KR20020038771A - 비내 인플루엔자 바이러스 백신 - Google Patents

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KR20020038771A
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마틴 프리에드
베로니크 헨데릭스
필리페 헤르만드
몬세프 모하메드 슬라오위
스테판 가브리엘 조세프 쏘엘렌
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장 스테판느
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 인플루엔자에 대한 1회 용량의 비내 백신접종을 위한 백신 포뮬레이션의 제조에 있어서, 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제, 특히 분할 인플루엔자 바이러스 제제의 용도에 관한 것으로서, 상기 1회 용량의 백신접종은 인플루엔자 백신을 위한 국제적인 규제 요건을 충족한다. 본 발명은 상기 백신을 생성하는 방법, 및 비내 투여 장치 및 1회 용량의 백신을 포함하는 약제학적 키트를 추가로 제공한다.

Description

비내 인플루엔자 바이러스 백신{INTRANASAL INFLUENZA VIRUS VACCINE}
인플루엔자 바이러스는 전세계에 걸쳐 존재하는 가장 편재성인 바이러스중 하나이며, 사람 및 가축류 둘 모두에 영향을 끼친다. 인플루엔자의 경제적인 타격은 상당하다.
인플루엔자 바이러스는 약 125 nm 크기의 입자 직경을 갖는 RNA 엔벨로핑된(enveloped) 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 기본적으로 지질 이중층 구조를 갖는 바이러스 엔벨로프 및 외부 당단백질에 의해 둘러싸인 내부 누클레오캡시드 또는 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)으로 구성된다. 바이러스 엔벨로프의 내부 층은 주로 매트릭스 단백질로 구성되고 외부 층은 대부분 숙주 유래된 지질 물질로 구성된다. 표면 당단백질 뉴라미니다제(NA) 및 혈구응집소(HA)는 스파이크처럼 생겼고, 길이는 10 내지 12 nm 이고 입자의 표면에 존재한다. 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 것은 이들 표면 단백질, 특히 혈구응집소이다.
전형적인 인플루엔자 유행병은 증가된 입원률 또는 사망률에 의해 증명된 바와 같이 폐렴 발생 및 하기도 질환의 증가를 초래한다. 노인 또는 잠재적인 만성 질환에 걸린 노인이 이러한 합병증을 겪을 가능성이 가장 높지만, 어린 유아 또한 심한 질환을 앓을 수 있다. 그러므로 이러한 군은 특히 보호받아야 할 필요가 있다.
현재 이용가능한 인플루엔자 백신은 불활성되거나 살아있는 약독화된 인플루엔자 백신이다. 불활성화된 플루(flu) 백신은 3가지 타입의 항원 제제로 구성된다: 불활성화된 전체 바이러스, 정제된 바이러스 입자를 세제 또는 다른 시약으로 붕괴시켜 지질 엔벨로프를 용해화시킨 서브-비리온(소위, "분할" 백신) 또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛 백신). 이러한 불활성화된 백신은 근내적으로(i.m.) 제공된다.
모든 종류의 인플루엔자 백신은 대개 3가 백신이다. 이들은 일반적으로 2개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 1개의 인플루엔자 B 균주로부터 유래된 항원을 함유한다. 대부분의 경우에 0.5 ml의 주사가능한 표준 용량은 일원방사상면역확산법(SRD)에 의해 측정된 바와 같이, 각각의 균주로부터의 혈구응집소 항원 성분 15 ㎍을 함유한다[참조: J.M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunitvaccines. J. Biol. Stand. 5(1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330].
각 시즌에 인플루엔자 백신내로 혼입되는 인플루엔자 바이러스 균주는 국립 보건 당국과 백신 제조사와 공동으로 세계 보건 기구에 의해 결정되었다.
매년 유행성 인플루엔자와 관련된 이환률 및 사망률을 제어하기 위한 현재의 노력은 근내적으로 투여되는 불활성화된 인플루엔자 백신의 사용에 기초한다. 호흡기 질환 및 인플루엔자 합병증을 예방하는데에 이러한 백신의 효능은 건강한 성인에서 75% 내지 노인에서 50% 미만의 범위이다.
많은 병원균과 마찬가지로 인플루엔자 바이러스는 초기에 상기도 기관의 점막 표면에 침입한다. 점막 면역성은 숙주를 위한 제 1 방어선을 구성하는데 이것은 코의 통로 및 하기도 기관의 통풍로에 있어서 면역 반응의 주요한 구성요소이다. 현재 사용되는 주사용 인플루엔자 백신이 주로 건강한 개체에게서 혈청 HA-특이적인 IgG를 자극하지만, HA-특이적인 코의 IgA 항체의 현저한 증가는 소수의 백신접종된 피검자에서만 일어난다. 더욱 우수한 면역원성 및 임상적 효능을 갖는 향상된 인플루엔자 백신이 국부적 및 전신적 항체 반응 둘 모두를 표적화하기 위해 필요하다.
불활성화된 인플루엔자 백신에 대한 실험적인 사람의 비내적 노출은 1940년대까지 거슬러 올라간다[참조: Eyles et al. 2000 BioDrugs 13(1): 35-59]. 1960년대 및 70년대에 비내적 면역화를 위한 불활성화된 바이러스의 사용에 있어서 흥미로운 소생이 있었지만, 비내 분야에서 대부분의 관심은 살아있는 약독화된 접근법에 관한 것이었다.
비내적으로 투여된, 살아있는 약독화된 인플루엔자 백신, 예컨대, 냉각-적응된 백신은 특히 어린이에게서 유망한 결과와 함께, 향상된 점막 면역성을 제공한다. 그러나, 이러한 접근법은 지금까지로는 전세계적인 허용성을 얻는데 실패하였다.
따라서, 대부분의 시판되는 인플루엔자 백신은 분할 또는 서브유닛 주사용 백신이다. 이들 백신은 일반적으로 유기 용매 또는 세제로 바이러스 입자를 붕괴시키고, 다양한 정도로 바이러스 단백질을 분리 또는 정제함으로써 제조된다. 분할 백신은 용해화 농도의 유기 용매 또는 세제를 사용하여 감염성이거나 불활성화된 전체 인플루엔자 바이러스를 단편화시킨 다음 용해화제 및 일부 또는 대부분의 바이러스 지질 물질을 제거함으로써 제조된다. 분할 백신은 일반적으로 멤브레인 엔벨로프 단백질 뿐만 아니라, 오염 매트릭스 단백질 및 핵단백질 및 때때로 지질을 함유한다. 분할 백신은 대개 전체 바이러스에서 일어나는 바와 동일한 비율로 존재할 필요는 없지만, 바이러스 구조 단백질의 대부분 또는 전부를 함유할 것이다. 다른 한편으로 서브유닛 백신은 필수적으로 고도로 정제된 바이러스 표면 단백질, 혈구응집소 및 뉴라미니다제로 구성되며, 이들은 백신접종시에 요망되는 바이러스가 항체를 중화시키는 것을 담당하는 표면 단백질이다.
더욱 최근에, 더욱 고도로 정제되고 더욱 잘 특징화된 분할 인플루엔자 백신이 성인 및 노인에게서 면역원성을 향상시키려는 시도로 애쥬번트와 결합되었다. 마우스에서 면역 반응이 현저하게 증가되었지만, 새로운 세대의 애쥬번트를 사용하는 수많은 접근법은 사람에서의 확정 가능성을 증명하지 못했다.
인플루엔자 백신의 효능을 측정하기 위해 표준이 국제적으로 적용되었다. 인플루엔자에 대해 효과적인 백신에 대한 유럽 연합 공식 기준을 하기 표에 기재하였다. 이론적으로, 유럽 연합 요건을 충족시키기 위해, 인플루엔자 백신은 백신내에 포함되어 있는 모든 인플루엔자 균주에 대해 하기 표의 기준 중 하나 이상만을 충족하면 된다. 그러나 실제로는, 특히, 새로운 비내 백신과 같은 새로운 백신의 경우, 모든 균주에 대해 기준 중 2가지 이상 또는 3가지 전부를 충족해야할 필요가 있을 것이다. 어떤 환경하에서는 2가지 기준이 충분할 수도 있다. 예를 들어, 3가지 기준이 전체가 아닌 일부 균주(예컨대, 3가지 균주 중 2가지)에 의해 충족되는 반면 3가지 기준 중 2가지가 모든 균주에 의해 허용될 수 있다. 이러한 요건은 성인 군집(18세 내지 60세) 및 노인 군집(60세 초과)에 대해 상이하다.
18세 내지 60세 60세 초과
혈청변환율* >40% >30%
변환 인자** >2.5 >2.0
보호율*** >70% >60%
* 혈청변환율은 각각의 백신 균주에 대해, 백신접종후에 혈청 혈구응집소 억제(HI) 역가에 있어서 4배 이상의 증가를 갖는 백신접종자의 퍼센트로서 정의된다.
** 변환 인자는 각각의 백신 균주에 대해, 백신접종후에 혈청 HI 기하학적 평균 역가(GMT)에 있어서의 배수 증가로서 정의된다.
*** 보호율은 (각각의 백신 균주에 대해) 백신접종후에 1:40과 동일하거나이보다 높은 혈청 HI 역가를 갖는 백신접종자의 퍼센트로서 정의되며 보통 지시 보호로서 여겨진다.
시판될 수 있는 비내 플루 백신을 위해, 이들 표준을 충족시킬 필요가 있을 뿐만 아니라 실제로 적어도 현재 유용한 주사용 백신만큼 효과적일 필요가 있을 것이다. 또한 요구되는 항원의 양 및 투여 횟수에 대하여 상용적으로 생존할 수 있어야 할 필요가 있을 것이다.
과거 수십년에 걸쳐 연구되어온 불활성화된 바이러스에 기초한 비내 플루 백신은 이러한 기준을 충족시키지 않는다.
펄크(Fulk) 등[참조: 1969, J. Immunol. 102, 1102-5]은 노인 환자에 있어서 사멸된 인플루엔자 바이러스의 비내 투여(점비약 및 분무)를 피하(s.c.) 투여와 비교하였다. s.c. 투여를 받은 환자 중 56%가 항체 역가(HI)에 있어서 4배 증가를 나타낸 반면, 비내 투여를 받은 환자 중 겨우 25%에서만 상응하는 증가가 관찰되었다. 2회의 비내 투여는 75% 혈청변환을 일으켰다.
글럭(Gluck) 등[참조: 1999, J. Virol. 73, 7780-6]은 강력한 점막 애쥬번트(대장균 열 불안정 독소, HLT)를 함유하는 스프레이에 의해 투여된 2회의 연속된 비내 접종이 근내 투여와 유사한 혈청변환(체액성 항체 반응에 있어서 4배 증가)을 유도시키기 위해 필요했음을 증명하였다. 애쥬번트의 존재하에서 균주 당 15 ㎍ HA의 단일 비내 투여, 또는 애쥬번트의 부재하에 2회 투여조차도 동등한 혈청변환을 일으킬 수 없었다. 인플루엔자 항원은 비로솜, 포스파티딜콜린을 사용하여 생성된 재구성된 지질 이중층 및 알(egg)-유래된 인플루엔자 바이러스로부터 추출된 바이러스 표면 단백질의 형태로 존재하였다.
또한 높은 레벨의 혈청변환을 달성하려는 시도를 위해 2회 이상의 비내 투여를 사용하는 개념이 다른 연구자들에 의해 사용되었다. 페트레스쿠(Petrescu) 등[참조: 1979. Rev. Rom. Med-Virol. 30, 109-115]은 불활성화된 바이러스(백신접종 용량 당 1000 국제 단위)를 2주에 걸쳐 비내적으로 2회 투여하였다. 오우(Oh) 등[참조: 1992 Vaccine 10, 506-11]은 분할 백신을 코 스프레이 형태로 균주 각각의 투여 당 15 ㎍ HA(각각의 시도 시에 콧구멍마다 0.25 ml)를 매주 간격으로 4회 투여하였다. 쿠노-사카이(Kuno-Sakai) 등[참조: 1994. Vaccine 12, 1303-1310]은 시판되는 분할 인플루엔자의 3배 강도인 불활성화된 백신 에어로졸을 1주 간격으로 2회 투여하였다.
최근에 무츠카트(Muszkat) 등[참조: 2000 Vaccine 18, 1696-9]은 노인 환자에게 불활성화된 전체 플루 바이러스(용량 당 20 ㎍의 A 균주 및 B 균주 및 또 다른 A 균주 40 ㎍)를 사용하여 2회 비내 면역화시키고 시판되는 불활성화된 분할 플루 백신의 표준 용량의 근내 주입의 경우 보다 비내 투여에 대해 더 낮은 전신 혈청변환을 관찰하였다.
따라서 1969년 내지 2000년의 문헌들은 불활성화된 인플루엔자 백신을 사용한 비내 백신접종이 폭넓게 조사되었지만, 어떠한 군도 단일 용량의 백신을 코로 투여함으로써 근내 또는 피하 주입과 동등한 전신 혈청변환을 달성할 수 없었음을 보여준다. 또한, 백신의 다중 투여를 사용하여 효과를 달성하기 위해, 사용된 항원의 용량은 각각의 백신접종자에 대해 균주 당 15 ㎍ HA의 통상적인 표준 용량 보다 상당히 높았다. 상기 데이터는 사실상, 바람직하게는 대장균 HLT와 같은 강력한 면역자극제의 존재하에, 다중 투여에 대한 필요성을 시사한다.
키무라(Kimura) 등[참조: 1988. Acta Paediatr Jpn. 30, 601-3]은 분무기에 의한 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 2-용량의 투여가 단일 s.c. 투여만큼 효과적이지만, 비내 스프레이에 의한 2-용량의 투여는 훨씬 덜 효과적이었음을 증명하였다. 분무는 폐에 도달하는 매우 미세한 스프레이를 생성시킨다. 따라서 공개된 임상학적 시도에서는 코 스프레이가 효과적이지 않을 수 있고, 분무가 더 우수할 수 있음을 시사한다.
문헌은 비내 백신에 있어서 강력한 애쥬번트, 더욱 상세하게는 강력한 면역자극제의 필요성을 추가로 시사한다.
예를 들어, 글럭 등(상기 인용됨)은 면역자극제의 부재하에서 인플루엔자 백신의 비내 투여가 면역자극제의 존재하에서 보다 현저하게 덜 효능적임을 증명하였다. 저자는 면역자극제가 결핍된 백신의 2회의 비내 투여조차 피하 투여에 의해 달성된 동일한 혈청변환을 유도시키지 못하였음을 보여주었다.
하쉬쿠찌(Hashigucci) 등[참조: 1996 Vaccine 14, 113-9]은 대장균 열 불안정성 독소 및 이의 B-서브유닛(LTB)를 애쥬번트로 사용한 분할 인플루엔자 백신을 4주 간격으로 2회 비내 투여함으로써 50%의 혈청변환이 일어남을 증명하였다. 애쥬번트의 부재하에서는 단지 31%의 혈청변환이 수득되었다. 전형적으로 s.c. 투여는 75 내지 90%의 혈청변환을 일으켰다.
따라서, 문헌은 통상적인 플루 백신을 사용하여 수득된 것과 동등한 전신적인 혈청변환을 달성하기 위해, 1회 이상의 투여가 필요하고, 추가로 백신은 독소를 애쥬번트로 사용해야 함을 명백하게 시사한다.
현재, 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원이 상용적으로 생존할 수 있는 비내적 플루 백신으로 사용될 수 있음이 발견되었다. 특히, 비내적 인플루엔자 바이러스 백신 제제의 단일 투여는 보호 레벨에서 전신 면역성을 자극한다. 또한, 이것은 효과적인 플루 백신을 위한 국제 기준을 충족한다. 더욱 상세하게는, 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제의 비내 투여는 동일한 백신의 s.c. 투여에 의해 수득된 것과 동등한 전신적 혈청변환(안티-HA 역가에 있어서 4배 증가)을 일으킬 수 있다. 놀랍게도, 인플루엔자 항원은 선행 기술에 기재된 것보다 백신접종자 당 현저하게 더 낮은 용량으로 제공될 수 있다.
주입에 의해 수득된 것과 동등한 혈청변환을 일으키는 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 표준 용량을 코에 단일 투여하는 것은 앞서 보고된 바 없다.
본 발명은 신규한 인플루엔자 백신 포뮬레이션, 이들을 제조하는 방법 및 예방 또는 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 점막에 투여, 더욱 특히 코에 투여하기 위한 백신에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 단일 용량으로 비내적으로 투여하여 규제 요건을 충족시키기에 충분한 면역 반응을 달성할 수 있는 인플루엔자 백신의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 비내적 전달을 위한 단일 투여 인플루엔자를 처음으로 제공한다. 상기 백신은 이 백신이 상용의 1회-용량 백신으로서 유럽에서 승인될 수 있도록, 상기에 설명한 바와 같이 인플루엔자 백신을 위한 EU 기준 중 일부 또는 전부를 충족한다. 바람직하게는, 3가지 EU 기준 중 2가지 이상이 백신내에 존재하는 인플루엔자의 특정 균주 또는 모든 균주에 대해 충족된다. 더욱 바람직하게는, 2가지 이상의 기준이 모든 균주에 대해 충족되고 세번째 기준이 모든 균주 또는 전부는 아니지만 적어도 균주중 하나에 의해 충족된다. 가장 바람직하게는, 모든 균주가 3가지 기준 전부를 충족시킨다.
따라서, 본 발명은 일면에서 인플루엔자에 대해 코에 1회-용량으로 백신접종하기 위한 백신 포뮬레이션의 제조에 있어서 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제의 용도를 제공한다. 상기 백신은 1-용량 포맷(mono-dose format) 또는 2-용량 포맷(bi-dose format)(일반적으로 각각의 콧구멍에 대해 1개의 서브(sub)-용량)으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서 인플루엔자에 대한 면역화를 위한 점막 백신의 제조에 있어서 낮은 용량의 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 물질의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제는 특히 비이온성 계면활성제일 수 있는 1종 이상의 계면활성제를 함유한다. 바람직하게는 비이온성 계면활성제는 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, 시판되는 TritonTM시리즈), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(TweenTM시리즈) 및 일반식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르 및 이들 중 둘 이상의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 계면활성제이다:
(I) HO(CH2CH2O)n-A-R
상기 식에서, n은 1 내지 50이고, A는 단일결합 또는 -C(O)-, R은 C1-50알킬 또는 페닐 C1-50알킬이다.
화학식 (I)에 속하는 바람직한 계면활성제는 n이 4 내지 24, 바람직하게는 6내지 12, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분이 C1-50, 바람직하게는 C4-20알킬 및 가장 바람직하게는 C12알킬인 분자이다.
옥틸페녹시 폴리옥시에탄올 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르는 문헌[참조: "Surfactant systems" Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall)]에 기재되어 있다. 또한 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100TM)을 포함하여, 옥틸페녹시 폴리옥시에탄올(옥톡시놀)은 문헌[참조: Merck Index Entry 6858 (Page 1162, 12thEdition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3)에 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80TM)를 포함하여, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르는 문헌[참조: Merck Index Entry 7742(Page 1308, 12thEdition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3]에 기재되어 있다. 둘 모두는 상기 인용문헌에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 시그마 인코포레이티드(Sigma Inc.)와 같은 상용 공급원으로부터 구입할 수 있다.
특히 바람직한 비이온성 계면활성제에는 트리톤(Triton) X-45, t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100), 트리톤 X-102, 트리톤 X-114, 트리톤 X-165, 트리톤 X-205, 트리톤 X-305, 트리톤 N-57, 트리톤 N-101, 트리톤 N-128, 브레이즈(Breij) 35, 폴리옥시에틸렌-9-로우릴 에테르(로레스(laureth) 9) 및 폴리옥시에틸렌-9-스테아릴 에테르(스테아레스(steareth) 9)가 포함된다. 트리톤 X-100 및 로레스 9가 특히 바람직하다. 또한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80TM)가 특히 바람직하다.
일반식 (I)의 추가로 적합한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-8-스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.
폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르를 위한 대안적인 용어 또는 이름은 CAS 등록소에 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 CAS 등록 번호는 9002-92-0이다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 머크 인덱스(Merck index; 12thed: entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3)에 또한 기재되어 있다. 로레스 9는 에틸렌 옥시드를 도데실 알콜과 반응시킴으로써 형성되며, 평균 9개의 에틸렌 옥시드 단위체를 갖는다.
계면활성제에서 폴리옥시에틸렌 부분의 길이 대 알킬 사슬의 길이의 비(즉, n : 알킬 사슬 길이의 비)는 수성 매질중의 이러한 클래스의 계면활성제의 용해도에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 계면활성제는 용액으로 존재하거나 미셀(micelle) 또는 소포와 같은 미립자 구조를 형성할 수 있다. 용액이기 때문에, 본 발명의 계면활성제는 안전하고, 쉽게 멸균할 수 있고, 투여하기 간편하고, 일정한 미립자 구조의 형성과 관련된 GMP 및 QC 문제 없이 간단한 형태로 제조될 수 있다. 로레스 9와 같은 일부 폴리옥시에틸렌 에테르는 비-소포성 용액을 형성할 수 있다. 그러나, 폴리옥시에틸렌-8 팔미토일 에테르 (C18E8)는 소포를 형성할 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 추가적인 비이온성 계면활성제와 결합된 폴리옥시에틸렌-8 팔미토일 에테르의 소포가 본 발명의 포뮬레이션에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 포뮬레이션에 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르는 용혈 활성을 갖는다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 용혈 활성은 하기 검정에 관하여 시험관내에서 측정될 수 있고, 적혈구의 용해를 일으키지 못하는 계면활성제의 최고 농도로서 표현된 바와 같다:
1. 기나아 피그(guinea pig)로부터의 신선한 혈액을 데스크탑 원심분리내에서 인산염 완충 염수(PBS)로 3회 세척하였다. 본래 부피로 재현탁시킨 후에 혈액을 추가적으로 PBS중에 10배 희석하였다.
2. 이러한 혈액 현탁물 50 ㎕를 2배 희석된 세제를 함유하는 PBS 800 ㎕에 첨가하였다.
3. 8시간 후에 용혈을 시각적으로 또는 상층액의 광학 밀도를 측정함으로써 평가하였다. 570 nm에서 빛을 흡수하는 붉은 상층액의 존재는 용혈의 존재를 나타낸다.
4. 결과를 용혈이 더 이상 일어나지 않는 제 1 세제 희석물의 농도로서 표현하였다.
이러한 생물학적 검정의 고유한 실험적 가변성내에서, 본 발명의 폴리옥시에틸렌 에트르, 또는 일반식 (I)의 계면활성제는 바람직하게는 약 0.5 내지 0.0001%,더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.0001%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.0001%, 가장 바람직하게는 0.003 내지 0.0004%의 용혈 활성을 갖는다. 이상적으로, 상기 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르는 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르 또는 폴리옥시에틸렌-8 스테아릴 에테르와 유사한(즉, 10배 차이 이내) 용혈 활성을 가져야 한다.
기술된 상이한 군의 계면활성제로부터의 둘 이상의 비이온성 계면활성제가 본원에 기술한 백신 포뮬레이션내에 존재할 수 있다. 특히, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (Tween 80TM)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤) X-100TM의 혼합물이 바람직하다. 또 다른 바람직한 비이온성 계면활성제의 혼합은 로레스 9 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 또는 옥톡시놀 또는 둘 모두를 포함한다.
바람직하게는 특정 비이온성 계면활성제 또는 각각의 비이온성 계면활성제는 최종 백신 포뮬레이션중에 0.001 내지 20%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10%, 가장 바람직하게는 약 2%(w/v) 이하의 농도로 존재한다. 1개 또는 2개의 계면활성제가 존재하는 경우, 일반적으로 각각 약 2% 이하의 농도, 전형적으로는 각각 약 0.6% 이하의 농도로 최종 포뮬레이션내에 존재한다. 하나 이상의 추가적인 계면활성제는 일반적으로 각각 약 1%의 농도 이하 및 전형적으로 각각 약 0.2% 또는 0.1% 이하의 극소량으로 존재할 수 있다. 계면활성제의 임의의 혼합물은 본 발명에 따른 백신 포뮬레이션내에 존재할 수 있다.
상기 논의한 것들과 같은 비이온성 계면활성제는 다음과 같이 최종 백신 조성물내에서 바람직한 농도를 갖는다: Tween 80TM과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르: 0.01 내지 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1%(w/v); Triton X-100TM과 같은 코어 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 또는 트리톤 시리즈의 다른 세제: 0.001 내지 0.1%, 가장 바람직하게는 0.005 내지 0.02%(w/v); 로레스 9와 같은 일반식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에테르: 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%(w/v).
특정한 백신 포뮬레이션을 위해, 기타 백신 성분이 포뮬레이션에 포함될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 포뮬레이션은 또한 담즙산 또는 이의 유도체를, 특히 염의 형태로 포함할 수 있다. 이들은 콜산 및 이의 염의 유도체, 특히 콜산 또는 콜산 유도체의 나트륨 염을 포함한다. 담즙산 및 이의 유도체의 예에는 콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 리토콜산, 우르소데옥시콜산, 히오데옥시콜산 및 상기 담즙산의 글리코-, 타우로-, 아미노프로필-1-프로판설폰-, 아미노프로필-2-하이드록시-1-프로판설폰 유도체 또는 N,N-비스 (3D글루코노아미도프로필) 데옥시콜라미드와 같은 유도체가 포함된다. 특히 바람직한 예는 최종 백신 용량내에 존재할 수 있는 나트륨 데옥시콜레이트(NaDOC)이다.
바람직하게는, 본 발명의 포뮬레이션은 수용액 형태 또는 비-소포성 형태의 현액액으로 존재한다. 이러한 포뮬레이션은 재현적으로 제조하기 쉽고, 또한 멸균하기 쉽고(450 또는 220 nm 포어 멤브레인을 통한 최종 여과) 애쥬번트의 복잡한물리적 구조의 분해없이 스프레이 형태로 코 점막에 투여하기 쉽다.
본 발명에 사용하기 위한 살아있지 않은 플루 항원 제제는 분할 바이러스 항원 제제, 서브유닛 항원(전체 바이러스로부터 재조합적으로 발현되거나 제조됨), 예컨대, 포름알데히드, β-프로피오락톤에 의해 화학적으로 불활성화되거나 다른 방법으로, 예컨대, U.V. 또는 열 불활성화에 의해 불활성화될 수 있는 불활성화된 전체 바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 항원 제제는 분할 바이러스 제제, 또는 바람직하게는 분할 과정에 이어 표면 항원의 정제에 의해 전체 바이러스로부터 제조된 서브유닛 항원이다.
바람직한 구체예에서, 백신 포뮬레이션은 1종 이상의 비이온성 계면활성제와 결합된 분할 플루 바이러스 제제를 포함한다. 1종 이상의 비이온성 계면활성제는 분할 플루 항원 제제가 생성되고/되거나 이후에 항원 제제에 첨가되는 과정으로부터 잔류할 수 있다. 본 발명이 이러한 필수적인 경우에 의존한다고 이해될 것이지만, 분할 플루 항원 물질이 비이온성 계면활성제의 존재하에 안정화될 수 있다고 생각된다.
본 발명은 또 다른 측면에서 추가된 면역자극제없이 1회-용량 비내 인플루엔자 백신의 제조에 사용되는 살아있지 않은 바이러스 항원 제제, 바람직하게는 분할 플루 바이러스 제제의 용도를 제공한다. 본 발명과 관련하여, 면역자극제는 예컨대, 캐리어와 결합하는 경우 자체가 자극 효과를 갖는 항원을 위한 캐리어로서 작용함으로써 간접적으로만 자극하는 것과는 반대로, 면역계의 세포를 직접적으로 자극할 수 있는 물질이다.
본 발명의 대안적인 측면에서, 포뮬레이션은 콜레라 독소 및 이의 B 서브유닛, 임의의 공급원으로부터의 해독화된 지질 A, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL) 및 3-데-O-아실화된 디포스포릴 지질 A와 같은 모노포스포릴 및 디포스포릴 지질 A의 비독성 유도체를 포함하여 US 4,912,094호 및 GB 2,220,211호에 기술되어 있는 것들을 포함하는 지질 A의 비독성 유도체, 퀼 A(남아프리카 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 껍질로부터 유래함)와 같은 사포닌, 및 QS21 및 QS17(US 5,057,540; Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; EP 0 362 279 B1; Kensil et al.(1991) J. Immunology vol 146, 431; WO 99/10008) 및 메틸화되지 않은 CpG 디누클레오티드(WO 96/02555호에 기술된 바와 같이) 를 함유하는 올리고누클레오티드 애쥬번트 시스템을 포함하는 애쥬번트 또는 면역자극제를 추가로 포함한다.
본 발명의 본 일면의 바람직한 구체예에서, 포뮬레이션은 3D-MPL로부터 선택된 비독성 지질 A 및 디포스포릴 지질 A, 특히 3D-MPL의 비독성 유도체를 포함한다. 더욱 상세하게는, 포뮬레이션은 상기 정의한 바와 같이 일반식 (I)의 폴리옥시틸렌 에테르 또는 에스테르, 특히 로레스 9와 함께 3D-MPL을 포함한다.
따라서, 본 발명은 3D-MPL과 로레스 9의 혼합물, 및 인플루엔자 바이러스 항원 제제, 특히 분할 항원 제제를 포함하는 백신을 제공한다. 이러한 백신은 전적인 것은 아니지만, 특히 본원에 기술한 바와 같이 비내 투여를 포함하는 점막 투여를 위해 적합하다.
본 발명의 본 일면에 따른 포뮬레이션에 바람직하게 존재하는 추가적인 성분은 본원에 기술한 바와 같이 옥톡시놀 및 폴리옥시에틸렌 에스테르, 특히 t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80)과 같은 비이온성 세제; 및 본원에 기술한 바와 같이 담즙 염 또는 콜산 유도체, 특히 나트륨 데옥시콜레이트 또는 타우로데옥시콜레이트를 추가로 포함한다. 따라서, 특히 바람직한 포뮬레이션은 인플루엔자 바이러스 항원 제제와 결합하여 점막 또는 비내 적용을 위해 적합한 백신을 제공할 수 있는 3D-MPL, 로레스 9, 트리톤 X-100, 트윈 80 및 나트륨 데옥시콜레이트를 포함한다.
또한 본 발명은 3D-MPL, 로레스 9 및 인플루엔자 바이러스 항원 제제, 바람직하게는 통상적인 근내 인플루엔자 백신에 사용되는 분할 항원 제제와 같은 분할 항원 제제를 혼합하는 것을 포함하는 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 일면에서, 본 발명은 비내 스프레이 장치 및 1회-용량의 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하는 약제학적 키트를 제공한다. 바람직하게는 상기 장치는 백신의 2개의 서브-용량을 위한 2-용량 전달 장치이다.
본 발명에 따른 혈구응집소의 용량은 바람직하게는 현재 시판되는 플루 백신에서의 용량에 비해 혈구응집소 용량이 낮다. 따라서 바람직한 낮은 용량은 인플루엔자 균주 당 혈구응집소는 불과 약 30 ㎍, 더욱 바람직하게는 불과 약 15 ㎍이다. 이것은 체중 1kg 당 0.1 내지 2 ㎍으로 보통 어디에서나 동일하다. 필수적인 것은 아니지만 바람직하게는 본 발명의 낮은 용량 백신은 예컨대, 2개의 서브-용량, 즉 각각의 콧구멍에 대해 하나씩 1회-용량 백신으로서 투여된다.
유리하게는, 본 발명에 따른 백신 용량은 통상적인 주사용 분할 플루 백신보다 작은 부피로 제공되며, 이는 일반적으로 용량 당 0.5 내지 1 ml이다. 본 발명에 따른 낮은 부피 용량은 용량 당 바람직하게는 500 ㎕ 미만, 더욱 바람직하게는 300 ㎕ 미만, 가장 바람직하게는 불과 약 200 ㎕ 이하이다. 2개의 서브-용량을 제공하는 경우, 서브-용량 당 바람직한 부피는 상기 언급된 전체 용량 부피의 절반이다.
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 백신 용량은 낮은 부피중에 낮은 항원 용량을 갖는 용량, 예컨대, 약 200 ㎕의 부피중에 약 15 ㎍ 또는 약 7.5 ㎍의 HA(균주당)이다.
또한 본 발명은 점막 표면을 통해 1회-용량의 살아있지 않은 인플루엔자 백신을 피검자에게 투여하는 것을 포함하여 피검자에게서 인플루엔자 감염 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 점막 표면을 통해 낮은 용량의 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 백신을 피검자에게 투여하는 것을 포함하여 피검자에게서 인플루엔자 감염 또는 질환을 예방하는 방법을 추가로 제공한다.
바람직하게는 상기 백신은 비내적으로 투여된다.
가장 바람직하게는, 상기 백신은 바람직하게는 폐로 흡입되지 않으면서, 비인두 지역에 국부적으로 투여된다. 백신 포뮬레이션이 폐로 들어가지 않거나 실질적으로 들어가지 않으면서, 백신 포뮬레이션을 비인두 지역으로 전달하는 비내 전달 장치를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 백신의 비내 투여를 위한 바람직한 장치는 스프레이 장치이다. 시판되는 적절한 코 스프레이 장치에는 AccusprayTM(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))이 포함된다. 분무기는 폐로 쉽게 흡입될 수 있는 매우 미세한 스프레이를 생성시키며 따라서 코 점막에 효율적으로 도달하지 못한다. 그러므로 분무기는 바람직하지 못하다.
비내용의 바람직한 스프레이 장치는 장치의 성능이 사용자에 의해 적용된 압력에 의존하지 않는 장치이다. 이들 장치는 압력 임계 장치로서 공지되어 있다. 액체는 임계 압력이 적용될 경우에만 노즐로부터 방출된다. 이들 장치는 스프레이가 일정한 방울 크기를 갖는 것을 쉽게 달성하도록 해준다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 압력 임계 장치는 당분야에 공지되어 있고 예컨대, WO 91/13281호 및 EP 311 863 B 및 EP 516 636호에 기재되어 있으며 참조로 본원에 인용하였다. 이들 장치는 페이퍼 게엠베하(Pfeiffer GmbH)로부터 시판되고 있고 또한 문헌[참조: Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999]에 기재되어 있다.
바람직한 비내 장치는 1 내지 200㎛, 바람직하게는 10 내지 120㎛의 방울(액체로서 물을 사용하여 측정)을 생성시킨다. 10㎛ 이하에서는 흡입될 우려가 존재하며, 그러므로 불과 약 5%의 방울이 10㎛ 이하의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 120㎛를 넘는 방울은 퍼지지 않을 뿐만 아니라 더 작은 방울이 되지도 못하므로, 불과 약 5%의 방울이 120㎛를 초과하는 것이 바람직하다.
2-용량 전달은 본 발명에 따른 백신과 함께 사용하기 위한 비내 전달 시스템의 추가적인 바람직한 특징이다. 2-용량 장치는 각각의 콧구멍에 투여하기 위한하나의 서브-용량인 단일 백신 용량으로 구성된 2개의 서브-용량을 함유한다. 일반적으로, 2개의 서브-용량은 단일 챔버내에 존재하며 상기 장치의 구조가 한번에 단일의 서브-용량의 효율적인 전달이 가능하도록 해준다. 대안적으로, 1-용량 장치는 본 발명에 따른 백신을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가 일면에서 본 발명에 따른 백신 포뮬레이션을 함유하는 본원에 기술한 바와 같이 비내 투여 장치를 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.
본 발명은 필수적으로 액체 포뮬레이션의 스프레이 전달에 제한되는 것이 아니다. 본 발명에 따른 백신은 기타 형태, 예컨대, 분말로서 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 인플루엔자 백신은 바람직하게는 2종 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 다가 인플루엔자 백신이다. 가장 바람직하게는 3가지 균주를 포함하는 3가 백신이다. 통상적인 인플루엔자 백신은 3가지 인플루엔자 균주, 즉, 2가지 A 균주 및 한가지 B 균주를 포함한다. 그러나, 예컨대 보편적인 상황에서 유용할 수 있는 1가 백신이 본 발명에서 배제되는 것은 아니다. 1가의 보편적인 플루 백신은 대부분 단일의 A 균주로부터의 인플루엔자 항원을 함유할 것이다.
살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 제제는 통상적인 수정란 방법으로부터 유래될 수 있거나, 바이러스를 증식시키기 위한 조직 배양을 사용하는 임의의 새로운 생성 방법으로부터 유래될 수 있다. 바이러스를 증식시키기에 적합한 세포 기질에는 예컨대, MDCK 또는 MDCK의 클론으로부터의 세포인 MDCK-유사 세포와 같은 개 신장 세포, Vero 세포를 포함하는 AGMK 세포와 같은 원숭이 신장 세포, 또는 백신 목적을 위해 인플루엔자 바이러스를 생성시키기에 적합한 임의의 그 밖의 포유류 세포 타입이 포함된다. 또한 적합한 세포 기질에는 사람 세포, 예컨대, MRC-5 세포가 포함된다. 적합한 세포 기질은 세포주에 제한되지 않으며; 예를 들어 계배 섬유아세포와 같은 일차 세포가 또한 포함된다.
인플루엔자 바이러스 항원 제제는 임의의 다수의 시판되는 방법, 예컨대 특허 번호 DD 300 833호 및 DD 211 444호에 기술된 분할 플루 방법에 의해 생성될 수 있으며, 상기 문헌들을 본원에 참조로 인용하였다. 전통적으로 분할 플루는 트리-n-부틸 포스페이트, 또는 TweenTM과 결합된 디에틸에테르와 같이, 용매/세제 처리("트윈-에테르" 분할법으로서 공지됨)를 사용하여 생성될 수 있었고 이러한 방법은 일부 생산 기관에서 여전히 사용되고 있다. 현재 사용되는 기타 분할 작용제에는 세제 또는 단백분해 효소 또는 담즙 염, 예컨대, 본원에 참조로 인용된 특허 번호 DD 155 875에 기술된 바와 같이 나트륨 데옥시콜레이트가 포함된다. 분할 작용제로서 사용될 수 있는 세제에는 양이온성 세제, 예컨대, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 기타 이온성 세제, 예컨대, 라우릴설페이트, 타우로데옥시콜레이트, 또는 트리톤 X-100(예컨대, 문헌(참조: Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103)에 기술된 방법에서) 및 트리톤 N-101을 포함하는 상기 기술한 것과 같은 비이온성 세제, 또는 임의의 둘 이상의 세제의 혼합물이 포함된다.
분할 플루 바이러스 제제를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 추가로 적합한 분할 작용제에는 다음이 포함된다:
1. 다음을 포함하는 담즙산 및 이들의 유도체: 콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시 콜산, 리토콜산 우르소데옥시콜산, 히오데옥시콜산 및 상기한 담즙산의 글리코-, 타우로-, 아미도프로필-1-프로판설폰-, 아미도프로필-2-하이드록시-1-프로판설폰 유도체, 또는 N,N-비스(3D글루코노아미도프로필) 데옥시콜라미드와 같은 유도체. 특정 예는 최종 백신 용량내에 극소량으로 존재할 수 있는 나트륨 데옥시콜레이트(NaDOC)이다.
2. 알킬 사슬이 C6 내지 C18, 전형적으로 C8 내지 C14이고, 당 부분이 임의의 5탄당 또는 6탄당 또는 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2와 같은 상이한 결합을 갖는 이들의 혼합물인 알킬글리코시드 또는 알킬티오글리코시드. 상기 알킬 사슬은 포화될 수 있고 불포화되고/되거나 분지될 수 있다.
3. 에스테르, 에톡실레이트, 설페이트, 에테르, 카보네이트, 설포숙시네이트, 이세티오네이트, 에테르카복실레이트, 4차 암모늄 화합물과 같은, 하나 이상의 하이드록실기, 바람직하게는 6개의 하이드록실기가 개질된 상기 2의 유도체.
4. 알킬 사슬이 C6 내지 C18, 전형적으로 C8 내지 C12이고, 당 부분이 임의의 5탄당 또는 6탄당 또는 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2와 같은 상이한 결합을 갖는 이들의 혼합물인 알킬 당. 상기 알킬 사슬은 포화되거나 불포화되고/되거나 분지되고, 환형 또는 비환형이거나, 1종 이상의 헤테로원자, 예컨대, N, S, P 또는 O를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
5. 구조 R-N,N-(R1R2)-3-아미노-1-프로판설포네이트의 설포베타인으로서, 여기서 R은 C6 내지 C18, 전형적으로 C8 내지 C16의 임의의 알킬 사슬 또는 아릴알킬 사슬이다. 알킬 사슬 R은 포화될 수 있고, 불포화되고/되거나 분지될 수 있다.R1 및 R2는 바람직하게는 C1 내지 C4, 전형적으로는 C1의 알킬 사슬이거나, R1, R2는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다.
6. 구조 R-N,N-(R1,R2)-글리신의 베타인으로서, 여기서 R은 C6 내지 C18, 전형적으로는 C8 내지 C16의 임의의 알킬 사슬이다. 상기 알킬 사슬은 포화될 수 있고, 불포화되고/되거나 분지될 수 있다. R1 및 R2는 바람직하게는 C1 내지 C4, 전형적으로는 C1의 알킬 사슬이거나 R1 및 R2는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다.
7. 구조 R-(N-R1)-글루카미드의 N,N-디알킬-글루카미드로서, 여기서 R은 C6 내지 C18, 전형적으로는 C8 내지 C12의 임의의 알킬사슬이다. 상기 알킬 사슬은 포화될 수 있고 불포화되고/되거나 분지되거나 환형화될 수 있다. R1 및 R2는 C1 내지 C6, 전형적으로는 C1의 알킬 사슬이다. 당 부분은 5탄당 또는 6탄당으로 개질될 수도 있다.
8. 구조 R,-N+(-R1,-R2,-R3)의 4차 암모늄 화합물로서, 여기서 R은 C6 내지 C20, 전형적으로는 C20의 임의의 알킬사슬이다. 상기 알킬 사슬은 포화될 수 있고 불포화되고/되거나 분지될 수 있다. R1, R2 및 R3는 바람직하게는 C1 내지 C4, 전형적으로는 C1의 알킬 사슬이거나, R1, R2는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다. 특정 예는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)이다.
분할 백신을 위한 제조 방법은 다양한 조합으로 초원심분리, 한외여과, 띠 원심분리 및 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환) 단계와 같은 다수의 상이한 여과및/또는 기타 분리 단계, 및 임의로 예컨대, 분할전 또는 분할후에 수행될 수 있는 포름알데히드 또는 β-프로피올락톤 또는 U.V.를 사용하는 불활성화 단계를 포함할 것이다. 분할 과정은 회분, 연속 또는 세미-연속 과정으로서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 나트륨 데옥시콜레이트와 같은 담즙 염은 본 발명에 따른 분할 백신 포뮬레이션내에 바람직하게는 0.05% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.0045%(w/v)의 농도로 극소량 존재한다.
본 발명에 따른 바람직한 분할 플루 백신 항원 제제는 트윈 80 및 트리톤 X-100가 첨가될 수 있거나 이들의 농도가 분할 항원의 제조후에 조정될 수 있지만, 생성 과정으로부터 남아있는 트윈 80 및/또는 트리톤 X-100의 잔량을 포함한다. 바람직하게는 트윈 80 및 트리톤 X-100 둘 모두가 존재한다. 백신 용량중의 이러한 비이온성 계면활성제의 최종 농도에 대해 바람직한 범위는 다음과 같다:
트윈 80: 0.01 내지 1%, 더욱 바람직하게는 약 0.1%(v/v)
트리톤 X-100: 0.001 내지 0.1(% w/v), 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.02%(w/v).
이러한 두 가지 계면활성제의 혼합물이 저농도로 존재하는 것이 용액내의 항원의 안정성을 촉진시킴이 밝혀졌다. 이렇게 향상된 안정성은 항원을 이전의 포뮬레이션 보다 코에 더욱 면역원성인 것으로 만들 수 있다. 이러한 향상은 작은 하원 응집체의 우세 또는 항원의 네이티브 형태의 향상으로부터 일어날 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 정확한 이론적 설명에 의존하지 않음이 이해될 것이다.
또한 분할 인플루엔자 바이러스 제제의 경우에, 바이러스 단백질과 결합되거나 바이러스 단백질, 특히 HA를 함유하는 전체 인플루엔자 바이러스의 단편의 존재는 항원의 제시를 보존시킬 수 있으며 강력한 면역 반응을 유도시키는데 기여할 수 있다. 따라서, 분할 인플루엔자 바이러스는 본 발명의 다양한 일면에 사용하기 위해 선택된 항원이다.
특정 구체예에서, 바람직한 분할 바이러스 제제는 또한 바람직하게는 0.1 내지 20%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%(w/v)의 로레스 9를 함유한다.
본 발명에 따른 백신은 일반적으로 불과 25%(w/v), 바람직하게는 15% 미만, 가장 바람직하게는 불과 약 2%의 세제 또는 계면활성제를 함유한다.
본 발명은 또 다른 일면에서 코에 적용하기 위한 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법에는 하기 단계가 포함된다:
(i) 본질적으로 통상적인 주사용(예컨대, 근내) 인플루엔자 백신의 경우에서와 같이 생산되고 1종 이상의 빙이온성 계면활성제를 포함하는 분할 인플루엔자 바이러스 제제를 제공하고;
(ii) 제제내의 혈구응집소의 농도 및/또는 비이온성 계면활성제의 농도를 임의로 조정하고;
(iii) 비내 전달 장치를, 임의로 2-용량 포맷으로 비내 투여하기에 적합한 부피인 분할 인플루엔자 바이러스 제제로부터의 백신 용량으로 충전시키는 단계.
본 발명의 본 일면에 따른 방법에서 추가적인 선택적 단계에는 로레스 9와 같은 흡수-향상 계면활성제의 첨가, 및/또는 비독성 지질 A 유도체, 특히 3D-MPL과같은 애쥬번트의 첨가가 포함된다.
통상적인 주사용의 불활성화된 플루 백신을 생성시키는 방법은 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다. 이러한 방법은 비내 백신이 장점적으로 주사용 백신 보다 작은 부피의 백신 포뮬레이션을 사용하기 때문에, 예컨대 백신의 최종 멸균 여과 이전에 농축 단계를 포함시킴으로써 본 발명에 사용하기 위한 1회-용량 점막 백신을 생성하도록 변경될 수 있다. 또는 상기 방법은 다른 성분, 예컨대, 비이온성 계면활성제의 농도를 본 발명에 따른 비내 백신을 위해 적합한 %(w/v)로 조정하기 위한 단계를 포함시킴으로써 변경될 수 있다. 그러나, 백신의 활성 성분, 즉, 인플루엔자 항원은 본질적으로 통상적인 근내 백신 및 본 발명에 따른 1회-용량 비내 백신과 동일하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 포뮬레이션은 1회-용량 백신으로서 투여되는 경우, 모든 균주에 대해 EU 기준 중 2가지 이상을 충족시키지 못하는 포뮬레이션을 포함하지 않는다.
본 발명은 제한되지 않는 하기의 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
실시예 1 - 분할 인플루엔자 백신의 제조
1가 분할 백신을 하기 방법에 따라 제조하였다.
바이러스 접종물의 제조
수정란의 접종 당일에 신선한 접종물을 젠타마이신 설페이트 0.5 mg/ml 및 하이드로코르티손 25 ㎍/ml(바이러스 균주에 의존적임)을 함유하는 인산염 완충 염수와 작업 시드 로트를 혼합시킴으로써 제조하였다. 상기 바이러스 접종물을 2 내지 8℃에 보관하였다.
수정란의 접종
9일 내지 11일 지난 수정란을 바이러스 복제를 위해 사용하였다. 껍질을 제거하였다. 상기 알(egg)에 바이러스 접종물 0.2 ml를 접종하였다. 접종된 알을 48 내지 96시간 동안 적절한 온도(바이러스 균주에 의존적임)에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 배(胚)를 냉각에 의해 죽이고 알을 2 내지 8℃에서 12 내지 60시간 동안 보관하였다.
수집
냉장된 수정란으로부터의 요막액을 수집하였다. 알 당 보통 8 내지 10 ml의 미정제 요막액을 수집하였다. 미정제 1가 바이러스 벌크에 0.100 mg/ml 티오메르살을 임의로 첨가하였다.
요막액으로부터 전체 바이러스의 농축 및 정제
1. 정화
수집된 요막액을 적절한 속도의 원심분리(범위: 4000 내지 14000 g)에 의해 정화하였다.
2. 흡착 단계
정화된 바이러스 푸울에서 CaHPO4겔을 수득하기 위해, 0.5 mol/L Na2HPO4및 0.5 mol/L CaCl2용액을 첨가하여 바이러스 균주에 따라 1.5 g 내지 3.5 g CaHPO4/ℓ의 최종 농도에 도달하도록 하였다.
마지막 8시간 동안 침전시킨 후에, 상층액을 제거하고 인플루엔자 바이러스를 함유하는 침전물을 사용된 CaHPO4의 양에 따라, 0.26 mol/L EDTA-Na2용액을 첨가함으로써 재용해화시켰다.
3. 여과
재현탁된 침전물을 6㎛ 필터 멤브레인상에서 여과시켰다.
4. 수크로오스 구배 원심분리
인플루엔자 바이러스를 100 ㎍/ml 티오메르살을 함유하는 선형 수크로오스 구배(0.55%(w/v))에서 등밀도 원심분리에 의해 농축하였다. 유속은 1시간 당 8 내지 15ℓ였다.
원심분리후에, 로터의 내용물을 4개의 상이한 분획에 의해 회수하였다(수크로오스를 굴절계에서 측정하였다):
- 분획 1 55 내지 52% 수크로오스
- 분획 2 약 52 내지 38% 수크로오스
- 분획 3 38 내지 20% 수크로오스*
- 분획 4 20 내지 0% 수크로오스
*바이러스 균주에 따라 의존적: 분획 3은 15% 수크로오스로 감소될 수 있다.
추가적인 백신 제조를 위해, 분획 2 및 3만을 사용하였다.
수크로오스 함량을 약 6% 이하로 감소시키기 위해 포스페이트 완충액을 사용하여 투석여과시킴으로써 분획 3을 세척하였다. 상기 희석된 분획내에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 펠렛화하여 가용성 오염물을 제거하였다.
상기 펠렛을 재현탁시키고 완전히 혼합하여 균질 현탁물을 수득하였다. 분획 2 및 분획3의 현탁된 펠렛을 푸울링시키고 포스페이트 완충액을 첨가하여 약 40ℓ 부피를 수득하였다. 상기 생성물은 1가 전체 바이러스 농축물이다.
5. 나트륨 데옥시콜레이트를 사용한 수크로오스 구배 원심분리
1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 ENI-Mark II 초원심분리에 적용하였다. K3 로터는 나트륨 데옥시콜레이트 구배가 추가적으로 씌워진 선형 수크로오스 구배(0.55%(w/v))를 함유한다. 트윈 80은 0.1%(w/v) 이하로 분할 동안 존재한다. 나트륨 데옥시콜레이트의 최대 농도는 0.7 내지 1.5%(w/v)이며 이것은 균주 의존적이다. 유속은 시간 당 8 내지 15ℓ였다.
원심분리후에, 로터의 내용물을 3개의 상이한 분획에 의해 회수하였다(수크로오스를 굴절계에서 측정하였다). 분획 2를 추가 과정을 위해 사용하였다. 분획 한도에 대한 수크로오스 함량(47% 내지 18%)은 균주에 따라 다양하였고 평가후에는 고정되었다:
6. 멸균 여과
분할 바이러스 분획을 0.2 ㎛ 필터 멤브레인상에서 여과하였다. 0.025%(w/v) 트윈 80을 함유하는 포스페이트 완충액을 희석을 위해 사용하였다. 여과된 분획 2의 최종 부피는 본래의 분획 부피의 5배였다.
7. 불활성화
여과된 1가 물질을 22 ±2℃에서 거의 84시간(바이러스 균주에 의존적이며, 인큐베이션은 짧아질 수 있다) 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 0.025% 트윈 80을 함유하는 포스페이트 완충액을 첨가하여 전체 단백질 함량을 최대 250㎍/ml로 감소시켰다. 포름알데히드를 최종 농도 50㎍/ml로 첨가하였고 불활성화는 적어도 72시간 동안 20℃±2℃에서 일어났다.
8. 한외여과
불활성화된 분할 바이러스 물질을 20 kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인에 장착된 한외여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 상기 물질을 후속적으로 0.025%(w/v) 트윈 80을 함유하는 포스페이트 완충액에 이어서 0.01%(w/v) 트윈을 함유하는 인산염 완충 염수로 세척하였다.
9. 최종 멸균 여과
한외여과후에 물질을 끝이 0.2 ㎛ 멤브레인인 필터 멤브레인상에서 여과하였다. SRD에 의해 측정된 혈구응집소의 최종 농도는 450 ㎍/ml를 초과해야 한다.
10. 보관
1가 최종 벌크를 최대 18개월 동안 2 내지 8℃에 보관하였다.
순도
순도를 쿠마쉬-염색된 폴리아크릴아미드 겔의 O.D. 스캐닝에 의해 측정하였다. 피크를 수동으로 측정하였다. 샘플 결과를 표 1에 기재하였다:
표 1
바이러스 단백질(HA, NP, M) % 기타 바이러스 및 숙주 세포 유래된 단백질 %
H3N2 HA 이량체 HA1 + 2 NP M
A/Syd/5/97A/Nan933/95 10.348.17 22.3415.8 25.1640.09 37.3330.62 4.835.32
B
B/Har/7/94B/Yam/166/98 5.7120.68 24.0727.62 15.6421.48 5046.02 4.584.2
H1N1
A/Tex/36/91A/Bei/262/95 33.4232.73 24.4635.72 34.3327.06 7.794.49
H2N2
A/sing/1/57 2.8 39.7 21.78 32.12 3.6
1= 100%에서 동일하지 않은 피크 전부를 뺀 값
실시예 2 - 벌크 백신으로부터 백신 용량의 제조
최종 백신을 필요한 만큼 조정된 세제 농도로 1가 벌크로부터 3가 백신을 포뮬레이션화함으로써 제조하였다.
주사용 물, 10x 농축된 PBS pH 7.4, 트윈 80 및 트리톤 X-100을 혼합하여 필요한 최종 농도(1x 농축된 PBS, 트윈 80 0.15% 및 트리톤 X-100 0.02%)를 수득하였다. 하기의 3가지 불활성화된 분할 비리온을 중간에 10분 교반시키면서 첨가하였다:
30㎍ HA A/베이징/262/95 (H1N1)
30㎍ HA A/시드니/5/97 (H3N2)
30㎍ HA B/하얼빈/7/94
15분 교반시킨 후에 pH를 7.2+/-0.2로 조정하였다.
용량 부피는 200㎕였다.
로레스 9와 함께 포뮬레이션된 백신에서, 로레스 9를 pH 조정에 앞서 첨가하여 0.5%(w/v)의 최종 농도를 수득하였다.
실시예 3 - 항체 반응을 측정하는 방법
1. ELISA에 의한 사람 코 분비물에서 특이적인 안티-플루 및 전체 IgA의 검출
사람 코 분비물을 수집하는 방법
2개의 심지를 지원자의 비개골 아래(각각의 콧구멍에 하나)에 대해 적용하였다. 심지를 1분 동안 코안에 놓은 다음 NaCl 0.9%, BSA 1% 및 나트륨 아지드 0.1%(보존 완충액) 2 ml에 위치시켰다. 모든 샘플을 2시간 동안 얼음위에 놓았다. 그런 다음 심지를 압착하여 항체를 회수하였다. 원심분리(10', 2000g, 4℃) 이후 모든 샘플의 유체를 수집하고, 분취하고 시험일까지 -20℃에 냉동시켰다. 펠렛을 생리학적 식염수 400㎕중에 현탁시키고 적혈구 오염에 대해 현미경으로 관찰하였다. 코 심지를 사용한 수집 및 사람 코 분비물의 처리 후에, 전체 및 특정 안티-FLU IgA의 검출을 2가지 상이한 ELISA를 사용하여 수행하였다.
전체 IgA를 검출하기 위한 캡쳐 ELISA
전체 IgA를 마이크로역가 플레이트상에 고정된 항사람 IgA 폴리클로날 친화도 정제된 Ig를 사용하여 캡쳐하고 이어서 페록시다제와 커플링된 상이한 폴리클로날 항사람 IgA 친화도 정제된 Ig를 사용하여 검출하였다.
정제된 사람 sIgA를 표준물질로서 사용하여 수집된 코 분비물에서 sIgA의 정량이 가능하도록 하였다.
정제된 사람 sIgA의 3개의 참조물질을 본 검정에서 낮은 참조물질, 중간 참조물질 및 높은 참조물질로서 사용하였다.
특이적인 안티-FLU IgA를 검출하기 위한 직접 ELISA
3가지 상이한 ELISA를 백신 포뮬레이션에 존재하는 각각의 FLU 균주에 대해 1회 수행하였다.
특이적인 안티-FLU IgA를 마이크로역가 플레이트상에 코팅된 분할 불활성화된 FLU 항원을 사용하여 캡쳐하고 이어서 페록시다제와 커플링된 전체 IgA ELISA를 위해 사용되는 것과 동일한 상이한 폴리클로날 항사람 IgA 친화도 정제된 Ig를 사용하여 검출하였다.
반응물
생물학적 반응물
- 염소 항사람 IgA 친화도 정제된 Ig.(Sigma I-0884)
- 정제된 사람 분비된 IgA(ICN-Cappel 55905)(전체 IgA 정량을 위한 표준물질)
- 사람 분비된 IgA(초유)(Biogenesis 5111-5504)(전체 IgA에 대한 참조 Bio), 낮은 참조물질, 중간 참조물질 및 높은 참조물질을 수득하기 위해 희석됨
- 정제된 사람 IgA(Sigma I-1010)(전체 IgA에 대한 참조 Sig)
- 특이적인 안티-FLU ELISA에 대한 네가티브 참조물질(3가지 균주에 대해 검출할 수 없는 반응물질과 코 분비물질의 푸울; 컷-오프= 0.6 OD450nm)
- 특이적인 안티-FLU ELISA에 대한 포지티브 낮은 참조물질(3가지 균주에 대해 낮게 검출되는 반응물질과 코 분비물질의 푸울)
- 특이적인 안티-FLU ELISA에 대한 포지티브 중간 참조물질(3가지 균주에 대해 중간으로 검출되는 반응물질과 코 분비물질의 푸울; 컷-오프= 0.6 OD)
- 컨쥬게이션된 염소 항사람 IgA 혈청 친화도 정제된 HRP(ICN 674221)
- 분할 불활성화된 알 유래된 항원 A/베이징/262/95 H1N1
- 분할 불활성화된 알 유래된 항원 A/시드니/5/97 H3N2
- 분할 불활성화된 알 유래된 항원 B/하얼빈/7/94
시약 제조
- 포화 완충액(PBS, 트윈 20 0.1%, BSA 1%, NCS 4%)
- NaCl T20(NaCl 9g/l, 트윈 20 0.05%)
방법
전체 사람 IgA 검출
- DPBS중의 1 ㎍/ml로 염소 폴리클로날 항사람 IgA를 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
- 포화 완충액을 웰 당 200 ㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
- 제 1가로열에, 250 ng/ml 에서 시작하여 0.12 ng/ml까지 낮아지는 포화 완충액중에 표준 IgA의 2배 희석물을 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다.
- 그 밖의 가로열에, 1/100 에서 시작하여 1/102400까지 낮아지는 포화 완충액중에 샘플(코 유체)의 2배 희석물을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고, 세로행 12에 포화완충액 100 ㎕를 첨가하고 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
- 플레이트를 NaCl T20으로 4회 세척하였다.
- 포화 완충액중에 1/10000으로 희석된 염소 페록시다제-컨쥬케이션된 항사람 IgA를 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 22℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션시켰다.
- 플레이트를 NaCl T20으로 4회 세척하였다.
- TMB(테트라메틸벤지딘)을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 암조건하에 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
- H2SO40.4N을 웰 당 100㎕ 첨가함으로써 반응을 중단시켰다.
- 630 nm에서의 참조를 사용하여 450 nm에서 스펙트로포토미터를 사용하여 각각의 플레이트의 흡수치(OD)를 측정하였다.
특이적인 안티-FLU IgA 검출
- DPBS중에 1 ㎍/ml로 FLU 바이러스 각 균주를 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
- 포화 완충액을 웰 당 200 ㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
- 1/5에서부터 시작하여 1/640까지 낮아지는 포화 완충액중의 샘플의 2배 희석물을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 22℃에서 2시간 동안 플레이트를 배양시켰다.
- 플레이트를 NaCl T20으로 4회 세척하였다.
- 포화 완충액중에 1/10000으로 희석된 염소 페록시다제-컨쥬게이션된 항사람 IgA를 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 22℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션시켰다.
- 플레이트를 NaCl T20으로 4회 세척하였다.
- TMB(테트라메틸벤지딘)을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 암조건하에 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
- H2SO40.4N을 웰 당 100 ㎕ 첨가함으로써 반응을 중단시켰다.
- 630 nm에서의 참조를 사용하여 450 nm에서 스펙트로포토미터를 사용하여 각각의 플레이트의 흡수치(OD)를 측정하였다.
결과 - 표시 및 계산
전체 IgA 표시
결과를 소프트맥스프로 프로그램을 사용하여, 코 유체 1 ml중의 전체 IgA의 ㎍으로서 표시하였다.
특이적인 안티-Flu IgA 표시
결과를 종말점 유닛 역가로서 표시하였는데, 이를 OD450nm상기 컷 오프(OD450nm= 0.6)를 제공하는 마지막 희석의 역으로서 계산하였다.
컷 오프 값은 1/5의 희석에서 네가티브 참조(유효 프로토콜 참조)의 최고의 광학 밀도로서 정의된다. 따라서 상기 컷 오프에서 종말점 유닛 역가에 상응하는 검출의 한계는 5 종말점 유닛인 것으로서 계산될 수 있다. 5 종말점 유닛과 같거나 작은 역가를 갖는 샘플은 네가티브로서 생각될 것이고 5 종말점 유닛 보다 큰 역가를 갖는 샘플은 포지티브로서 생각될 것이다.
샘플의 최종 결과를 다음과 같이 표시하였다:
특정 반응 및 전체 IgA 농도 사이의 비의 계산에 의한 특정 반응의 표준화: 종말점 유닛/㎍ 전체 IgA(문헌에서 가장 보편적으로 사용되는 계산 방법).
2. Flu-특이적 혈청 Ab의 혈구응집소 억제(HAI) 활성
혈청(50 ㎕)을 37℃에서 16시간 동안 200 ㎕ RDE(수용체 파괴 효소)로 처리하였다. 상기 반응을 150 ㎕ 2.5% Na 시트레이트로 중단시키고 혈청을 56℃에서 30분 동안 불활성화시켰다. 100 ㎕ PBS를 첨가함으로써 희석물 1:10을 제조하였다. 그런 다음, 25 ㎕ PBS로 25 ㎕ 혈청을 희석(1:10)함으로써 96 웰 플레이트(V 모양의 바닥)에 2배 연속 희석물을 제조하였다. 참조 항원 25 ㎕를 25 ㎕ 당 4 혈구응집소 유닛의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 항원 및 항혈청 희석물을 마이크로역가 플레이트 쉐이커를 사용하여 혼합하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 50 ㎕ 닭 적혈구(RBC)(0.5%)를 첨가하고 RBC를 실온에서 1시간 동안 침전되도록 하였다. HAI 역가는 바이러스-유도된 혈구응집을 완전히 억제시키는 마지막 혈청 희석물의 역에 상응하였다.
실시예 4 - 건강한 성인 피검자에서 허가된 통상적인 비경구 백신(Fluarix TM )의 면역원성과 비내 분할 인플루엔자 백신의 면역원성과의 비교
연구에 사용된 포뮬레이션
알-유래된 분할 인플루엔자 항원의 2가지 포뮬레이션(A,B)를 평가하였다. A는 비내 포뮬레이션이고 B는 근내적으로 제공된 FluarixTM/α-Rix?이다. 상기 포뮬레이션은 1998/1999 시즌의 WHO 추천 균주로부터 제조된 3가지 불활성화된 분할 비리온 항원을 함유한다.
백신의 투여를 위해 사용된 장치는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터의 AccusprayTM비내 시린지였다. 상기 장치는 통상적인 시린지와 유사한 원리로 작동하지만, 플런저상에 압력이 발생할 경우에도 스프레이를 생성하는 나선모양의 채널을 포함하는 특별한 팁을 갖고 있다. 상기 장치를 백신 포뮬레이션 200 ㎕로 충전시키고, A 포뮬레이션 100 ㎕를 각각의 콧구멍에 스프레이하였다.
포뮬레이션의 조성
비내 포뮬레이션 (A)는 하기 불활성화된 분할 비리온 및 인산염 완충 염수 pH 7.4±0.1, 트윈 80 0.1%, 트리톤 X-100 0.015%, Na 데옥시콜레이트 0.0045% 및 35 ㎍/ml 미만의 티오메르살을 함유하였다:
1. 30㎍ HA A/베이징/262/95 (H1N1)
2. 30㎍ HA A/시드니/5/97 (H3N2)
3. 30㎍ HA B/하얼빈/7/94.
1회 용량의 부피는 200㎕였다(각각의 콧구멍에 대해 100㎕ 서브-용량).
비교물질 FluarixTM/α-Rix?은 스미스클라인 비이참 바이오로지칼스의 상용 불활성화된 3가 분할 인플루엔자 백신이다. 500㎕의 용량을 근내적으로 투여하였다.
이러한 용량은 다음을 포함한다:
상기 언급한 3가지 균주의 15㎍ HA, 트윈 80 ml당 500 내지 1000㎍(0.05% 내지 0.1%), 트리톤 X-100 50 내지 170㎍/ml(0.005% 내지 0.017%), 나트륨 데옥시콜레이트 최대 100㎍/ml, 티오메르살 100㎍/ml 및 인산염 완충 염수 pH 6.8 내지 7.5.
면역원성 연구
개방적이고 제어되고 무작위적인 연구를 통해 통상적인 비경구 백신(즉, FluarixTM)와 비교하여 트윈 80 및 트리톤 X-100과 함께 포뮬레이션된 비내 분할 인플루엔자 백신의 면역원성을 평가하였다. 20명의 건강한 성인 피검자(연령 18세 내지 40세)에게 1회 용량의 FluarixTM을 투여하고 10명의 피검자에게는 1회 용량의 비내 인플루엔자 백신을 투여하였다. 비내 포뮬레이션(200㎕)은 다음의 불활성화된 비리온을 함유하고 있었다: 인산염 완충 염수(pH 7.4±0.1), 트윈 80(0.1%), 트리톤 X-100(0.015%), 나트륨 데옥시콜레이트(0.0045%) 및 티오메르살(<35㎍/ml)과 함께 혈구응집소 A/베이징/262/95 (H1N1) 30㎍, 혈구응집소 A/시드니/5/97 (H32N) 30㎍, 혈구응집소 B/하얼빈/7/94 30㎍.
8일 후에 얻어진 국부적이고 일반적인 증후가 있었고 양 백신 모두 안전성 및 리엑토제네시티(reactogenecity)에 대해 우수한 내성이 있었다. 백신접종에 대한 어떠한 심각한 부작용도 보고되지 않았다.
상기 백신의 면역원성을 혈청 혈구응집소 억제(HI) 역가를 평가함으로써 혈청변환율(각각의 백신 균주에 대해 0일째와 비교하여 21일째에 혈청 HI 역가의 적어도 4배 증가를 갖는 백신접종자의 퍼센트로서 정의됨), 변환 인자(각각의 백신 균주에 대해 0일째와 비교하여 21일째에 혈청 HI 기하학적 평균 역가(GMT)의 배수 증가로서 정의됨) 및 혈청보호율(지시 보호로서 여겨지는 (각각의 백신 균주에 대해) 백신접종 후에 40 이하의 혈청 HI 역가를 갖는 백신접종자의 퍼센트로서 정의됨)을 측정하였다. 추가적으로, 점막 IgA 항체 반응을 효소결합면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하였다.
1회 용량의 FluarixTM또는 비내 포뮬레이션 투여후 21일째의 HI 혈청양성, 혈청변환율 및 혈청보호율을 표 2에 기재하였다. 변환 인자는 표 2a에 기재하였다.
표 2:
제 1 투여후 21일째의 HI 혈청양성, 혈청변환율 및 혈청보호율
균주 군 시기 N 혈청양성n % 혈청보호n % 혈청변환n %
A/베이징 비내 백신 +트윈 80 및 트리톤 X100 0일째21일째 2020 4 20.017 85.0 0 0.015 75.0 15 75.0
FluarixTM 0일째21일째 1919 4 21.119 100.0 3 15.818 94.7 19 100.0
A/시드니 비내 백신 +트윈 80 및 트리톤 X100 0일째21일째 2020 13 65.020 100.0 3 15.019 95.0 15 75.0
FluarixTM 0일째21일째 1919 14 73.719 100.0 1 5.318 94.7 16 84.2
B/하얼빈 비내 백신 +트윈 80 및 트리톤 X100 0일째21일째 2020 10 50.020 100.0 7 35.018 90.0 14 70.0
FluarixTM 0일째21일째 1919 17 89.519 100.0 11 57.919 100.0 15 78.9
혈청양성(n,%): 역가가 10이상인 피검자의 수 및 퍼센트
혈청보호(n,%): 역가가 40이상인 피검자의 수 및 퍼센트
혈청변환(n,%): 0일째부터 21일째까지 역가가 적어도 4배 증가한 피검자의수 및 퍼센트
모든 경우에 있어서, 변환 인자(백신접종후 혈청 HI GMT에서의 배수 증가)는 성공적인 인플루엔자 백신을 위해 요구되는 레벨인 2.5를 초과하였다.
21일째 내지 0일째 사이(1회 용량)에 특정/전체 점막 IgA 항체 비의 2배 또는 4배 증가를 갖는 피검자의 퍼센트를 표 3에 기재하였다.
표 3:
21일째 내지 0일째 사이(1회 용량)에 특정/전체 IgA 비의 2배 또는 4배 증가를 갖는 피검자의 퍼센트.
균주 군 N 2배 증가 (%) 4배 증가 (%)
A/베이징 트윈 및 트리톤FluarixTM 2019 55.052.6 30.026.3
A/시드니 트윈 및 트리톤FluarixTM 2019 65.047.4 45.05.3
B/하얼빈 트윈 및 트리톤FluarixTM 2019 40.026.3 30.05.3
요약
상기 표로 기재된 면역원성은 비내 포뮬레이션이 1회 투여한지 21일째에 통상적인 비경구 백신(FluarixTM)에 의해 생성된 것과 유사한 레벨의 혈청양성, 혈청변환 및 혈청보호를 일으킴을 보여준다. 비내 포뮬레이션은 통상적인 비경구 백신(FluarixTM) 보다 1회 투여후 더 우수한 점막 IgA 반응을 일으켰다.
실시예 5 - 건강한 성인 피검자에서 허가된 통상적인 비경구 백신(Fluarix TM )의 면역원성과 로레스 9, 트리톤 X-100 및 트윈 80과 함께 포뮬레이션된 비내 분할 인플루엔자 백신의 면역원성의 비교.
로레스 9, 트리톤 X-100 및 트윈 80와 함께 포뮬레이션된, 알-유래된 분할 인플루엔자 항원의 비내 포뮬레이션 (A)를 평가하고 FluarixTM/α-Rix?(B)와 비교하였다. 상기 포뮬레이션은 1998/1999 시즌의 WHO 추천된 균주로부터 제조된 3가지의 불활성화된 분할 비리온 항원을 함유하였다. 백신의 투여를 위해 사용된 장치는 벡톤 디킨슨으로부터의 AccusprayTM비내 시린지였다. 상기 장치는 통상적인 시린지와 유사한 원리로 작동하지만, 나선모양의 채널을 함유한 특별한 팁을 가지고 있어서 압력이 플런저상에 발생하는 경우에도 스프레이를 생성시킨다. 포뮬레이션 100㎕를 각각의 콧구멍에 스프레이하였다.
포뮬레이션의 조성
비내 포뮬레이션 (A)는 하기 불활성화된 분할 비리온 및 인산염 완충 염수 pH 7.4±0.1, 트윈 80 0.1%, 트리톤 X-100 0.015%, 나트륨 데옥시콜레이트 0.0045% 및 35㎍/ml 이하의 티오메르살을 함유하였다:
1. 30㎍ HA A/베이징/262/95 (H1N1)
2. 30㎍ HA A/시드니/5/97 (H3N2)
3. B/하얼빈/7/94의 30㎍ HA.
1회 용량의 부피는 200㎕였다(각각의 콧구멍에 대해 100㎕ 서브-용량). 포뮬레이션 A를 로레스 9와 함께 포션레이션시켜 0.5%(w/v)의 최종 농도를 수득하였다.
비교물질 FluarixTM/α-Rix?(B)은 스미스클라인비이참 바이오로지칼스의 상용 불활성화된 3가 분할 인플루엔자 백신이고, 이를 500㎕의 용량으로 근내적으로 투여하였다.
면역원성 연구
개방적이고 제어되고 무작위적인 연구를 통해 통상적인 비경구 백신(즉, FluarixTM)와 비교하여 트윈 80 및 트리톤 X-100가 보충된 로레스 9와 함께 포뮬레이션된 비내 분할 인플루엔자 백신의 면역원성을 평가하였다. 20명의 건강한 성인 피검자(연령 18세 내지 40세)에게 1회 용량의 FluarixTM을 투여하고 10명의 피검자에게는 1회 용량(2개의 서브-용량, 콧구멍 당 1개)의 비내 인플루엔자 백신을 투여하였다.
8일 후에 일어난 국부적이고 일반적인 증후가 있었고 양 백신 모두는 안전성 및 리엑토제니시티(reactogenicity)에 관하여 우수한 내성이 있었다. 백신접종에 대해 어떠한 심각한 부작용도 보고되지 않았다.
백신의 면역원성을 혈청 혈구응집 억제(HI) 역가를 평가함으로써 검사하여 혈청변환율(각각의 백신 균주에 대해 0일째와 비교하여 21일째에 혈청 HI 역가가 적어도 4배 증가된 백신접종자의 퍼센트로서 정의됨), 변환 인자(각각의 백신 균주에 대해 0일째와 비교하여 21일째에 혈청 HI 기하학적 평균 역가(GMT)의 배수 증가로서 정의됨) 및 혈청보호율(지시 보호로서 여겨지는 (각각의 백신 균주에 대해) 백신접종후에 40 이상의 혈청 HI 역가를 갖는 백신접종자의 퍼센트로서 정의됨)을측정하였다. 추가적으로, 점막 IgA 항체 반응을 효소결합면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하였다.
FluarixTM또는 비내 포뮬레이션을 1회 투여한지 21일째에 HI 혈청양성, 혈청변환율 및 혈청보호율을 표 4에 기재하였다.
표 4: 1회 투여한지 21일째에 HI 혈청양성, 혈청변환율 및 혈청보호율:
균주 군 시기 N 혈청양성n % 혈청보호n % 혈청변환n %
A/베이징 비내 백신 + 로레스 9 0일21일 2020 5 25.019 95.0 1 5.010 50.0 15 75.0
FluarixTM 0일21일 1919 4 21.119 100.0 3 15.818 94.7 19 100.0
A/시드니 비내 백신 + 로레스 9 0일21일 2020 16 80.020 100.0 4 20.019 95.0 15 75.0
FluarixTM 0일21일 1919 14 73.719 100.0 1 5.318 94.7 16 84.2
B/하얼빈 비내 백신 + 로레스 9 0일21일 2020 18 90.020 100.0 11 55.019 95.0 12 60.0
FluarixTM 0일21일 1919 17 89.519 100.0 11 57.919 100.0 15 78.9
혈청양성(n,%): 10이상의 역가를 갖는 피검자의 수 및 퍼센트
혈청보호(n,%): 40이상의 역가를 갖는 피검자의 수 및 퍼센트
혈청변환(n,%): 0일째부터 21일째까지 역가가 적어도 4배 증가한 피검자의 수 및 퍼센트
모든 경우에 있어서, 변환 인자(백신접종후 혈청 HI GMT의 배수 증가)는 성공적인 인플루엔자 백신을 위해 필요한 레벨인 2.5를 초과하였다.
제 21일째 및 제 0일째(1회 용량) 사이의 특정/전체 점막 IgA 항체 비의 2배 또는 4배 증가를 갖는 피검자의 퍼센트를 표 5에 기재하였다.
표 5 : 21일째 및 0일째(1회 용량) 사이의 특정/전체 IgA 비의 2배 또는 4배증가를 갖는 피검자의 퍼센트.
균주 군 N 2배 증가 (%) 4배 증가 (%)
A/베이징 로레스-9FluarixTM 2019 50.052.6 20.026.3
A/시드니 로레스-9FluarixTM 2019 55.047.4 25.05.3
B/하얼빈 로레스-9FluarixTM 2019 15.026.3 10.05.3
요약
상기 표에 기재된 면역원성 결과는 비내 포뮬레이션이 1회 투여한지 21일 후에 통상적인 비경구 백신(FluarixTX)과 유사한 레벨의 혈청양성, 혈청변환 및 혈청보호를 일으킴으로 보여준다. 비내 포뮬레이션은 일반적으로 통상적인 비경구 백신(FluarixTX) 보다 1회 투여후 더 우수한 점막 IgA 반응을 일으켰다.
실시예 6 - 프라이밍된 마우스에서 로레스 9 + 3D-MPL을 포함하는 비내 플루 백신 및 포함하지 않는 비내 플루 배신의 평가.
6.1.제 1 실험에서, 마우스를 이들의 프라이밍을 위해 사용된 것과 동일한 인플루엔자 균주를 함유하는 후보 포뮬레이션으로 백신접종하였다.
실험 방법
암컷 Balb/c 마우스(8주령)를 β-프로피올락톤 불활성화된 알-유래된 3가 전체 인플루엔자 바이러스(A/베이징/262/95, A/시드니/5/97 및 B/하얼빈/7/94; 5 ㎍ HA/균주)를 사용하여 0일째에 비내적으로 "프라이밍"시켜 사람에게서 일어나는 천연 프라이밍을 모방하도록 하였다.
28일 후에, 마우스(군 당 10마리)를 프라이밍을 위해 사용된 것과 동일한 균주를 함유하는 하기 3가 백신 포뮬레이션을 사용하여 비내적으로 백신접종하였다:
군 경로(방법) 3가 분할 항원 추가 반응물
플레인 1 비내적(점적) 3.0 ㎍ HA/균주 없음
플레인 2 비내적(점적) 1.5 ㎍ HA/균주 없음
L9 비내적(점적) 1.5 ㎍ HA/균주 0.5% 로레스-9
L9 + MPL 비내적(점적) 0.75 ㎍ HA/균주 0.5% 로레스-9 + 5 ㎍ MPL
비경구 근내적(주입) 1.5 ㎍ HA/균주 없음
마우스에 투여된 비내 백신 포뮬레이션은 실시예 7에서 사람에게 투여된 것과 유사하되, 마우스에게 투여된 용량은 사람 용량의 10분의 1에 상응한다.
혈청 샘플을 42일째에 수집하고 혈구응집 억제(HI) 항체에 대해 시험하였다. 희생시킨 다음(42일째), 코 세척을 수행하고 ELISA에 의해 IgA 항체 역가에 대해 시험하였다. 특이적인 IgA 항체를 종말점 역가(EPT)로서 측정하고 결과를 샘플링 방법에 기인하는 임의의 차이를 배제시키기 위해 전체 IgA ㎍ 당 특이적인 IgA EPT로서 표시하였다.
결과
본 연구의 제 1 목적은 비내 백신 포뮬레이션이 비경구 투여로부터 생성된 것과 현저하게 상이하지 않은 혈청 HI 역가를 일으킬 수 있음을 확인하는 것이었다. 도 1은 다양한 백신을 사용하여 42일째(즉, 백신접종후 14일째)에 혈청에서 관찰된 HI 역가를 보여준다.
통계학적 분석(터키-HSD 통계학적 비교 분석)을 관찰된 HI 역가에 대해 수행하여 비내 백신과 비경구 백신을 비교하였다. 플레인 1 및 2 군과 함께 관찰된 HI 역가는 3가지 Flu 균주중 2가지(A/H1N1 및 B 균주)에 대한 비경구 백신에 의해 유도된 것과 현저하게 상이하였다(p<0.05). 안티-A/H3N2 균주 역가는 현저하게 상이하지 않았다. L9 포뮬레이션은 3가지 균주중 2가지(A/H3N2 및 B 균주)에 대해 비경구 백신만큼 면역원성이었다. 이와 대조적으로, L9 + MPL 포뮬레이션된 백신은 비경구 백신과 함께 관찰된 것과 현저하게 상이하지 않았던 역가를 갖는 3가지 Flu 균주에 대한 HI 항체를 발생시켰다.
제 2 목적은 비내 백신접종에 대한 코 IgA 반응이 근내적으로 추가접종된 동물에서 관찰된 것 보다 탁월한지 아닌지를 결정하는 것이었다. 도 2에 추가 백신접종(42일째)한지 14일 후에 기록된 코 IgA 반응을 도시하였다.
임의의 비내 포뮬레이션에 의해 유도된 반응들간에 어떤 현저한 차이는 없었다. 비내 투여는 비경구 경로에 비해 2배 내지 4내 높은 반응을 일으켰다. 마지막으로, L9 + MPL과 함께 포뮬레이션된 백신은 기타 비내 백신과 비교하여 동일한 레벨의 반응을 지속시킬 수 있지만 더 낮은 항원 용량을 사용하였다.
결론
L9 + MPL(0.75 ㎍ HA + 0.5% 로레스 9 + 5 ㎍ MPL)과 함께 포뮬레이션된 3가 분할 인플루엔자 항원은 HI 항체 반응 면에서 가장 면역원성인 비내 백신 포뮬레이션이었다.
코로 전달되어 시험된 모든 백신은 비경구적으로 투여된 백신 보다 국부적인 IgA 항체를 포함하는 경우 더욱 강력하였다. L9 + MPL 포뮬레이션은 그 밖의 포뮬레이션과 유사한 반응을 유도시켰지만 감소된 항원 함량을 가졌다.
6.2 제 2 실험에서, 마우스를 프라이밍을 위해 사용된 것과 상이한 균주를 사용하여 비내적으로 면역화시켰다.
항원적 조류는 매년 유행병 발생을 담당한다. Flu 백신에 매년 포함되는 균주는 가장 일반적으로 발견되는 균주이지만; 다소 관련된 기타 균주 또한 당분야에서 발견될 수 있다. 결과적으로, 가장 우수한 후보 Flu 백신은 광범위한 균주에 대해 효과적인 보호를 유도시켜야 할 것이다. 그러므로, 백신내에 함유된 것과 이종인 균주를 사용한 "프라이밍" 후에 면역 반응을 일으킬 수 있는 광범한 소정의 비내 포뮬레이션을 조사하고자 하였다.
실험 방법
암컷 Bal/c 마우스(8주령)를 β-프로피올락톤 불활성화된 알-유래된 3가 전체 인플루엔자 바이러스(A/요하네스버그/82/96 H1N1, A/요하네스버그/33/94 H3N2 및 B/파나마/45/90; 5 ㎍ HA/균주)를 사용하여 0일째에 비내적으로 "프라이밍"시켜 사람에게서 일어나는 천연 프라이밍을 모방하도록 하였다.
28일 후에, 마우스(군 당 10마리)를 하기 3가 백신 포뮬레이션(이종 균주로서 A/베이징/262/95 H1N1, A/시드니/5/97 H3N2 및 B/하얼빈/7/94를 함유)을 사용하여 비내적으로 백신접종하였다.
군 경로 (방법) 3가 분할 항원 추가 반응물
플레인 1 비내적 (점적) 3.0 ㎍ HA/균주 없음
플레인 2 비내적 (점적) 1.5 ㎍ HA/균주 없음
L9 비내적 (점적) 1.5 ㎍ HA/균주 0.5% 로레스-9
L9 + MPL 비내적 (점적) 0.75 ㎍ HA/균주 0.5% 로레스-9 + 5 ㎍ MPL
비경구 근내적 (주입) 1.5 ㎍ HA/균주 없음
마우스에서 시험될 다양한 비내 백신 포뮬레이션에 함유된 3가 분할 비리온의 양은 실시예 7에서 사람 지원자에게 투여되는 용량의 10분의 1에 상응하였다.
혈청 샘플을 42일째에 수집하고 혈구응집 억제(HI) 항체에 대해 시험하였다.희생시킨 후에(42일째), 코 세척을 수행하고 ELISA에 의해 IgA 항체 역가에 대해 시험하였다. 특이적인 IgA 항체를 종말점 역가(EPT)로서 측정하고 그 결과를 샘플링 방법에 기인하는 임의의 차이를 배제시키기 위해 전체 IgA의 ㎍ 당 특이적인 IgA EPT로서 표시하였다.
결과
본 연구의 제 1 목적은 이종서브타입 균주가 프라이밍을 위해 사용되는 경우 비내 백신 포뮬레이션이 백신 항원에 대해 혈청 HI 반응을 일으킬 수 있는지를 결정하는 것이었다. 도 3은 다양한 백신 포뮬레이션을 사용하여 백신접종(42일째)한지 14일 후에 혈청에서 관찰된 HI 역가를 보여준다.
L9 또는 L9 + MPL을 함유하는 모든 비내 포뮬레이션은 3가지 인플루엔자 균주에 대해 면역 반응을 유도시킬 수 있었으며, 이는 플레인 백신의 비경구 투여에 의해 일어난 것과 유사하였다. 통계학적 분석(터키-HSD 통계학적 비교 검정)을 통해 모든 비내 포뮬레이션에 의해 일어난 반응이 비경구 투여 반응과 현저하게(p>0.05) 상이하지 않음을 확인하였다. 비내 포뮬레이션내에서, 어떠한 통계학적 차이도 관찰되지 않았다. L9 + MPL 및 L9 포뮬레이션은 일반적으로 더욱 면역원성이며, 전자는 후자 항원 함량의 절반을 함유한다(0.75 ㎍ 대 1.5 ㎍ HA).
제 2 목적은 (1)이종 균주에 대한 코의 특이적인 IgA 반응이 비내 백신접종후에 측정가능한지 및 (2)상기 반응이 근내적으로 백신접종된 동물에서 관찰된 것 보다 탁월한지를 결정하는 것이다. 도 4는 백신접종(42일째)한지 14일 후에 기록된 코의 특이적인 안티-이종 IgA 반응을 도시한 것이다.
제 2 목적의 기준은 모두 충족되었다. 모든 비내 포뮬레이션은 플레인 백신이 근내적으로 주입되는 경우 관찰된 것 보다 3배 내지 8배 높은 3가지 이종 균주에 대해 IgA 반응을 유도시켰다. IgA 반응의 크기는 비내 포뮬레이션내에서 현저하게 상이하지 않았다.
이종 백신접종에 의해 관찰된 반응의 크기는 동종 백신접종에 대한 것과 동일한 범위에 도달하였다(도 2 참조). 여기서, L9 + MPL 포뮬레이션된 백신은 플레인 또는 L9 포뮬레이션(3 및 1.5 ㎍ HA)과 비교하여 낮은 용량의 항원(0.75 ㎍ HA)에 의한 반응의 동일한 크기를 지속시킬 수 있었다.
결론
흡수-향상된 계면활성제의 존재 또는 부재, 또는 애쥬번트의 첨가 또는 비첨가하에, 3가 분할 인플루엔자 백신의 비내 투여는 혈청 HI 항체 및 Flu 백신 균주에 대해 특이적인 비내 IgA의 면에서 이종-서브타입 반응을 유도시킬 수 있었다.
군들 사이의 차이가 통계학적으로 현저하지 않음에도 불구하고, 3가 분할 비리온이 L9 또는 L9 + MPL과 함께 포뮬레이션된 백신은 일반적으로 국부적인 면역 반응 뿐만 아니라 더욱 강력한 전신 반응을 유도하였다. 추가적으로, L9 함유 백신과 비교하여, L9 + MPL과 함께 포뮬레이션된 백신은 동일한 레벨의 면역성을 유도시켰지만 더 낮은 항원 투여량을 사용하였다.
실시예 7 - 18세 내지 40세의 건강한 성인에게서 근내적으로 투여된 3가 분할 비리온 인플루엔자 백신과 비교하여, 1회 투여 계획이후 투여된 로레스 9 또는 로레스 9 + 3D-MPL의 존재 또는 부재하에 비내적으로 투여된 알-유래된 3가 분할비리온 인플루엔자 백신의 평가.
본 연구에서 백신에 대한 국부적 점막 및 전신 면역 반응을 약 120명의 건강한 남여 피검자에게서 평가하였다.
후보 백신의 조성
5가지 포뮬레이션의 알-유래된 분할 인플루엔자 항원을 본 연구에서 평가하였다. 후보 백신을 비내적으로 투여하였다. 추가적으로, 스미스클라인 비이참 바이오로지칼스의 FluarixTM-근내적으로 투여되는 불활성화된 분할 비리온 인플루엔자 백신- 를 비교물질로서 사용하였다.
후보 비내 백신은 FluarixTM의 포뮬레이션에 사용된 3가지의 불활성화된 분할 비리온 항원을 함유한다. 상기 균주들은 2000 남반구 시즌에 대해 WHO에 의해 추천된 것들이다. 다양한 포뮬레이션에 대한 일반적인 설명을 표 6에 기재하였다.
표 6: 백신의 일반적인 설명
투여 용량 당 항원 (㎍ HA/균주) 추가 반응물
비내적 30 ㎍ 없음
비내적 15 ㎍ 없음
비내적 15 ㎍ 로레스-9
비내적 7.5 ㎍ 로레스-9
비내적 7.5 ㎍ 로레스-9 + 3D-MPL
근내적 15 ㎍ 없음
L9 또는 MPL(30 ㎍ 용량 및 15 ㎍ 용량)을 포함하지 않는 비내 3가 분할 인플루엔자 백신
1회 용량의 부피는 0.2 ml이다.
표 7:
성분 투여 당 양*
불활성화된 분할 비리온-A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)-A/시드니/5/97(H3N2)-B/야마나시/166/98 30 또는 15 ㎍ HA30 또는 15 ㎍ HA30 또는 15 ㎍ HA
인산염 완충 염수(pH 7.0-7.4)-무수 이염기 나트륨 포스페이트-일염기 칼륨 포스페이트-염화칼륨-염화나트륨트리톤 X100트윈 80주사용 물 8.10 mM1.47 mM2.70 mM137 mM0.02%0.15%0.2 ml까지 적당량 추가
잔류 티오메르살 <2 ㎍
*각각의 비내 바이알은 20% 이상의 부피를 함유한다.
L9(15 ㎍ 용량 및 7.5 ㎍ 용량)과 함께 포뮬레이션된 비내 3가 분할 인플루엔자 백신
1회 용량의 부피는 0.2 ml이다. 포뮬레이션은 표 7에 기재된 바와 같고, 균주당 15 또는 7.5 ㎍ 용량의 HA와 함께, 용량당 1 mg의 로레스 9를 추가로 포함한다. 로레스 9는 독일에 소재하는 크레슬러(Kreussler)로부터 입수하였다.
L9 + 3D-MPL(7.5 ㎍ 용량)과 함께 포뮬레이션된 비내 3가 분할 인플루엔자 백신
1회 용량의 부피는 0.2 ml이다. 포뮬레이션은 표 7에 기재된 바와 같고, 균주당 7.5 ㎍ HA의 용량과 함께, 용량당 1 mg의 로레스 9 및 50 ㎍의 3D-MPL을 추가로 포함한다.
비교물질로서 사용된 Fluarix TM 상용 불활성화된 3가 분할 인플루엔자 백신
FluarixTM2000(남반구)을 비교물질로서 사용하였다. 이러한 0.5 ml 용량 백신을 근내적으로 투여하였다.
1회 용량은 용량당 각각의 인플루엔자 바이러스 균주(A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1) - A/시드니/5/97 (H3N2) - B/야마나시/166/98)에 대해 15 ㎍ 혈구응집소 및 보존제로서 티오메르살 50 ㎍을 함유한다.
3가 분할 인플루엔자 후보 백신의 포뮬레이션
1.3가지 불활성화된 분할 비리온의 농축
최종 후보 백신의 포뮬레이션 전에, 3가지 불활성화된 분할 비리온을 ml당 1000 내지 1500 ㎍의 HA의 접선 플로우 여과에 의해 개별적으로 농축시켰다. 10 kDa의 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 트리아세테이트 멤브레인이 장착된 멤브레인 카세트를 사용하였다.
2.3가 분할 인플루엔자 백신의 포뮬레이션
포뮬레이션 플로우 개략도를 하기에 기재하였다:
주사용 물
+
인산염 완충 염수 pH 7.4
+
트윈 80 (0.15%)
+
트리톤 X100 (0.02%)
+ →실온에서 5분 교반
균주 A/뉴 칼레도니아/20/99
150 또는 75 또는 37.5 ㎍ HA/ml
+ →실온에서 10분 교반
균주 A/시드니/5/97
150 또는 75 ㎍ HA/ml
+ →실온에서 10분 교반
균주 B/야마나시/166/98
150 또는 75 ㎍ HA/ml
+ →실온에서 15분 교반
pH를 7.2±0.2로 조정
↓
최종 벌크 →+2℃ 내지 +8℃에 보관
로레스 9-함유 포뮬레이션을 위해, pH 조정 직전에 로레스-9를 0.5%까지 첨가하고 실온에서 15분 동안 계속 교반하였다.
로레스 9 + 3D-MPL-함유 포뮬레이션을 위해, 250 ㎍/ml 3D-MPL을 로레스 9를 첨가하기 진전에 첨가하고 포뮬레이션을 로레스 9를 첨가하기 전에 15분 동안 교반시켰다.
3가 분할 인플루엔자 후보 백신의 충전
최종 벌크를 페이퍼(Pfeiffer)(독일)로부터의 타입-1(Ph. Eur.) 유리 바이알에 무균적으로 충전하였다. 충전 직후, 이들 바이알을 고무 마개로 막았다. 모든작업을 무균실(층상 플로우 시스템(laminar flow system))에서 수행하였다.
충전하고 닫은 후에, 마개로 막힌 바이알을 플라스틱 플런저내로 삽입하고 스프레이 생성을 위한 스프레이 노즐 장치내로 조립하였다. 이 장치는 100 ㎕의 2개의 스프레이의 투여를 가능하도록 해준다.
결과
모든 피검자에 대해 하기 분석을 수행하였다:
1. 0일, 21일 및 42일: 점막 IgA(국부적 면역 반응) ELISA 역가를 백신내에 존재하는 3가지 인플루엔자 바이러스 균주 각각에 대해 개별적으로 시험하였다.
2. 0일, 21일 및 42일: 혈청 혈구응집-억제(HI) 항체 역가를 3가지 인플루엔자 균주 각각에 대해 개별적으로 시험하였다.
이로부터 유래된 것은 다음과 같다:
1. 모든 시점에서 혈청 HI 항체 GMT(95% 신뢰 구간).
2. HI에 대해: 21일째에 혈청변환율.
3. HI에 대해: 21일째에 변환 인자.
4. HI에 대해: 21일 및 42일째에 보호율.
5. IgA 단독에 대해: 0일 내지 21일 및 0일 내지 42일의 IgA 역가에 있어서 2배 내지 4배 증가를 갖는 피검자의 퍼센트.

Claims (32)

  1. 인플루엔자에 대한 1회-용량의 비내 백신접종을 위한 백신 포뮬레이션의 제조에 사용되는 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제의 용도로서, 1회-용량 백신접종이 인플루엔자 백신을 위한 국제적 규제 요건을 충족하는 면역 반응을 일으키는 용도.
  2. 제 1항에 있어서, 1회-용량의 백신접종으로 백신내에 존재하는 인플루엔자의 특정 균주 또는 모든 균주에 대해 혈청변환율, 혈청보호율 및 혈청변환 인자에 대한 3가지 유럽 연합 기준중에서 2가지 이상이 달성됨을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 2항에 있어서, 3가지 유럽 연합 기준 전부가 백신내에 존재하는 인플루엔자의 특정 균주 또는 모든 균주에 대해 충족됨을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원 제제가 분할 바이러스 항원 제제, 서브유닛 항원, 화학적으로 불활성화되거나 다른 방법으로 불활성화된 전체 바이러스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 4항에 있어서, 인플루엔자 항원 제제가 분할 바이러스 항원 제제임을 특징으로 하는 용도
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 포뮬레이션이 1종 이상의 계면활성제를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 6항에 있어서, 계면활성제가 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(예컨대, 시판되는 TritonTM시리즈), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(TweenTM시리즈) 및 하기 일반식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르 및 이들 중 둘 이상의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 비이온성 계면활성제임을 특징으로 하는 용도:
    (I) HO(CH2CH2O)n-A-R
    상기 식에서, n은 1 내지 50이고, A는 단일 결합 또는 -C(O)-이고, R은 C1-50알킬 또는 페닐 C1-50알킬이다.
  8. 제 7항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤(Triton) X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (트윈(Tween) 80) 및 로레스(laureth) 9 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 계면활성제임을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 8항에 있어서, 백신이 3가지 비이온성 계면활성제 중 2가지, 즉, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (트윈 80) 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤 X-100)의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 백신이 3가지 비이온성 계면활성제 전부의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 담즙산 또는 콜산, 또는 나트륨 데옥시콜레이트와 같은 이들의 유도체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 포뮬레이션의 각각의 용량이 낮은 용량의 혈구응집소를 함유함을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 12항에 있어서, 인플루엔자 균주 당 혈구응집소 함량이 용량 당 약 30 ㎍ 이하임을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 13항에 있어서, 인플루엔자 균주 당 혈구응집소 함량이 용량 당 약 15 ㎍ 이하임을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 14항에 있어서, 혈구응집소 함량이 백신 용량 당 바이러스 균주 당 혈구응집소 약 7.5 ㎍ 이하임을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 포뮬레이션의 용량 당 부피가 낮음을 특징으로 하는 용도.
  17. 제 16항에 있어서, 용량 당 부피가 용량 당 500 ㎕ 미만 또는 300 ㎕ 미만이거나 불과 약 200 ㎕임을 특징으로 하는 용도.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 2개의 서브(sub)-용량으로 구성된 2-용량 포맷(bi-dose format)으로 전달됨을 특징으로 하는 용도.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이, 추가된 면역자극제를 함유하지 않음을 특징으로 하는 용도.
  20. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 바람직하게는 모노포스포릴 지질 A 및 디포스포릴 지질 A의 비독성 유도체로부터 선택된 지질 A의 비독성 유도체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  21. 제 20항에 있어서, 백신이 3D-MPL을 포함함을 특징으로 하는 용도.
  22. 제 21항에 있어서, 백신이 3D-MPL 및 로레스 9를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  23. 피검자에게 단일 용량의 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 백신을 점막 표면을 통해 투여하여 백신내에 존재하는 모든 인플루엔자 균주에 대해 하기 기준 중 둘 이상을 충족시키는 면역 반응을 유도시키는 것을 포함하여 피검자에게서 인플루엔자 감염 또는 질환을 예방하는 방법:
    (i) 40% 이상의 혈청변환율;
    (ii) 70% 이상의 혈청보호율; 및
    (iii) 2.5 이상의 변환 인자.
  24. 피검자에게 단일 용량의 HA 함량이 낮은 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 백신을 점막 표면을 통해 투여하여 백신내에 존재하는 모든 인플루엔자 균주에 대해 하기 기준 중 둘 이상을 충족시키는 면역 반응을 유도시키는 것을 포함하여 피검자에게서 인플루엔자 감염 또는 질환을 예방하는 방법:
    (i) 40% 이상의 혈청변환율;
    (ii) 70% 이상의 혈청보호율; 및
    (iii) 2.5 이상의 변환 인자.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 3가지 기준 전부가 존재하는 모든 인플루엔자 균주에 대해 충족됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 비내적으로 전달됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 비내 전달 장치 및 추가된 면역자극제 없이 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제를 포함하는 1회-용량의 백신을 포함하는 약제학적 키트.
  28. 비내 전달 장치 및 인플루엔자 백신을 위한 국제적 규제 요건을 충족시키는 면역 반응을 생성시키는 1회-용량의 인플루엔자 백신을 포함하는 약제학적 키트.
  29. 비내 전달 장치 및 HA 용량이 낮은 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스 항원 제제를 포함하는 1회-용량의 백신을 포함하는 약제학적 키트.
  30. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 단일 투여로 2개의 서브-용량을 전달하기 위한 2-용량 전달 장치임을 특징으로 하는 약제학적 키트.
  31. 제 27항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 비내 스프레이 장치임을 특징으로 하는 약제학적 키트.
  32. (i) 본질적으로 통상적인 주사용 인플루엔자 백신의 경우에서와 같이 생산되고 1종 이상의 비이온성 계면활성제를 포함하는 분할 인플루엔자 바이러스 제제를 제공하고;
    (ii) 제제내의 혈구응집소의 농도 및/또는 비이온성 계면활성제의 농도를 임의로 조정하고;
    (iii) 비내 전달 장치를, 임의로 2-용량 포맷으로 비내 투여하기에 적합한 부피인 분할 인플루엔자 바이러스 제제로부터의 백신 용량으로 충전시키는 것을 포함하여 코에 적용하기 위한 인플루엔자 백신을 제조하는 방법.
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