CZ20021044A3 - Pouľití antigenu chřipkového viru pro výrobu vakciny - Google Patents

Description

Použití antigenů chřipkového viru pro výrobu vakciny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových vakcin proti chřipce, způsobu jejich výroby a jejich použití při prevenci nebo léčení. Vynález se zvláště týká vakcin pro podávání na sliznici, zvláště pro podávání nosem. Vynález se zvláště týká použití vakcin proti chřipce, které mohou být podávány intranazálně v jediné dávce pro dosažení dostatečné imunitní odpovědi při splnění požadavků směrnic pro vakciny.

Dosavadní stav techniky

Virus chřipky je jeden z nejběžnějších virů přítomných na světě a ovlivňuje jak lidi, tak i hospodářská zvířata. Ekonomické důsledky chřipky jsou velmi významné.

Virus chřipky je RNA virus opatřený obalem s průměrem částice přibližně 125 nm. V zásadě se skládá z vnitřní nukleokapsidy neboli jádra ribonukleové kyseliny (RNA) asociované s nukleoproteinem, obklopené virovým obalem, který má strukturu lipidové dvojvrstvy s vnějšími glykoproteiny. Vnitřní vrstva virového obalu je složena převážně z matricových proteinů a vnější vrstvu tvoří z větší části lipidový materiál odvozený od hostitele. Povrchové glykoproteiny neuraminidáza (NA) a hemaglutinin (HA) se jeví jako hroty o délce 10 až 12 nm na povrchu částic. Tyto povrchové proteiny, zejména hemaglutinin, určují antigenní specificitu subtypů chřipky.

Typické epidemie chřipky způsobují nárůst výskytu zápalu plic a onemocnění dolního respiračního traktu, čehož důkazem jsou zvýšené počty hospitalizací a zvýšená úmrtnost. Tyto komplikace se nejpravděpodobněji mohou vyskytnout u starších osob nebo osob ···· ·· ·· « · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · · · ·

- 2 s chronickými onemocněními, ale vážně onemocnět mohou také malé děti. Tyto skupiny je proto třeba zvláště chránit.

Na trhu dostupné vakciny proti chřipce jsou buď inaktivované nebo živé oslabené vakciny proti chřipce. Inaktivované vakciny proti chřipce jsou složeny ze tří typů antigenních preparátů: inaktivovaný úplný virus, subviriony, kde čištěné virové částice jsou rozbity pomocí detergentů nebo jiných reagencií pro solubilizaci lipidového obalu (tzv. vakcina typu „split“) nebo čištěné proteiny HA a NA (subjednotková vakcína). Tyto inaktivované vakciny se podávají intramuskulárně (i.m.).

Vakciny proti chřipce všechy typů jsou obvykle trivalentní vakciny. Obecně obsahují antigeny odvozené ze dvou kmenů viru chřipky typu A a jednoho kmene chřipky typu B. Standardní dávka pro injekci 0,5 ml ve většině případů obsahuje 15 pg složky hemaglutininového antigenu z každého kmene při měření imunodifuzní metodou (single radial immunodiffusion, SRD) (J. M. Wood a další, An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines, J. Biol. Stand. 5 (1977) 237 - 247; J. M. Wood a další, International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus, J. Biol. Stand. 9 (1981) 317 - 330).

Kmeny chřipkového viru obsažené ve vakcinách proti chřipce jsou určovány pro každou sezónu světovou zdravotnickou organizací (World Health Organisation) ve spolupráci s národními zdravotními úřady a výrobci vakcin.

Současné úspěchy při omezování nemocnosti a úmrtnosti v souvislosti s každoročními epidemiemi chřipky jsou založeny na použití inaktivovaných vakcin proti chřipce podávaných intramuskulárně. Účinnost těchto vakcin při prevenci respiračních « ·

• · · · · · · * • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · · · · · onemocnění a komplikací chřipky se pohybuje od 75 % u zdravých dospělých do méně než 50 % u starších osob.

Viry chřipky, podobně jako mnoho dalších patogenů, pronikají povrchy sliznic, zpočátku v horním respiračním traktu. Imunita sliznic představuje první linii obrany hostitele a je hlavní součástí imunitní odpovědi v nosních dutinách a v dýchacích cestách dolního respiračního traktu. I když v současnosti používané injekční vakcíny proti chřipce stimulují HA-specifické IgG v séru u většiny zdravých jednotlivců, podstatný nárůst HA-specifické nosní protilátky IgA se vyskytuje pouze u menší části vakcinovaných osob. Zlepšené vakciny proti chřipce s lepší imunogenicitou a klinickou účinností by se měly zaměřovat jak na lokální, tak i systémové odpovědi protilátek.

Experimentální intranazální expozice lidí inaktivovaným vakcinám proti chřipce spadá již do čtyřicátých let (viz přehledný článek v Eyles a další, 2000 BioDrugs 13(1): 35 - 59). I když zájem o použití inaktivovaného viru pro i.n. imunizaci byl oživen v šedesátých i sedmdesátých letech, větší pozornost v intranazální oblasti byla věnována použití živého oslabeného viru.

Intranazálně podávané vakciny proti chřipce s živým oslabeným virem, například vakciny adaptované na chlad, často zlepšovaly imunitu sliznic, přičemž slibné výsledky se objevily zvláště u dětí. Tento přístup však nedosáhl takových úspěchů, aby dosáhl celosvětového obecného přijetí.

Většina komerčně dostupných vakcin proti chřipce jsou tedy buď štěpené nebo subjednotkové vakciny podávané injekčně. Tyto vakciny se vyrábějí rozbitím částice viru, obecně organickým rozpouštědlem nebo detergentem, a oddělením nebo čištěním virových proteinů na různé stupně čistoty. Štěpené vakciny se připravují fragmentací úplného chřipkového viru, buď infekčního nebo inaktivovaného, solubilizujícími koncentracemi organických rozpouštědel nebo • ·

detergentů a následným odstraněním solubilizačního činidla a některého nebo většiny virových lipidových materiálů. Štěpené vakcíny obecně obsahují kontaminující matricový protein a nukleoprotein a někdy lipid, stejně jako membránové proteiny obalu. Štěpené vakcíny budou obvykle obsahovat většinu nebo všechny proteiny struktury viru, i když ne nezbytně ve stejných podílech, v jakých se vyskytují v úplném víru. Subjednotkové vakcíny se na druhé straně skládají v podstatě z vysoce čištěných proteinů virového obalu, hemaglutininu a neuraminidázy, což jsou povrchové proteiny odpovědné za vyvolání tvorby žádoucích neutralizačních protilátek proti viru po vakcinaci.

V poslední době byly kombinovány štěpené vakcíny proti chřipce s ještě vyšším stupněm čistoty a ještě lépe charakterizované s adjuvantními látkami ve snaze zlepšit imunogenicitu u dospělých a starších osob. Přes podstatná zvýšení imunitních odpovědí u myší nebyla celá řada přístupů využívajících adjuvans nové generace potvrzena u lidí.

Pro měření účinnosti vakcin proti chřipce se používají mezinárodní standardy. Oficiální kritéria pro účinnou vakcinu proti chřipce platná v Evropské unii jsou uvedena v následující tabulce. Teoreticky musí vakcína proti chřipce, aby vyhověla požadavkům Evropské unie, splnit pouze jedno z kritérií uvedených v tabulce pro všechny kmeny viru chřipky zařazené ve vakcině. V praxi však budou muset být pro všechny kmeny splněna alespoň dvě nebo všechna tři uvedená kritéria. Za určitých okolnéstí mohou dostačovat pouze dvě kritéria. Může být například přijatelné, aby pro všechny kmeny byla splněna dvě nebo tři kritéria, zatímco třetí kritérium není splněno u některého, ale nikoli u všech kmenů (například dvou ze tří kmenů). Požadavky jsou odlišné pro dospělé populace (18 až 60 let) a starší populace (>60 let).

φ · · ·

	18 až 60 let	>60let
Míra sérokonverze*	> 40 %	>30 %
Konverzní faktor**	>2,5	>2,0
Míra ochrany***	>70 %	>60 %

Míra sérokonverze je definována jako procento vakcinovaných, u kterých bylo dosaženo alespoň čtyřnásobného zvýšení titrů inhibice sérového hemaglutininu (Hl) po vakcinaci pro každý kmen obsažený ve vakcině.

Konverzní faktor je definován jako násobek zvýšení geometrických středních titrů sérové Hl (GMT) po vakcinaci pro každý kmen obsažený ve vakcině.

Míra ochrany je definována jako procento vakcinovaných s titrem Hl v séru po vakcinaci rovným nebo vyšším než 1 : 40 (pro každý kmen obsažený ve vakcině), a normálně se používá pro označení ochrany.

Aby mohla být intranazální vakcína proti chřipce komerčně • použitelná, musí splňovat nejen tyto standardy, ale v praxi musí být alespoň stejně účinná jako v současnosti dostupné vakciny podávané injekcemi. Musí být také komerčně životaschopná z hlediska množství antigenů a počtu nezbytných podání.

Intranazální vakciny proti chřipce založené na inaktivovaném viru, které byly studovány v posledních několika dekádách, tato kritéria nesplňovaly.

Fulk a další, 1969 (J. Immunol. 102, 1102 - 5) srovnával intranazální podávání (nosní kapky + nebulizace) usmrceného chřipkového viru se subkutánním (s.c.) podáváním u starších osob. Zatímco u 56 % pacientů, kterým bylo očkování podáno s.c., došlo ke ··· · • · · • ·

- 6 • ·· · čtyřnásobnému zvýšení titrů protilátky (Hl), odpovídající zvýšení bylo pozorováno pouze u 25 % osob, kterým byla očkovací látka podána intranazálně. Dvě intranazální podávání vedla k 75% sérokonverzi.

Gluck a další, 1999 (J. Virol. 73, 7780 - 6) ukázali, že byla nutná dvě za sebou následující intranazální očkování podaná ve formě spreje obsahující silná adjuvans účinná na sliznice (E. Coli Heat Labile Toxin, HLT) pro indukci sérokonverze (čtyřnásobné zvýšení odpovědi humorálních protilátek) ve srovnání s intramuskulárním podáním. Jediné intranazální podávání 15 pg HA na kmen v přítomnosti adjuvans, nebo dokonce dvě podání v nepřítomnosti adjuvans, nebyly schopny poskytnout ekvivalentní sérokonverzi. Antigen proti chřipce byl ve formě virosomů, rekonstituovaných lipidových dvojvrstev vytvořených pomocí fosfatidylchlolinu a proteinů virového povrchu extrahovaných z viru chřipky kultivovaného na vejcích.

Koncept použití dvou nebo více intranazálních podání pro dosažení vyšších hodnot sérokonverze byl také použit jinými autory. Petrescu a další (1979, Rev. Rom. Med. Virol. 30, 109 - 115) podávali inaktivovaný virus (1000 mezinárodních jednotek na vakcinační dávku) intranazálně dvakrát v průběhu dvou týdnů. Oh a další (1992, Vaccine 10, 506 - 11) podávali štěpenou vakcinu ve formě nosního spreje čtyřikrát v týdenních intervalech, kde v každém podání bylo obsaženo 15 pg HA na kmen (0,25 ml na nosní dírku při každém podání). KunoSakai a další (1994, Vaccine 12, 1303 - 1310) podávali dvakrát v intervalu jednoho týdne aerosol inaktivované vakciny s trojnásobnou silou než komerčně dostupná štěpená vakcina proti chřipce.

V poslední době Muszkat a další (2000 Vaccine 18, 1696 - 9) podávali dvě intranazální imunizace úplným inaktivovaným chřipkovým virem (20 pg kmene A a kmene B a 40 pg jiného kmene A na dávku) starším pacientům a zjistili nižší systémovou sérokonverzi pro intranazální podávání než v případě intramuskulární injekce standardní dávky komerční inaktivované štěpené vakciny proti chřipce.

Literatura v období let 1969 až 2000 tedy ukazuje, že přes široký výzkum intranazální vakcinace inaktivovanou chřipkovou vakcinou nebyla žádná skupina schopna dosáhnout použitím jediné dávky vakciny při nosním podání systémové sérokonverze ekvivalentní intramuskulární nebo subkutánní injekci. Pro dosažení účinku při vícenásobném podání vakciny v časových odstupech byly navíc používány podstatně vyšší dávky antigenu než je běžná dávka 15 pg HA pro každou vakcinu. Tyto údaje tedy ukazují, že je zapotřebí většího počtu podání a s výhodou v přítomnosti silných imunostimulačních látek, jako je E. coli HLT.

Kimura a další (1988, Acta Paediatr Jpn. 30, 601 - 3) ukázali, že podání dvou dávek inaktivovaného chřipkového viru nebulizérem bylo stejně účinné jako jediné podání s.c., ale podání dvou dávek intranazálním sprejem mělo daleko nižší účinnost. Nebulizace poskytuje velmi jemné rozprášení, které dosáhne do plic. Ve zveřejněných klinických pokusech se tedy také ukazuje, že nosní sprej nemusí být účinný, a lepší účinnosti se může dosáhnout použitím nebulizace.

Z literatury je dále zřejmé, že je v intranazálních vakcinách zapotřebí používat silnější adjuvans, zvláště silnějších imunostimulačních látek.

Například Gluck a další (citováno výše) ukázali, že intranazální podání vakciny proti chřipce bez přítomnosti imunostimulační látky má významně nižší účinnost než v přítomnosti imunostimulační látky. Autoři ukazují, že dokonce i dvě intranazální podání vakciny bez imunostimulační látky, nebyla schopna indukovat stejnou míru sérokonverze, jaké bylo dosaženo při subkutánním podání.

Hashigucci a další, 1996 (Vaccine 14, 113-9) ukázali, že dvě intranazální podání v odstupu čtyř týdnů štěpené vakciny proti chřipce s použitím směsi tepelně labilního toxinu E. coli (Heat labile toxin) a jeho B-subjednotky (LTB) vedlo k míře sérokonverze 50 %.

• · · <

• 4

4 · 4

- 8 V nepřítomnosti adjuvans bylo dosaženo pouze 31% sérokonverze. Při podání s.c. se typicky dosahuje sérokonverze 75 až 90 %.

Údaje v literatuře tedy jasně ukazují, že pro získání ekvivalentní systémové sérokonverze jako s použitím běžných vakcín proti chřipce je nutno použít více než jednoho podání a vakcina musí navíc obsahovat toxin jako adjuvans.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že v komerčně použitelné intranazální vakcině proti chřipce může být použit antigen neživého viru chřipky. Systémovou imunitu na ochranné úrovni konkrétně stimuluje jediné podání intranazální vakciny proti chřipce. Navíc tento prostředek splňuje mezinárodní kritéria pro účinné vakciny proti chřipce. Intranazální podání antigenů s neživým virem chřipky může konkrétněji poskytnout systémovou sérokonverzi (čtyřnásobné zvýšení titrů antiHA) ekvivalentní k sérokonverzi získané podáním stejné vakciny s.c. Překvapivě je možno poskytnout chřipkový antigen jako součást vakciny v podstatně nižší dávce než bylo uváděno v dosavadním stavu techniky.

Jediné nosní podání standardní dávky inaktivovaného viru chřipky, které by vedlo k sérokonverzi ekvivalentní k sérokonverzi získané injekcí, dosud nebylo popsáno.

Předkládaný vynález poskytuje poprvé vakcinu proti chřipce pro jediné intranazální podání. Vakcina splňuje některá nebo všechna kritéria EU pro chřipkové vakciny uvedená výše, takže vakcinu je možno schválit v Evropě jako komerční vakcinu podávanou v jedné dávce. S výhodou jsou splněna alespoň dvě ze tří kritérií EU pro kmen nebo všechny kmeny chřipky, které jsou ve vakcině zastoupeny. S výhodou jsou splněna alespoň dvě kritéria pro všechny kmeny a třetí φφ ··♦*·· φφ φφ φφφφ φφφ · » · · φφφ φ φ φφφ φ φ ·

9· · · · · φ φ Φ·· φ φ • φ φ φ φφφφ ••ΦΦ φφ φφ φφφ φ· φφφφ kritérium je splněno všemi kmeny nebo alespoň kmeny s výjimkou jediného. Výhodněji splňují všechny kmeny všechna tři kritéria.

Vynález tedy v jednom provedení poskytuje použití antigenního preparátu s neživým virem chřipky při výrobě vakciny pro nazální vakcinaci proti chřipce v jedné dávce. Vakcína může být podávána v jednodávkovém nebo dvojdávkovém uspořádání (obecně jedna dílčí dávka do každé nosní dírky).

Vynález poskytuje v dalším provedení použití nízké dávky antigenního materiálu s neživým virem chřipky při výrobě vakciny pro imunizaci proti chřipce přes sliznice.

Preparát antigenů neživého viru chřipky obsahuje s výhodou alespoň jednu povrchově aktivní látku, kterou může být zvláště neiontová povrchově aktivní látka. Neiontová povrchově aktivní látka je s výhodou alespoň jedna povrchově aktivní látka zvolená ze skupiny oktyl- nebo nonylfenoxypolyoxyethanolů (například komerčně dostupné řady Triton™), polyoxyethylensorbitanových esterů (řada Tween™) a polyoxyethylenetherů nebo -esterů obecného vzorce (I):

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R (I), kde n je 1 - 50, A je vazba nebo -C(O)-, R je Ci_₅₀-alkyl nebo fenyl-Cvso-alkyl; a kombinace dvou nebo více těchto látek.

Výhodné povrchově aktivní látky spadající do rámce vzorce (I) jsou molekuly, ve kterých n je 4 až 24, výhodněji 6 až 12 a nejvýhodněji 9; složka R je Ci._5O, s výhodou C₄-C₂₀-alkyl a nejvýhodněji Ci₂-alkyl.

Oktylfenoxypolyoxyethanoly a polyoxyethylensorbitanové estery se popisují v publikaci „Surfactant systems“, ed: Attwood a Florence (1983, Chapman a Halí). Oktylfenoxypolyoxyethanoly (oktoxynoly), včetně t-oktylfenoxypolyethoxyethanolu (Triton X-100™), jsou také ♦ · · · · · • · ·· ft· • ♦ ♦ · • · · • ··· . · · ftftftft ftft popsány v Merck Index Entry 6858 (str. 1162, 12^th ed., Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA; ISBN 0911910-12-3). Polyoxyethylensorbitanové estery, včetně polyoxyethylensorbitan— monooleátu (Tween 80™) jsou popsány v Merck Index Entry 7742 (str. 1308, 12^thed., Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA; ISBN 0911910-12-3). Obě látky je možno vyrábět použitím metod popsaných v této literatuře nebo je možno zakoupit z komerčních zdrojů jako je Sigma Inc.

Zvláště výhodné neiontové povrchově aktivní látky zahrnují Triton X-45, t-oktylfenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), Triton X102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, polyoxyethylen-9-laurylether (laureth 9) a polyoxyethylen-9-stearylether (steareth 9). Triton X-100 a laureth 9 jsou zvláště výhodné. Zvláště výhodný je také polyoxyethylensorbitanový ester, polyoxyethylensorbitanmonooleát (Tween 80™).

Další vhodné polyoxyethylenethery obecného vzorce (I) se volí z následující skupiny: polyoxyethylen-8-stearylether, polyoxyethylen-4laurylether, polyoxyethylen-35-laurylether a polyoxyethylen-23laurylether.

Alternativní označení nebo názvy polyoxyethylenlauryletheru jsou popsány v registru CAS. Číslo registru CAS polyoxyethylen-9lauryletheru je: 9002-92-0. Polyoxyethylenové ethery jako je ± h polyoxyethylenlaurylether se popisují v Merck index (12 ed.: položka 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA; ISBN 091191012-3), Laureth 9 se vyrábí reakcí ethylenoxidu s dodecylalkoholem a obsahuje v průměru devět ethylenoxidových jednotek.

Poměr délky polyoxyethylenové části k délce alkylového řetězce v povrchově aktivní látce (tj. poměr n: délka alkylového řetězce) ovlivňuje rozpustnost této třídy povrchově aktivních látek ve vodném .:··· • ♦ · · • ·

- 11 - .· to to • · médiu. Povrchově aktivní látky podle předkládaného vynálezu mohou být tedy v roztoku nebo mohou vytvářet částicové struktury jako jsou micely nebo váčky. Ve formě roztoku jsou povrchově aktivní látky podle předkládaného vynálezu bezpečné, snadno sterilizovatelné, mohou být jednoduše podávány a mohou být jednoduše vyráběny bez nutnosti dodržovat ukazatele GMP a QC v souvislosti s tvorbou stejnoměrných částicových struktur. Některé polyoxyethylenové ethery, jako je laureth 9, mohou vytvářet roztoky neobsahující váčky. Polyoxyethylen-8-palmitoylether (C₁₈E₈) je však schopen tvořit váčky. Váčky polyoxyethylen-8-palmitoyletheru v kombinaci s alespoň jednou další neiontovou povrchově aktivní látkou mohou být v prostředcích podle předkládaného vynálezu použity také.

Polyoxyethylenový ether používaný v prostředcích podle předkládaného vynálezu má s výhodou hemolytickou aktivitu. Hemolytická aktivita polyoxyethylenového etheru může být měřena in vitro, například podle následujícího testu, a je vyjádřena jako nejvyšší koncentrace povrchově aktivní látky, která již nezpůsobí lyži červených krvinek.

1. Čerstvá krev morčat se třikrát promyje na stolní centrifuze fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS). Po resuspendování na původní objem se krev dále 10 x zředí v PBS.

2. 50 pi této suspenze krve se přidá do 800 μΙ PBS s obsahem dvojnásobných ředění detergentu.

3. Po 8 hod se zjišťuje hemolýza vizuálně nebo měřením optické hustoty supernatantu. Přítomnost červeného supernatantu, který obsorbuje světlo při 570 nm, ukazuje na hemolýzu.

4. Výsledky se vyjádří jako koncentrace prvního ředění detergentu, při kterém již nedojde k hemolýze.

V rámci nezbytné experimentální variability takového biologického testu mají polyoxyethylenové ethery nebo povrchově * · ·< ·· »* ··· · ··

9 9 9 9 999 9 9 9 j z-1 · 999 9 9 9 9 9 9 9 9

- Ί / - « 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9999 aktivní látky obecného vzorce (I) podle předkládaného vynálezu s výhodou hemolytickou aktivitu přibližně mezi 0,5 až 0,0001 %, výhodněji mezi 0,05 až 0,0001 %, ještě výhodněji mezi 0,005 až 0,0001 %, a nejvýhodněji mezi 0,003 až 0,0004 %. V ideálním případě by měly mít uvedené polyoxyethylenové ethery nebo estery podobnou hemolytickou aktivitu (tj. v rámci desetinásobného rozdílu) jako je aktivita buď polyoxyethylen-9-lauryletheru nebo polyoxyethylen-8stearyletheru.

V popisované vakcině mohou být přítomny dvě nebo více neiontové povrchově aktivní látky z různých skupin popisovaných povrchově aktivních látek. Výhodná je zvláště kombinace polyoxyethylensorbitanového esteru jako je polyoxyethylen— sorbitanmonooleát (Tween 80™) a oktoxynolu jako je toktylfenoxypolyethoxyethanol (Triton) X-100™. Další zvláště výhodná kombinace neiontových povrchově aktivních látek obsahuje laureth 9 plus polyoxyethylensorbitanový ester oktoxynolu nebo obě tyto látky.

Každá neiontová povrchově aktivní látka je v hotové vakcině přítomna v koncentraci mezi 0,001 až 20 %, výhodněji 0,01 až 10 % a nejvýhodněji až do přibližně 2 % (hmotn./obj.). Jestliže jsou přítomny dvě povrchově aktivní látky, jsou obecně přítomny v konečné formulaci v koncentraci až do 2 % každá, typicky je každá přítomna v koncentraci až do přibližně 0,6 %. Může být přítomna jedna nebo více dalších povrchově aktivních látek, obecně až do koncentrace každé takové látky přibližně 1 %, a typicky může být každá taková látka přítomna ve stopách až do přibližně 0,2 % nebo 0,1 %. Ve vakcinách podle vynálezu může být přítomna jakákoli směs povrchově aktivních látek.

Neiontové povrchově aktivní látky jako jsou výše uvedené látky mají v hotové vakcině následující výhodné koncentrace: polyoxyethylensorbitanové estery jako je Tween 80™: 0,01 až 1 %, ·· 9 • 9 » 9 • 9 999 ♦ 9 9

4 * ♦ * 44 4 nejvýhodněji přibližně 0,1 % (hmotn. /obj.); oktyl- nebo nonylfenoxypolyoxyethanoly jako je Triton X-100™ nebo jiné deetergenty řady Tritonů: 0,001 až 0,1 %, nejvýhodněji 0,005 až 0,02 % (hmotn./obj.); polyoxyethylenové ethery obecného vzorce (I) jako je laureth 9: 0,1 až 20 %, s výhodou 0,1 až 10 % a nejvýhodněji 0,1 až 1 % nebo přibližně 0,5 % (hmotn./obj.).

Pro některé vakciny mohou být zahrnuty i jiné složky vakcin. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat také žlučovou kyselinu nebo její derivát, zvláště ve formě soli. Patří sem deriváty kyseliny cholové a jejich soli, zvláště sodné soli kyseliny cholové nebo derivátů kyseliny cholové. Příklady žlučových kyselin a jejich derivátů zahrnují kyselinu cholovou, kyselinu deoxycholovou, kyselinu chenodeoxycholovou, kyselinu lithocholovou, kyselinu ursodeoxychoiovou, kyselinu hyodeoxycholovou a jejich deriváty, jako jsou glyko-, tauro-, amidopropyl-1-propansulfonové, amidopropyl-2-hydroxy-1-propansulfonové deriváty výše uvedených žlučových kyselin nebo N,N-bis(3Dglukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláště výhodný příklad je deoxycholát sodný (NaDOC), který může být přítomen v hotové vakcinační dávce. Formulace podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou ve formě vodného roztoku nebo suspenze neobsahující váčky. Tyto formulace mohou být snadno reprodukovatelně vyráběny a mohou být také sterilizovány (konečná filtrace přes membránu s póry 450 nebo 220 nm) a mohou být snadno podávány na nosni sliznicí ve formě spreje, aniž by došlo k degradaci komplexní fyzikální struktury adjuvans.

Antigenní preparát s neživým virem chřipky pro použití podle vynálezu může být zvolen ze skupiny antigenních preparátů na bázi štěpeného viru, subjednotkových antigenů (buď rekombinantně exprimovaných nebo připravovaných z úplného viru), inaktivovaných úplných virů, které mohou být chemicky inaktivovány například formaldehydem, β-propiolaktonem nebo jinak, například UV zářením ·· ··· · ·· *« • » · · · 9 9 · · · ·

9 9 9 9 999 9 9 9

A Λ · ··* 999 99·· ·

- 14 - · · · · · ··· ···· 99 99 99· ·· ···· nebo teplem. Antigenní preparát je s výhodou preparát na bázi štěpeného viru nebo subjednotkového antigenu připraveného z úplného viru, zvláště procesem štěpení s následnou purifikací povrchového antigenu.

Ve výhodném provedení obsahuje vakcína preparát rozštěpeného viru chřipky v kombinaci s jednou nebo více neiontovými povrchově aktivními látkami. Jedna nebo více neiontových povrchově aktivních látek může pocházet z procesu, kterým se štěpený chřipkový antigen vyrábí, nebo se může k antigennímu preparátu přidávat později. Předpokládá se, že rozštěpený chřipkový antigenní materiál může být stabilizován v přítomnosti neiontové povrchově aktivní látky, i když je zřejmé, že tomu tak nemusí být vždy.

V dalším provedení poskytuje vynález použití preparátu antigenu neživého viru chřipky, s výhodou preparátu štěpeného viru chřipky, při výrobě intranazální vakciny proti chřipce pro podávání v jedné dávce, bez přidaného imunostimulačního činidla. V souvislosti předkládaného vynálezu je imunostimulační činidlo látka, která je schopná přímo stimulovat buňky imunitního systému, což je protiklad s pouhou nepřímou stimulací například působením nosiče antigenu, který má sám v kombinaci s nosičem stimulační účinek.

V alternativním provedení předkládaného vynálezu prostředek dále obsahuje adjuvantní látky nebo imunostimulační látky včetně cholerového toxinu a jeho podjednotky B, detoxifikovaného lipidu A z jakéhokoli zdroje, netoxických derivátů lipidu A včetně derivátů popsaných v US 4,912,094 a GB 2,220,211, včetně netoxických derivátů monofosforyllipidu a difosforyllipidu A, jako je 3-de-Oacylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) a 3-de-O-acylovaný difosforyllipid A, saponinů jako je Quil A (odvozený z kůry jihoamerického stromu Ouillaja Saponaria Molina) a jeho frakcí, včetně QS21 a QS17 (US 5,057,540; Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. Drug

090· • 0 • 990

- 15 k · 000

Carrier Syst., 1996, 12(1 - 2): 1 - 55; EP O 362 279 B1; Kensil a další (1991, J. Immunology díl 146, 431 - 437; WO 99/10008) a oligonukleotidového adjuvantního systému obsahujícího nemethylovaný dinukleotid CpG (jak je popsáno ve WO 96/02555).

Ve výhodném provedení tohoto aspektu vynálezu obsahuje prostředek derivát netoxického lipidu A zvolený z 3D-MPL a netoxických derivátů difosforyllipidu A, zvláště 3D-MPL. Prostředek výhodněji obsahuje 3D-MPL spolu s polyoxythylenetherem nebo -esterem obecného vzorce (I) uvedeného výše, zvláště laureth 9.

Vynález tedy dále poskytuje vakcinu obsahující kombinaci látek 3D-MPL a laureth 9 a preparát antigenu viru chřipky, zvláště rozštěpený antigenní preparát. Tato vakcina je zvláště, i když ne výlučně, vhodná pro podávání přes sliznice, včetně intranazálního podávání, jak bylo popsáno výše.

Další složky, které jsou s výhodou přítomny v prostředku podle tohoto provedení vynálezu, zahrnují další neiontové detergenty jako jsou oktoxynoly a polyoxyethylenové estery popisované výše, zvláště toktylfenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) a polyoxyethylen-sorbitanmonooleát (Tween 80); a deriváty solí žlučových kyselin nebo kyseliny cholové popisované výše, zvláště deoxycholát sodný nebo taurodeoxycholát sodný. Zvláště výhodný prostředek tedy obsahuje 3D-MPL, laureth 9, Triton X-100, Tween 80 a deoxycholát sodný, které mohou být kombinovány s preperátem antigenu viru chřipky za poskytnutí vakcíny vhodné pro podávání přes sliznice nebo intranazální podávání.

Vynález také poskytuje způsob výroby vakcíny zahrnující míšení látek 3D-MPL, laureth 9 a preparátu antigenu viru chřipky, s výhodou štěpeného antigenního preparátu, jako je štěpený preparát antigenu používaný v běžné protichřipkové vakcině pro intramuskulární podávání.

·« ·· ♦··» «« *· • · · · · · · · 9 · · * * 9 9 9 999 9 9 9

99999 9 999 9 9

-ΊΑ-· · ·· · 9 9 9

IV ·«» · · · 9 9 999 9 9 99 9 9

Μ dalším provedení poskytuje vynález farmaceutický kit obsahující zařízení nosního spreje a jednu dávku vakcíny na bázi neživého viru chřipky. S výhodou je zařízení dvojdávkové pro dodání dvou dílčích dávek vakcíny.

Nízká dávka hemaglutininu podle předkládaného vynálezu je s výhodou dávka hemaglutininu srovnatelná s dávkou v běžných vakcinách proti chřipce. Výhodná nízká dávka tedy nepředstavuje více než přibližně 30 pg, výhodněji ne více než přibližně 15 pg hemaglutininu na kmen chřipky. To odpovídá za normálních okolností přibližně mezi 0,1 a 2 pg/kg tělesné hmotnosti. S výhodou, i když ne nezbytně, se vakcíny s nízkou dávkou podle vynálezu podávají jako vakcína pro podání v jedné dávce, například ve dvou dílčích dávkách do každého nosního otvoru.

Vakcína podle vynálezu se s výhodou poskytuje v menším objemu než mají obvyklé štěpené vakciny proti chřipce podávané injekcemi, kde se používá obecně 0,5 nebo 1 ml na dávku. Dávky v nízkých objemech podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou nižší než 500 pl, výhodněji nižší než 300 pl a nejvýhodněji ne více než přibližně 200 pl nebo méně na dávku. Jestliže se podávají dvě dílčí dávky, výhodný objem na dílčí dávku je polovina objemů celkové dávky uvedených výše.

Výhodná dávka vakciny podle vynálezu je dávka s nízkým dávkováním antigenu v malém objemu, například přibližně 15 pg nebo přibližně 7,5 pg HA (na kmen) v objemu přibližně 200 pl.

Vynález také poskytuje způsob prevence infekce virem chřipky nebo onemocnění pacienta, kde tento způsob zahrnuje podání jedné dávky vakciny na bázi neživého viru chřipky přes povrch sliznice pacientovi.

9« 99 • 9 4 9 • * · • 99« 9 ⁹ ·

Ir “9999 · · • 9 · • 9 999 • · ·

9 9

999

9· 99 « 9 9 9

9 9

9 9 9

9 9 «4 9999

Vynález dále poskytuje způsob prevence infekce virem chřipky nebo onemocnění u pacienta, kde tento způsob zahrnuje podání nízké dávky vakciny na bází neživého viru chřipky přes povrch sliznice pacientovi.

Vakcína se s výhodou podává intranazálně.

Vakcina se nejvýhodněji podává místně do oblasti nosohltanu, přičemž s výhodou se neinhaluje do plic. Je žádoucí používat zařízení pro intranazální podávání, které dodává vakcinu do oblasti nosohltanu, bez vstupu nebo v podstatě bez vstupu do plic.

Výhodná zařízení pro intranazální podávání vakcin podle vynálezu jsou sprejová zařízení. Mezi komerčně dostupná nosní sprejová zařízení patří Accuspray™ (Becton Dickinson). Nebulizéry poskytují velmi jemně rozprášenou mlhu, která může být snadno inhalována do plic, a proto nedosáhne účinně nosní sliznice. Z toho důvodu nejsou nebulizéry výhodné.

Výhodná rozprašovací zařízení pro intranazální použití jsou zařízení, u kterých výkon není závislý na tlaku použitém uživatelem. Tato zařízení jsou známá jako zařízení s prahovou hodnotou tlaku. Kapalina se z trysky uvolní pouze v případě, kdy se použije praové hodnoty tlaku. Tato zařízení usnadňují dosažení rozprášení s pravidelnou velikostí kapiček. Zařízení s prahovou hodnotou tlaku vhodná pro použití v rámci předkládaného vynálezu jsou v oboru známá a popisují se například ve WO 91/13281 a EP 311 863 B a EP 516 636, které se zařazují odkazem. Tato zařízení jsou komerčně dostupná od firmy Pfeiffer GmbH a popisují se také v Bommer, R., Pharmaceutical Technology Europe, září 1999.

Výhodná intranazální zařízení poskytují kapičky (měřeno s použitím vody jako kapaliny) v rozmezí velikostí 1 až 200 pm, s výhodou 10 až 120 pm. Pod velikostí 10 pm je riziko inhalace, ·9 9· ···· ·· ·· **«« · Φ · a··· • · · » · ··· · * · • a·· a·· · · « » a · ··· ····

- |O -*··· ·· ·· ··· ·· ···· a proto je vhodné, aby velikost nižší než 10 pm nemělo více než 5 % kapiček. Kapičky větší než 120 pm se nešíří tak dobře jako menší kapičky, takže je žádoucí, aby u více než 5 % kapiček nepřesáhla velikost 120 pm.

Dodávání ve dvojdávkovém uspořádání je další výhodná vlastnost intranazálního dodávacího systému pro použití s vakcinami podle vynálezu. Dvojdávková zařízení obsahují dvě dílčí dávky jediné dávky vakcíny, přičemž jedna dílčí dávka je určena k podání do každého nosního otvoru. Obecně jsou dvě dílčí dávky přítomny v jediné komoře a konstrukce zařízení umožní účinné dodávání každé dílčí dávky zvlášť. Alternativně může být pro podávání vakcin podle vynálezu použito zařízení v jednodávkovém uspořádání.

Vynález v dalším provedení poskytuje farmaceutický kit obsahující intranazální podávači zařízení popisované výše, obsahující vakcínu podle vynálezu.

Předkládaný vynález není nutně omezen na rozprašovací dodávání kapalných prostředků. Vakcíny podle vynálezu mohou být podávány v jiných formách, například ve formě prášku.

Vakcina proti chřipce podle vynálezu je s výhodou multivalentní vakcina proti chřipce obsahující dva nebo více kmenů chřipky. Nejvýhodněji jde o trivalentní vakcinu obsahující tři kmeny. Běžné vakciny proti chřipce obsahují tři kmeny chřipky, dva kmeny A a jeden kmen B. Monovalentní vakciny, které mohou být použity například při pandemiích, však nejsou z tohoto vynálezu vyloučeny. Monovalentní vakcina proti chřipce v případě pandemie bude nejpravděpodobněji obsahovat antigen chřipky z jediného kmene A.

Preparáty neživého viru chřipky mohou být odvozeny z běžných metod množení na embryonovaných vejcích, nebo mohou být odvozeny z jakékoli metody nové generace, při které se pro množení φ» ·· φφ φφφ* ·· ·· φ φ · · · · · φφφφ φφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φφ φ φφφ φ φ

-19 - ..· ·*.·.♦.· viru používají tkáňové kultury. Vhodné buněčné substráty pro pěstování viru zahrnují například buňky psí ledviny, jako jsou buňky MDCK nebo buňky z klonu MDCK, buňky podobné MDCK, buňky opičích ledvin jako jsou buňky AGMK včetně buněk Věro, nebo jakýkoli jiný typ savčích buněk vhodných pro výrobu viru chřipky pro vakcinační účely. Mezi vhodné buněčné substráty také patří lidské buňky, například buňky MRC-5. Vhodné buněčné substráty nejsou omezeny na buněčné linie; jsou zahrnuty například také primární buňky jako jsou fibroblasty kuřecích embryí.

Preparát antigenů chřipkového viru může být vyráběn jakýmkoli z celé řady komerčně použitelných postupů, například procesem „split flu“ popsaným v patentech No. DD 300 833 a DD 211 444, které se zařazují odkazem. Tradičně se tento štěpený chřipkový antigen vyráběl působením rozpouštědla/detergentu, jako je tri-n-butylfosfát nebo diethylether v kombinaci s látkou Tween™ (způsob známý jako „Tween-ether“ splitting), přičemž tento způsob se v některých výrobních zařízeních stále ještě používá. Nyní se používají štěpící činidla včetně detergentů nebo proteolytických enzymů nebo solí žlučových kyselin, například deoxycholát sodný, jak se popisuje v patentu No. DD 155 875, který se zařazuje odkazem. Mezi detergenty, které lze používat jako štěpící činidla, patří kationtové detergenty, například cetyltrimethylamoniumbromid (CTAB), další iontové detergenty, například laurylsulfát, taurodeoxycholát, nebo neiontové detergenty, jako jsou látky popisované výše, včetně Tritonu X-100 (například ve způsobu popsaném v Lina a další, 2000, Biologicals 28, 95 - 103) a Tritonu N-101, nebo kombinace kterýchkoli dvou nebo více těchto detergentů. Mezi další vhodná štěpící činidla, která mohou být použita pro výrobu preparátu štěpeného viru chřipky, jsou následující:

1. Žlučové kyseliny a jejich deriváty včetně následujících látek: kyselina cholová, kyselina deoxycholová, kyselina

- ···· ·· ··· · · • « « · • ·

chenodeoxycholovou, kyselina lithocholová, kyselina ursodeoxycholová, kyselina hyodeoxycholová a deriváty jako glyko-, tauro-, amidopropyl-1-propansulfonové, amidopropyl-2hydroxy-1-propansulfonové deriváty výše uvedených žlučových kyselin, nebo N,N-bis(3D-glukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláštním příkladem je deoxycholát sodný (NaDOC), který může být v dávce hotové vakciny přítomen ve stopových množstvích.

2. Alkylglykosidy nebo alkylthioglykosidy, kde délka alkylového řetězce je C6-C18, typicky mezi C8 a C14, cukernou částí je jakákoli pentóza nebo hexóza nebo jejich kombinace s různým způsobem připojení, jako 1—>6, 1—>5, 1—>4, 1->3, 1-2. Alkylový řetězec může být nasycený, nenasycený a/nebo rozvětvený.

3. Deriváty látek uvedených v odst. 2 výše, kde je modifikována jedna nebo více hydroxylových skupin, s výhodou hydroxylová skupina v poloze 6, jako jsou estery, ethoxyláty, sulfáty, ethery, karbonáty, sulfosukcináty, isethionáty, etherkarboxyláty a kvarterní amoniové sloučeniny.

4. Acylové deriváty cukru, kde acylový řetězec má délku mezi C6 a C18, typicky mezi C8 a C 12, cukernou částí je jakákoli pentóza nebo hexóza nebo jejich kombinace s různým způsobem navázání, jako je 1—»6, 1^-5, 1—>4, 1-^-3, 1-2. Acylový řetězec může být nasycený nebo nenasycený a/nebo rozvětvený, cyklický nebo necyklický, s nebo bez jednoho nebo více heteroatomů, jako je N, S, P nebo O.

5. Sulfobetainy struktury R-N,N-(R1 ,R2)-3-amino-1-propan— sulfonátu, kde R je jakýkoli alkylový řetězec nebo arylalkylový řetězec o délce mezi C6 a C18, typicky mezi C8 a C16. Alkylový řetězec R může být nasycený, nenasycený a/nebo rozvětvený. R1 a R2 jsou s výhodou alkylové řetězce s délkou mezi C1 a C4, typicky C1, nebo R1, R2 mohou tvořit heterocyklický kruh spolu s atomem dusíku.

999 · • · ·'· ·· · · ·· ···

6. Betainy struktury R-N,N-(R1 ,R2)-glycinu, kde R je jakýkoli alkylový řetězec o délce mezi C6 a C18, typicky mezi C8 a C16. Alkylový řetězec může být nasycený, nenasycený a/nebo rozvětvený. R1 a R2 jsou s výhodou alkylové řetězce s délkou mezi C1 a C4, typicky mohou C1 nebo R1 a R2 tvořit heterocyklický kruh spolu s atomem dusíku.

7. Ν,Ν-dialkylglukamidy struktury R-(N-R1)-glukamidu, kde R je jakýkoli alkylový řetězec s délkou mezi C6 a C18, typicky mezi C8 a C2. Alkylový řetěz může být nasycený, nenasycený a/nebo rozvětvený nebo cyklický. R1 a R2 jsou alkylové řetězce s délkami mezi C1 a C6, typicky C1. Cukerná část může být modifikována pentózami nebo hexózami.

8. Kvarterní amoniové sloučeniny struktury R,-N⁺(-R1 ,-R2,-R3), kde R je jakýkoli alkylový řetězec mezi C6 a C20, typicky C20. Alkylový řetězec může být nasycený, nenasycený a nebo rozvětvený. R1, R2 a R3 mohou být s výhodou alkylové řetězce s délkami mezi C1 a C4, typicky C1, nebo R1, R2 může tvořit heterocyklický kruh spolu s atomem dusíku. Konkrétním příkladem je cetyltrimethylamoniumbromid (CTAB).

Způsob výroby štěpené vakciny bude zahrnovat řadu různých kroků filtrace a/nebo separace, jako je ultracentrifugace, ultrafiltrace, zonální centrifugace a chromatografie (například s výměnou iontů) v řadě kombinací, a popřípadě také krok inaktivace, například formaldehydem nebo β-propiolaktonem nebo UV zářením, který může být prováděn před nebo po štěpení. Proces štěpení může být prováděn vsádkovým, kontinuálním nebo semikontinuálním způsobem.

Sůl žlučové kyseliny jako je deoxycholát sodný je s výhodou v prostředku štěpené vakciny podle vynálezu přítomna ve stopových množstvích, s výhodou v koncentraci nepřevyšující 0,05 %, nebo • · » 4 > · · » · · ·· nepřevyšující 0,01 %, výhodněji v množství přibližně 0,0045 % (hmotn./obj.).

Preparáty vakciny antigenů štěpeného viru chřipky podle vynálezu s výhodou obsahují zbytkové množství látek Tween 80 a/nebo Triton X-100 z výrobního procesu, ačkoli tyto látky je také možno přidávat nebo mohou být jejich koncentrace nastaveny po přípravě štěpeného antigenů. S výhodou jsou přítomny jak Tween 80, tak Triton X-100. Výhodná rozmezí pro konečné koncentrace těchto neiontových povrchově aktivních látek v dávce vakciny jsou následující:

Tween 80: 0,01 až 1 %, výhodněji přibližně 0,1 % (obj./obj.)

Triton X-100: 0,001 až 0,1 % (hmotn./obj.), výhodněji 0,005 až 0,02 % (hmotn./obj.).

Přítomnost kombinace těchto dvou povrchově aktivních látek v nízkých koncentracích podporuje podle experimentů stabilitu antigenů v roztoku. Je možné, že tato zvýšená stabilita způsobí zvýšenou imunogenicitu antigenů při nazálním podávání, proti dřívějším prostředkům. Takové zvýšení by mohlo pocházet od převahy malých agregátů antigenů, nebo od zlepšení nativní konformace antigenů. Bude zřejmé, že předkládaný vynález není závislý na tom, zda toto teoretické vysvětlení je správné.

Existují také důkazy, že v případě preparátů štěpeného viru chřipky může přítomnost fragmentů úplného viru chřipky asociovaných s virovými proteiny nebo obsahujících virové proteiny, zvláště HA, uchovávat přítomnost antigenů a může přispívat k indukci silné imunitní odpovědi. Antigen štěpeného viru chřipky je tedy možností volby v různých provedeních předkládaného vynálezu.

- 23 ,· • · · · · • · · · · · ·· • · · · · · • · · · · · ·

V konkrétním provedení obsahuje preparát štěpeného viru také laureth 9, s výhodou v rozmezí 0,1 až 20 %, výhodněji 0,1 až 10 % a nejvýhodněji 0,1 až 1 % (hmotn./obj.).

Vakciny podle vynálezu obecně obsahují ne více než 25 % (hmotn./obj.) detergentu nebo povrchově aktivní látky, s výhodou méně 15 % a nejvýhodněji ne více než přibližně 2 %.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález způsob výroby vakciny proti chřipce pro nazální podávání, kde tento způsob zahrnuje:

(i) poskytnutí preparátu štěpeného viru chřipky vyrobeného v podstatě stejným způsobem jako pro běžné vakciny proti chřipce pro injekční (např. intramuskulární) podávání, který obsahuje alespoň jednu neiontovou povrchově aktivní látku;

(ii) popřípadě úpravu koncentrace hemaglutininu a/nebo koncentrace neiontové povrchově aktivní látky v preparátu;

(iii) naplnění dávky vakciny preparátu štěpeného viru chřipky do intranazálního dodávacího zařízení, kde uvedená dávka má vhodný objem pro intranazální podávání, popřípadě ve dvojdávkovém uspořádání.

Další případný krok při způsobu podle tohoto provedení vynálezu zahrnuje přidání povrchově aktivní látky zvyšující absorpci, jako je laureth 9, a/nebo přidání adjuvantní látky, jako je netoxický derivát lipidu A, zvláště 3D-MPL.

Způsoby výroby běžných vakcin na bázi inaktivovaného viru chřipky pro injekční podávání jsou v oboru dobře známy a popsány v literatuře. Tyto způsoby mohou být modifikovány pro výrobu vakciny na sliznice pro podávání v jedné dávce pro použití v rámci předkládaného vynálezu, například zahrnutím kroku zakoncentrování před konečnou sterilní filtrací vakciny, protože intranazální vakciny

4

4 4· s výhodou používají menšího objemu vakcinačního prostředku než vakciny určené pro injekční podávání. Způsob může být také modifikován zahrnutím kroku úpravy koncentrace jiných složek, například neiontových povrchově aktivních látek, na vhodnou velikost (% hmotn./obj.) pro intranazální vakcinu podle vynálezu. Aktivní složka vakciny, tj. chřipkový antigen, však může být v podstatě stejný pro běžnou intramuskulární vakcinu a pro intranazální vakciny pro podávání v jedné dávce podle vynálezu.

Vakciny podle předkládaného vynálezu nezahrnují prostředky, které nesplňují pro všechny kmeny alespoň dvě kritéria EU při podání v jedné dávce.

Vynález bude dále popsán na následujících neomezujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Příprava štěpené chřipkové vakciny

Monovalentní štěpená vakcina byla připravena následujícím postupem:

Příprava inokula viru

V den očkování embryonovaných vajec se připraví čerstvé inokulum smícháním množství určeného pro očkování s fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem s obsahem sulfátu gentamycinu v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortisonu v množství 25 pg/ml (závisí na kmeni viru). Virové inokulum se udržuje při teplotě 2 až 8 °C.

Inokulace embryonovaných vajec

Pro replikaci viru se používají 9 až 11 dnů stará embryonovaná vejce. Skořápky se dekontaminují. Vejce se zaočkují 0,2 ml virového • · · · ···

- 25 ,* inokula. Zaočkovaná vejce se inkubují při vhodné teplotě (závisí na kmeni viru) 48 až 96 hod. Na konci inkubační doby se embrya usmrtí ochlazením a vejce se uchovají 12 až 60 hod při 2 až 8 °C.

Sklizení

Alantoidní kapalina z vychlazených embryonovaných vajec se sklidí. Obvykle se z jednoho vejce odebere 8 až 10 ml surové alantoidní kapaliny. K zásobnímu množství surového monovalentního viru se případně přidá 0,100 mg/ml thiomersalu.

Zakoncentrování a čištění úplného viru z alantoidní kapaliny

1. Vyčeření

Sklizená alantoidní kapalina se vyčeří centrifugací při mírné rychlosti (rozmezí 4000 až 14 000 g).

2. Krok adsorpce

Pro získání gelu CaHPO₄ v zásobním množství vyčeřeného viru se přidá roztok 0,5 mol/l Na₂HPO₄ a 0,5 mol/l CaCI₂ pro dosažení konečné koncentrace CaHPO₄ 1,5 g až 3,5 g CaHPO₄/l v závislosti na kmenu viru.

Po sedimentaci po dobu alespoň 8 hod se supernatant odstraní a sediment obsahující virus chřipky se znovu solibilizuje přidáním roztoku 0,26 mol/l EDTA-Na₂ v závislosti na množství použitého CaHPO₄.

3. Filtrace

Resuspendovaný sediment se zfiltruje na filtrační membráně pm.

·· 44 ·· ···· ·· ·« • 444 · » * » # » » • · · · · ··· · · ·

QC 4 444 4 4 4 4 4 4 4 · ~ £.\J « 4 4 4 4 4 4 4

4. Centrifugace v gradientu sacharózy

Virus chřipky se zakoncentruje isopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém gradientu (0,55 % (hmotn./obj.)) obsahujícím 100 pg/ml thiomersalu. Průtok je 8 až 15 l/hod.

Na konci centrifugace se obsah rotoru oddělí do čtyř různých frakcí (koncentrace sacharózy se měří refraktometrem):

frakce 1	55 až 52 % sacharózy
frakce 2	přibližně 52 - 38 % sacharózy
frakce 3	38 až 20 % sacharózy*
frakce 4	20 až 0 % sacharózy

* závisí na kmeni viru: hranice frakce 3 může být snížena na 15 % sacharózy.

Pro další přípravu vakciny se použijí pouze frakce 2 a 3.

Frakce 3 se promyje diafiltrací s fosfátovým pufrem pro snížení obsahu sacharózy na nižší koncentraci než přibližně 6 %. Virus chřipky přítomný v této zředěné frakci se centrifuguje pro odstranění rozpustných kontaminujících látek.

Usazený virus se resuspenduje a důkladně rozmíchá za získání homogenní suspenze. Frakce 2 a resuspendovaný usazený virus z frakce 3 se spojí a fosfátový pufr se přidá pro získání objemu přibližně 40 I. Tento produkt je koncentrát monovalentního úplného viru.

5. Centrifugace v sacharózovém gradientu s deoxycholátem sodným

Koncentrát monovalentního úplného chřipkového viru se vloží do ultracentrifugy ENI-Mark II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharózový gradient (0,55 % (hmotn./obj.)), přes který se dále převrství gradient deoxycholátu sodného. Tween 80 je přítomen v průběhu štěpení až do koncentrace 0,1 % (hmotn./obj.). Maximální koncentrace deoxycholátu ·· «9 9« 9999 • ♦ · 9 9 9 9

9 9 9999

sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotn./obj.) a závisí na použitém kmenu. Průtok je 8 až 15 l/hod.

Na konci centrifugace se obsah rotoru oddělí do tří různých frakcí (koncentrace sacharózy se měří refraktometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy pro hraniční hodnoty frakcí (47 až 18 %) kolísá podle kmenů a zjistí se po vyhodnocení.

6. Sterilní filtrace

Frakce rozštěpeného viru se filtruje na filtračních membránách, přičemž jako poslední se použije membrána 0,2 pm. Pro ředění se použije fosfátový pufr obsahující 0,025 % (hmotn./obj.) Tweenu 80. Konečný objem zfiltrované frakce 2 je pětinásobek původního objemu frakce.

7. Inaktivace

Zfiltrovaný monovalentní materiál se inkubuje při 22 ± 2 °C nejvýše 84 hod (v závislosti na kmenech viru je možno tuto inkubaci zkrátit). Přidá se fosfátový pufr obsahující 0,025 % Tweenu 80 pro snížení celkového obsahu proteinu na maximálně 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd na konečnou koncentraci 50 pg/ml a inaktivace se nechá probíhat při 20 °C ± 2 °C alespoň 72 hod.

8. Ultrafiltrace

Inaktivovaný materiál štěpeného viru se zakoncentruje alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami z acetátu celulózy s prahovou hodnotou molekulové hmotnosti 20 kDa. Materiál se potom promyje fosfátovým pufrem s obsahem 0,025 % (hmotn./obj.) Tweenu 80 a potom fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem s obsahem 0,01 % (hmotn./obj.) Tweenu.

• to toto · to toto·· ·· to · • tototo ««·· • ····· to · · • to··· · · · · · · • ·· to ··« ·· ·· · · · ·· ····

9. Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtruje na filtračních membránách, přičemž jako poslední se použije membrána 0,2 pm. Konečná koncentrace hemaglutininu měřená metodou SRD (doporučená WHO) by měla být vyšší než 450 g/ml.

10. Skladování

Hotový materiál monovalentní vakciny se uchovává při 2 až 8 °C maximálně 18 měsíců.

Čistota

Čistota byla zjišťována skenováním optické hustoty polyakrylamidových gelů barvených Coomassie modří. Poloha vrcholů byla určena manuálně. Výsledky vzorků jsou uvedeny v tabulce 1:

Tabulka 1

Virové proteiny (HA, NP, M) %	Jiné virové proteiny a proteiny host. buňky
H3N2	HA dimer	HA1+2	NP	M
A/Syd/5/97	10,34	22,34	25,16	37,33	4,83
A/Nan933/95	8,17	15,8	40,09	30,62	5,32
B
B/Har/7/94	5.712	24,07	15,64	50	4,58
B/Yam/166/98	0,68	27,62	21,48	46,02	4,2
H1N1
A/Tex/36/91		33,42	24,46	34,33	7,79
A/Bei/262/95		32,73	35,72	27,06	4,49
H2N2
A/sing/1/57	2,8	39,7	21,78	32,12	3,6

100 % - všechny neidentifikované vrcholy ·· ···* • » · • · ··· • · · • ··

Příklad 2 - Příprava vakcinačních dávek z materiálu vakciny

Hotová vakcina se připravuje formulací trivalentní vakciny z monovalentních zásobních množství s koncentracemi detergentu upravenými podle potřeby.

Voda pro injekce, PBS pH 7,4 10 x koncentrovaný Tween 80 a Triton X-100 se smíchají za získání požadovaných konečných koncentrací (PBS 1 x koncentrovaný, Tween 80 0,15% a Triton X-100 0,02%). Přidají se tři následující inaktivované štěpené viriony, přičemž mezi jednotlivými přídavky se směs 10 min míchá:

pg HAA/Beijing/262/95 (H1N1) pg HA A/Sydney/5/97 (H3N2) pg HA B/Harbin/7/94

Po 15 min míchání se pH nastaví na 7,2 ± 0,2. Objem dávky je 200 pl. Ve vakcině formulované s látkou laureth 9 se laureth 9 přidá před úpravou pH na konečnou koncentraci 0,5 % (hmotn./obj.).

Příklad 3 - Způsoby používané pro měření odpovědí protilátek

1. Detekce specifických protichřipkovych a celkových IgA v lidských nosních sekretech metodou ELISA

Metoda odběru lidských nosních sekretů

Dovnitř spodní nosní konchy (každé nosní dírky) dobrovolníka se vloží dva knoty. Knoty se v nose ponechají 1 minutu před tím, než se vloží do 2 ml NaCl 0,9%, BSA 1% a azid sodný 0,1% (uchovávací pufr). Všechny vzorky se ponechají 2 hod v ledu. Knoty se pak stlačí pro oddělení protilátek. Po centrifugaci (10 min, 2000 g, 4 °C) se kapaliny ze všech vzorků oddělí, rozdělí na alikvoty a až do testu zamrazí při -20 °C. Centrifugáty se suspendují ve 400 pl fyziologické vody a mikroskopicky se zjišťuje kontaminace krevními buňkami. Po • ·

- 30.:..

• ♦ ♦ · • · odběru použitím nosních knotů a zpracování lidských nosních sekretů se provede detekce celkových a specifických protichřipkových IgA dvěma různými testy ELISA:

Zachatávací ELISA pro detekci celkových IgA

Celkové IgA se zachytí na polyklonální afinitně čištěný Ig proti lidským IgA imobilizovaný na mikrotitračních destičkách a provede se detekce použitím různých polyklonálních afinitně čištěných Ig proti lidským IgA navázaných na peroxidázu.

Jako standard pro umožnění kvantifikace slgA v odebraných nosních sekretech se použije čištěný lidský slgA.

Jako referenční se v tomto testu použijí nízké, střední a vysoké hodnoty slgA.

Přímá metoda ELISA pro detekci specifického protichřipkového IgA

Pro každý kmen chřipky přítomný ve vakcině se provede jiný test ELISA. Specifické protichřipkové IgA se zachytí štěpenými inaktivovanými chřipkovými antigeny potaženými na mikrotitračních destičkách a potom se provede detekce s použitím stejného polyklonálního afinitně čištěného Ig proti různým lidským IgA navázaného na peroxidázu, jako se používá v případě ELISA pro celkové IgA.

Reakční činidla

Biologická reakční činidla • Kozí afinitně čištěný Ig proti lidskému IgA (Sigma 1-0884) • Čištěný lidský sekreční IgA (ICN-Cappel 55905) (standard pro kvantifikaci celkových IgA) • Lidský sekreční IgA (kolostrum) (Biogenesis 5111-5504) (reference Bio pro celkové IgA), zředěný pro získání nízkých, středních a vysokých referenčních hladin

Čištěný lidský IgA (Sigma 1-1010) (reference Sig pro celkové igA)

Negativní referenční hodnota pro specifické protichřipkové protilátky metodou ELISA (spojené nosní sekrety s nedetekovatelnými odezvami proti třem kmenům; mezní hodnota ⁼ 0,6 OD450nm)

Pozitivní nízká referenční hodnota pro specifické protichřipkové protilátky metodou ELISA (spojené nosní sekrety s nízkými detekovatelnými odezvami proti třem kmenům)

Pozitivní střední referenční hladina pro specifické protichřipkové protilátky metodou ELISA (spojené nosní sekrety se středními detekovatelnými odezvami proti třem kmenům)

Afinitně čištěný sérový imunoglobulin proti lidskému IgA konjugovaný s HRP (křenová peroxidáza) (ICN 674221)

Štěpený inaktivovaný antigen A/Beijing/262/95 H1N1 z vajec Štěpený inaktivovaný antigen A/Sydney/5/97 H3N2 z vajec Štěpený inaktivovaný antigen B/Harbin/7/94 z vajec

Příprava reakčních činidel • Saturační pufr (PBS, Tween 20 0,1%, BSA 1%, NCS 4%) • NaCI T20 (NaCI 9 g/l, Tween 20 0,05%)

Metoda

Detekce celkových lidských IgA • V množství 100 μΙ/jamku se přidá kozí polyklonální protilátka proti lidskému IgA v koncentraci 1 pg/ml v DPBS a inkubuje se přes noc při 4 °C.

< :

9+ · ·♦ ·

9 9 • 9 ttt

9 9

9 9

9 · 9 ·

Přidá se 200 μΙ/jamku saturačního pufru a inkubuje se 1 hod při 37 °C.

Do první řady se přidá 100 μί/jamku dvojnásobných ředění standardního IgA v saturačním pufru, přičemž se začíná od 250 ng/ml až na 0,12 ng/ml.

Do dalších řad se přidá 100 μί/jamku dvojnásobných ředění vzorků (nosní tekutiny) v saturačním pufru, přičemž se začíná od 1/100 až do 1/102 400, přidá se 100 μί saturačního pufru do sloupce 12 a inkubuje se 2 hod při 22 °C.

Destičky se čtyřikrát promyjí v NaCl T20.

Přidá se 100 μί/jamku kozí protilátky proti lidskému IgA konjugované s peroxidázou v saturačním pufru v koncentraci 1/10 000 a inkubuje se 1 hod při 22 °C.

Destičky se čtyřikrát promyjí v NaCl T20.

Přidá se 100 μί/jamku TMB (tetramethylbenzidin) a inkubuje se při teplotě laboratoře 10 min v temnu.

Reakce se zastaví přidáním 100 μΙ/jamku H2SO4 0,4N.

Měří se absorbance (OD) na každé destičce použitím spektrofotometru při 450 nm s referencí při 630 nm.

Detekce specifického protichřipkového IgA • Přidá se 100 μΙ/jamku každého kmene chřipkového viru v koncentraci 1 pg/ml v DPBS a inkubuje se přes noc při 4 °C.

• Přidá se 200 μΙ/jamku saturačního pufru a inkubuje se 1 hod při 37 °C.

• Přidá se 100 μΙ/jamku dvojnásobných ředění vzorků v saturačním pufru od 1/5 až do 1/640 a destičky se inkubují 2 hod při 22 °C.

4'4 4-«r· ·

4 4

4 4»·

4 * « 4 4 ♦ » ·

4» «4<4 44

Destičky se čtyřikrát promyjí v NaCl T20.

Přidá se 100 μΙ/jamku kozí protilátky proti lidskému IgA konjugované s peroxidázou, zředěné v saturačním pufru na 1/10 000 a inkubuje se 1,5 hod při 22 °C.

Destičky se čtyřikrát promyjí v NaCl T20.

Přidá se 100 μΙ/jamku TMB (tetramethylbenzidin) a inkubuje se při teplotě laboratoře 10 min v temnu.

Reakce se zastaví přidáním 100 μΙ/jamku H2SO4 0,4N.

Měří se absorbance (OD) na každé destičce použitím spektrofotometru při 450 nm s referencí při 630 nm.

Výsledky - vyjádření a výpočty

Vyjádření celkových IgA

Výsledky jsou vyjádřeny jako mikrogramy celkových IgA v 1 ml nosních tekutin s výpočty prováděnými programem Softmaxpro.

Vyjádření specifického protichřipkového IgA

Výsledky jsou vyjádřeny jako konečné jednotkové titry (end-point unit titre), které se vypočtou jako převrácená hodnota posledního ředění, které poskytne OD₄₅o_nm vyšší než mezní hodnota (OD4_50nm = 0,6).

Mezní hodnota se definuje jako nejvyšší optická hustota negativní referenční hladiny (viz validační protokol) při ředění 1/5. Limit detekce odpovídající konečnému jednotkovému titru při mezní hodnotě může být tedy vypočten jako pětinásobek konečných jednotek. Vzorky s titrem menším nebo rovným 5 konečných jednotek budou považovány za negativní a vzorky s titrem větším než 5 konečných jednotek budou považovány za pozitivní.

·♦ ·φ * 9 * *

-34-Ή • · » · · · *· • * ·

»· ν·

Konečné výsledky pro vzorek jsou vyjádřeny následujícím způsobem:

Normalizace specifické odpovědi výpočtem poměru mezi specifickou odpovědí a celkovou koncentrací IgA: konečná jednotka/pg celkových IgA (nejběžněji používaný způsob výpočtu v literatuře).

2. Inhibice hemaglutinační (HAI) aktivity sérových protilátek specifických pro chřipku

K sérům (50 pl) se přidá 200 μΙ RDE (enzym ničící receptor) na 16 hod při 37 °C. Reakce se zastaví 150 μΙ 2,5% citrátu Na a séra se inaktivují při 56 °C 30 min. Připraví se ředění 1:10 přidáním 100 μΙ PBS. Potom se připraví dvojnásobná sériová ředění v 96-jamkových destičkách (se dny ve tvaru V) zředěním 25 μΙ séra (1:10) 25 μΙ PBS. 25 μΙ referenčních antigenů se přidá do každé jamky v koncentraci čtyři hemaglutinační jednotky na 25 μΙ. Ředění antigenů a antiséra se smísí na třepačce mikrotitračních destiček a inkubují se 60 min při teplotě laboratoře. Potom se přidá 50 μΙ kuřecích červených krvinek (RBC) (0,5%) a krvinky se ponechají sedimentovat 1 hod při laboratorní teplotě. Hemaglutinační titr odpovídá převrácené hodnotě posledního ředění séra, které úplně inhibuje hemaglutinaci indukovanou virem.

Příklad 4 - Porovnání imunogenicity intranazální štěpené chřipkové vakciny s imunogenicitou běžně používané parenterální vakciny (Fluarix™) u zdravých dospělých osob

Prostředky používané ve studii

Byly vyhodnocovány dva prostředky (A, B) se štěpenými chřipkovými antigeny odvozenými z vajec. A je intranazální prostředek a B je intramuskulárně podávaný Fluarix™/a-Rix®. Prostředky obsahují tři antigeny inaktivovaných štěpených virionů připravené z kmenů doporučených WHO, sezóna 1998/1999.

• 4 44 • 4 · 4 .-·* ’··;

4444 44 •4 444· · · • 4 4 44 ♦ 4 4 4

4 · * 4 4 4 • 4 4 4 • 4 0 4 • 4 4

4 4

Pro podávání vakcin bylo použito zařízení Accuspray™, což je intranazální stříkačka firmy Becton Dickinson. Zařízení pracuje na podobném principu jako běžná stříkačka, ale je opatřeno speciálním hrotem obsahujícím spirálové kanálky, což vede při aplikaci rovnoměrného tlaku na píst k dosažení rozprášení. Zařízení bylo naplněno 200 μΙ vakciny a do každé nosní dírky bylo vstříknuto 100 μΙ prostředku A.

Složení prostředků

Intranazální formulace (A) obsahovala následující inaktivované štěpené viriony:

1. 30 pg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)

2. 30 pg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)

3. 30 pg HA B/Harbin/7/94 a fyziologický roztok s fosfátovým pufrem pH 7,4 ±0,1, Tween 80 0,1%, Triton X-100 0,015%, Na deoxycholát 0,0045% a thiomersal s koncentrací nižší než 35 pg/ml.

Objem jedné dávky byl 200 pl (dílčí dávky 100 pl do každé nosní dírky).

Pro srovnání použitá vakcina Fluarix™/ct-Rix® je komerční inaktivovaná trivalentní štěpená vakcina proti chřipce firmy SmithKline Beecham Biologicals. Dávka 500 pl byla podána intramuskulárně.

Tato dávka obsahuje:

pg HA tří kmenů uvedených výše, Tween 80 mezi 500 a 1000 pg na ml (0,05% - 0,1%), Triton X-100 mezi 50 a 170 pg/ml (0,005% - 0,017%), deoxycholát sodný maximálně 100 pg/ml, thiomersal 100 pg/ml a fyziologický roztok s fosfátovým pufrem s pH mezi 6,8 a 7,5.

09

9 0 9

0 9

- 36 ,· ··:

0000 90

0099 0« 0»

0 9 9 9 0 0

0 009 9· 0

000 900 · 0

9 0 9 9 0

090 00 9990

Studie imunogenicity

V otevřené, kontrolované a randomizované studii byla vyhodnocována imunogenicita intranazální štěpené chřipkové vakciny formulované s látkami Tween 80 & Triton X-100 v porovnání s běžnou parenterální vakcinou (tj. Fluarix™). Dvacet zdravých dospělých osob (věk 18 až 40 let) dostalo jednu dávku vakciny Fluarix™ a deset osob dostalo jednu dávku intranazální vakciny proti chřipce. Intranazální formulace (200 pl) obsahovala následující inaktivované viriony: 30 pg hemaglutininu A/Beijing/262/95 (H1N1), 30 pg hemaglutininu

A/Sydney/5/97 (H3N2), 30 pg hemaglutininu B/Harbin/7/94 s fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (pH 7,4 ± 0,1), Tween 80 (0,1%), Triton X-100 (0,015%), deoxycholát sodný (0,0045%) a thiomersal (< 35 pg/ml).

Po dobu 8 dnů bylo prováděno pozorování zaměřené na místní a celkové příznaky, přičemž obě vakciny byly z hlediska bezpečnosti a reaktogenicity dobře snášeny. Nebyly hlášeny žádné vážné nepříznivé události související s vakcinaci.

Imunogenicita vakcin byla vyšetřována stanovením titrů inhibice hemaglutinace (Hl) v séru pro zjištění míry sérokonverze (definována jako procento vakcinovaných, u kterých došlo k alespoň čtyřnásobnému zvýšení titrů Hl v séru v den 21 ve srovnání s dnem 0 pro každý kmen ve vakcině), faktoru konverze (definován jako násobek zvýšení Hl v séru (geometrické střední titry, GMT) v den 21 ve srovnání s dnem 0 pro každý kmen ve vakcině) a míra séroprotekce (definováno jako procento vakcinovaných s titrem Hl v séru >40 po vakcinaci (pro každý kmen ve vakcině), které se přijímá jako ukazatel ochrany). Navíc byla zjišťována odpověď protilátek IgA ve sliznici testem ELISA.

»♦ OM • · • ··· ·· #« φ * * « » · « • · ·♦ « · ···· ·«

Séropozitivita, serokonverze a seroprotekce Hl 21 dnů po jedné dávce Fluarix™ nebo intranazální formulace je uvedena v tabulce 2. Faktor konverze lze nalézt v tabulce 2a.

Tabulka 2

Míry séropozitivity, sérokonverze a séroprotekce Hl 21 dnů po dávce 1

Kmen	Skupina	Čas	N	Séropozitivita	Séroprotekce	Sérokonverze
n	%	n	%	n	%
A/Beijing	Intranazální	den 0	20	4	20,0	0	0,0
	vakcína plus
	Tween 80 &	den 21	20	17	85,0	15	75,0	15	75,0
	Titron X100
	Fluarix™	den 0	19	4	21,1	3	15,8
		den 21	19	19	100,0	18	94,7	19	100,0
A/Sydney	Intranazální	den 0	20	13	65,0	3	15,0
	vakcína plus
	Tween 80 &	den 21	20	20	100,0	19	95,0	15	75,0
	Titron X100
	Fluarix™	den 0	19	14	73,7	1	5,3
		den 21	19	10	100,0	18	94,7	16	84,2
B/Harbin	Intranazální	den 0	20	10	50,0	7	35,0
	vakcína plus
	Tween 80 &	den 21	20	20	100,0	18	90,0	14	70,0
	Titron X100
	Fluarix™	den 0	19	17	89,5	11	57,9		78,9
		den 21	19	19	100,0	19	100,	15
							0

Séropozitivita (n, %): počet a procento osob s titrem >10

Séroprotekce (n, %): počet a procento osob s titrem >40

Sérokonverze (n, %): počet a procento osob s alespoň čtyřnásobným zvýšením titrů v rozmezí den 0 až den21

Ve všech případech byl faktor konverze (násobek zvýšení GMT sérového Hl po vakcinaci) vyšší než 2,5, nezbytný pro úspěšnou vakcinu proti chřipce.

** ·· • · · · • · · OO · *♦·

- 38 · * ·♦ «<*·· »€ «Φ • 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 9999

Procento osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným zvýšením poměru specifické/celkové protilátky IgA ve sliznici mezi dnem 21 a dnem 0 (1 dávka) je vidět v tabulce 3.

Tabulka 3

Procenta osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným zvýšením poměru specificky/celkovy IgA mezi dny 21 a 0 (1 dávka)

Kmen	Skupina	N	Dvojnásobné zvýšení %	Čtyřnásobné zvýšení %
A/Beijing	Tween & Triton	20	55,0	30,0
	Fluarix™	19	52,6	26,3
A/Sydney	Tween & Triton	20	65,0	45,0
	Fluarix™	19	47,4	5,3
B/Harbin	Tween & Triton	20	40,0	30,0
	Fluarix™	19	26,3	5,3

Souhrn

Výsledky imunogenicity uvedené v tabulce výše ukazují, že intranazální prostředek poskytoval podobné míry séropozitivity, sérokonverze a séroprotekce jako hodnoty poskytnuté běžnou parenterální vakcinou (Fluarix™) 21 dnů po jedné dávce. Intranazální formulace poskytovala lepší odpověď IgA ve sliznici po jedné dávce než běžná parenterální vakcina (Fluarix™).

··*· * * • ·»· • tt tt • · · « • · · « ·♦« -» · ·♦·· ··

Příklad 5 - Srovnání imunoqenicity intranazální štěpené chřipkové vakciny formulované s látkami laureth 9, Triton X-100 a Tween 80, s imunogenicitou běžně používané parenterální vakciny (Fluarix™) u zdravých dospělých osob

Byla vyhodnocována intranazální formulace štěpených chřipkových antigenu odvozených z vajec připravená s látkami laureth 9, Triton X-100 a Tween 80 (A) ve srovnání s vakcinou Fluarix™/a-Rix® (B). Formulace obsahovaly tři antigeny štěpených virionů připravené podle doporučení WHO ze sezóny 1998/1999. Pro podávání vakcín se používalo zařízení Accuspray™, což je intranazální stříkačka firmy Becton Dickinson. Zařízení pracuje na podobném principu jako běžná stříkačka, ale je opatřeno speciálním hrotem obsahujícím spirálovité kanálky, kterým se dosáhne rozprášení, pokud se vykonává rovnoměrný tlak na píst. Do každé nosní dírky bylo vstříknuto 100 pl prostředku.

Složení prostředku

Intranazální prostředek (A) obsahoval následující inaktivované štěpené viriony:

1. 30 pg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)

2. 30 pg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)

3. 30 pg HA B/Harbin/7/94 a fyziologický roztok s fosfátovým pufrem pH 7,4 ±0,1, Tween 80 0,1%, Triton X-100 0,015%, deoxycholát sodný 0,0045% a thiomersal 35 pg/ml.

Objem jedné dávky byl 200 pl (dílčí dávky 100 pl do každé nosní dírky). Prostředek A byl formulován s látkou laureth 9 v konečné koncentraci 0,5 % (hmotn./obj.).

• 4 4444 *

4 ·· • 4

44

4 4 4 4

4 4 4

44444 4 4

4 4 4 4

4444 44 44 444

4 4

4 4

4

4

4 4 ·«··

Srovnávací vakcina Fluarix™/a-Rix® (B) je komerční inaktivovaná trivalentní štěpená chřipková vakcina firmy SmithKlineBeecham Biologicals, která se podává intramuskulárně v dávce 500 pl.

Studie imunogenicity

Otevřená, kontrolovaná a randomizovaná studie vyhodnocovala imunogenicitu intranazální štěpené chřipkové vakciny formulované s látkou laureth 9 doplněnou látkami Tween 80 a Triton X-100 ve srovnání s běžnou parenterální vakcinou (tj. Fluarix™). Dvacet zdravých dospělých osob (stáří 18 až 40 let) dostalo jednu dávku vakciny Fluarix™ a deset osob dostalo jednu dávku (dvě dílčí dávky, jedna do každé nosní dírky) intranazální chřipkové vakciny.

Po dobu osmi dnů bylo prováděno pozorování zaměřené na místní a celkové příznaky, přičemž bylo zjištěno, že obě vakciny jsou z hlediska bezpečnosti a reaktogenicity dobře tolerovány. Nebyly hlášeny žádné vážné nepříznivé události v souvislosti s vakcinaci.

Imunogenicita vakcin byla vyšetřována zjišťováním titrů inhibice hemaglutinace (Hl) v séru pro zjištění míry sérokonverze (definována jako procento vakcinovaných, u kterých došlo k alespoň čtyřnásobnému zvýšení titrů Hl v séru v den 21 ve srovnání s dnem 0 pro každý kmen ve vakcině), faktor konverze (definovaný jako násobek zvýšení geometrických středních titrů (GMT) sérové Hl v den 21 ve srovnání s dnem 0 pro každý kmen ve vakcině) a míra séroprotekce (definovaná jako procento vakcinovaných s titrem Hl v séru >40 po vakcinaci (pro každý kmen ve vakcině), která je akceptována jako ukazatel ochrany). Navíc byla zjišťována odpověď protilátek IgA ve sliznici metodou ELISA.

* — *· ♦ · ·

9 9

9 9

999 ·· 9999 99 99

9 9 · 9 9 9

9 9 99 9 9 ·>

• · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 9999

Séropozitivita, serokonverze a séroprotekce HI 21 dnů po jedné dávce vakciny Fluarix™ nebo intranazální formulace jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Míry séropozitivity, sérokonverze a séroprotekce HI 21 dnů po dávce 1

Kmen	Skupina	Čas	N	Séropozitivita	Séroprotekce	Sérokonverze
n	%	n	%	n	%
A/Beijing	Intranazální	den 0	20	5	25,0	1	5,0
	vakcina plus
	Laureth 9	den 21	20	19	95,0	10	50,0	15	75,0
	Fluarix™	den 0	19	4	21,1	3	15,8
		den 21	19	19	100,0	18	94,7	19	100,0
A/Sydney	Intranazální	den 0	20	16	80,0	4	20,0
	vakcina plus
	Laureth-9	den 21	20	20	100,0	19	95,0	15	75,0
	Fluarix™	den 0	19	14	73,7	1	5,3
		den 21	19	19	100,0	18	94,7	16	84,2
B/Harbin	Intranazální	den 0	20	18	90,0	11	55,0
	vakcina plus
	Laureth-9	den 21	20	20	100,0	19	95,0	12	60,0
	Fluarix™	den 0	19	17	89,5	11	57,9
		den 21	19	19	100,0	19	100,0	15	78,9

Séropozitivita (n, %): počet a procento osob s titrem >10

Séroprotekce (n, %): počet a procento osob s titrem >40

Sérokonverze (n, %): počet a procento osob s alespoň čtyřnásobným zvýšením titrů mezi dny 0 a 21

Ve všech případech byl faktor konverze (násobek zvýšení GMT sérového HI po vakcinaci) vyšší než 2,5, což je hladina požadovaná pro úspěšnou protichřipkovou vakcinu.

Procento osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným zvýšením poměru specifické/celkové protilátky IgA ve sliznici mezi dnem 21 a dnem 0 (1 dávka) je možno nalézt v tabulce 5.

·· 99 *9 ··«· ·9 99 • 9 9 · 9 9 · 9 9 · 9 • 9 9 * 9 9·9 9 9 · ,· ····· · 999 · 9

- 49 ·- 999 9999

Μ#·· 99 99 999 99 9999

Tabulka 5

Procenta osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným zvýšením poměru specifického/celkového IgA mezi dnem 21 a dnem 0 (1 dávka)

Kmen	Skupina	N	Dvojnásobné zvýšení %	Čtyřnásobné zvýšení %
A/Beijing	Laureth-9	20	50,0	20,0
	Fluarix™	19	52,6	26,3
A/Sydney	Laureth-9	20	55,0	25,0
	Fluarix™	19	47,4	5,3
B/Harbin	Laureth-9	20	15,0	10,0
	Fluarix™	19	26,3	5,3

Souhrn

Výsledky imunogenicity uvedené v tabulce výše ukazují, že intranazální prostředek poskytoval podobné míry séropozitivity, sérokonverze a séroprotekce jako běžná parenterální vakcina (Fluarix™) 21 dnů po jedné dávce. Intranazální formulace obecně poskytovala lepší odpověď IgA ve sliznici po jedné dávce než běžná parenterální vakcina (Fluarix™).

Příklad 6 - Vyhodnocení intranazální chřipkové vakciny s a bez látek laureth 9 + 3D-MPL u myší po úvodním podání

6.1 V prvním experimentu byly myši vakcinovány testovacími prostředky obsahujícími stejné kmeny chřipky jako kmeny použité pro úvodní podání (priming).

Postup experimentu

Samice myší Balb/c (stáří 8 týdnů) dostaly při úvodním podání intranazálně v den 0 inaktivovanou trivalentní vakcinu úplného viru chřipky odvozenou z vajec (inaktivace β-propiolaktonem) kmenů

-4^ *· ·· • « · • · · • ··· t · ··« φφ • φ ···« φφ • · · r φ « · • · «φφ · · · • « * · · · · φ · φ φφφ φφ φφφ *φ φφφφ

A/Beijing/262/95, A/Sydney/5/97 a B/Harbin/7/94; 5 pg HA/kmen), aby se dosáhlo napodobení přirozeného úvodního podání, ke kterému dochází u lidí.

Po 28 dnech byly myši (10 zvířat ve skupině) intranazálné vakcinovány následujícími trivalentními vakcinami obsahujícími stejné kmeny jako vakciny použité pro úvodní podání:

Skupina	Způsob podání (metoda)	Trivalentní štěpené antigeny	Další složky
Prostá vakcína 1	Intranazálné (kapky)	3,0 pg HA/kmen	ne
Prostá vakcína 2	Intranazálné (kapky)	1,5 mg HA/kmen	ne
L9	Intranazálné (kapky)	1,5 pg HA/kmen	0,5 % Laureth-9
L9 + MPL	Intranazálné (kapky)	0,75 pg HA/kmen	0,5 % Laureth-9 + 5 pg MPL
Parenterální	Intramuskulárně (injekce)	1,5 pg HA/kmen	ne

Intranazální vakciny podávané myším se podobají vakcinám, které byly lidem podávány v příkladu 7 s tím rozdílem, že dávka podaná myším odpovídá 1/10 dávky pro člověka.

Vzorky sér byly odebírány v den 42 a testovány na protilátky inhibující hemaglutinaci (Hl). Po usmrcení myší (den 42) byly provedeny nosní výplachy, které byly testovány na titry protilátky IgA metodou ELISA. Specifické protilátky IgA byly měřeny jako konečné titry (end point titres, EPT) a výsledky byly vyjádřeny jako EPT pro specifický IgA na pg celkových IgA s cílem vyloučit případné rozdíly, které mohly být způsobeny metodou vzorkování.

Výsledky

Prvním cílem této studie bylo potvrzení, že formulace intranazální vakciny jsou schopny vyvolat titry Hl v séru, které se podstatně neliší od titrů dosažených při parenterálním podání. Obr. 1 ·· ·· ···« ·· €· • · * · 9 9 9 ····

9 9 9 9 999 9 9 9

999 999 9999 9 “ ·· 99 999 99 9999 ukazuje titry HI pozorované v séru v den den 42 (tj. 14 dnů po vakcinaci) různými vakcinami.

Statistická analýza (statistický komparativní test Tukey-HSD) byla prováděna u pozorovaných titrů HI s cílem srovnat intranazální vakciny s parenterální vakcinou. Titry HI pozorované u skupin Prostá vakcina 1 a 2 byly významně odlišné (p<0,05) od titrů indukovaných parenterální vakcinou pro dva ze tří kmenů chřipky (kmeny A/H1N1 a B). Titry proti kmenu A/H3N2 nebyly významně odlišné. Prostředek L9 měl stejnou imunogenicitu jako parenterální vakcina u dvou ze tří kmenů (kmeny A/H3N2 a B). Naopak vakcina formulovaná s L9 + MPL vyvolávala protilátky HI proti třem kmenům chřipky s titry, které se významněji nelišily od titrů pozorovaných u parenterální vakciny.

Druhým cílem experimentu bylo zjistit, zda odpověď nosních IgA je nebo není lepší než odpověď pozorovaná u zvířat, kterým byla intramuskulámě podána zesilující dávka.

Obr. 2 ukazuje odpověď nosních IgA 14 dnů po zesilující vakcinaci (den 42).

Nebyly nalezeny žádné významné rozdíly mezi odpověďmi indukovanými kteroukoli z intranazálních formulací. Intranazální podávání vyvolalo dva až čtyřikrát silnější odpovědi ve srovnání s parenterální cestou. Konečně vakcina formulovaná s L9 + MPL byla schopna zachovat stejnou míru odpovědi ve srovnání s jinými intranazálními akcinami, ale s nižší dávkou antigenů.

Závěry

Trivalentní antigeny štěpeného viru chřipky formulované s L9 + MPL (0,75 pg HA + 0,5% Laureth 9 + 5 pg MPL) poskytly nejimunogennější intranazální vakcinu z hlediska odpovědi protilátky HI.

• ·

Všechny testované vakciny podávané nosem byly silnější při indukci lokálních protilátek IgA než parenterálně podávaná vakcína. Formulace L9 + MPL indukovala podobnou odpověď jako jiné formulace, ale se sníženým obsahem antigenů.

6.2 Ve druhém experimentu byly myši imunizovány intranazálně kmeny, které byly odlišné od kmenů použitých pro úvodní dávku.

U každoročních epidemií lze pozorovat posun antigenů. Kmeny, které se každoročně přidávají do vakciny proti chřipce, jsou nejnověji nalezené kmeny; v terénu však mohou být nalezeny i jiné kmeny, které jsou s nimi více nebo méně příbuzné. Důsledkem je, že nejlepší kandidát na vakcinu proti chřipce má indukovat ochranu proti širokému rozmezí kmenů. Proto byla snaha zjistit, do jaké míry byla daná intranazální formulace schopna vyvolat imunitní odpověď po „úvodní“ dávce kmeny, které byly vzhledem ke kmenům obsaženým ve vakcině heterologní.

Postup experimentu

Samicím myší Balb/c (stáří 8 týdnů) byla intranazálně podána „úvodní dávka“ v den 0 β-propiolaktonem inaktivované trivalentní vakciny úplného viru chřipky odvozené z vajec (A/Johannesburg/82/96 H1N1, A/Johannesburg/33/94 H3N2 a B/Panama/45/90; 5 pg

HA/kmen), aby se napodobil přirozený „priming“, ke kterému dochází u lidí.

Po 28 dnech byly myši (10 zvířat ve skupině) intranazálně vakcinovány následujícími trivalentními vakcinami (obsahujícími jako heterologní kmeny A/Beijing/262/95 H1N1, A/Sydney/5/97 H3N2 a B/Harbin/7/94).

Skupina

Způsob podání (metoda)

Trivalentní štěpené antigeny

Další složky

• ·

Prostá vakcina 1	Intranazálně (kapky)	3,0 pg HA/kmen	ne
Prostá vakcina 2	Intranazálně (kapky)	1,5 mg HA/kmen	ne
L9	Intranazálně (kapky)	1,5 pg HA/kmen	0,5 % Laureth-9
L9 + MPL	Intranazálně (kapky)	0,75 pg HA/kmen	0,5 % Laureth-9 + 5 pg MPL
Parenterální	Intramuskulárně (injekce)	1,5 pg HA/kmen	ne

Množství trivalentních štěpených virionů obsažených v různých intranazálních vakcinách testovaných na myších opět odpovídalo 1/10 dávky podávané lidským dobrovolníkům v příkladu 7.

Vzorky séra byly odebrány v den 42 a testovány na protilátky inhibující hemaglutinaci (Hl). Po usmrcení (den 42) byly provedeny nosní výplachy, které byly testovány na titry protilátek IgA metodou ELISA. Specifické protilátky IgA byly měřeny jako konečné titry (EPT) a výsledky byly vyjádřeny jako EPT specifických IgA na pg celkových IgA pro vyloučení případného rozdílu v důsledku metody vzorkování.

Výsledky

Prvním cílem této studie bylo zjistit, zda jsou intranazální vakciny schopny vyvolat odpovědi Hl v séru proti antigenům ve vakcině, jestliže se pro úvodní podání použijí heterosubtypové kmeny. Obr. 3 ukazuje titry Hl pozorované v séru 14 dnů po vakcinaci (den 42) různými vakcínami.

Všechny intranazální formulace (s L9 nebo L9 + MPL) byly schopny indukovat imunitní odpovědi zaměřené na tři kmeny chřipky, které byly srovnatelné s odpověďmi vyvolanými parenterálním podáním prosté (bez L9 nebo L9 + MPL) vakciny. Statistická analýza (statistický komparativní test Tukey-HSD) potvrdila, že odpovědi vyvolané všemi intranazálními formulacemi nebyly podstatně (p>0,05) odlišné od odpovědí vyvolaných při parenterálním podání. V rámci * · • · · · ·· ·· • · · ·

A—r · · ··

- 47 intranazálních prostředků nebyly pozorovány žádné statistické rozdíly. Formulace L9 + MPL a L9 však obecné měly vyšší imunogenicitu, přičemž systém L9 + MPL obsahoval polovinu obsahu antigenu než systém s L9 (0,75 pg proti 1,5 pg HA).

Druhým cílem bylo zjistit (1) zda po intranazální vakcinaci je měřitelná nosní odpověď na specifický IgA pro heterologní kmeny a (2) zda tato odpověď byla lepší než odpověď pozorovaná u zvířat vakcinovaných intramuskulárně.

Obr. 4 ukazuje nosní odpověď specifického antiheterologního IgA zaznamenanou 14 dnů po vakcinaci (den 42).

Obě kritéria druhého cíle výzkumu byla splněna. Všechny intranazální formulace indukovaly odpovědi IgA proti třem heterologním kmenům, které byly tři až osmkrát vyšší než odpovědi pozorované u intramuskulární injekce prosté vakciny. Amplituda odpovědí IgA se podstatně nelišila mezi jednotlivými intranazálními formulacemi.

Velikost odpovědí pozorovaných u heterologní vakcinace dosáhla stejných hodnot jako pro homologní vakcinaci (viz obr. 2).

I v tomto případě byla vakcina formulovaná s L9 + MPL schopna udržet stejnou amplitudu odpovědi s nižší dávkou antigenu (0,75 pg HA) ve srovnání s prostou vakcinou nebo formulacemi s L9 (3 a 1,5 pg HA).

Závěry

Intranazální podávání trivalentní štěpené chřipkové vakciny s nebo bez povrchově aktivní látky nebo adjuvans zvyšujícími absorpci bylo schopno indukovat heterosubtypové odpovědi jak z hlediska protilátky Hl v séru, tak i pro intranazální IgA specifické pro kmeny obsažené v chřipkové vakcině.

• · · · • · • · ·· • · • ·

Ačkoli rozdíly mezi skupinami nebyly statisticky významné, vakciny, ve kterých byly trivalentní štěpené viriony formulovány s L9 nebo L9 + MPL indukovaly obecně silnější systémovou i lokální imunitní odpověď. Navíc indukovala vakcina formulovaná s L9 + MPL ve srovnání s vakcinou obsahující L9 stejnou míru imunity, ale s nižší dávkou antigenů.

Příklad 7 - Vyhodnocení intranazálně podávané trivalentní chřipkové vakciny se štěpenými viriony odvozené z vajec s nebo bez látek laureth 9 nebo laureth 9 + 3D-MPL při podání ve schématu s jednou dávkou, v porovnán? s intramuskulárně podávanou trivalentní chřipkovou vakcinou se štěpenými viriony, u zdravých dospělých osob věku 18 až 40 let

Při této studii se vyhodnocují lokální odpovědi na sliznicích a systémové imunitní odpovědi na vakciny u přibližně 120 zdravých mužů a žen.

Složení testovaných vakcin

Při této studii se testuje pět formulací štěpených chřipkových antigenů odvozených z vajec. Testované vakciny se podávají intranazálně. Navíc se pro porovnání podává vakcina firmy SmithKline Beecham Biologicals - Fluarix™, což je intramuskulárně podávaná protichřipková vakcina se štěpenými viriony.

Testované intranazální vakciny obsahují tři antigeny inaktivovaných štěpených virionů použité ve formulaci vakciny Fluarix™. Kmeny jsou doporučeny WHO pro sezónu 2000 pro jižní polokouli. Obecný popis různých formulací je uveden v tabulce 6.

Tabulka 6

Obecný popis vakcin ·· ·· · · · · · · ·· ·· • · · · · · · · « · · • · · · · · · · · · · • ····· · · · · · · • · · · · · · · ···· ·· »· ··· ·· ····

Podávání	Antigen na dávku (pg HA/kmen)	Další složky
Intranazálně	30 pg	ne
Intranazálně	15 pg	ne
Intranazálně	15 pg	Laureth-9
Intranazálně	7,5 pg	Laureth-9
Intranazálně	7,5 pg	Laureth-9 + 3D-MPL
Intramuskulárně	15 pg	ne

Intranazální trivalentní štěpené chřipkové vakciny bez L9 nebo MPL (dávka 3 pg a 15 pg)

Objem jedné dávky je 0,2 ml.

Tabulka 7

Složka	Množství na dávku*
Inaktivované štěpené viriony
- A/New Caledonia/20/99 (H1N1)	30 nebo 15 pg HA
-A/Sydney/5/97 (H3N2)	30 nebo 15 pg HA
-B/Yamanashi/166/98	30 nebo 15 pg HA
Fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (pH 7,0-7,4)
- Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný	8,10 mM
- Dihydrogenfosforečnan sodný	1,47 mM
- Chlorid draselný	2,70 mM
- Chlorid sodný	137 mM
Triton X100	0,02 %
Tween 80	0,15 %
Voda pro injekce	0,2 ml
Zbytkový thiomersal	< 2 pg

· · · <

I · · » · · · «

- 50 * Každá lahvička pro intranazální podávání obsahuje 20% přebytek objemu

Intranazální trivalentní štěpené chřipkové vakciny formulované s L9 (dávka 15 g a 7,5 ug)

Objem jedné dávky je 0,2 ml. Složení je ukázáno v tabulce 7, přičemž dále je obsažen 1 mg látky laureth 9 na dávku spolu s dávkou 15 nebo 7,5 pg HA na kmen. Laureth 9 je od firmy Kreussler, Německo.

Intranazální trivalentní štěpená chřipková vakcina formulovaná s L9 +

3D-MPL (dávka 7,5 ug)

Objem jedné dávky je 0,2 ml. Složení je ukázáno v tabulce 7, přičemž navíc je obsaženo 1 mg látky laureth 9 a 50 pg 3D-MPL na dávku spolu s dávkou 7,5 pg HA na kmen.

Komerční inaktivovaná trivalentní štěpená chřipková vakcina Fluarix™ použitá pro srovnání

Pro srovnání se používá vakcina Fluarix™ 2000 (jižní polokoule). Tato vakcina v dávce 0,5 ml se podává intramuskulárně.

Jedna dávka obsahuje 15 pg hemaglutininu z každého kmene viru chřipky (A/New Caledonia/20/99 (H1N1) - A/Sydney/5/97 (H3N2) B/Yamanashi/166/98) a 50 pg thiomersalu jako ochranné látky na jednu dávku.

Složení testovaných trivalentních štěpených chřipkových vakcín

1. Zakoncentrování tří inaktivovaných štěpených virionů

Před vytvořením hotových testovacích vakcin byly inaktivované štěpené viriony odděleně zakoncentrovány filtrací s tangenciálním tokem na 1000 až 1500 pg HA na ml. Byly použity membránové kazety opatřené membránami z triacetátu celulózy s mezní hodnotou 10 kDa.

» 4·· · • 4

4··

2. Formulace trivalentních štěpených chřipkových vakcin

Schéma formulace je uvedeno dále:

Voda pro injekce +

Fyziologický roztok s fosfátovým pufrem pH 7,4 +

Tween 80 do 0,15 % +

Triton X 100 do 0,02 % + ->míchání 5 min při teplotě laboratoře

Kmen A/New Caledonia/20/99 150 nebo 75 nebo 37,5 pg HA/ml + ->míchání 5 min při teplotě laboratoře

Kmen A/Sydney/5/97 150 nebo 75 pg HA/ml + -smíchání 5 min při teplotě laboratoře

Kmen B/Yamanashi/166/98 150 nebo 75 pg HA/ml + ->míchání 5 min při teplotě laboratoře

Úprava pH na 7,2 ± 0,2

Hotový materiál

->skladování při +2 až +8 °C • · i · • * ·· • · · · • · · • · · ·

- · · • · · · · ·

Pro formulace obsahující látku laureth 9 se laureth-9 do 0,5 % přidává bezprostředně před úpravou pH a míchání pokračuje při teplotě laboratoře 15 min.

Pro formulace obsahující laureth 9 + 3D-MPL se přidá 250 pg/ml 3D-MPL bezprostředně před přidáním látky laureth 9 a směs se míchá 15 min před přidáním laureth 9.

Rozplňování testovacích trivalentních štěpených chřipkových vakcin

Hotový materiál se asepticky plní do skleněných lahviček typu 1 (Evropský lékopis) firmy Pfeiffer (Německo). Ihned po rozplnění se tyto lahvičky uzavřou kaučukovou zátkou. Všechny operace se provádějí v aseptickém prostoru (systém s laminárním tokem).

Po rozplnění a uzavření se zavíčkované lahvičky vloží do pístu z plastické hmoty a vloží se do zařízení s rozprašovací tryskou pro vytváření nástřiku. Toto zařízení umožní podání dvou nástřiků po 100 μΙ.

Výsledky

Pro všechny subjekty se provede následující analýza:

1. Ve dnech 0, 21 a 42: IgA ve sliznici (lokální imunitní odpověď) jako titry ELISA se testují odděleně pro každý ze tří kmenů viru chřipky obsažených ve vakcíně.

2. Ve dnech 0, 21 a 42: titry protilátky inhibující hemaglutinaci (Hl) se testují odděleně pro každý ze tří kmenů chřipky.

♦ 0 · · · ·

0 • · · 0

- 53 Z těchto hodnot lze odvodit:

1. Hodnoty GMT Hl protilátky v séru (s 95% intervaly spolehlivosti) ve všech časech.

2. Pro Hl: míry sérokonverze v den 21.

3. Pro Hl: konverzní faktory v den 21.

4. Pro Hl: míry ochrany ve dnech 21 a 42.

5. Pouze pro IgA: procento osob, u kterých došlo ke dvojnásobnému a čtyřnásobnému zvýšení titrů IgA mezi dny 0 a 21 a dny 0 a 42.

Zastupuje:

♦* ·«♦· * * • · ·· 'fy.tm- λμ *· ·· • · 4 · • · 4

-54- .· ··:

Claims (32)

1. Použití preparátu antigenu neživého viru chřipky při výrobě vakciny pro intranazální vakcinaci proti chřipce pro podávání v jedné dávce, kde vakcinace jednou dávkou vytvoří imunitní odpověď splňující mezinárodní předpisy na vakciny proti chřipce.

2. Použití podle nároku 1, kde vakcinace jednou dávkou splní alespoň dvě ze tří kritérií Evropské unie pro míru sérokonverze, míru séroprotekce a faktor sérokonverze pro kmen nebo všechny kmeny chřipky přítomné ve vakcině.

3. Použití podle nároku 2, kde kritéria Evropské unie jsou splněna pro všechny kmeny chřipky zastoupené ve vakcině.

4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, kde preparát antigenu viru chřipky se volí ze skupiny preparátů antigenů štěpeného viru, subjednotkových antigenů a chemicky nebo jinak inaktivovaného úplného viru.

5. Použití podle nároku 4, kde preparát chřipkového antigenu je preparát antigenu štěpeného viru.

6. Použití podle některého z nároků 1 až 5, kde prostředek obsahuje alespoň jednu povrchově aktivní látku.

9« · · 9·9· 9 · »·

9999 999 ··«»

99 9 9 9 9 99 9 9 9 r- r- 9 999 999 9 9 9 9 9

- 00 - · 999 999«

9999 99 99 9·« 4 « 949·

7. Použití podle nároku 6, kde povrchově aktivní látkou je alespoň jedna neiontová povrchově aktivní látka zvolená ze skupiny oktylfenoxypolyethoxyethanolů, například komerčně dostupné řady Triton™, polyoxyethylensorbitanových esterů řady Tween™ a polyoxyethylenových etherů nebo esterů obecného vzorce (I):

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R (I) kde n je 1 až 50, A je vazba nebo skupina -C(0)-, R je C1-50alkyl nebo fenyl-Ci-50-alkyl, a kombinace dvou nebo více těchto látek.

8. Použití podle nároku 7, kde neiontovou povrchově aktivní látkou je alespoň jedna povrchově aktivní látka zvolená ze skupiny t-oktylfenoxypolyethoxyethanol tj. Triton X-100, polyoxyethylensorbitanmonooleát tj. Tween 80 a iaureth 9, nebo kombinace dvou nebo více těchto látek.

9. Použití podle nároku 8, kde vakcina obsahuje kombinaci dvou ze tří neiontových povrchově aktivních látek, totiž polyoxyethylensorbitanmonooleát tj. Tween 80 a t-oktyl-fenoxypolyethoxyethanol, tj. Triton X-100.

10. Použití podle nároku 9, kde vakcina obsahuje kombinaci všech tří neiontových povrchově aktivních látek.

11. Použití podle některého z nároků 1 až 10, kde vakcina dále obsahuje žlučovou kyselinu nebo cholovou kyselinu, nebo jejich derivát, jako je deoxycholát sodný.

• 4

4 ·♦ 4 ·· · 4 • 444 4 44 4444

444 444 «4 44 4 f-Λ 4 4·· 444 4444 4

- OO - · 444 4444

4444 44 ·· 444 · · 444·

12. Použití podle některého z nároků 1 až 11, kde každá dávka vakciny obsahuje nízkou dávku hemaglutininu.

13. Použití podle nároku 12, kde obsah hemaglutininu na kmen chřipky je přibližně 30 pg nebo méně na dávku.

14. Použití podle nároku 13, kde obsah hemaglutininu na kmen chřipky je přibližně 15 pg nebo méně na dávku.

15. Použití podle nároku 14, kde obsah hemaglutininu je přibližně 7,5 pg nebo méně hemaglutininu na kmen viru na dávku vakciny.

16. Použití podle některého z nároků 1 až 15, kde vakcina má nízký objem na dávku.

17. Použití podle nároku 16, kde objem na dávku je nižší než 500 pl, nebo nižší než 300 pl, nebo není vyšší než 200 pl na dávku.

18. Použití podle některého z nároků 1 až 17, kde vakcina je dodávána ve dvojdávkovém uspořádání složeném ze dvou dílčích dávek.

19. Použití podle některého z nároků 1 až 18, kde vakcina neobsahuje přidané imunostimulans.

► 99

9 9 9

9 9 9 » 999 »9 9 ·

- 57 9 9 ·9« ··

9 9« 9 9 9 9

9 9 999 9 9 9

999 9999 9

9 · 9 9 9 9

9« 999 99 9999

20. Použití podle některého z nároků 1 až 18, kde vakcina dále obsahuje netoxický derivát lipidu A, s výhodou zvolený z netoxických derivátů monofosforyllipidu A a difosforyllipidu A.

21. Použití podle nároku 20, kde vakcina obsahuje 3D-MPL.

22. Použití podle nároku 21, kde vakcina obsahuje 3D-MPL a laureth 9.

23. Způsob prevence chřipkové infekce nebo onemocnění u pacienta, kde tento způsob zahrnuje podání jedné dávky vakciny neživého viru chřipky přes povrch sliznice pro indukci imunitní odpovědi splňující alespoň dvě z následujících kritérií pro všechny kmeny chřipky přítomné ve vakcině:

(i) míra sérokonverze vyšší než nebo rovna 40 %;

(ii) míra séroprotekce vyšší než nebo rovna 70 %; a (iii) konverzní faktor vyšší nebo roven 2,5.

24. Způsob prevence chřipkové infekce nebo onemocnění u pacienta, kde tento způsob zahrnuje podání jedné dávky vakciny s nízkým obsahem HA založené na neživém viru chřipky přes povrch sliznice pro indukci imunitní odpovědi, splňující alespoň dvě z následujících kritérií pro všechny kmeny chřipky přítomné ve vakcině:

(i) míra sérokonverze vyšší než nebo rovna 40 %;

(ii) míra séroprotekce vyšší než nebo rovna 70 %; a (iii) konverzní faktor vyšší nebo roven 2,5.

A A • ♦ A A

A A A A AAA „A ·

AAAA AA • A AAAA A· AA

AAA A A A A

A A A A A A· A

AAA A · A A A

A A A AAA

AA AAA aA AAAA

25. Způsob podle nároku 23 nebo 24, kde pro přítomné kmeny chřipky jsou splněna všechna tři kritéria.

26. Způsob podle některého z nároků 23 až 25, kde vakcina se dodává intranazálně.

27. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že obsahuje zařízení pro intranazální dodávání a vakcinu pro podávání v jedné dávce, obsahující preparát antigenů neživého viru chřipky bez přidané imunostimulační látky.

28. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že obsahuje zařízení pro intranazální dodávání a vakcinu pro podávání v jedné dávce, který vyvolá imunitní odpověď splňující mezinárodní předpisy pro protichřipkovou vakcinu.

29. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že obsahuje zařízení pro intranazální dodávání a vakcinu pro podávání v jedné dávce, obsahující dávku s nízkým obsahem HA preparátu antigenů neživého viru chřipky.

30. Farmaceutický kit podle některého z nároků 27 až 29, vyznačující se tím, že zařízení je dvojdávkové dodávací zařízení pro dodání dvou dílčích dávek při jediném podání.

31. Farmaceutický kit podle některého z nároků 27 až 30, vyznačující se tím, že zařízení je intranazální rozprašovací zařízení.

- 59 « * » · · · « • · »·· · · · «·· ···· · • * · · · » •* 9 99 9 9 99 9 9

32. Způsob výroby vakciny proti chřipce pro nazáiní podávání, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(i) poskytne se preparát štěpeného viru chřipky vyrobený v podstatě stejným způsobem jako pro běžnou injekčně podávanou vakcínu proti chřipce, který obsahuje alespoň jednu neiontovou povrchově aktivní látku;

(ii) popřípadě se upraví koncentrace hemaglutininu a/nebo koncentrace neiontové povrchově aktivní látky v preparátu;

(iii) zařízení pro intranazální dodávání se naplní dávkou vakciny preparátu štěpeného viru chřipky, přičemž tato dávka má vhodný objem pro intranazální podávání, popřípadě ve dvojdávkovém uspořádání.

Zastupuje:

1/4 ·· ·· > · » · • ♦ · 9 999

9 · ► ** · ·« ·· • · ♦ ·*·

Obr. 1

Titry Hl v séru 14 dnů po vakcinaci

Homologní vakcinace kmenem A/H1N1

1,5 gg 3 μg 1,5 μg 1,5 μg 0,75 μg

Homologní vakcinace kmenem A/H3N2 rální vakcína 1 vakcína 2

1>⁵μ9 3 μg 1,5 μg 1,5 μρ 0,75 μρ

Homologní vakcinace kmenem B

1,5 μg 3 μg 1,5 μg 1,5 pg 0,75 pg

2/4 «· ·« • · · · • · · « 99» · • · ·· · · ·« *· ·*»* • · • ··»» ·· »· • ♦ · · * » 9 • · 9 9

9 9 9

99 9999

ΊΊ ÍM - 40hh

Obr. 2

Odpovědi nosních specifických IgA 14 dnů po vakcinaci

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5 pg 0,75 pg

Homologní vakcinace kmenem A/H3N2

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5 pg 0,75 pg

Homologní vakcinace kmenem B

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5 pg 0,75 pg

Obr. 3

Ó/4 *0 99 • · 1 · • · · « «09 0

0 * 0000 10

00 000» » 9 • ·♦» »

0 ·

0 0

00 *0

000

0 0 •

«0

0 0 0

0 0 0 0 0 0 004 0

Titry Hl v séru 14 dnů po heterologní vakcinaci

Titry Hl (GMT) Titry Hl (GMT) Titry Hl (GMT)

Heterologní vakcinace kmenem A/H1N1

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5 pg 0,75 pg

Heterologní vakcinace kmenem A/H3N2

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5pg0,75pg

Heterologní vakcinace kmenem B

1,5 pg 3 pg 1,5 pg 1,5 pg 0,75 pg

Hypotéza = není významně odlišný od parenterální skupiny. Hodnoty p>0,05 znamenají, že titr testované skupiny není statisticky odlišný od titru parenterální skupiny «· * · » • · • 999

999 • · ··> : ϊ · ♦ :: · · 2 : · ·· ··· *··* ·:·.

7/ £θθ£ -. 40¼

Obr. 4

4/4

Odpovědi nosních specifických IgA proti zesilujícímu podání 14 dnů. po heterologní vakcinaci

Heterologní vakcinace kmenem A/H1N1