (0,5), NaCI (1), FeSO4.7H2O (0,1), CoCI2.6H2O (0,1), CaCI2 (0,1), ZnSO4.7H2O (0,1), CuSO4.5H2O (0,01), AIK(SO4)2.12H2O (0,01), H3BO3 (0,01), Na2MoO4.2H2O (0,01), NiSO4.6H20 (0,03), Na2SeO3 (0,02), e Na2Wo4.2H2O (0,02).
Em densidades óticas (DO), medidas em um comprimento de ònda de 600 (ϋΟθοο), entre 0,10 e 0,14, M. ruminantium foi desafiado com 1 ml e 2 ml de ar estéril (oxigênio -160 a 320 μΙ), respectivamente (figura 1C) e MitomicinaC 2 pG/ml (figura 1a). Curvas de lise típicas podem ser observadas para ambos os desafios, com tempos latentes de ~90 minutos do desafio com ar. Resultados iniciais do desafio com MitomicinaC indicam um período latente muito curto. Para verificar a excisão do fago do genoma hospedeiro, 2 oligonucleotídeos foram desenhados, ficando diante de ambos os sítios de ligação ao fago, respectivamente (R1F: caaagagagattaaagaagcagacg; SEQ ID NO:146 e L2R agtagtgttggaatcagtgaaaagg; SEQ ID NO:147). Este par de iniciadores somente produz um amplicon se o genoma de fago recircularizar sob excisão.
A figura 1E representa os experimentos de excisão iniciais quando M. ruminantium foi desafiado com ar. Sob indução, um amplicon claro e inequívoco de tamanho esperado foi encontrado, indicando excisão bem sucedida e recircularização. Uma banda similar, embora mais fraca, também foi achada em células não induzidas de M. ruminantium, indicando que (prnru tem a capacidade de cortar espontaneamente durante o crescimento normal, não desafiado.
EXEMPLO 5C: Bioensaios de Enzima Lítica
O polipeptídeo codificado pelo ORF 2058 é útil como uma enzima lítica específica para metanógeno de rúmen e foi subclonada em um vetor de expressão de E. coli para produção da proteína recombinante. ORF 2058 foi amplificado por PCR usando iniciadores Mbbruml 1for22 (1122For, cac cat ggt tag att cag cag aga c; SEQ ID NO:148) e Mbbruml 1rev22 (1122Rev, tca tgc agg aca gac aac ata gta g; SEQ ID NO: 149) em volume de reação de 150 pL contendo: 121,5 ng de DNA genômico da cepa M1 de M. ruminantium-, iniciadores 1122For e 1122Rev 0,2 μΜ; 15 pL de tampão Accuprime Pfx (com dNTPs, InVitrogen); 2,4 pL de Accuprime Pfx (InVitrogen). Condições de PCR foram desnaturação inicial a 95°C por 2 min seguida por 35 ciclos a 95°C por 15 segundos, 55°C por 30 segundos e 68°C por 40 segundos. Nenhuma extensão final foi usada. O produto de PCR foi purificado e quantificado usando um Nanodrop (Thermo Scientific, GA, USA).
Clonagem da ORF 2058: A ORF 2058 amplificada por PCR foi cionada em vetores Topo pET 100 ou pET 151D (InVitrogen) de acordo cóm recomendações do fabricante, e transformada em células quimicamente competentes TOP 10 (InVitrogen). Transformantes foram analisados pela colônia de PCR, e DNA plasmidial purificado e sequenciado. Clones com sequências de DNA combinando com aquela da ORF 2058 foram selecionados.
Expressão da ORF 2058: DNA de plasmídeo de clones contendo inserções verificadas da ORF 2058 foi transformado através de eletroporação em células BL21* ou Rosetta 2 eletrocompetentes. Foi encontrado que as melhores condições de crescimento da expressão da proteína ORF 2058 solúvel estavam em meios LB, com indução sendo realizada entre Absorvância de 0,48 a 0,6 a 600 nm usando IPTG 0,5 mM e continuação de crescimento por aproximadamente seis horas a 30°C. Células então foram coletadas por centrifugação e congeladas a -20°C.
Lise celular: O precipitado celular foi descongelado e ressuspenso no seguinte tampão (pH 7,5): NaCI 300 mM, DTT 2 mM, imidazol 10 mM, Tris 20 mM, glicerol 20%, Triton-X 1%, CaCI2 5 mM e MgCI2 10 mM. Lisozima foi adicionada a concentração final de 1 mg/ml, seguida pela incubação em gelo com agitação suave por 30 minutos. DNase I e RNase I foram adicionadas a concentração final de 5 pg/ml seguida pela incubação em gelo com agitação suave por 30 minutos. O lisado celular foi centrifugado em 12.000 rpm por 15 minutos e o lisado bruto foi filtrado através de um filtro de 0,8 pm.
Cromatografia por afinidade ao níquel: o sobrenadante filtrado do procedimento da lise celular foi aplicado em uma coluna por afinidade ao níquel de 80 mL e eluído usando um gradiente de imidazol 20 mM a 250 mM no seguinte tampão (pH 7,5): NaCI a 300 mM, DTT a 2 mM, Tris a 20 mM, e glicerol a 20%. As frações eluídas da coluna contendo a proteína ORF 2058 expressa foram concentradas usando uma célula de ultrafiltração Millipore com uma membrana de ponto de corte de peso molecular de 10.000 kDa. O construto de ORF 2058 em pET100 expresso em células de E. coli BL21* foi eluído da coluna de níquel pelo seguinte tampão de eluição, pH 8,2 (Tris 20 mM, imidazol 250 mM, NaCI 300 mM, b-mercaptoetanol 10 mM, glicerol
10%), e a enzima foi armazenada em um tampão no qual glicerol e ditiotreitol adicionais foram adicionados para alcançar uma concentração final de glicerol 40%, ditiotreitol a 1 mM, pH 8,2). Dessalinização: Dessalinização da proteína concentrada expressa a partir do construto pET 151 em células Rosetta 2 foi realizada usando uma coluna BioGel P6 DG de 250 mL (BioRad, CA, USA) com o seguinte tampão (pH 7,0): MOPS 20 mM, DTT a 1 mM, NaCI a 300 mM e glicerol 20%. Frações da coluna foram concentradas como descrito acima e a amostra final foi filtrada e congelada instantaneamente em nitrogênio líquido antes de ser armazenada a -20°C. Lise de células M. ruminantium em repouso: Culturas de cinco ml de M. ruminantium M1 (DSM 1093) foram cultivadas em meio BY+ em tubos Hungate em fase log tardia e as células foram coletadas pela centrifugação dos tubos Hungate em 5.000 x g à temperatura ambiente por 30 minutos. Os tubos foram movidos em uma câmara anaeróbica (atmosfera CO2 95%-H2 5%, Coy Laboratory Products, Ml, USA) onde o sobrenadante foi descartado e 10 ml de células de cultura foram ressuspensas em 1 ml de tampão MOPS pH 6,8 (MOPS a 50 mM, CaCI2 a 5 mM, ditiotreitol a 1 mM). A suspensão celular foi ajustada a uma DO (600 nm) de ~0,12 pela diluição com o tampão MOPS adicional.
A suspensão celular padronizada (50 μΙ) foi dispensada em uma placa de microtítulo e concentrações variadas de enzima lítica da ORF 2058 (preparada a partir do construto pET 100) foram adicionadas e o volume total da reação foi feito até 250 ml com tampão. As misturas celulares e proteicas foram incubadas a 37°C e leituras de DO foram registradas. Os efeitos das adições de enzima (pg de enzima adicionada por ensaio) em células M. ruminantium em repouso são mostrados na FIGURA 7. As adições de enzima reduziram as leituras de OD 600 nm das células suspensas em uma maneira dose-dependente em comparação com células controle sem enzima adicionada. Isto indica que a enzima lítica da ORF 2058 é capaz de atacar e lisar células de M. ruminantium em repouso sob condições anaeróbicas.
Lise de células M. ruminantium em crescimento: M. ruminantium foi cultivado em meio RM02. Meio RM02 foi composto dos seguintes ingredientes (g/L): KH2PO4 (1,4), (NH4)2SO4 (0,6), KCI (1,5), solução SL10 de ele67 mento traço (1 ml), solução de selenita/tungstato, (1 ml), 0,1% (p/v) solução de resazurina (4 gotas). Os componentes foram misturados e fervidos sob CO2100% livre de O2 e resfriados em um banho de gelo enquanto borbulhádos com CO2100%. Após resfriamento, NaHCO3 (4,2 g) e L-cisteína HCI H2O (0,5 g) foram adicionados e 9,5 ml do meio foi dispensado em tubos Hungate enquanto gaseificação dos tubos com CO2100%. Os tubos foram autoclavados e armazenados no escuro por 24 h antes da utilização. Antes da inoculação, NoSubRFV (0,5 ml por tubo, contendo substratos, extrato de levedura, vitaminas) foi adicionado. Após inoculação, os tubos foram gaseificados com
CO2 80%/H2 20% a 172368,9 Pa. M. ruminantium foi cultivado em meio-log (OD 600 nm —0,1) em que enzima lítica de ORF 2058 pontual (preparada a partir do clone Topo pET 151 D) foi adicionada a culturas em concentrações variadas. A incubação de culturas continuou e leituras de DO foram registradas. O efeito das adições de enzima no crescimento de M. ruminantium e na
-15 formação de metano (% da produção de metano em relação ao controle sem adição após crescimento de 217 horas são indicados entre parênteses) é mostrado na figura 8. Os resultados mostram que enzima lítica de ORF 2058 afetou dramaticamente o crescimento de M. ruminantium em uma maneira dose-dependente, reduzindo a OD 600 nm de culturas em crescimento em 2 horas de adição. Os dois níveis mais altos da adição de enzima também reduziram a formação de metano até um ponto similar àquela da adição de clorofórmio (100 μΙ/10 ml de adição à cultura).
EXEMPLO 6: Sumário
Uma descoberta inesperada a partir do seqüenciamento do ge25 noma de M ruminantium foi a presença de uma sequência de pró-fago. A análise da sequência de genoma identificou uma região do conteúdo GC excepcionalmente alto que continha diversos genes relacionados ao fago. A estrutura total do pró-fago predito foi identificada por análises adicionais de bioinformática e designada como cpmru. Aproximadamente 40% dos genes de fago foram destinados a grupos funcionais discretos incluindo integração de fago, replicação e empacotamento de DNA, proteínas estruturais de fago e lise. Foi encontrado que sequências de DNA que flanqueiam o genoma de fago representavam sítios potenciais de integração de fago (attL e attR).
O fago parece ter se inserido em uma proteína de membrana putativa de M. ruminantium que provavelmente abriga o sítio de integração metanógeno original do genoma de fago (pmru, attB. Além disso, acredita-se que uma estrutura semelhante a terminador encontrada dentro do módulo de replicação de DNA representa uma origem de replicação de DNA de fago. Uma região de baixo GC na extremidade 3’ do genoma de fago abriga o que parece ser um sistema de modificação de DNA pelo enxofre, incluindo um gene que provavelmente controla a expressão do sistema dnd. Estes genes foram provavelmente transportados no genoma de M. ruminantium durante a integração do fago e seu papel com relação à modificação do fago, do hospedeiro ou do DNA estranho resta ser elucidado. A retenção do sistema dnd pelo M ruminantium sugere que tenha transmitido um benefício ao hospedeiro. Entretanto, o papel do sistema dnd de (pmru na modificação do DNA de M ruminantium ou estranho ainda está sob investigação.
Outra característica interessante da sequência de (pmru é o número de genes codificados na fita antissenso que corresponde a regiões de baixo GC e têm combinações fracas a proteínas de uma variedade de organismos. Isto sugere que estes genes tenham se acumulado no genoma de <pmru desde sua integração em M. ruminantium e pode ser que estes genes representem um acúmulo contínuo de inserções que poderia eventualmente levar a inativação do fago e domesticação do fago. O alto conteúdo GC da sequência de fago de (pmru em comparação com genoma de M. ruminantium sugere que se originou de outro organismo. Entretanto, o hospedeiro prévio não é óbvio já que as proteínas de (pmru parecem um tanto únicas em comparação com outros fagos encontrados até agora.
Os genes de (pmru de notável interesse no que diz respeito à mitigação de metano são aqueles localizados no cassete de lise. Um gene em particular codifica uma proteína com similaridade à família de peptidasès C39. Esta família de peptidase inclui, entre outras, cisteína endopeptidases virais, tais como as endoisopeptidases arqueofágicas C71 que clivam os peptídeos de ligação cruzada de pseudomureína que compõe as paredes celulares de Methanobrevibacter. Com base na posição gênica dentro dò genoma do fago e sintenia com pseudomureína endoisopeptidases de outros genomas de fago metanógeno de não rúmen, este gene pode ter um papel como um gene lisina que codifica a enzima lítica envolvida na lise celular antes da liberação da progênie de fago. Este gene e sua enzima codificada têm interesse óbvio como possível mecanismo de controle de M. ruminantium e outros metanógenos de rúmen com paredes celulares similares.
O fago ruminante e suas enzimas que estão envolvidas na lise de células hospedeiras representam oportunidades significantes para controlar tanto populações metanógenas como outros membros de comunidade (bactérias, protozoários e fungos) no rúmen. Além disso, é possível identificar alvos enzimáticos chave no hospedeiro que são suscetíveis à inibição por proteínas de fago através da compreensão dos ciclos de vida dos fagos. Os inventores inspecionaram a composição do fago de rúmen em vacas, ovelhas e cervos e os mostraram para expor a variação temporal em números e tipo. Metanógenos isolados da Nova Zelândia que são afetados pelo fago também foram identificados. Culturas puras de metanógenos foram usadas para avaliar enzimas líticas de fago, e as técnicas baseadas em cultura e baseadas em PCR foram desenvolvidas para rastrear o novo fago. Foi mostrado que o fago purificado a partir de amostras de rúmen é acessível à análise de sequência de DNA randômica que permite que enzimas de fago sejam descobertas. Há várias vantagens no uso de fago ou suas enzimas em técnicas de mitigação para reduzir emissões de metano. Fagos são membros naturais da comunidade microbiana do rúmen e, dessa forma, não seriam examinados como tratamento antibiótico (e pode superar mais facilmente quaisquer restrições reguladoras). Fagos são normalmente específicos para uma faixa estreita de hospedeiros que potencialmente permitem o direcionamento selecionado de metanógenos. A terapia de fago é reconhecida agora como um tratamento para organismos resistentes a antibióticos e geralmente considerada como segura. Uma vez produzido, os fagos são normalmente relativamente estáveis. A introdução de cepas metanógenás que são suscetíveis ao fago no rúmen pode ter efeitos benéficos a longo prazo, particularmente se a inoculação ocorre em uma primeira idade (por exemplo, em cordeiros e bezerros jovens). Certos metanógenos são conhecidos por conter genomas de fago, sendo suscetíveis a fago lítico, ou sofrer autólise (sugestivo de enzimas líticas) incluindo Methanobrevibacter smithii (cepa PS), Methanobacterium bryantii e cepa MF-1 de Methanobrevibacter. Um exemplo notável de fago que é usado para inibir organismos agricolamente problemáticos é o uso do fago para visar Escherichia coli. 0157:H7.
Methanobrevibacter ruminantium foi escolhido para o sequenciamento de genoma por causa da sua prevalência no rúmen sob uma variedade de condições dietéticas (com base em dados de cultivo e de detecção molecular), a disponibilidade de culturas, sua facilidade ao crescimento de rotina no laboratório e quantidade relativamente grande de estudos prévios e literatura antecedente disponível para este organismo. A presente invenção fornece dados importantes quanto ao genoma de M. ruminantium, e constrói um quadro detalhado do fago dentro do rúmen. A sequência do pró-fago φmru fornece reagentes específicos para inibição de M. ruminantium e para futuras manipulações genéticas para auxiliar na determinação da função gênica. O fago pode ser usado para bloquear funções/componentes conservados entre metanógenos para prevenir ou reduzir a formação de metano no rúmen.
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Todas as publicações e as patentes mencionadas no relatório descritivo acima mencionado são neste pedido incorporadas por referência.
Onde referência à descrição precedente foi feita a números inteiros tendo equivalentes conhecidos dos mesmos, aqueles equivalentes são neste pedido incorporados como se individualmente apresentados. Embora a invenção tenha sido descrita com relação a modalidades preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. É apreciado que. modificações adicionais podem ser feitas à invenção como descrito neste .15 pedido sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de inibição de uma célula metanógena, caracterizado pelo fato de que compreende: o contato da célula com o polipeptídeo
    a) que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 63;
    5 ou
    b) que compreende os resíduos 74-228 da SEQ ID NO: 63.
  2. 2. Método de inibição de uma célula metanógena, caracterizado pelo fato de que compreende: o contato da célula com a molécula conjugada ou molécula de fusão compreendendo um polipeptídeo
    10 a) que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 63;
    ou
    b) que compreende os resíduos 74-228 da SEQ ID NO: 63 conjugado ou fusionado com um composto anti-metanogênese, uma sequência sinal, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, um ácido 15 nucleico peptídico, um peptídeo antimicrobiano, ou um antibiótico.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula é um metanógeno.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula é a Methanobrevibacter ruminantium.
    20
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a célula é a Methanobrevibacter ruminantium da cepa M1T (DSM1093).
  6. 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo
    25 a) que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 63;
    ou
    b) que compreende os resíduos 74-228 da SEQ ID NO: 63, e um adjuvante adequado.
    Petição 870170073527, de 29/09/2017, pág. 7/12
    1/32 ο
    □) ο ο ro φ φ ο» 2 φ ω 'ω ω ω ω <0 (0 (0
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