CN107961372B - 呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒‑多价肺炎球菌联合疫苗及其制备方法，所述疫苗以肺炎链球菌多糖‑蛋白载体‑RSV特异性蛋白为抗原，其中：该多糖为7价肺炎链球菌多糖，蛋白载体为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白和霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)的融合蛋白；RSV特异性蛋白经化学反应连接到肺炎链球菌多糖‑蛋白载体结合物C端。本发明的优点在于可同时诱导机体产生抗RSV及肺炎链球菌的双重免疫反应。

Description

呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

一、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，投入临床的疫苗很少，为其防控提出了挑战。至今仅有美国MedImmune公司研制生产的流感三价减毒活疫苗

通过FDA审批。RSV是婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV属副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒，含A、B两个血清型。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，包括由三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusionprotein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护性抗原。

对于RSV而言，20世纪60年代，Fulginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡和80％住院，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在嗣后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。

近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。活载体疫苗的种类主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vaccinia virus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。

二、肺炎球菌及其流行病学

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)简称肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌多糖疫苗和多糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌多糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。但肺炎球菌多糖为胸腺非依赖性抗原(Thymus independent antigen，TI-Ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无T淋巴细胞辅助的情况下直接与B淋巴细胞表面的IgM受体交联，所诱导的抗体主要为IgM和IgG2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。多糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对多糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证多糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对多糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需要加入多种化学试剂参与反应，并且多糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。

使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗已成为近十年来肺炎疫苗的研发主流，具有种属特异性抗原为基础的疫苗广受研发人员的重视，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的结构及理化性质的限制，很多肺炎球菌蛋白无法直接用于人体免疫，需要花费大量的人力和物力进行研究及临床验证。

肺炎球菌由于其血清型多，导致其抗原本身的抗原结构大稳定性差，难以与其他疫苗联合共存使用，但肺炎等下呼吸道感染类疾病的诱发病因较多，很难通过单一疫苗来实现全方位的免疫预防。因此研究一款免疫原性够好、能够稳定存在的联合疫苗成为了疫苗研发领域的当务之急。

发明内容

本申请人的目的是基于在先申请CN2017102214206、CN2017102598140及CN2017105857749的基础上，对重组蛋白载体的另一应用拓展，以解决现有产品中无呼吸道合胞病毒-肺炎球菌联合疫苗的技术空白。

本发明的主要目的在于提供一种呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，所述疫苗以肺炎球菌多糖-重组蛋白载体-RSV特异性蛋白为抗原复合物，其中：该多糖为7价肺炎球菌多糖，重组载体蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白和霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)重组融合蛋白；将肺炎链球菌多糖-蛋白载体表面功能基团羟基改性为醛基，然后连接RSV特异性蛋白。

优选地，RSV特异性蛋白为可引起RSV特异性免疫反应的蛋白，RSV特异性蛋白选自：G蛋白、F蛋白和SH蛋白、M蛋白、M2蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、F优势表位、G优势表位或其组合。

更优选地，RSV特异性蛋白为F蛋白，表达F蛋白的序列如序列表SEQ ID NO：1所示；根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，引物结合后的待扩增序列如序列表SEQ ID NO：4所示，待扩增序列插入表达载体中，构建表达载体。

作为一种优选地实施方式，重组的呼吸道合胞病毒蛋白表达载体为pcDNA3.1-F。

优选地，编码的重组蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：10所示，编码该氨基酸序列的基因序列如序列表SEQ ID NO：9所示，如序列表SEQ ID NO：10所示的载体蛋白结构为LTB蛋白的C端连CTB蛋白的N端，LTB基因与CTB基因之间通过引物连接，LTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：12所示，CTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：13所示，LTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：11所示，CTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：14所示。

所述肺炎球菌多糖抗原是分离提纯血清型肺炎球菌的荚膜多糖，所述肺炎球菌的血清型包括4、6B、9V、14、18、19F和23F。其他血清型的肺炎球菌多糖及组合也可作为本发明中的肺炎球菌抗原，在此不做限制。

优选地，肺炎球菌多糖与RSV特异性蛋白之间的质量比为(0.5～2):1。

本发明的另一目的在于提供一种呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗的制备方法包括如下步骤：

a.分别分离提纯多种血清型肺炎球菌的荚膜多糖；

b.制备并分离提纯PCV疫苗所用的重组载体蛋白；

c.制备RSV特异性蛋白；

d.制备多糖与重组载体蛋白结合；

e.将结合后的多糖-载体蛋白进行改性，并与RSV特异性蛋白结合；

f.分离纯化步骤e中联合的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗。

优选地，步骤e具体为：将肺炎链球菌多糖-蛋白载体表面功能基团羟基改性为醛基，然后连接RSV特异性蛋白。

将肺炎链球菌多糖-蛋白载体表面改性为醛基，在0.1MPBS缓冲液下，4℃、pH 4.0-9.0下，将改性后的肺炎链球菌多糖-蛋白载体与RSV F蛋白共反应12-24h，改性后载体蛋白的C端连接RSV特异性蛋白的N端。

改性时介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0.1M TBS溶液，反应缓冲液的最佳pH为6，最佳反应时间为24h。

作为更进一步优选方案，步骤f中的分离纯化是将结合物和未结合的多糖和蛋白分离纯化，纯化方法可用层析法或超滤法，可根据获得的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的分子大小进行分离纯化，层析法优选采用Superdex200凝胶过滤柱、SepharoseCL-4B或Sepharose CL-6B进行；而超滤法采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未结合物。

优选地，RSV特异性蛋白的制备方法包括如下步骤：

a.培养RSV病毒，采用病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒分别提取RSV病毒RNA，将提取出的菌体RNA进行逆转录(RT)，以逆转录的cDNA产物为模板进行F蛋白基因序列扩增；

b.根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，特异性引物序列如序列表SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示，引物连接成功的表达载体为pcDNA3.1-F。

所述RSV病毒细胞可以是MDCK、Vero、293T、COS细胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培养细胞系。

优选地，步骤b具体为：

根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，上游特异性引物序列如序列表SEQID NO：2所示，限制性内切酶位点为Hind III，下游特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：3所示，限制性内切酶位点为Xho I引物连接待扩增序列及表达载体pcDNA3.1-F。

本发明的疫苗，可用公知技术加工成供临床用的各种制剂，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。

该呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗为了增强免疫原性，可加入佐剂，常用佐剂均可。该疫苗的各制剂的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中，优选在糖(蔗糖或乳糖)存在下进行冻干。

本发明的疫苗接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门、阴道黏膜途径。给药量是本领域技术人员根据常识可以确定的。

总之，本发明提供的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗主要的优点在于：

1、本发明采用重组载体蛋白连接肺炎球菌的多种多糖，该载体蛋白还具有激活黏膜免疫的佐剂效果，与肺炎球菌抗原联合后，不仅可以引起高滴度的血清抗体，还可以延长黏膜血清抗体保持时间；

2、肺炎球菌抗体可选肺炎球菌蛋白及肺炎球菌多糖，当疫苗的价态较高时，可采用重组的蛋白载体与肺炎球菌同源蛋白组合使用，不仅能够增强现有肺炎球菌血清型引发的免疫反应，而且可以引起肺部的黏膜免疫；

3、使用重组载体蛋白的肺炎球菌疫苗具有一定的结构弹性，具有多种多糖蛋白的联合组合，载体蛋白促进机体产生特异性抗原，但本身不致病，也不会产生交叉性的免疫影响，易于与其他疫苗联合使用，副作用小，安全性好；

4、肺炎球菌疫苗与RSV疫苗联合用药，可以在很大程度上同时引起免疫反应，使接种者的下呼吸道感染发病率大大降低。

附图说明

图1是本发明实施例提供的F蛋白PCR扩增产物电泳图。

图2是本发明实施例提供的阳性质粒构建插入位点图。

图3是本发明提供的构建pET28a-LTB-CTB质粒的质粒示意图。

图4是本发明提供的重组LTB-CTB载体蛋白诱导纯化结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。

一、呼吸道合胞病毒(RSV)的质粒构建、表达和纯化

本实施例选择RSV F蛋白的CDS区基因(GeneID：1489825)进行扩增，F蛋白的CDS区基因如序列表SEQ ID NO：1所示，根据F基因的特异性设计上下游引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO：2所示，下游引物如序列表SEQ ID NO：3所示，结合引物后的待扩增片段如序列表SEQ ID NO：4所示。

1.呼吸道合胞病毒的培养

1.1采用Vero细胞对RSV进行培养

取复苏并进行继代培养的Vero细胞，清洗后接入稀释的病毒，37℃吸附1h，每间隔15min摇动接毒细胞一次，使病毒充分感染细胞；倒掉接毒细胞瓶的病毒稀释液和未接毒细胞瓶的培养液，分别添加6～8mL含2％血清的DMEM维持液，37℃CO₂孵箱中培养，第二天起每天根据对照观察一次细胞病变情况。当细胞出现75％病变时收毒(约需要7d)，即将培养液于-80℃/37℃反复冻融3次后，10000r/min离心10min，无菌操作取上清，分装，于-80℃冰箱长期保存。

1.2RSV病毒RNA总提

采用DEPC(焦炭酸二乙酯)对提取RNA需要的离心管、枪头及PCR管进行去RNA酶处理，并采用RNA/DNA试剂盒提取RSV RNA。本实施例中采用的提取试剂盒为TaKaRa小量病毒RNA/DNA提取试剂盒，按说明书操作即可。提取出的RNA需立即使用或置于-80℃冰箱保存备用。

1.3RT-PCR

逆转录体系采用25μl体系，加入RNA 12μL，通用引物Olingo(d)T18 1μL轻轻混匀，70℃孵育5min，冰浴2min。向离心管中加入AMV 1μL，AMV Buffer 5μL，dNTP 5μL，RNaseInhibitor 1μL轻轻混匀，42℃孵育60min。70℃10min灭活转录酶。得到的产物cDNA需立即使用或于-20℃长期保存备用。

根据RSV F蛋白CDS片段设计特异性引物，引物序列由5’端至3’端依次为保护碱基-酶切位点-连接引物，上游酶切位点为Hind III酶切位点，下游酶切位点为Xho I酶切位点，引物序列具体如下：

F:：5'-ccc-AAGCTT-CAGAAAACCGTGACCTATCAAG-3'

R：5'-cc-CTCGAG-ACATGAAGTTTTGCCTCACTAGTA-3'

PCR体系采用25μL体系，加入10×rTaq buffer 2.5μL，dNTP 2μL，rTaq 0.25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水17.25μL，RT-PCR产物cDNA 1μL；扩增F全长片段的反应条件：94℃5min，94℃50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸10min，4℃结束；扩增G全长片段的反应条件：94℃5min，94℃45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃延伸7min，4℃结束。

1.4产物检验及纯化

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测，检测后确认F基因片段大小约为2150bp的PCR扩增片段。扩增产物电泳图如图1所示，图中条带1位F基因，条带M1为标准DNA marker，条带清晰，符合预期理论值。

采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。-20℃保存。

引物连接后的待扩增片段具体如下：

CTTAGTTATTCAAAAACTACATCTTAGCAGAAAACCGTGACCTATCAAGCAAGAACGAAATTAAACCTGGGGCAAATAACCATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAGACAAAAAACCACCTGATCATGTTTCAACAACAGTCTGCTGATCACCAATCCCAAATCAACCCATAACAAACACTTCAACATCACAGTACAGGCTGAATCATTTCTTCACATCATGCTACCCACACAACTAAGCTAGATCCTTAACTCATAGTTACATAAAAACCTCAAGTATCACAATCAAACACTAAATCAACACATCATTCACAAAATTAACAGCTGGGGCAAATATGTCGCGAAGAAATCCTTGTAAATTTGAGATTAGAGGTCATTGCTTGAATGGTAGAAGATGTCACTACAGTCATAATTACTTTGAATGGCCTCCTCATGCCTTACTAGTGAGGCAAAACTTCATGTTAAACAAGATACTCAAGTCAATGGACAAAAGCATAGACACTTTGTCTGAAATAAGTGGAGCTGCTGAACTGGACAGAACAGAAGAATATGCTCTTGGTATAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTACATAGGATCTATAAACAACATAACA

片段中下划线位置为F蛋白的启动子和终止子。

根据上述引物，采用表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-F，将F蛋白基因片段克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3.1-F。构建成功的部分连接片段如图2所示。

扩增F蛋白基因序列，限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.1，双酶切产物后连接，完成质粒构建。

PCR质粒PCR产物F片段长约2150bp，与预期PCR产物一致。阳性质粒序列测定结果与原F基因序列完全一致。双酶切载体和目的片段位置也与预期一致。证明阳性质粒构建成功。

二、重组LTB和CTB蛋白的表达与纯化

根据GeneBank登录的LTB和CTB核酸序列和氨基酸序列，具体序列如下：

核酸，LTB核酸序列(375bp)如序列表SEQ ID NO：5所示，由此核酸序列编码的氨基酸序列(124a.a，MW＝14133.74)如序列表SEQ ID NO：6所示。

CTB核酸序列(375bp)如序列表SEQ ID NO：7所示，由此核酸序列编码的CTB氨基酸序列(124a.a.MW＝13896.46)如序列表SEQ ID NO：8所示。

选择pET28a作为载体，根据GeneBank登录的LTB和CTB的全长CDS序列，设计引物如下：

LTB-Fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--BamHⅠ酶切位点--LTB蛋白N端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：11所示)具体如下：

5’-CG--GGATCC--atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgtta-3’

LTB-Rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--Eco311酶切位点--CTB蛋白N端序列--LTB蛋白C端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：12所示)具体如下：

5’-CTAG--GGTCTC--cat--gtttttcatactgattgccgcaa-3

CTB-Fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--Eco311酶切位点--LTB蛋白C端序列--CTB蛋白N端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：13所示)具体如下：

5’-CTAG--GGTCTC--AAC--atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagtttta-3’

CTB-Rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--XhoⅠ酶切位点--CTB蛋白C端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：14所示)具体如下：

5’-CC--CTCGAG--ttaatttgccatactaattgcggcaa-3’

如图3所示，构建pET28a-LTB-CTB质粒。由于LTB和CTB的具有较高的同源性，因此在LTB片段插入CTB的片段，可扩增得到重组LTB-CTB载体蛋白全长片段。构建的pET28a质粒的全序列如序列表SEQ ID NO：9所示，编码的氨基酸序如序列表SEQ ID NO：10所示。

载体和PCR产物通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，凝胶回收LTB和CTB融合片段。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，连接转化大肠杆菌DH5α，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和XhoⅠ双酶切鉴定的约800bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，阳性筛选后测序，将测序结果在NCBI网站进行比对，结果完全正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21。

重组LTB-CTB载体蛋白在20℃诱导30h，IPTG浓度为0.3mmol/L，诱导条件最佳。诱导后取适量超声波裂解产物的上清和沉淀进行SDS-PAGE，同时设诱导前的蛋白做为对照。破菌后，发现表达蛋白质以包涵体形式存在。将包涵体洗涤后，用8mol/L的尿素溶解，经复性液复性，再经谷胱甘肽转硫酶(GST)亲和层析柱纯化，得到纯度约为93％的重组融合蛋白。SDS-PAGE结果显示重组菌裂解沉淀中出现一条约30kD的额外条带，与预期结果相近。由于蛋白主要以包涵体的形式表达，因此选择较低温度的长时间诱导，以保证蛋白表达量。诱导表达的纯化结果如图4所示，条带1为蛋白Marker；2为诱导前总的蛋白；3为诱导后总的蛋白；4为细菌破碎液离心后上清；5为细菌破碎液离心后沉淀；条带6为冻干后的重组LTB-CTB载体蛋白。

三、制备肺炎球菌蛋白-多糖结合体

3.1.1肺炎球菌多糖(7价)的制备

选取7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F、23F)的肺炎球菌发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25～80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采GE Sephadex G25Coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收多糖，置于-20℃保存备用。

3.1.2重组LTB-CTB载体蛋白肺炎球菌多糖结合物

将纯化备用的重组LTB-CTB载体蛋白以氨基还原法与肺炎球菌多糖进行结合，具体为将上述步骤获得的重组LTB-CTB载体蛋白与多种多糖以1：0.5～2质量比混合。取各血清型多糖溶于pH7.2的150mmol/LPBS中，加入过碘酸钠(终浓度为2mmol/L)室温氧化10min，以制备10mL疫苗原液为例，加入多糖4、9V、14、19F及23F各40μg，寡糖18C 20μg及多糖6B 80μg，加入乙二醇(终浓度为25mmol/L)终止反应。用150mmol/L PBS透析3次后加入预先复溶的重组LTB-CTB载体蛋白160μg，室温轻轻搅拌5d，出现颗粒状结合物，在4℃离心10min收集。经凝胶层析柱层析纯化，得到纯化的肺炎球菌与重组LTB-CTB的结合物。

重组LTB-CTB载体蛋白肺炎球菌多糖结合物可选择冻干剂型，便于储存与运输。冻干剂型蔗糖作为冻干骨架，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到肺炎球菌多糖-蛋白疫苗冻干制剂。

3.1.3重组LTB-CTB载体蛋白肺炎球菌多糖结合物检验

将结合产物通过凝胶过滤层析柱进行纯化，洗脱液为0.2M NaCl，检测紫外280nm处的吸光值，收集个洗脱峰内的物质。采用SDS-PAGE法确认结合产物中含有重组LTB-CTB组分，并检测蛋白含量。采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，确认产物中多糖含量约为95μg/ml。

通过GM1-ELISA检测结合产物是否与小肠表面的GM1结合，刺激黏膜系统产生黏膜IgA。具体测定方法如下：

1)包被：用碳酸盐包被缓冲液将GM1稀释至10μg/ml。在96孔板的每个反应孔中加100μl上述包被抗原，4℃放置过夜。次日，移去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗3次；

2)封闭：加4％的BSA溶液200μL于上述已包被的反应孔中，37℃放置2小时。弃去封闭液，洗涤3次；

3)加样：分别加入一系列稀释梯度的CTB溶液和结合物样品溶液，每孔100μL，置于37℃孵育1.5小时，然后洗涤3次；

4)加一抗：每孔加入1：4000稀释的兔抗CTB IgG抗体100μL，37℃孵育2小时；

5)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标驴抗兔IgG抗体100μl，37℃孵育1小时，洗涤3次；

6)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液100μL，室温放置10～15分钟；

7)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μL；

8)读数：在酶标仪上，于紫外450nm处检测各孔的吸光值，打印记录。

检测结果显示，CTB纯蛋白的OD值为0.30左右，且与GM1的结合能力稳定。重组LTB-CTB蛋白的OD值在0.25～0.48之间波动，说明结合产物中的重组LTB-CTB仍然维持与GM1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。各峰值处于预计结果完全相同。收集各峰产物，并进行GM1-ELISA检测，确认结合产物中的重组LTB-CTB仍然维持与GM1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。

四、重组LTB-CTB载体蛋白肺炎球菌多糖结合物改性

取重组载体蛋白肺炎球菌多糖结合物30mL，搅拌条件下缓慢加入2mL25％戊二酸，200r/min搅拌反应6h，反应完毕后，用0.01MPBS洗涤三次后，定容至30mL，使得载体蛋白表面位于多糖反应的-OH改性为-CHO。

在0.1MPBS缓冲液下，4℃、pH 4.0-9.0下，将改性后的载体蛋白肺炎球菌与RSV F蛋白共反应24h，为保证充分联合反应，载体蛋白与RSV F蛋白均为过量的，反应完成后，得到呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗。

将联合后的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗经凝胶过滤柱分离纯化，洗脱后进行质谱分析，根据质谱中对应峰值分析，确认多糖在结合了载体蛋白并改性的前后，结构并未发生改变。

五、呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的免疫学评价

5.1小鼠体内IgG抗体滴度检测

取40只5周龄的雌性Balb/C小鼠，随机分为4组，即FI-RSV组、沛儿组、呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗组、PBS阴性对照组，每组10只小鼠。腹腔注射、每只每次注射5μg，每周注射一次，共注射3次。

21天后眼眶取血，检测小鼠血浆中肺炎球菌各血清型IgG抗体滴度及RSV IgG抗体滴度。实验结果见表1。

表1

由上表1可知，本发明中的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗可以有效地引起小鼠体内的PCV、RSV两种免疫反应，产生免疫效果，但与现有疫苗相比抗体滴度略低，可能是由于两种抗原在体内引发了免疫竞争，导致抗体滴度略低于现有单苗产品，这一点可以作为后续的研发方向继续深入研究。

5.2稳定性检测

呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周，外观检查和鉴别试验未见异常，pH值和抗原含量保持相对稳定，进行小鼠试验也未发现抗体水平发生明显差异。说明呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周的稳定性良好。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗及其制备方法

<130> 2017

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus

<220>

<223> F CDS DNA

<400> 1

atggagctgc tgatccacag gttaagtgca atcttcctaa ctcttgctat taatgcattg 60

tacctcacct caagtcagaa cataactgag gagttttacc aatcgacatg tagtgcagtt 120

agcagaggtt attttagtgc tttaagaaca ggttggtata ccagtgtcat aacaatagaa 180

ttaagtaata taaaagaaac caaatgcaat ggaactgaca ctaaagtaaa acttataaaa 240

caagaattag ataagtataa gaatgcagtg acagaattac agctacttat gcaaaacaca 300

ccagctgcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagt atatgaacta tacaatcaat 360

accactaaaa acctaaatgt atcaataagc aagaagagga aacgaagatt tctgggcttc 420

ttgttaggtg taggatctgc aatagcaagt ggtatagctg tatccaaagt tctacacctt 480

gaaggagaag tgaacaagat caaaaatgct ttgttatcta caaacaaagc tgtagtcagt 540

ctatcaaatg gggtcagtgt tttaaccagc aaagtgttag atctcaagaa ttacataaat 600

aaccaattat tacccatagt aaatcaacag agctgtcgca tctccaacat tgaaacagtt 660

atagaattcc agcagaagaa cagcagattg ttggaaatca acagagaatt cagtgtcaat 720

gcaggtgtaa caacaccttt aagcacttac atgttaacaa acagtgagtt actatcattg 780

atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaaattaa tgtcaagcaa tgttcagata 840

gtaaggcaac aaagttattc tatcatgtct ataataaagg aagaagtcct tgcatatgtt 900

gtacagctac ctatctatgg tgtaatagat acaccttgct ggaaattaca cacatcacct 960

ctatgcacca ccaacatcaa agaaggatca aatatttgtt taacaaggac tgatagagga 1020

tggtattgtg ataatgcagg atcagtatcc ttctttccac aggctgacac ttgtaaagta 1080

cagtccaatc gagtattttg tgacactatg aacagtttga cattaccaag tgaagtcagc 1140

ctttgtaaca ctgacatatt caattccaag tatgactgca aaattatgac atcaaaaaca 1200

gacataagca gctcagtaat tacttctctt ggagctatag tgtcatgcta tggtaaaact 1260

aaatgcactg catccaacaa aaatcgtggg attataaaga cattttctaa tggttgtgac 1320

tatgtgtcaa acaaaggagt agatactgtg tcagtgggca acactttata ctatgtaaac 1380

aagctggaag gcaagaacct ttatgtaaaa ggggaaccta taataaatta ctatgaccct 1440

ctagtgtttc cttctgatga gtttgatgca tcaatatctc aagtcaatga aaaaatcaat 1500

caaagtttag cttttattcg tagatctgat gaattactac ataatgtaaa tactggcaaa 1560

tctactacaa atattatgat aactacaatt attatagtaa tcattgtagt attgttatca 1620

ttaatagcta ttggtttgct gttgtattgc aaagccaaaa acacaccagt tacactaagc 1680

aaagaccaac taagtggaat caataatatt gcattcagca aatag 1725

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-F引物

<400> 2

cccaagcttc agaaaaccgt gacctatcaa g 31

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-R引物

<400> 3

ccctcgagac atgaagtttt gcctcactag ta 32

<210> 4

<211> 2306

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 待扩增片段

<400> 4

cttagttatt caaaaactac atcttagcag aaaaccgtga cctatcaagc aagaacgaaa 60

ttaaacctgg ggcaaataac catggagctg ctgatccaca ggttaagtgc aatcttccta 120

actcttgcta ttaatgcatt gtacctcacc tcaagtcaga acataactga ggagttttac 180

caatcgacat gtagtgcagt tagcagaggt tattttagtg ctttaagaac aggttggtat 240

accagtgtca taacaataga attaagtaat ataaaagaaa ccaaatgcaa tggaactgac 300

actaaagtaa aacttataaa acaagaatta gataagtata agaatgcagt gacagaatta 360

cagctactta tgcaaaacac accagctgcc aacaaccggg ccagaagaga agcaccacag 420

tatatgaact atacaatcaa taccactaaa aacctaaatg tatcaataag caagaagagg 480

aaacgaagat ttctgggctt cttgttaggt gtaggatctg caatagcaag tggtatagct 540

gtatccaaag ttctacacct tgaaggagaa gtgaacaaga tcaaaaatgc tttgttatct 600

acaaacaaag ctgtagtcag tctatcaaat ggggtcagtg ttttaaccag caaagtgtta 660

gatctcaaga attacataaa taaccaatta ttacccatag taaatcaaca gagctgtcgc 720

atctccaaca ttgaaacagt tatagaattc cagcagaaga acagcagatt gttggaaatc 780

aacagagaat tcagtgtcaa tgcaggtgta acaacacctt taagcactta catgttaaca 840

aacagtgagt tactatcatt gatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaaatta 900

atgtcaagca atgttcagat agtaaggcaa caaagttatt ctatcatgtc tataataaag 960

gaagaagtcc ttgcatatgt tgtacagcta cctatctatg gtgtaataga tacaccttgc 1020

tggaaattac acacatcacc tctatgcacc accaacatca aagaaggatc aaatatttgt 1080

ttaacaagga ctgatagagg atggtattgt gataatgcag gatcagtatc cttctttcca 1140

caggctgaca cttgtaaagt acagtccaat cgagtatttt gtgacactat gaacagtttg 1200

acattaccaa gtgaagtcag cctttgtaac actgacatat tcaattccaa gtatgactgc 1260

aaaattatga catcaaaaac agacataagc agctcagtaa ttacttctct tggagctata 1320

gtgtcatgct atggtaaaac taaatgcact gcatccaaca aaaatcgtgg gattataaag 1380

acattttcta atggttgtga ctatgtgtca aacaaaggag tagatactgt gtcagtgggc 1440

aacactttat actatgtaaa caagctggaa ggcaagaacc tttatgtaaa aggggaacct 1500

ataataaatt actatgaccc tctagtgttt ccttctgatg agtttgatgc atcaatatct 1560

caagtcaatg aaaaaatcaa tcaaagttta gcttttattc gtagatctga tgaattacta 1620

cataatgtaa atactggcaa atctactaca aatattatga taactacaat tattatagta 1680

atcattgtag tattgttatc attaatagct attggtttgc tgttgtattg caaagccaaa 1740

aacacaccag ttacactaag caaagaccaa ctaagtggaa tcaataatat tgcattcagc 1800

aaatagacaa aaaaccacct gatcatgttt caacaacagt ctgctgatca ccaatcccaa 1860

atcaacccat aacaaacact tcaacatcac agtacaggct gaatcatttc ttcacatcat 1920

gctacccaca caactaagct agatccttaa ctcatagtta cataaaaacc tcaagtatca 1980

caatcaaaca ctaaatcaac acatcattca caaaattaac agctggggca aatatgtcgc 2040

gaagaaatcc ttgtaaattt gagattagag gtcattgctt gaatggtaga agatgtcact 2100

acagtcataa ttactttgaa tggcctcctc atgccttact agtgaggcaa aacttcatgt 2160

taaacaagat actcaagtca atggacaaaa gcatagacac tttgtctgaa ataagtggag 2220

ctgctgaact ggacagaaca gaagaatatg ctcttggtat agttggagtg ctagagagtt 2280

acataggatc tataaacaac ataaca 2306

<210> 5

<211> 375

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB DNA序列

<400> 5

atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atatgcacac 60

ggagctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 120

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 180

attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 240

tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 360

agtatgaaaa actag 375

<210> 6

<211> 124

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> LTB 氨基酸序列

<400> 6

MNKVKCYVLF TALLSSLYAH GAPQTITELC SEYRNTQIYT INDKILSYTE SMAGKREMVI 60

ITFKSGETFQ VEVPGSQHID SQKKAIERMK DTLRITYLTE TKIDKLCVWN NKTPNSIAAI 120

SMKN 124

<210> 7

<211> 375

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CTB DNA序列

<400> 7

atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcaaat 60

ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg 120

ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180

attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240

tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300

gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360

agtatggcaa attaa 375

<210> 8

<211> 124

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> CTB 氨基酸序列

<400> 8

MIKLKFGVFF TVLLSSAYAN GTPQNITDLC AEYHNTQIHT LNDKIFSYTE SLAGKREMAI 60

ITFKNGATFQ VEVPGSQHID SQKKAIERMK DTLRIAYLTE AKVEKLCVWN NKTPHAIAAI 120

SMAN 124

<210> 9

<211> 747

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-CTB DNA

<400> 9

atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atatgcacac 60

ggagctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 120

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 180

attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 240

tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 360

agtatgaaaa acatgattaa attaaaattt ggtgtttttt ttacagtttt actatcttca 420

gcatatgcaa atggaacacc tcaaaatatt actgatttgt gtgcagaata ccacaacaca 480

caaatacata cgctaaatga taagatattt tcgtatacag aatctctagc tggaaaaaga 540

gagatggcta tcattacttt taagaatggt gcaacttttc aagtagaagt accaggtagt 600

caacatatag attcacaaaa aaaagcgatt gaaaggatga aggataccct gaggattgca 660

tatcttactg aagctaaagt cgaaaagtta tgtgtatgga ataataaaac gcctcatgcg 720

attgccgcaa ttagtatggc aaattaa 747

<210> 10

<211> 248

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-CTB 氨基酸序列

<400> 10

MNKVKCYVLF TALLSSLYAH GAPQTITELC SEYRNTQIYT INDKILSYTE SMAGKREMVI 60

ITFKSGETFQ VEVPGSQHID SQKKAIERMK DTLRITYLTE TKIDKLCVWN NKTPNSIAAI 120

SMKNMIKLKF GVFFTVLLSS AYANGTPQNI TDLCAEYHNT QIHTLNDKIF SYTESLAGKR 180

EMAIITFKNG ATFQVEVPGS QHIDSQKKAI ERMKDTLRIA YLTEAKVEKL CVWNNKTPHA 240

IAAISMAN 248

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-Fwd引物序列

<400> 11

cgggatccat gaataaagta aaatgttatg ttttatttac ggcgtta 47

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-Rev引物序列

<400> 12

ctagggtctc catgtttttc atactgattg ccgcaa 36

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CTB-Fwd引物序列

<400> 13

ctagggtctc aacatgatta aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt ta 52

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CTB-Rev引物序列

<400> 14

ccctcgagtt aatttgccat actaattgcg gcaa 34

Claims (9)

1.一种呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述疫苗以肺炎链球菌多糖-蛋白载体-RSV特异性蛋白为抗原，其中：该多糖为7价肺炎链球菌荚膜多糖，所述肺炎球菌的血清型包括4、6B、9V、14、18、19F和23F；蛋白载体为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白和霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)的融合蛋白，编码的重组载体蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：10所示；肺炎链球菌多糖-蛋白载体结合物经化学反应，将RSV特异性蛋白连接到重组蛋白载体表面的C端，所述RSV特异性蛋白为F蛋白，表达F蛋白的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，引物结合后的待扩增序列如序列表SEQ ID NO：4所示，待扩增序列插入表达载体中，构建表达载体。

3.根据权利要求2所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：重组的呼吸道合胞病毒蛋白的表达载体为pcDNA3.1-F。

4.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述载体蛋白为LTB与CTB的重组融合蛋白，编码氨基酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示，其中，LTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：12所示，CTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：13所示，LTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：11所示，CTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：14所示。

5.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：肺炎球菌多糖与RSV特异性蛋白之间的质量比为(0.5～2):1。

6.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述联合疫苗的制备方法包括如下步骤：

a.分别纯化多种血清型肺炎球菌荚膜多糖；

b.制备并纯化重组载体蛋白；

c.制备RSV特异性蛋白；

d.制备多糖与重组载体蛋白的结合物；

e.将结合后的多糖-载体蛋白经化学反应与RSV特异性蛋白连接；

f.分离纯化步骤e中的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗。

7.根据权利要求6所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤e具体为：将肺炎链球菌多糖-蛋白载体表面功能基团羟基改性为醛基，然后连接RSV特异性蛋白。

8.根据权利要求6所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于：RSV特异性蛋白的制备方法包括如下步骤：

a.培养RSV病毒，采用病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒提取RSV病毒RNA，将提取出的菌体RNA进行逆转录(RT)，以逆转录的cDNA产物为模板进行F蛋白基因序列扩增；

b.根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，重组蛋白的表达载体为pcDNA3.1-F。

9.根据权利要求8所述的呼吸道合胞病毒-多价肺炎球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤b具体为：根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，上游特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：2所示，限制性内切酶位点为Hind III，下游特异性引物序列如序列表SEQID NO：3所示，限制性内切酶位点为Xho I，连接后的表达载体为pcDNA3.1-F。

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