ES2825712T3 - Concentración de antígenos de vacuna contra la influenza sin liofilización - Google Patents

Abstract

Un proceso para preparar una vacuna contra la influenza, que comprende los pasos de (i) aumentar la concentración de hemaglutinina del virus de la influenza en una composición líquida que incluye esa hemaglutinina mediante filtración de flujo tangencial, para proporcionar un antígeno concentrado con un contenido de hemaglutinina de >15 mg/ml medido por SRID, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de disacárido y de alcohol de azúcar, y (ii) formular una vacuna contra la influenza a partir del antígeno concentrado; en donde el antígeno concentrado no se liofiliza entre o durante los pasos (i) y (ii); en donde la formulación de vacuna final está sustancialmente libre de disacáridos y alcohol de azúcar.

Description

DESCRIPCIÓN

Concentración de antígenos de vacuna contra la influenza sin liofilización

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se encuentra en el campo del procesamiento de soluciones de antígenos para su uso en vacunas.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] Durante la fabricación de la vacuna, a menudo ocurre que la concentración de antígeno en un volumen de fabricación excede la concentración en una formulación final para el paciente, por lo que el proceso implica una etapa en donde se diluye el volumen. En algunas situaciones, sin embargo, es necesario aumentar la concentración de antígeno en una masa acuosa y la invención se refiere a procesos para concentrar antígenos. Los procesos útiles deben aumentar la concentración de un antígeno sin destruir su inmunogenicidad. Una situación en donde se requiere concentración de antígeno es para nuevas técnicas de administración en las que solo se administra un pequeño volumen de material. Por ejemplo, las vacunas pueden administrarse mediante microagujas [2,3] o mediante películas delgadas o tiras [1,14-17]. Estas técnicas suministran mucho menos volumen que la inyección intramuscular típica de 0,5 ml, pero pueden requerir la misma cantidad de antígeno, que a menudo requerirá un antígeno a granel más concentrado.

[0003] Un proceso de concentración existente que puede aumentar la concentración de una hemaglutinina de virus de influenza individual (HA) de 125-500mg/ml a 14 mg/ml implica filtración de flujo tangencial (TFF) de un volumen de partida de material acuoso a una concentración de 10 mg/ml, luego liofilización, luego reconstitución del liofilizado en un volumen acuoso menor que el volumen inicial. Este proceso se puede realizar en tres volúmenes de HA monovalente diferentes, y su reconstitución como una composición acuosa trivalente única puede proporcionar una concentración final de h A de 42 mg/ml.

[0004] Un objeto de la invención proporciona procesos nuevos y mejorados para aumentar la concentración de antígeno en un material para su uso en la fabricación de vacunas, y en particular para la fabricación de vacunas de la gripe, tales como vacunas de la gripe que no se suministran por inyección intramuscular.

[0005] El documento US20050266011A1 describe un método para preparar una vacuna antigripal basada en HA que comprende una etapa de TFF, que no comprende liofilización.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0006] La invención proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la influenza, que comprende las etapas de (i) el aumento de la concentración de una hemaglutinina del virus de la gripe en una composición líquida que incluye esa hemaglutinina por filtración de flujo tangencial, para proporcionar un antígeno concentrado con un contenido de hemaglutinina de >15 mg/ml medido por SRID, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de disacárido y de alcohol de azúcar, y (ii) formular una vacuna contra la influenza a partir del antígeno concentrado; en donde el antígeno concentrado no se liofiliza entre o durante las etapas (i) y (ii); en donde la formulación de vacuna final está sustancialmente libre de disacáridos y alcohol de azúcar.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0007] En contraste con un proceso existente en donde la concentración de antígenos se basa en la liofilización de un gran volumen acuoso seguido de la reconstitución de liofilizados en un volumen acuoso más pequeño, la invención proporciona un procedimiento de concentración de antígenos que no implica la liofilización de un antígeno a granel antes de su formulación y/o entrega finales. Los inventores han descubierto que, aunque el procedimiento de liofilización puede mejorar la vida útil de un antígeno al tiempo que logra la concentración deseada, puede dañar el antígeno de manera que la cantidad de antígeno funcional que se recupera después de la reconstitución es menor de lo esperado. Además, el antígeno liofilizado a menudo no funciona bien en los ensayos estándar que se han establecido utilizando antígenos solubles (p. ej., el ensayo SRID para la cuantificación de hemaglutinina). Un procedimiento de concentración sin liofilización mejora así el producto final de la vacuna, permite el uso de ensayos estándar y también puede evitar la necesidad de añadir lioprotectores (como sacarosa) a la vacuna final.

[0008] Así, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna de influenza, que comprende las etapas de (i) el aumento de la concentración de una hemaglutinina del virus de la gripe en una composición líquida que incluye que la hemaglutinina por filtración de flujo tangencial, para proporcionar un concentrado de antígeno con un contenido de hemaglutinina de >15 mg/ml medido por SRID, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de disacárido y de alcohol de azúcar, y (ii) formular una vacuna contra la influenza a partir del antígeno concentrado; en donde el antígeno concentrado no se liofiliza entre o durante las etapas (i) y (ii); en donde la formulación de vacuna final está sustancialmente libre de disacáridos y alcohol de azúcar.

[0009] También se describe aquí una vacuna preparada por este proceso. La invención es particularmente útil para preparar formas sólidas de vacunas.

[0010] La invención también proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra influenza que comprende hemaglutinina de n diferentes cepas de virus de influenza, que comprende las etapas de (i) aumentar por filtración de flujo tangencial de la concentración de hemaglutinina del virus de la gripe en n composiciones líquidas separadas, cada una incluyendo hemaglutinina de una cepa diferente, para proporcionar n antígenos concentrados separados, con un antígeno concentrado con un contenido de hemaglutinina de >15 mg/ml medido por SRID, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de disacáridos y de alcohol de azúcar, y (ii) formular una vacuna multivalente contra la influenza de los n antígenos concentrados separados; en donde ninguno de los n antígenos concentrados separados se liofiliza entre o durante las etapas (i) y (ii); en donde la formulación de vacuna final está sustancialmente libre de disacáridos y alcohol de azúcar. El valor de n es 2 o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) pero normalmente será 3 (es decir, una vacuna contra la influenza trivalente) o 4 (es decir, una vacuna tetravalente contra la influenza).

[0011] También se describe aquí una vacuna líquida a granel que comprende hemaglutinina del virus de la gripe, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 12 mg/ml y (b) la vacuna está sustancialmente libre de sacarosa.

[0012] También se describe en el presente documento una vacuna líquida a granel que comprende hemaglutinina de al menos dos cepas de virus de la gripe, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 2 mg/ml/cepa y (b) la vacuna está sustancialmente libre de sacarosa.

El antígeno

[0013] También se describe aquí es un procedimiento para concentrar antígenos de diversas fuentes. El antígeno puede ser de una bacteria, un virus, un hongo o un parásito. Por tanto, la vacuna puede proteger contra enfermedades causadas por una bacteria, un virus, un hongo y/o un parásito.

[0014] Bacterias típicas para su uso con el proceso descrito en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

•Bórdetela, tales como B. pertussis.

•Clostridios, como C.tetani y C. botulinum

•Corinebacterias, como C. diphtheriae.

•Pasteurella, como Haemophilus influenzae.

•Micobacterias, como M.tuberculossi, M.bovis y Bacillus Calmette Guerin atenuado.

•Neisseria, como N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

•Salmonella, como S.typhi, S.paratyphi, S.typhimurium, S.enteritidis.

•Estreptococos, como S.pneumoniae (neumococo), S.agalactiae y S.pyogenes.

[0015] Los virus típicos para su uso con el proceso descrito en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

•Orthomyxovirus, tal como un virus de gripe A, B o C. Los virus de la influenza A o B pueden ser cepas interpandémicas (anuales/estacionales) o de cepas con el potencial de causar un brote pandémico (es decir, cepas de influenza con nueva hemaglutinina en comparación con una hemaglutinina en las cepas que circulan actualmente, o cepas de influenza que son patógenas en sujetos aviares y tienen el potencial de transmitirse horizontalmente en la población humana, o cepas de influenza que son patógenas para los humanos). Dependiendo de la estación particular y de la naturaleza de la cepa, un virus de influenza A puede derivarse de uno o más de los siguientes subtipos de hemaglutinina: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. Se dan más detalles a continuación.

•Virus Paramyxoviridae, como Pneumovirus (RSV), Paramixovirus (PIV) y Morbilivirus (Sarampión).

•Neumovirus o metaneumovirus, por ejemplo virus respiratorio sincitial (VSR), virus respiratorio sincitial bovino, virus de la neumonía de ratones y virus de la rinotraqueítis de Turquía. Preferiblemente, el neumovirus es RSV o metaneumovirus humano (HMPV).

•Paramixovirus, como el virus de la parainfluenza (PIV) tipo 1, 2, 3 o 4, las paperas, los virus de Sendai, el virus de los simios 5, el virus de la parainfluenza bovina y el virus de la enfermedad de Newcastle. Preferiblemente, el paramixovirus es PIV o paperas.

•Picornavirus, como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. Los enterovirus incluyen poliovirus tipos 1,2 o 3, virus Coxsackie A tipos 1 a 22 y 24, virus Coxsackie B tipos 1 a 6, virus Echovirus (ECHO)) tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y Enterovirus 68 a 71. Preferiblemente, el enterovirus es poliovirus, por ejemplo, una cepa de tipo 1 como Mahoney o Brunenders, una cepa de tipo 2 como MEF-I o una cepa de tipo 3 como Saukett. Un ejemplo de Heparnavirus (también llamado Hepatovirus) es el virus de la Hepatitis A.

•Togavirus, como un rubivirus, un alfavirus o un arterivirus. Se prefieren los rubivirus, como el virus de la rubéola. Los alfavirus útiles para la inactivación incluyen alfavirus acuáticos, como el virus de la enfermedad del páncreas del salmón y el virus de la enfermedad del sueño.

•Flavivirus, como encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis del Nilo occidental, encefalitis de San Luis, encefalitis rusa de primavera-verano, encefalitis de Powassan.

•Virus de la hepatitis C (VHC).

•Pestivirus, como la diarrea viral bovina (BVDV), la peste porcina clásica (CSFV) o la enfermedad de la frontera (BDV).

•Hepadnavirus, como el virus de la hepatitis B.

•Rabdovirus, como Lyssavirus (p. ej., un virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV).

•Caliciviridae, como el virus Norwalk, y virus similares a Norwalk, como el virus Hawaii y el virus Snow Mountain, y Vesivirus, como el Exantema vesicular del virus porcino.

•Coronavirus, como SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis del ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV).

•Retrovirus, como un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus. Un oncovirus puede ser HTLV-1, HTLV- 2 o HTLV-3. Un lentivirus puede ser VIS, VIH-1 o VIH-2.

•Reovirus, como un Orthoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus.

•Parvovirus, como Parvovirus B19 o Bocavirus.

•Virus del herpes humano, como virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (HHV6), virus del herpes humano 7 (HHV7) y virus del herpes humano 8 (HHV8).

•Papovavirus, como Papilomavirus y Poliomavirus. Los papilomavirus incluyen los serotipos del VPH 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 y 65.

•Adenoviridae, incluyendo cualquiera de los adenovirus humanos A, B, C, D, E, F o G.

[0016] En el presente documento se describen procesos para preparar vacunas para virus, y en particular virus en los que el antígeno de la vacuna es una glicoproteína de superficie viral. La invención es ideal para concentrar hemaglutinina del virus de la influenza para preparar vacunas contra la influenza, como se describe a continuación con más detalle. El paso de concentración puede proporcionar un antígeno de vacuna antigripal con un contenido de HA de >5 mg/ml, >10 mg/ml, >15 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml e incluso >30 mg/ml.

La composición líquida

[0017] Un procedimiento de la invención aumenta la concentración de un antígeno en una composición líquida, de este modo proporcionando un antígeno concentrado para la formulación de propósitos.

[0018] Una composición líquida preferida es una que nunca ha sido liofilizada.

[0019] Una composición líquida preferida es sustancialmente libre de lioprotectores. Por tanto, una composición puede estar sustancialmente libre de alcoholes de azúcar exógenos (en particular: sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol) y/o de disacáridos exógenos (en particular: sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa). La concentración combinada de (sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa) en una composición líquida puede ser, por tanto, inferior a 10 mg/ml (es decir, inferior al 1%) e idealmente menor de 1 mg/ml, por ejemplo, menos de 0,1 mg/ml.

[0020] Una composición líquida típica es una vacuna a granel, por ejemplo, conteniendo suficiente antígeno para al menos 500 dosis unitarias humanas separadas de la vacuna.

[0021] La composición líquida puede ser monovalente (es decir, que contiene antígeno de la vacuna para la protección frente a sólo un patógeno) o multivalente (es decir, que contiene antígeno de la vacuna para la protección contra más de un patógeno, que incluye donde hay más de un patógeno protector no cruzado diferente, por ejemplo, múltiples serogrupos meningocócicos o múltiples tipos de hemaglutinina del virus de la influenza A). Preferiblemente es monovalente.

[0022] La invención se puede utilizar con muestras de líquido que tiene una variedad de concentraciones de antígeno de la vacuna. Normalmente, la muestra líquida incluirá un antígeno de vacuna a una concentración de al menos 1 mg/ml.

El paso de concentración

[0023] Se da a conocer en el presente documento un proceso que implica un paso en donde se aumenta la concentración de un antígeno. Se pueden usar varias técnicas para este paso de concentración que incluyen, pero no se limitan a: filtración centrífuga; ultrafiltración; o filtración de flujo tangencial (también conocida como filtración de flujo cruzado). El método de la invención usa TFF ya que puede lograr una buena concentración incluso sin requerir liofilización.

[0024] La filtración centrífuga implica la centrifugación de un líquido a través de un filtro. El filtro retiene el antígeno que se va a concentrar, pero no retiene disolvente ni solutos más pequeños. A medida que aumenta el volumen del filtrado, también aumenta la concentración del antígeno en el retenido. Esta técnica suele utilizar un rotor de ángulo fijo. Varios dispositivos de filtración centrífuga adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, los productos vendidos con las marcas comerciales Centricon™, Vivaspin™ y Spintek™. El corte del filtro se seleccionará de manera que el antígeno de interés permanezca en el retenido.

[0025] La ultrafiltración implica el uso de presión hidrostática para forzar un líquido contra una membrana semipermeable. El filtro retiene el antígeno que se va a concentrar, pero no retiene disolvente ni solutos más pequeños. La aplicación continuada de presión hidrostática hace que aumente el volumen del filtrado y, por tanto, también aumenta la concentración del antígeno en el retenido. Muchas membranas de ultrafiltración están disponibles comercialmente. El límite de peso molecular (MWCO) de una membrana de ultrafiltración determina qué solutos pueden pasar a través de la membrana (es decir, al filtrado) y cuáles se retienen (es decir, en el retenido). El MWCO del filtro usado con la invención se seleccionará de manera que sustancialmente todo el antígeno de interés permanezca en el retenido.

[0026] La filtración de flujo tangencial (TFF) implica hacer pasar un líquido tangencialmente a través de una membrana de filtro. El lado de la muestra se mantiene típicamente a una presión positiva con respecto al lado del filtrado. A medida que el líquido fluye sobre el filtro, los componentes del mismo pueden pasar a través de la membrana hacia el filtrado. El flujo continuo hace que aumente el volumen del filtrado y, por tanto, aumenta la concentración del antígeno en el retenido. El TFF contrasta con la filtración sin salida, en donde la muestra pasa a través de una membrana en lugar de tangencialmente a ella. Muchos sistemas TFF están disponibles comercialmente. El MWCO de una membrana de TFF determina qué solutos pueden atravesar la membrana (es decir, en el filtrado) y cuáles se retienen (es decir, en el retenido). El MWCO de un filtro de TFF se utiliza con la invención se selecciona de tal manera que sustancialmente todo el antígeno de los restos de interés en el material retenido.

[0027] Estas tres técnicas de concentración no son mutuamente excluyentes por ejemplo, la invención puede utilizar ultrafiltración de flujo tangencial.

[0028] Cualquiera que sea la técnica elegida, aumenta preferiblemente la concentración del antígeno de interés por al menos n-fold, donde n es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o más.

El paso de formulación

[0029] Después de la concentración de antígeno, un proceso de la invención formula el antígeno concentrado como una vacuna, sin liofilización intermedia. El paso de formulación tampoco implica la liofilización del antígeno. Idealmente, tampoco hay liofilización posterior a la formulación, es decir, el antígeno de la vacuna evita la liofilización desde el inicio de la concentración hasta la administración al paciente.

[0030] La invención se puede utilizar para preparar diversas formulaciones de vacunas. El uso de un paso de concentración significa que la invención es ideal para técnicas que implican el suministro de pequeños volúmenes de material a un paciente. Por ejemplo, la invención es útil para preparar formulaciones de vacunas líquidas que tienen un volumen de dosis unitaria de 0,1 ml o menos (p. ej., para inyección intradérmica). La invención también es útil para preparar formulaciones de vacunas sólidas (pero no liofilizadas), ya que estas pueden requerir altas concentraciones de antígeno. Como se describe con más detalle a continuación, las formulaciones sólidas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, microagujas sólidas biodegradables, microagujas revestidas y películas delgadas. Por tanto, el paso de formulación en un proceso de la invención puede comprender: preparar una forma de vacuna sólida a partir del antígeno concentrado. Este paso puede implicar el secado, pero no la liofilización, por ejemplo, puede implicar la evaporación [11].

[0031] Las vacunas formuladas de la invención a veces están sustancialmente libres de lioprotectores, aunque estos a menudo se añaden a las formulaciones por razones no relacionadas con la liofilización (p. ej., para mejorar el recubrimiento). Una vacuna formulada de la invención está sustancialmente libre de alcoholes de azúcar (en particular: sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol) y de disacáridos (en particular: sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa). Por tanto, la concentración combinada de (sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa) en una vacuna formulada puede ser inferior a 10 mg/ml (es decir, inferior al 1%), por ejemplo, inferior a 1 mg/ml o menos de 0,1 mg/ml.

[0032] El paso de formulación idealmente tiene lugar dentro de 4 semanas (p. ej., dentro de 2 semanas) de el paso de concentración, para asegurar que el antígeno concentrado conserva eficacia adecuada.

[0033] Las vacunas de la invención están idealmente libres de inulina. Además, las vacunas de la invención idealmente no incluyen vesículas de tensioactivo que encapsulan antígenos virales.

Microagujas biodegradables sólidas

[0034] Una formulación sólida útil que se puede preparar usando la invención es una microaguja biodegradable sólida. Por lo general, estas no se administran solas, sino que se administran simultáneamente múltiples agujas, p.ej. como un parche para la piel que comprende una pluralidad de microagujas.

[0035] Las microagujas son sólidas, de tal manera que conservan su integridad estructural durante el almacenamiento y pueden penetrar en la piel de un sujeto cuando se aplica el parche. Las características mecánicas que se requieren para la penetración cutánea dependen del organismo en cuestión, pero normalmente tendrán la fuerza suficiente para penetrar la piel humana. Los materiales para formar agujas sólidas adecuadas están fácilmente disponibles y se pueden probar para determinar las concentraciones apropiadas, etc. para cualquier necesidad particular.

[0036] Las microagujas son biosolubles y biodegradables. Por tanto, el material sólido se disuelve en la piel después de la aplicación del parche, en contraste con las microagujas recubiertas utilizadas en las referencias 2 y 3 (ver más abajo). Una vez disuelto, el material se metabolizará para dar productos finales inofensivos. La escala de tiempo para la disolución después de la aplicación del parche puede variar, pero la disolución generalmente comenzará inmediatamente después de la aplicación del parche (p. ej., dentro de los 10 segundos) y puede continuar, por ejemplo, hasta 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas o 24 horas, hasta que la microaguja se haya disuelto por completo. Los materiales con una cinética de disolución in vivo adecuada están fácilmente disponibles y pueden variarse y probarse para determinar las concentraciones apropiadas, etc. para cualquier perfil de disolución deseado.

[0037] Los materiales adecuados de matriz para formar las microagujas serán polímeros típicamente biosolubles y biodegradables, y éstos pueden comprender uno o más hidratos de carbono. Por ejemplo, el material puede comprender una celulosa, una dextrina, un dextrano, un disacárido, un quitosano, una quitina, etc., o mezclas de los mismos. También se pueden utilizar otros materiales GRAS.

[0038] Celulosas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulosa, carboximetilo celulosa sódica, celulosa de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo y metilcelulosa de hidroxipropilo. Las dextrinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, maltodextrina, ciclodextrina, amilodextrina, icodextrina, dextrina amarilla y dextrinas blancas. Los disacáridos adecuados incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, turanosa y celobiosa. Un material adecuado para formar microagujas biosolubles y biodegradables es una mezcla de dextrina/trehalosa.

[0039] Las microagujas pueden penetrar la piel. Deben ser suficientemente largas para penetrar a través de la epidermis para entregar el material en la dermis (es decir, entrega intradérmica), pero idealmente no son tan largas que pueden penetrar en o más allá de la hipodermis. Típicamente tendrán una longitud de 100-2500 pm, por ejemplo, entre 1250-1750 pm de longitud, o aproximadamente 1500 pm. En el momento del parto, la punta puede penetrar en la dermis, pero la base de la aguja puede permanecer en la epidermis.

[0040] Las microagujas pueden tener varias formas y geometrías. Normalmente estarán ahusadas con un punto que mira hacia la piel, por ejemplo, con forma de pirámides o conos. Es típica una microaguja cónica con un diámetro más ancho de <500 pm.

[0041] Un parche solo incluirá típicamente una pluralidad de microagujas por ejemplo >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >50, >750, >1000 o más por parche. Cuando un parche incluye una pluralidad de microagujas, puede comprender una capa de respaldo a la que se unen todas las microagujas. Es típica una capa de respaldo unitaria con >20 microagujas salientes. Cuando un parche incluye una pluralidad de microagujas, estas pueden estar dispuestas en un patrón o matriz de repetición regular, o pueden estar dispuestas irregularmente.

[0042] Un parche tendrá típicamente un área de 3cm2 o menos, por ejemplo <2cm2 o <1cm2. Un parche circular con un diámetro de entre 0,5 cm y 1,5 cm es útil.

[0043] La densidad de microagujas en un parche puede variar, pero puede ser >10cm2, >20cm2, >30cm2, >40cirr2, >50cirr2, >60cirr2, >70cirr2, >80cm'2 o más.

[0044] Un parche de la divulgación tiene una cara interior orientada hacia la piel y una cara exterior orientada al entorno. La cara interior puede incluir un adhesivo para facilitar la adherencia a la piel de un sujeto. Cuando está presente, preferiblemente no está presente en las propias microagujas, es decir, las microagujas no tienen adhesivo. En lugar de tener adhesivo en la cara interna, un parche puede tener un respaldo adicional que proporcione un margen adhesivo externo para adherir el parche a la piel, por ejemplo, como se ve en tiritas adhesivas o parches de nicotina.

[0045] Los parches como se describe anteriormente se pueden hacer siguiendo las técnicas y orientaciones en las referencias 4-8. Por ejemplo, se puede preparar un molde con cavidades de microagujas de 1,5 mm de largo. Se puede combinar un material de matriz de dextrina y trehalosa con una vacuna contra la influenza y este material acuoso se puede verter por centrifugación en el molde para formar una matriz de microagujas sólidas. A continuación, se puede verter un gel de celulosa sobre la mezcla de matriz/vacuna (p. ej. cuya mezcla ha formado una película) para formar una capa de respaldo sobre el parche. Cuando esta capa se haya secado, se puede quitar para dar un parche del que se proyectan las microagujas sólidas. Por tanto, el paso de formulación en un proceso de la invención puede comprender: (a) mezclar un material de matriz biosoluble y biodegradable con el antígeno de vacuna concentrado; y (b) añadir la mezcla de el paso (a) a un molde que contiene cavidades para formar microagujas. Puede comprender además: (c) dejar que la mezcla se asiente en el molde, para formar microagujas sólidas; (d) opcionalmente, aplicar material al conjunto de microagujas para proporcionar una capa de respaldo; y (e) retirar las microagujas (y la capa de respaldo opcional) de la plantilla.

[0046] Los parches pueden ser empaquetados en bolsas individuales por ejemplo, selladas en atmósfera de nitrógeno, a continuación, termoselladas. Deben almacenarse con cuidado para evitar dañar las microagujas.

Microagujas recubiertas

[0047] Otra formulación sólida útil que puede ser preparada usando la invención es una microaguja recubierta. Normalmente, estas no se administran solas, sino que se administran múltiples agujas simultáneamente, por ejemplo, mediante una pluralidad de microagujas. Un producto adecuado se comercializa con el nombre comercial de Macroflux™ (Zosano).

[0048] Las microagujas son sólidas, de tal manera que conservan su integridad estructural durante el almacenamiento y pueden penetrar en la piel de un sujeto. Las características mecánicas que se requieren para la penetración cutánea dependen del organismo en cuestión, pero normalmente tendrán la fuerza suficiente para penetrar la piel humana. Las microagujas son sólidas y permanecen intactas después de la inserción en la piel del paciente (en contraste con las microagujas biodegradables discutidas anteriormente). Los materiales para formar agujas sólidas adecuadas están fácilmente disponibles y estas se pueden probar y seleccionar para cualquier necesidad particular, por ejemplo, metales (como acero inoxidable) o polímeros (como policarbonato, idealmente de grado médico). Las agujas de metal se pueden fabricar mediante corte por láser y electropulido [9]. Las agujas de polímero se pueden fabricar mediante microrreplicación y/o micromoldeo (incluido el moldeo por inyección). Las microagujas adecuadas se describen en las referencias 2, 3 y 9-13.

[0049] Un concentrado de antígeno de la invención puede revestirse sobre las microagujas. Este recubrimiento se puede lograr mediante un proceso simple como el recubrimiento por inmersión, por ejemplo, que implica una etapa de inmersión y luego una etapa de secado (p. ej., por evaporación), con repetición según sea necesario. Otras técnicas de recubrimiento útiles se describen en la referencia 11. Por tanto, el paso de formulación en un proceso de la invención puede comprender: aplicar el antígeno de vacuna concentrado a la superficie de una o más microagujas sólidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubierto para la inyección de la vacuna.

[0050] Una solución de recubrimiento para aplicar a las agujas puede incluir uno o más materiales de matriz biosoluble y biodegradable, y estos pueden comprender uno o más hidratos de carbono. Por ejemplo, el material puede comprender una celulosa, una dextrina, un dextrano, un disacárido, un quitosano, una quitina, etc., o mezclas de los mismos. También se pueden utilizar otros materiales GRAS. Las celulosas, dextrinas y disacáridos adecuados se enumeran anteriormente. Por tanto, el paso de formulación en un proceso de la invención puede comprender: (a) mezclar un material de matriz biosoluble y biodegradable con el antígeno de vacuna concentrado; y (b) aplicar la mezcla del paso (a) a la superficie de una o más microagujas sólidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubierto para la inyección de la vacuna. El revestimiento puede ser mejorado por el uso de uno o más "componentes para mejorar la deposición" como se describe en la referencia 11.

[0051] Las etapas de aplicación discutidas anteriormente puede comprender una subetapa de aplicación seguida por una sub-etapa de secado, y este par de sub-pasos puede ser realizado una o más de una vez, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces.

[0052] Las microagujas en el dispositivo pueden penetrar la piel cuando se aplican. Deben ser suficientemente largas para penetrar a través de la epidermis para entregar el material en las dermis (es decir, la administración intradérmica), pero idealmente no son tan largas que pueden penetrar en o más allá de la hipodermis. Por lo general, tendrán entre 100 y 2500 mm de largo, por ejemplo, entre 250 y 750 mm de largo, o aproximadamente 1500 mm. En el momento del parto, la punta puede penetrar en la dermis, pero la base de la aguja puede permanecer en la epidermis. Las agujas se pueden aplicar a la piel de un paciente entre 30 segundos y 30 minutos, y luego se retiran.

[0053] Las microagujas pueden tener varias formas y geometrías. Normalmente estarán ahusadas con un punto que mira hacia la piel, por ejemplo, con forma de pirámides o conos. Es típica una microaguja cónica con un diámetro más ancho de <500 mm.

[0054] Un dispositivo de microaguja incluirá típicamente una pluralidad de microagujas por ejemplo >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >50, >750, >1000, >1500, >2000 o más por dispositivo (p. ej., 300-1500 por dispositivo). Cuando un dispositivo incluye una pluralidad de microagujas, estas típicamente estarán todas unidas a una capa de respaldo unitaria. Cuando un dispositivo incluye una pluralidad de microagujas, estas pueden estar dispuestas en un patrón o matriz de repetición regular, o pueden estar dispuestas irregularmente.

[0055] Un dispositivo de microaguja tendrá típicamente un área de 3cm2 o menos, por ejemplo <2cm2 o <1cm2 Es útil un dispositivo circular con un diámetro de entre 0,5 cm y 1,5 cm.

[0056] La densidad de las microagujas puede variar, pero puede ser >10cm-2, >20cm-2, >30cm-2, >40cm-2 >50cm-2, >60cm-2, >70cm-2, >80cm-2 o más. Es útil un dispositivo con 2 mm entre cada microaguja y una densidad de 14 microagujas/cm2.

[0057] Un dispositivo de microagujas tiene una cara interior orientada hacia la piel y una cara exterior orientada al entorno. La cara interior puede incluir un adhesivo para facilitar la adherencia a la piel de un sujeto. Cuando está presente, preferiblemente no está presente en las propias microagujas, es decir, las microagujas no tienen adhesivo. En lugar de tener adhesivo en la cara interior, un dispositivo puede tener un respaldo adicional que proporcione un margen adhesivo exterior para adherir el dispositivo a la piel.

[0058] Un dispositivo de microaguja puede ser empaquetado en bolsas individuales, por ejemplo selladas en atmósfera de nitrógeno, y luego selladas por calor. Deben almacenarse con cuidado para evitar dañar las microagujas.

Películas delgadas

[0059] Otra formulación sólida útil que puede ser preparada usando la invención es una película delgada, tales como película oral delgada. Estas películas se humedecen y se disuelven rápidamente al entrar en contacto con la saliva y el tejido bucal, por lo que liberan el antígeno de la vacuna en la boca. El componente principal de estas películas delgadas es típicamente uno o más polímeros hidrófilos, que pueden tener buenas propiedades mucoadhesivas para proporcionar una fuerte adhesión al tejido bucal hasta su completa disolución. Pueden usarse películas similares para administración no oral, p.ej. para entrega transcutánea como se describe en la referencia 14.

[0060] Películas delgadas adecuadas típicamente tienen un espesor de 10-500|jm cuando se aplican inicialmente, p. ej., espesor de 75-150jm. Sus otras dimensiones pueden ser adecuadas para caber en la boca de un paciente, p. ej. en la boca de un ser humano adulto o en la boca de un humano infantil.

[0061] Un tipo adecuado de película se describe en la referencia 15. Esta película comprende una película bicapa mucoadhesiva con (i) Noveon y Eudragit S-100 como una capa mucoadhesiva y (ii) una cera farmacéutica como un capa de soporte impermeable. Otros detalles de estas películas se encuentran en referencia 16.

[0062] Otro tipo adecuado de película se describe en la referencia 17. Esta película comprende: (a) uno o más polímeros solubles en agua; (b) uno o más polímeros mucoadhesivos; (c) un antígeno de vacuna encapsulado dentro de micropartículas. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a: pululano, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico, alginato de sodio, polietilenglicol, goma xantano, goma tragacanto, goma guar, goma arábiga, ácido poliacrílica, copolímero de metilmetacrilato, polímero de carboxivinilo, amilasa, almidón con alto contenido de amilasa, almidón con alto contenido de amilasa hidroxipropilado, dextrina, pectina, quitina, levan, elsinan, colágeno, gelatina, zeína, gluten, aislado de proteína de soja, aislado de proteína de suero y caseína. Los polímeros mucoadhesivos adecuados incluyen, pero no se limitan a: quitosano, hialuronato, alginato, ácido poli(acrílico), ácido poli(metacrílico), poli(L-lisina), poli(etilenimina), óxido de poli(etileno), poli(2 -metacrilato de hidroxietilo), y sus derivados o copolímeros. Las micropartículas útiles están hechas de un material que libera el contenido encapsulado de la partícula (es decir, el antígeno de la vacuna) mientras aún está presente en la boca.

[0063] La película en referencia 14 comprende un éster poli(p-amino)catiónico para la administración transcutánea.

[0064] Una película oral útil con la invención puede incluir un agente aromatizante para hacer la vacuna más aceptable durante la administración.

[0065] Las películas delgadas se pueden realizar mediante una variedad de procesos, incluyendo, pero no limitados a: moldeo con disolvente; extrusión termofusible; extrusión de dispersión sólida; y rodando.

[0066] El paso de formulación en un procedimiento de la invención puede comprender: (a) mezclar el antígeno de vacuna concentrada con uno o más polímeros oralmente solubles; y (b) formar una película usando la mezcla de el paso (a) para proporcionar una película delgada adecuada para la administración bucal de la vacuna.

[0067] El paso de formulación en un procedimiento de la invención puede comprender: (a) mezclar el antígeno de vacuna concentrada con uno o más polímeros tópicamente solubles, tales como un éster poli(p-amino); y (b) formar una película usando la mezcla de el paso (a) para proporcionar una película delgada adecuada para la administración transcutánea de la vacuna.

[0068] Estas películas pueden ser empaquetadas en bolsas individuales de unidad de dosis por ejemplo, selladas en atmósfera de nitrógeno y a continuación térmicamente selladas. Las bolsas deben ser herméticas para mantener las películas secas durante el almacenamiento.

Métodos de tratamiento, y administración de la vacuna

[0069] Vacunas formuladas de la invención se pueden administrar a un sujeto por ejemplo, a través de su piel, a través de su tejido bucal, etc. Por lo tanto en el presente documento se describe un método para generar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende el paso de administrar una vacuna formulada de la invención al sujeto. Esto podría implicar, por ejemplo, aplicar un parche o dispositivo de microagujas a la piel del sujeto, de manera que las microagujas penetren en la dermis del sujeto, o aplicar una película delgada al tejido bucal o la lengua del sujeto.

[0070] También se describe aquí un antígeno no liofilizado concentrado para el uso en un método de vacunación de un sujeto. También se describe en el presente documento el uso de antígeno concentrado no liofilizado en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmune en un sujeto.

[0071] Productos de vacunas son apropiados para la administración de vacunas a sujetos humanos o animales no humanos. La respuesta inmune planteada por estos métodos y usos será generalmente la inclusión de una respuesta de anticuerpo, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectores.

[0072] Parches o dispositivos de microaguja se pueden aplicar a la piel por aplicación manual sencilla (p. ej., como con un esparadrapo o con parches para la piel conocidos) o pueden ser aplicados utilizando un inyector accionado por resorte.

[0073] Las vacunas preparadas según la invención pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos.

[0074] El tratamiento puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Típicamente, se administrarán múltiples dosis separadas por al menos 1 semana (p. ej., aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Vacunación contra la influenza

[0075] Los procesos de la invención son ideales para la preparación de vacunas contra la influenza. Actualmente se encuentran disponibles varias formas de vacuna contra el virus de la influenza (p. ej., ver los capítulos 17 y 18 de la referencia 18) y las vacunas actuales se basan en virus inactivados o vivos atenuados. Las vacunas inactivadas (virus completo, virión dividido o antígeno de superficie) se administran por inyección intramuscular o intradérmica, mientras que las vacunas vivas se administran por vía intranasal. La invención se puede utilizar con todas estas formas de vacuna.

[0076] Algunas realizaciones de la invención utilizan una vacuna contra la influenza de antígeno de superficie (inactivada). Estas vacunas contienen menos componentes virales que una vacuna de virión completo o dividido. Incluyen los antígenos de superficie hemaglutinina y, típicamente, también neuraminidasa. Los procesos para preparar estas proteínas en forma purificada a partir de virus de la influenza son bien conocidos en la técnica. Los productos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUv Ac ™ son ejemplos de vacunas antigripales de superficie.

[0077] Cuando la invención utiliza una vacuna contra la influenza de antígeno de superficie, este virus puede haber sido cultivado en huevos o en cultivo celular (véase a continuación). El método estándar actual para el crecimiento del virus de la influenza para las vacunas utiliza huevos de gallina embrionados SPF, y el virus se purifica del contenido del huevo (líquido alantoideo). Si se utiliza el crecimiento viral a base de huevo, se pueden introducir uno o más aminoácidos en el líquido alantoideo del huevo junto con el virus [24]. El virus se cultiva primero en huevos. Luego se recolecta de los huevos infectados. Los viriones se pueden extraer del líquido alantoideo mediante varios métodos. Por ejemplo, un proceso de purificación puede implicar la centrifugación zonal utilizando una solución de gradiente de sacarosa lineal que incluye detergente para romper los viriones. A continuación, los antígenos se pueden purificar, después de una dilución opcional, mediante diafiltración. Los medios químicos para inactivar un virus incluyen el tratamiento con una cantidad eficaz de uno o más de los siguientes agentes: detergentes, formaldehído, ppropiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxiffuNereno (C60), etilamina binaria, acetilo etilenimina o combinaciones de los mismos. Se conocen en la técnica métodos no químicos de inactivación viral, tales como, por ejemplo, luz UV o irradiación gamma.

[0078] Algunas realizaciones de la invención pueden usar virus completo, virus fraccionado, virosomas, virus vivo atenuado, o hemaglutinina recombinante. Estas vacunas se pueden distinguir fácilmente de las vacunas de antígeno de superficie probando sus antígenos, por ejemplo, para detectar la presencia de proteínas adicionales del virus de la influenza.

[0079] Virus completo inactivado se puede obtener por viriones de cosecha a partir de fluidos que contienen virus (p. ej., obtenido a partir de huevos o del medio de cultivo) y luego su tratamiento como se describe anteriormente.

[0080] Viriones fraccionados se obtienen mediante el tratamiento de viriones purificados con detergentes (p. ej., éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, tri-W-butilo fosfato, Triton X-100, Triton N101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) para producir preparaciones de subviriones, incluido el proceso de división “Tween-ether”. Los métodos para dividir los virus de la influenza, por ejemplo, son bien conocidos en la técnica, p. ej. ver referencias 19­ 24, etc. La división del virus se lleva a cabo típicamente interrumpiendo o fragmentando el virus completo, ya sea infeccioso o no infeccioso, con una concentración disruptiva de un agente de división. La ruptura da como resultado una solubilización total o parcial de las proteínas del virus, alterando la integridad del virus. Los agentes de división preferidos son tensioactivos no iónicos e iónicos (p. ej., catiónicos), por ejemplo, alquilglucósidos, alquiltioglucósidos, azúcares acilo, sulfobetaínas, betaínas, polioxietilen-alquiléteres, N,N-dialquilo-glucamidas, Hecameg, compuestos de amilfenoxi-polietoxietanoles, sarcosilo cuaternario, CTAb (bromuros de cetilo trimetilamonio), fosfato de tri-W-butilo, sales de miristiltrimetilamonio, lipofectina, lipofectamina y DOT-MA, los octil o nonilfenoxi polioxietanoles (p. ej., los tensioactivos Triton, como Triton X-100 o Triton N), ésteres de polioxietileno de sorbitán (los tensioactivos Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. un procedimiento de división útil utiliza los efectos consecutivos de desoxicolato de sodio y formaldehído, y la división puede tener lugar durante la purificación inicial del virión (p. ej., en una solución de gradiente de densidad de sacarosa). Por lo tanto, un proceso de división puede implicar la clarificación del material que contiene viriones (para eliminar el material que no es virión), la concentración de los viriones recolectados (p. ej., utilizando un método de adsorción, como la adsorción de CaHPO4), la separación de viriones completos del material que no es virión, división de viriones usando un agente de división en una etapa de centrifugación en gradiente de densidad (p. ej., usando un gradiente de sacarosa que contiene un agente de división como desoxicolato de sodio) y luego filtración (p. ej., ultrafiltración) para eliminar materiales no deseados. Los viriones divididos se pueden resuspender de manera útil en una solución de cloruro de sodio isotónica tamponada con fosfato de sodio. Ejemplos de vacunas divididas son los productos BEGR1VAC™, INTANZA™, FLUARlX™, FLUZONE™ y FLUSHlELD™.

[0081] Los virosomas son partículas liposomales de tipo viral sin ácido nucleico [25]. Pueden prepararse mediante la solubilización del virus con un detergente seguido de la eliminación de la nucleocápsida y la reconstitución de la membrana que contiene las glicoproteínas virales. Un método alternativo para preparar virosomas implica la adición de glicoproteínas de membrana viral a cantidades excesivas de fosfolípidos, para dar liposomas con proteínas virales en su membrana.

[0082] Los virus vivos atenuados se obtienen a partir de virus (cultivados en huevos o en cultivo celular), pero los virus no se inactivan. Más bien, el virus se atenúa ("att"), por ejemplo, para no producir una enfermedad similar a la influenza en un modelo de hurón de infección por influenza humana. También puede ser una cepa adaptada al frío ("ca"), es decir, puede replicarse eficazmente a 25°C, una temperatura que es restrictiva para la replicación de muchos virus de influenza de tipo silvestre. También puede ser sensible a la temperatura ("ts"), es decir, su replicación está restringida a temperaturas a las que muchos virus de influenza de tipo silvestre crecen de manera eficiente (37-39°C). El efecto acumulativo de los fenotipos ca, ts y att es que el virus de la vacuna atenuada puede replicarse en la nasofaringe para inducir inmunidad protectora en un paciente humano típico, pero no causa enfermedad, es decir, es seguro para la administración general a la población humana diana. Estos virus se pueden preparar purificando viriones a partir de fluidos que contienen viriones, por ejemplo, después de la clarificación de los fluidos mediante centrifugación, luego estabilización con tampón (p. ej., que contiene sacarosa, fosfato de potasio y glutamato monosódico). Las vacunas vivas incluyen el producto FLUMlST™. Aunque se pueden usar vacunas vivas con la invención, se prefiere usar vacunas no vivas.

[0083] Como una alternativa al uso de antígenos obtenidos a partir de viriones, la hemaglutinina se puede expresar en un huésped recombinante (p. ej., en una línea celular de insecto, tales como Sf9, usando un vector de baculovirus) y se utiliza en forma purificada [26-28] o en la forma de partículas similares a virus (VLP; por ejemplo, véanse las referencias 29 y 30).

[0084] Algunas realizaciones de la invención utilizan vacuna contra la influenza preparada a partir de los virus que se hicieron crecer en cultivo celular, en lugar de en los huevos. Cuando se usa cultivo celular, el sustrato de crecimiento viral será típicamente una línea celular de origen mamífero. Las células de origen de mamíferos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de hámster, ganado, primates (incluidos humanos y monos) y células de perro. Pueden usarse varios tipos de células, tales como células renales, fibroblastos, células retinianas, células pulmonares, etc. Ejemplos de células de hámster adecuadas son las líneas celulares que tienen los nombres BHK21 o HKCC. Las células de mono adecuadas son, por ejemplo, células de mono verde africano, tales como células de riñón como en la línea celular Vero. Las células de perro adecuadas son, por ejemplo, células de riñón, como en la línea celular MDCK. Por tanto, las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI- 38; etc. Las líneas celulares de mamíferos preferidas para el cultivo de virus de la influenza incluyen: células MDCK [31-34], derivadas de riñón canino Madin Darby; células Vero [35-37], derivadas de riñón de mono verde africano (Cercopithecus aethiops); o células PER.C6 [38], derivadas de retinoblastos embrionarios humanos. Estas líneas celulares están ampliamente disponibles, p. ej. de la colección American Type Cell Culture (ATCC), de Coriell Cell Repositories o de la European Collection of Cell Cultures (ECACC). Por ejemplo, la ATCC suministra varias células Vero diferentes con los números de catálogo CCL-81, CCL-81,2, Cr L-1586 y CRL-1587, y suministra células MDCK con el número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponible en la ECACC con el número de depósito 96022940. Como alternativa menos preferida a las líneas celulares de mamíferos, el virus puede cultivarse en líneas celulares aviares [por ejemplo, refs. 39-41], incluidas las líneas celulares derivadas de patos (p. ej., retina de pato) o gallinas. Ejemplos de líneas celulares aviares incluyen células madre embrionarias de aves [39, 42] y células de la retina de pato [40]. Las células madre embrionarias de aves adecuadas incluyen la línea celular EBx derivada de células madre embrionarias de gallina, EB45, EB14 y EB14-074 [43]. También se pueden usar fibroblastos de embriones de gallina (CEF).

[0085] Las líneas celulares preferidas la mayoría de los virus de influenza de crecimiento son líneas de células MDCK. La línea celular MDCK original está disponible en la ATCC como CCL-34, pero también pueden usarse derivados de esta línea celular. Por ejemplo, la referencia 31 describe una línea celular MDCK que se adaptó para el crecimiento en cultivo en suspensión ('MDCK 33016', depositado como DSM ACC 2219). De manera similar, la referencia 44 describe una línea celular derivada de MDCK que crece en suspensión en un cultivo sin suero ('B-702', depositado como FERM BP-7449). La referencia 45 describe células MDCK no tumorigénicas, incluidas 'MDCK-S' (At Cc PTA-6500), 'MOCKSF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) y 'MDCK-SF103' (PTA-6503). La referencia 46 describe líneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a la infección, que incluyen células 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Puede usarse cualquiera de estas líneas celulares MDCK.

[0086] Cuando el virus se ha cultivado en un mamífero línea celular continuación, los productos de la invención ventajosamente estar libre de proteínas de huevo (p. ej., ovoalbúmina y ovomucoide) y de ADN de pollo, lo que reduce la alergenicidad potencial.

[0087] La hemaglutinina en productos derivados de células de la invención puede tener un patrón de glicosilación diferente de los patrones observados en virus derivados de huevo. Por lo tanto, las HA (y otras glicoproteínas) pueden incluir glicoformas que no se ven en los huevos de gallina. La HA útil incluye glicoformas caninas.

[0088] La ausencia de materiales derivados del huevo y de glicoformas de gallina proporciona una manera en donde la vacuna preparada a partir de virus que crecen en cultivo celular se puede distinguir de los productos derivados del huevo.

[0089] Cuando el virus se ha cultivado en una línea celular, entonces el cultivo para el crecimiento, y también el inóculo viral se usa para iniciar el cultivo, preferiblemente estará libre (es decir, se han probado para y dado un resultado negativo para la contaminación por) de virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus parainfluenza 3, coronavirus del SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus, birnavirus, circovirus y/o parvovirus [47]. Se prefiere particularmente la ausencia de virus del herpes simple.

[0090] Para el crecimiento de una línea celular, tal como en células MDCK, virus puede ser cultivado en células en suspensión [31, 48, 49] o en cultivo adherente. Una línea celular MDCK adecuada para cultivo en suspensión es MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219). Como alternativa, se puede utilizar un cultivo en microportadores.

[0091] Las líneas celulares que soportan la replicación del virus influenza se hacen crecer preferiblemente en medios de cultivo libres de suero y/o medios libres de proteínas. Un medio se denomina medio exento de suero en el contexto de la presente invención en donde no hay aditivos de suero de origen humano o animal. Se entiende sin proteínas los cultivos en los que se produce la multiplicación de las células con exclusión de proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos proteicos y proteínas no séricas, pero que opcionalmente pueden incluir proteínas como tripsina u otras proteasas que puedan ser necesarias para el crecimiento viral. Las células que crecen en tales cultivos contienen proteínas de forma natural.

[0092] Las líneas celulares que soportan la replicación del virus de la gripe se cultivan preferiblemente por debajo de 37°C [50] durante la replicación viral, p. ej. 30-36°C, a 31-35°C, o al 33±1°C.

[0093] El método para la propagación de virus en cultivos de células generalmente incluye las etapas de inocular las células cultivadas con la cepa para ser cultivadas, el cultivo de las células infectadas durante un período de tiempo deseado para la propagación de virus, tales como por ejemplo como se determina por el título de virus o expresión del antígeno (p. ej., entre 24 y 168 horas después de la inoculación) y recolección del virus propagado. Las células cultivadas se inoculan con un virus (medido por PFU o TCID50) a una proporción de células de 1:500 a 1:1, preferiblemente de 1:100 a 1:5, más preferiblemente de 1:50 a 1:10. El virus se agrega a una suspensión de las células o se aplica a una monocapa de las células, y el virus se absorbe en las células durante al menos 60 minutos pero generalmente menos de 300 minutos, preferiblemente entre 90 y 240 minutos a 25°C. a 40°C, preferiblemente de 28°C a 37°C. El cultivo de células infectadas (p. ej., monocapas) puede eliminarse por congelación-descongelación o por acción enzimática para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes del cultivo recolectado. Los fluidos recolectados se inactivan o almacenan congelados. Las células cultivadas se pueden infectar con una multiplicidad de infección ("moi") de aproximadamente 0,0001 a 10, preferiblemente de 0,002 a 5, más preferiblemente de 0,001 a 2. Aún más preferiblemente, las células se infectan a una moi de aproximadamente 0,01. Las células infectadas se pueden recolectar de 30 a 60 horas después de la infección. Preferiblemente, las células se recolectan de 34 a 48 horas después de la infección. Aún más preferiblemente, las células se recolectan de 38 a 40 horas después de la infección. Las proteasas (típicamente tripsina) se agregan generalmente durante el cultivo celular para permitir la liberación viral, y las proteasas se pueden agregar en cualquier etapa adecuada durante el cultivo.

[0094] Un producto de vacuna incluyendo vacuna preparada a partir de cultivo celular contiene preferiblemente menos de 10 ng (preferiblemente menos de 1 ng, y más preferiblemente menos de 100 pg) de ADN de células huésped residuales por dosis, aunque pequeñas cantidades de ADN de células huésped pueden estar presentes.

[0095] Se prefiere que la longitud media de cualquier ADN de células huésped residuales es de menos de 500 pb por ejemplo menos de 400 pb, a menos de 300 pb, a menos de 200 pb, a menos de 100 pb, etc.

[0096] ADN contaminante puede eliminarse durante la preparación de la vacuna utilizando procedimientos de purificación estándar, por ejemplo, cromatografía, etc. La eliminación del ADN de la célula huésped residual puede potenciarse mediante tratamiento con nucleasa, por ejemplo, utilizando una ADNasa. Un método conveniente para reducir la contaminación del ADN de la célula huésped se describe en las referencias 51 y 52, que implica un tratamiento de dos pasos, primero usando una DNasa (p. ej., Benzonasa), que puede usarse durante el crecimiento viral, y luego un detergente catiónico (p. ej., CTAB)., que puede utilizarse durante la alteración del virión. El tratamiento con un agente alquilante, como p-propiolactona, también se puede utilizar para eliminar el ADN de la célula huésped, y ventajosamente también se puede utilizar para inactivar viriones [53].

[0097] Algunas realizaciones de la invención utilizan una vacuna monovalente de la gripe (es decir, que incluye antígeno de hemaglutinina de una sola cepa de virus de influenza), pero en algunas realizaciones puede ser una vacuna multivalente, tal como una vacuna bivalente, vacuna trivalente, una vacuna tetravalente, o una vacuna >4-valente (es decir, que incluye hemaglutinina de más de cuatro cepas diferentes del virus de la influenza). Vacunas monovalentes y multivalentes se distinguen fácilmente mediante pruebas de múltiples tipos de HA, por secuenciación de aminoácidos, etc.

[0098] Una vacuna monovalente es particularmente útil para inmunizar contra una cepa de pandemia o potencialmente de pandemia, ya sea durante una pandemia o en una situación de pre-pandemia. Las características de estas cepas son: (a) contienen una nueva hemaglutinina en compraración con las hemaglutininas en las cepas humanas que circulan actualmente, es decir, una que no ha sido evidente en la población humana durante más de una década (p. ej., H2), o que no ha sido previamente visto en absoluto en la población humana (p. ej., H5, H6 o H9, que generalmente se han encontrado solo en poblaciones de aves), de modo que la población humana será inmunológicamente ingenua a la hemaglutinina de la cepa; (b) pueden transmitirse horizontalmente en la población humana; y (c) son patógenos para los seres humanos. Estas cepas pueden tener cualquiera de los subtipos de influenza A HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. Se prefiere un virus con el tipo de hemaglutinina H5 para inmunizar contra la influenza pandémica, o un subtipo H2, H7 o H9. La invención puede proteger contra uno o más de los subtipos NA del virus de la influenza A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. Por tanto, las posibles cepas incluyen H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 y H7N7, y cualquier otra cepa emergente potencialmente pandémica.

[0099] Una vacuna multivalente es más típica en un entorno de temporada, p. ej. una vacuna trivalente es típica, incluyendo hemaglutininas de dos cepas de virus de influenza A y una cepa de virus de influenza B, tales como a partir de una cepa A de la gripe H1N1, una cepa de virus de influenza A H3N2 y una cepa del virus de la influenza B. Una vacuna tetravalente también es útil [54], por ejemplo, que incluye antígenos de dos cepas del virus de la influenza A y dos cepas del virus de la influenza B, o tres cepas del virus de la influenza A y una cepa del virus de la influenza B. Por tanto, una vacuna puede ser bivalente, trivalente, tetravalente, etc. A excepción de las vacunas monovalentes, es habitual incluir hemaglutinina de las cepas del virus de la influenza A y de la influenza B. En las vacunas que incluyen solo dos cepas del virus de la influenza A, estas serán normalmente una cepa H1 (p. ej., una cepa H1N1) y una cepa H3 (p. ej., una cepa H3N2). En algunas realizaciones, sin embargo, puede haber una cepa del virus de la influenza A pandémica y una cepa H1, o una cepa del virus A de la influenza pandémica y una cepa H3.

[0100] Cuando una vacuna incluye más de una cepa de influenza, las diferentes cepas se cultivan típicamente por separado y se mezclan después de que se hayan recolectado los virus y se hayan preparado los antígenos. Por tanto, un proceso de la invención puede incluir el paso de mezclar antígenos de más de una cepa de influenza.

[0101] Como se describe en la referencia 54, las vacunas tetravalentes ejemplares pueden incluir hemaglutinina a partir de dos cepas de virus de influenza A y dos cepas de virus de influenza B ('A-A-B-B'), o de tres cepas de virus de influenza A y una cepa de virus de influenza B ('A-A-A-B').

[0102] El virus de la influenza B actualmente no muestra diferentes subtipos de HA, pero las cepas del virus de la influenza B se clasifican en dos linajes distintos. Estos linajes surgieron a finales de la década de 1980 y tienen HA que pueden distinguirse antigénica y/o genéticamente entre sí [55]. Las cepas actuales del virus de la influenza B son similares a B/Victoria/2/87 o similares a B/Yamagata/16/88. Cuando una vacuna de la invención incluye dos cepas de influenza B, normalmente será una cepa similar a B/Victoria/2/87 y una cepa similar a B/Yamagata/16/88. Estas cepas generalmente se distinguen antigénicamente, pero también se han descrito diferencias en las secuencias de aminoácidos para distinguir los dos linajes, por ejemplo, las cepas similares a B/Yamagata/16/88 a menudo (pero no siempre) tienen proteínas HA con deleciones en el residuo de aminoácido 164, numerados en relación con la secuencia HA 'Lee40' [56].

[0103] Vacunas A-A-B-B preferidas incluyen hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2; (iii) una cepa similar a B/Victoria/2/87; y (iv) cepa similar a B/Yamagata/16/88.

[0104] En las vacunas incluyendo tres cepas de virus de Influenza A, éstas generalmente serán una cepa H1 (p. ej., una cepa H1N1) y dos cepas H3 (p. ej. dos cepas H3N2). Las dos cepas H3 tendrán proteínas HA antigénicamente distintas, p. ej. una cepa H3N2 que reacciona de forma cruzada con A/Moscow/10/99 y una cepa H3N2 que reacciona de forma cruzada con A/Fujian/411/2002. Las dos cepas H3 pueden ser de diferentes clados (los clados A, B y C de las cepas H3N2 se describen en la referencia 57). En algunas realizaciones, sin embargo, una de estas cepas (es decir, H1 o una de las dos cepas H3) puede reemplazarse por una cepa pandémica.

[0105] Así, una vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2 similar a A/Moscow/10/99; (iii) una cepa H3N2 similar a A/Fujian/411/2002; y (iv) una cepa del virus de la influenza B, que puede ser similar a B/Victoria/2/87 o similar a B/Yamagata/16/88.

[0106] Otra vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1, (ii) una cepa H3N2, (iii) una cepa H5 (p. ej., una cepa H5N1) y (iv) una cepa de influenza B.

[0107] Otra vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) dos cepas H1 diferentes, (ii) una cepa de H3N2, y (iii) una cepa de la influenza B.

[0108] Cuando están presentes antígenos de dos o más cepas del virus de la influenza B, al menos dos de las cepas del virus de la influenza B pueden tener hemaglutininas distintas pero neuraminidasas relacionadas. Por ejemplo, ambas pueden tener una neuraminidasa similar a B/Victoria/2/87 [58] o ambas pueden tener una neuraminidasa similar a B/Yamagata/16/88. Por ejemplo, dos neuraminidasas similares a B/Victoria/2/87 pueden tener una o más de las siguientes características de secuencia: (1) no una serina en el residuo 27, pero preferiblemente una leucina; (2) no un glutamato en el residuo 44, pero preferiblemente una lisina; (3) no una treonina en el residuo 46, pero preferiblemente una isoleucina; (4) no una prolina en el residuo 51, pero preferiblemente una serina; (5) no una arginina en el residuo 65, pero preferiblemente una histidina; (6) no una glicina en el residuo 70, pero preferiblemente un glutamato; (7) no una leucina en el residuo 73, pero preferiblemente una fenilalanina; y/o (8) no una prolina en el residuo 88, pero preferiblemente una glutamina. De manera similar, en algunas realizaciones, la neuraminidasa puede tener una deleción en el residuo 43, o puede tener una treonina; una deleción en el residuo 43, que surge de una deleción de trinucleótidos en el gen NA, se ha descrito como una característica de las cepas similares a B/Victoria/2/87, aunque las cepas recientes han recuperado Thr-43 [58]. A la inversa, por supuesto, las características opuestas pueden ser compartidas por dos neuraminidasas similares a B/Yamagata/16/88, por ejemplo, S27, E44, T46, P51, R65, G70, L73 y/o P88. Estos aminoácidos se enumeran en relación con la secuencia de neuraminidasa 'Lee40' [59]. Por lo tanto, una vacuna A-A-B-B de la invención puede usar dos cepas B que son antigénicamente distintas para hA (una similar a B/Yamagata/16/88, una similar a B/Victoria/2/87), pero están relacionadas para NA (ambas similares a B/Yamagata/16/88-like, o ambas similares a B/Victoria/2/87).

[0109] En algunas realizaciones, la invención no abarca una vacuna trivalente dividida que contiene la hemaglutinina de cada una de A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wyoming/03/2003 (H3N2) y B/Jiangsu/10/Cepas de 2003.

[0110] Las cepas cuyos antígenos útilmente se pueden incluir en las composiciones incluyen cepas que son resistentes a la terapia antiviral (p. ej., resistentes al oseltamivir [60] y/o zanamivir), incluyendo cepas pandémicas resistentes [61].

[0111] En algunas realizaciones de la divulgación, una vacuna puede incluir una pequeña cantidad de conservante a base de mercurio, tal como tiomersal o mertiolato. Cuando están presentes, tales conservantes proporcionarán típicamente menos de 5 pg/ml de mercurio y son posibles niveles más bajos, por ejemplo, <1 pg/ml, <0,5 pg/ml. Las vacunas preferidas están libres de tiomersal y, más preferiblemente, están libres de mercurio [23,62]. Estas vacunas pueden incluir un conservante no mercurial. Las alternativas no mercuriales al tiomersal incluyen 2-fenoxietanol o succinato de a-tocoferol [23]. Lo más preferiblemente, una vacuna no contiene conservantes.

[0112] En algunas realizaciones, una vacuna puede incluir una cantidad estabilizante de gelatina por ejemplo, a menos de 0,1%. En otras realizaciones, sin embargo, una vacuna no contiene gelatina. La ausencia de gelatina puede asegurar que la vacuna sea segura en la pequeña proporción de pacientes que son sensibles a la gelatina [63,64].

[0113] En algunas realizaciones, una vacuna puede incluir uno o más antibióticos por ejemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B. En realizaciones preferidas, sin embargo, la vacuna está libre de antibióticos.

[0114] En algunas formas de realización, una vacuna puede incluir formaldehído. Sin embargo, en formas de realización preferidas, la vacuna está libre de formaldehído.

[0115] Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, una vacuna puede incluir componentes del huevo (p. ej., ovoalbúmina y ovomucoide), pero realizaciones preferidas están libres de componentes de huevo.

[0116] La preparación de vacunas sin el uso de ciertos componentes y aditivos se describe en la referencia 65, asegurando así que estos materiales no están presentes incluso en cantidades residuales.

[0117] La hemaglutinina (HA) es el inmunógeno principal en las vacunas antigripales inactivadas actuales, y las dosis de vacuna están estandarizadas por referencia a los niveles de HA, normalmente medidos por SRID. Las vacunas existentes contienen típicamente alrededor de 15 |jg de HA por cepa, aunque se pueden usar dosis más bajas, por ejemplo, para niños o en situaciones de pandemia, o cuando se usa un adyuvante. Se han utilizado dosis fraccionadas como A (es decir, 7,5 jg de HA por cepa), % y 1/8, al igual que las dosis más altas (p. ej., dosis 3x o 9x [66,67]). Estas vacunas tienen un volumen de dosificación de 0,5 ml, es decir, una concentración típica de HA de 30 jg/ml/cepa. El producto trivalente INTANZA™ contiene 9 jg de HA por cepa en un volumen de 0,1 ml, es decir, una concentración de HA de 90 jg/ml/cepa, lo que da una concentración total de HA de 270 jg/ml.

[0118] Los productos preparados mediante los procesos de la presente invención pueden incluir entre 0,1 y 50 jg de HA por cepa de influenza por dosis, preferiblemente entre 0,1 y 50 jg , por ejemplo, 1-20 jg . Idealmente, un producto tiene <16 mg de hemaglutinina por cepa, por ejemplo, 1-15 jg , 1-10 jg , 1-7,5 jg , 1-5 jg , etc. Las dosis particulares de HA por cepa incluyen, por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, alrededor de 1,9, aproximadamente 1,5, etc.

[0119] vacunas antígeno en la superficie, HA puede hacer hasta más de 50% (en masa) de la proteína total en la composición, p. ej. entre 60-100%, 60-90% o 60-80% de la proteína de influenza total en la composición inmunogénica.

[0120] Para las vacunas vivas, la dosificación se mide por dosis de cultivo de tejidos mediana infecciosa (TCID⁵⁰) en lugar de contenido HA por ejemplo un TCID⁵⁰ de entre 106 y 108 (preferiblemente entre 1065 a 1075) por cepa por dosis.

[0121] Las cepas de influenza utilizadas con la invención pueden tener un HA natural como el que se encuentra en un virus de tipo silvestre, o una HA modificada. Por ejemplo, se sabe cómo modificar HA para eliminar determinantes (p. ej., regiones hiperbásicas alrededor del sitio de escisión HA1/HA2) que hacen que un virus sea altamente patógeno en especies de aves. El uso de genética inversa facilita tales modificaciones.

[0122] Productos de vacuna preparados por los procesos de la invención pueden incluir componentes además de los antígenos de la vacuna de la gripe. Como se discutió anteriormente, por ejemplo, pueden incluir un material de matriz biosoluble y biodegradable, o un polímero de película oral.

[0123] Productos de vacuna pueden incluir un detergente. El nivel de detergente puede variar ampliamente, por ejemplo, entre 0,01-50 jg de detergente por jg de HA ( 'jg / jg ') o entre 0,05-50 jg . Un bajo nivel de detergente se puede usar por ejemplo entre 0 ,05-1 jg/jg o entre 0,1-1 jg / jg , o un alto nivel puede ser usado por ejemplo entre 5-30 jg /jg . El detergente puede ser un detergente único (p. ej., polisorbato 80 o CTAB) o una mezcla (p. ej., polisorbato 80 y CTAB). Los detergentes preferidos son no iónicos, tales como polisorbato 80 ('Tween 80') o etoxilato de octilfenol ('Triton X100'). El polisorbato 80 puede estar presente entre 0,05-50 jg de polisorbato 80 por jg de HA, por ejemplo, entre 0,05-0,75 jg / jg , 0,1-1 jg / jg , 0,1-0,8 jg / jg , 0,1-0,5 jg / jg , 5-40 jg / jg , 5-30 jg / jg o 8-25 jg / jg . El CTAB puede estar presente en una cantidad baja, por ejemplo, menos de 0,1 jg / jg , menos de 0,05 jg / jg .

[0124] Como se ha mencionado anteriormente, algunos productos de vacunas pueden incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol, pero las vacunas preferidas son mercurio o libres de conservante.

[0125] Productos de vacuna pueden incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato de dihidrógeno de potasio, dihidrato de fosfato de disodio, cloruro de magnesio, calcio, cloruro, etc.

[0126] Productos de vacuna pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones normalmente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.

[0127] Productos de la vacuna son preferiblemente estériles. Los productos de vacuna son preferiblemente no pirogénicos, por ejemplo, contienen <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0,1 UE por dosis. Los productos de vacuna preferiblemente no contienen gluten.

[0128] Productos de la vacuna pueden incluir moléculas inmunoestimuladoras. Estas se pueden mezclar con antígeno antes de preparar un parche. Las clases adecuadas de molécula inmunoestimuladora incluyen, pero no se limitan a: agonistas de TLR3; agonistas de TLR4; agonistas de TLR5; agonistas de TLR7; agonistas de TLR8; agonistas de TLR9; y agonistas de CDld. Las moléculas inmunoestimuladoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a: imidazoquinolinas tales como imiquimod ("R-837") [68,69] y resiquimod ("R-848") [70], o sales de las mismas (p. ej., las sales de clorhidrato); derivados de fosfato de aminoalquilo glucosaminida, tales como RC-529 [71,72]; aglicosilceramidas, tales como a-galactosilceramida; 'ER 804057' de la referencia 73; E5564 [74,75]; etc.

[0129] Los métodos para evaluar las respuestas de anticuerpos, la neutralización de la capacidad y la protección después de la vacunación contra el virus de la gripe son bien conocidas en la técnica. Los estudios en humanos han demostrado que los títulos de anticuerpos contra la hemaglutinina del virus de la influenza humana se correlacionan con la protección (un título de inhibición de la hemaglutinación de la muestra de suero de aproximadamente 30-40 proporciona aproximadamente un 50% de protección contra la infección por un virus homólogo) [76]. Las respuestas de los anticuerpos se miden típicamente por inhibición de la hemaglutinación, por microneutralización, por inmunodifusión radial simple (SRID) y/o por hemólisis radial simple (SRH). Estas técnicas de ensayo son bien conocidas en la técnica. Las vacunas preferidas satisfacen 1, 2 o 3 de los criterios de eficacia del CPMP. En adultos (18-60 años), estos criterios son: (1) seroprotección >70%; (2) >40% de seroconversión; y/o (3) un aumento de GMT >2,5 veces. En ancianos (>60 años), estos criterios son: (1) seroprotección >60%; (2) seroconversión >30%; y/o (3) un aumento de GMT >2 veces. Estos criterios se basan en estudios abiertos con al menos 50 pacientes.

[0130] Las vacunas antigripales se recomiendan actualmente para su uso en la inmunización pediátrica y de adultos, a partir de los 6 meses de edad. Por lo tanto, un sujeto humano puede tener menos de 1 año, 1 a 5 años, 5 a 15 años, 15 a 55 años o al menos 55 años. Los sujetos preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (p. ej., >50 años, >60 años y preferiblemente >65 años), los jóvenes (p. ej., <5 años), sujetos hospitalizados, trabajadores sanitarios, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos, sujetos inmunodeficientes, sujetos que han tomado un compuesto antiviral (p. ej., un compuesto de oseltamivir o zanamivir; ver más abajo) en los 7 días anteriores a recibir la vacuna, personas con alergia al huevo y personas que viajan al extranjero. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse de manera más general en una población. Para las cepas pandémicas, se prefiere la administración a todos los grupos de edad.

[0131] La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en pacientes inmunológicamente ingenuos, por ejemplo, para personas que nunca han recibido una vacuna contra la influenza antes, o para vacunar contra un nuevo subtipo de HA (como en un brote pandémico).

Vacunas líquidas a granel

[0132] Como se mencionó anteriormente, también se describe aquí una vacuna líquida a granel que comprende hemaglutinina del virus de la gripe, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es al menos 12 mg/ml y (b) la vacuna está sustancialmente libre de sacarosa. Estas vacunas a granel pueden ser intermedios útiles durante la fabricación de vacunas para su administración por vías no intramusculares. La concentración de HA puede ser superior a 12 mg/ml, por ejemplo, >15 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml, >30 mg/ml, >35 mg/ml, >40 mg/ml, >45 mg/ml, >50 mg/ml.

[0133] También se describe en el presente documento una vacuna líquida a granel que comprende una hemaglutinina del virus de la influenza A, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 2 mg/ml, (b) la hemaglutinina no es un H1 o una hemaglutinina H3. Preferiblemente, la vacuna (c) está sustancialmente libre de sacarosa. Estas vacunas a granel, que no contienen hemaglutinina(s) del virus de la influenza A H1 ni H3, pueden ser intermedios útiles durante la fabricación de vacunas para su administración por vías no intramusculares. La concentración de HA puede ser superior a 2 mg/ml por ejemplo >3mg/ml, >4mg/ml, >5 mg/ml, >6mg/ml, >7mg/ml, >8mg/ml, >9mg/ml, >10 mg/ml, >12 mg/ml, >14 mg/ml, >15 mg/ml, >16 mg/ml, >18 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml, >30 mg/ml, >35 mg/ml, >40 mg/ml, >45 mg/ml, >50 mg/ml. La hemaglutinina puede ser H5.

[0134] También se describe en el presente documento una vacuna líquida a granel que comprende una hemaglutinina del virus de influenza B, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 2 mg/ml, (b) la hemaglutinina no es una hemaglutinina B/Shandong/7/97. Preferiblemente, la vacuna (c) está sustancialmente libre de sacarosa. Estas vacunas a granel, que no contienen hemaglutinina(s) del virus de la influenza A H1 ni H3, pueden ser intermedios útiles durante la fabricación de vacunas para su administración por vías no intramusculares. La concentración de HA puede ser mayor que 2 mg/ml por ejemplo >3mg/ml, >4mg/ml, >5 mg/ml, >6mg/ml, >7mg/ml, >8mg/ml, >9mg/ml, >10mg/ml, >12 mg/ml, >14 mg/ml, >15 mg/ml, >16 mg/ml, >18 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml, >30 mg/ml, >35 mg/ml, >40 mg/ml, >45 mg/ml, >50 mg/ml.

[0135] También se describe aquí una vacuna líquida a granel que comprende una hemaglutinina del virus de influenza B, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 2 mg/ml, (b) el virus de la gripe B es una cepa similar a B/Yamagata/16/88. Preferiblemente, la vacuna (c) está sustancialmente libre de sacarosa. Estas vacunas a granel, que no contienen hemaglutinina(s) del virus de la influenza A H1 ni H3, pueden ser intermedios útiles durante la fabricación de vacunas para su administración por vías no intramusculares. La concentración de HA puede ser mayor que 2 mg/ml por ejemplo >3mg/ml, >4mg/ml, >5 mg/ml, >6mg/ml, >7mg/ml, >8mg/ml, >9mg/ml, >10mg/ml, >12 mg/ml, >14 mg/ml, >15 mg/ml, >16 mg/ml, >18 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml, >30 mg/ml, >35 mg/ml, >40 mg/ml, >45 mg/ml, >50 mg/ml.

[0136] También se describe en el presente documento una vacuna líquida a granel que comprende hemaglutinina de al menos dos cepas de virus de la gripe, en donde (a) la concentración de hemaglutinina es de al menos 2 mg/ml/deformación y (b) la vacuna está sustancialmente libre de sacarosa. La concentración de HA puede ser superior a 2 mg/ml/cepa, por ejemplo, >3 mg/ml/cepa, >4 mg/ml/cepa, >5 mg/ml/cepa, >6 mg/ml/cepa, >7 mg/ml/cepa, >8 mg/ml/cepa, >9 mg/ml/cepa, >10 mg/ml/cepa, >12 mg/ml/cepa, >14 mg/ml/cepa, >15 mg/ml/cepa, >16 mg/ml/cepa, >18 mg/ml/cepa, >20 mg/ml/cepa, >25 mg/ml/cepa, >30 mg/ml/cepa, >35 mg/ml/cepa, >40 mg/ml/cepa, >45 mg/ml/cepa, >50 mg/ml/cepa. Esta vacuna multivalente a granel sin sacarosa es idealmente 2-valente, 3-valente o 4-valente. En una vacuna 3-valente, por lo tanto, la concentración total de HA es de al menos 6 mg/ml. La concentración de HA en estas vacunas líquidas a granel es preferiblemente una concentración de HA medida por SRID, por ejemplo, usando reactivos de referencia aprobados por el regulador. La SRID se puede realizar en una vacuna a granel antes de su formulación (p. ej., antes del recubrimiento o de la formación de la película), pero en algunas realizaciones se realiza en material recuperado de un producto ya formulado (p. ej., después de recuperar el antígeno de una aguja recubierta). Una ventaja de SRID es que puede distinguir entre diferentes HA en una sola muestra, por ejemplo, cada HA en una vacuna trivalente puede analizarse en paralelo. Cuando una composición incluye una hA particular, por lo tanto, su contenido se puede analizar incluso en presencia de otras HA.

[0138] Además de ser sustancialmente libres de sacarosa, estos graneles pueden estar sustancialmente libres de manitol. Los volúmenes pueden incluso estar sustancialmente exentos de sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa, sorbitol, manitol, maltitol, eritritol y xilitol. En algunas realizaciones, los volúmenes están sustancialmente exentos de disacárido y de alcohol de azúcar.

General

[0139] El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste en", p. ej. una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X Y.

[0140] La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

[0141] El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±5%.

[0142] A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezclar dos o más componentes no requiere cualquier orden específico de mezcla. Por tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces se pueden combinar dos componentes entre sí, y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc.

[0143] Cuando se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes que estén libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) y, en particular, libres de encefalopatía espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales.

[0144] La invención proporciona procedimientos de concentración libre de liofilización. Esto significa que la invención utiliza antígeno que se concentra y formula sin liofilizar. El alcance de la protección no pretende excluir situaciones en las que se añade un antígeno liofilizado a una vacuna, siempre que al menos una parte del antígeno de la vacuna se concentre y formule sin liofilizar. Por tanto, el uso de un liofilizado mientras se realiza también un procedimiento de concentración sin liofilización de la invención no cae fuera del alcance pretendido de protección global.

[0145] Cuando se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición, entonces el compuesto alternativamente puede ser reemplazado por un profármaco adecuado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0146]

La Figura 1 muestra cromatógrafos CET de un antígeno en masa del virus de la influenza B monovalente. La masa se analizó (A) antes de la liofilización, (B) después de la liofilización en presencia de sacarosa, o (C) después de la liofilización en presencia de sacarosa y manitol. El eje x muestra el tiempo de retención (minutos) y el eje y muestra las unidades de absorbancia.

La Figura 2 muestra los títulos de HI en suero para (A) H1N1 Brisbane (B) H3N2 Brisbane (C) B Florida. Los 4 pares de barras son, de izquierda a derecha: trivalente sin adyuvante; adyuvante trivalente; monovalente sin adyuvante; y control negativo de PBS. La barra de la izquierda en cada par es una masa monovalente no concentrada; la barra de la derecha es el antígeno concentrado en TFF.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Impacto de la liofilización sobre hemaglutinina del virus de la gripe

[0147] Antígeno a granel del virus de la gripe monovalente se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño (CET), y después se analizó de nuevo después de la liofilización y reconstitución. Se probaron dos procedimientos de liofilización diferentes: uno con sacarosa sola como lioprotector y otro con sacarosa y manitol. Los resultados de la Figura 1 muestran que un pico prominente a los 5 minutos (Figura 1A) ha desaparecido en los materiales reconstituidos (Figuras 1B y 1C). Por tanto, la concentración de antígeno debería evitar la liofilización porque este tratamiento altera de forma tangible el antígeno de la vacuna.

Comparación de las técnicas de concentración de antígeno

[0148] La concentración de partida de HA fue de aproximadamente 0,5 mg/ml en graneles de virus de la influenza monovalente. Se utilizaron tres métodos diferentes para la concentración de varios graneles: filtración centrífuga; ultrafiltración; y TFF. La filtración centrífuga utilizó un dispositivo Millipore™ con un límite de 10 kDa, operado a 5000 rpm durante 45 minutos. La ultrafiltración utilizó un concentrador de célula de agitación Amicon™ con una membrana de corte de 10 kDa hecha de celulosa regenerada, operada bajo nitrógeno presurizado durante 1 hora. TFF utilizó un filtro de fibra hueca de polietersulfona modificada con un límite de 30 kDa, operado para concentrar un volumen inicial de 45 ml hasta 1,5 ml. Para aumentar la concentración que podía alcanzarse, los métodos de centrifugación y ultrafiltración también se combinaron con liofilización.

[0149] La filtración centrífuga alcanzó una concentración de ~ 10 veces por si sola. Si seguía la liofilización, aparecían picos de CET adicionales y las muestras reconstituidas contenían agregados visibles.

[0150] La ultrafiltración seguida de liofilización, y luego reconstitución de nuevo en el volumen inicial, dio material que tenía una concentración de HA (medida por SRID) comparable a la del material inicial, lo que indica que no hay pérdida de antígeno funcional. El material reconstituido fue estable durante >2 semanas.

[0151] Mientras que estos dos métodos requirieron liofilización para lograr una alta concentración (p. ej., 30 veces), esto se podría lograr en un solo paso cuando se utiliza TFF. Además, el material concentrado es estable durante >2 semanas. Para lograr una alta concentración de antígeno sin requerir liofilización, por lo tanto, la TFF es la técnica preferida.

TFF y liofilización

[0152] Graneles monovalentes de tres cepas cultivadas de huevos de virus de la gripe A y B fueron tratados por: (i) la adición de sacarosa; (ii) liofilización en presencia de sacarosa, con reconstitución en el volumen original; (iii) la misma liofilización que en (ii), pero con reconstitución a la mitad del volumen original; (iv) concentración por TFF; o (v) concentración por TFF como en (v), seguida de liofilización y reconstitución como en (ii). En cada caso, el contenido de HA fue evaluado por SRID y se muestra a continuación como el valor absoluto y también como un factor de concentración relativo a los respectivos graneles iniciales (que tenían una concentración de HA que variaba de 311 a 437 mg/ml). Si el factor de concentración en (i) o (ii) es menor que 1, el lioprotector y/o la liofilización está interfiriendo con la unión de HA; lo mismo se aplica si el factor en (iii) es menor que 2, o si el factor en (v) es menor que en (iv).

[0153] Los resultados de un conjunto de experimentos fueron los siguientes:

(Continuación)

_____ _____

[0154] En todos los casos, por lo tanto, los tratamientos de (i) a (iii), condujeron a una reducción en HA detectable, aunque el efecto de tratamiento (i) de la cepa 2 era muy pequeña. Además, aunque la adición del lioprotector solo condujo a una reducción de HA, la reducción posterior a la reconstitución fue incluso mayor, es decir, la reducción de los niveles de HA fue siempre mayor después del tratamiento (ii) que del tratamiento (i). Por tanto, la liofilización conduce a una gran caída de HA detectable. Con la excepción de la cepa 2, se observó un efecto similar después de la TFF, es decir, la liofilización redujo el contenido de HA detectable por SRID.

[0155] Los resultados de un conjunto separado de experimentos, usando solo los tratamientos (iv) y (v), fueron los siguientes:

[0156] Por tanto, TFF solo puede alcanzar una concentración >50 veces. Sin embargo, como se vio anteriormente, el paso adicional de liofilización siempre condujo a una reducción en el contenido de HA medido por SRID.

Estudios de inmunogenicidad

[0157] TFF concentró los graneles monovalentes de influenza de la temporada 2008/2009. Los antígenos de influenza concentrados se evaluaron para determinar su inmunogenicidad in vivo y se compararon con los materiales a granel monovalentes originales. Los antígenos se administraron por vía intramuscular a ratones Balb/C hembra usando 2 inmunizaciones separadas por 3 semanas. Los antígenos se administraron como vacunas monovalentes (03 |jg HA), como vacunas trivalentes (03 jg HA), o como vacunas trivalentes con adyuvante (03 jg HA con adyuvante de emulsión de aceite en agua MF59). Se utilizó PBS como control negativo. Los títulos de anticuerpos anti-influenza funcionales se evaluaron mediante inhibición de la hemaglutinación (HI).

[0158] Los graneles monovalentes de influenza se concentraron mediante TFF a 29, 28 y 20 mg/ml de HA. Los tres concentrados tenían una proporción de HA a proteína total en el rango de 0,6 a 0,8 ( jg de HA por jg de proteína). Se concentró Tween 80 (polisorbato 80) junto con el antígeno y se estimó en 8-14 mg/ml. La relación de Tween 80 a HA para los antígenos concentrados fue de 0,1-0,2 jg por jg de HA, que es la misma que en los graneles monovalentes típicos. En contraste con Tween 80, CTAB no se concentró durante el proceso y estaba muy por debajo del nivel que estaba presente en los graneles monovalentes sin procesar (<0,01 jg de detergente por jg de HA). Los antígenos concentrados fueron estables por SRID durante 3-4 semanas en solución a 4°C.

[0159] Los títulos de HI 2 semanas después de la segunda inmunización se muestran en la Figura 2. Para las tres cepas (H1N1 Brisbane; H3N2 Brisbane; B Florida) la inmunogenicidad de los antígenos concentrados fue comparable a la de los graneles monovalentes no concentrados.

[0160] Se entenderá que la invención se ha descrito a modo de ejemplo solamente y modificaciones pueden hacerse mientras permanezcan dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones.

REFERENCIAS

[0161]

[1] Malke et al. (2010) The Internet Journal of Pediatrics and Neonatology. Vol 11, n° 2.

[2] Koutsonanos et al. (2009) PLoS ONE 4(e): e4773.

[3] Quan et al. (2009) PLoS ONE 4(9):e7152.

[4] WO2007/030477.

[5] US-6945952.

[6] US-7211062.

[7] US-7182747.

[8] Oh et al. (2006) American Association of Pharmaceutical Scientists, 2006 Annual Meeting and Exposition. The AAPS Journal. 8(S2). (Annual Meeting).

[9] Gill & Prausnitz (2007) J Control Release 117:227-37.

[10] WO2007/124393.

[11] WO2007/061964.

[12] WO2007/059289.

[13] Jin el al. (2009) Biomed Microdevices. 11(6):1195-203.

[14] Su et al. (2009) ACS Nano. 3(11):3719-29.

[15] Cui & Mumper (2002) Pharmaceutical Research 19:947-53.

[16] WO02/051382.

[17] WO2010/002418.

[18] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4a edición, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0. 2004, ISBN: 0-7216-9688­ 0.

[19] WO02/28422.

[20] WO02/067983.

[21] WO02/074336.

[22] WO01/21151.

[23] WO02/097072.

[24] WO2005/113756.

[25] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373:74-91.

[26] WO96/37624.

[27] WO98/46262.

[28] WO95/18861.

[29] Bright et al. (2008) PLoS ONE 3:e1501.

[30] Crevar & Ross (2008) Virology Journal 5:131.

[31] WO97/37000.

[32] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[33] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[34] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50.

[35] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[36] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[37] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[38] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[39] WO03/076601.

[40] WO2005/042728.

[41] WO03/043415.

[42] WO01/85938.

[43] WO2006/108846.

[44] EP-A-1260581 (WO01/64846).

[45] WO2006/071563.

[46] WO2005/113758.

[47] WO2006/027698.

[48] WO03/023021

[49] WO03/023025

[50] WO97/37001.

[51] EP-B-0870508.

[52] US 5948410.

[53] WO2007/052163.

[54] WO2008/068631.

[55] Rota et al. (1992) J Gen Virol 73:2737-42.

[56] GenBank sequence GI:325176.

[57] Holmes et al. (2005) PLoS Biol. 3(9):e300.

[58] McCullers et al. (1999) J Virol 73:7343-8.

[59] GenBank sequence GI:325237.

[60] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9):1627-30.

[61] Le et al. (2005) Nature 437(7062):1108.

[62] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[63] Lasley (2007) Pediatric Asthma, Allergy & Immunology. 20(3): 201-5.

[64] Coop et al. (2008) Int Arch Allergy Immunol. 146(1):85-8.

[65] WO2009/001217 [66] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[67] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[68] US 4,680,338.

[69] US 4,988,815.

[70] WO92/15582.

[71] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[72] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[73] WO03/011223.

[74] Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42.

[75] US2005/0215517.

[76] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para preparar una vacuna contra la influenza, que comprende los pasos de (i) aumentar la concentración de hemaglutinina del virus de la influenza en una composición líquida que incluye esa hemaglutinina mediante filtración de flujo tangencial, para proporcionar un antígeno concentrado con un contenido de hemaglutinina de >15 mg/ml medido por SRID, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de disacárido y de alcohol de azúcar, y (ii) formular una vacuna contra la influenza a partir del antígeno concentrado; en donde el antígeno concentrado no se liofiliza entre o durante los pasos (i) y (ii); en donde la formulación de vacuna final está sustancialmente libre de disacáridos y alcohol de azúcar.

2. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde el paso (i) aumenta la concentración de antígeno en al menos 10 veces.

3. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición líquida incluye un detergente; por ejemplo, en donde el detergente es un detergente iónico (p. ej., CTAB) o un detergente no iónico (p. ej., polisorbato 80).

4. El proceso de la reivindicación 3, en donde el detergente se concentra en el paso (i); por ejemplo, en donde el detergente se concentra en un grado menor que el grado en donde se concentra el antígeno; o en donde el detergente no está concentrado en el paso (i).

5. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde el paso (ii) prepara una forma sólida de vacuna; por ejemplo, en donde el paso (ii) implica el secado por evaporación.

6. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en donde el paso (ii) prepara microagujas sólidas biodegradables a partir del antígeno concentrado.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el paso (ii) recubre microagujas sólidas con el antígeno concentrado; por ejemplo, en donde las microagujas son de metal o plástico.

8. El proceso de la reivindicación 7, en donde el paso (ii) aplica el antígeno concentrado a la superficie de una o más microagujas sólidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubierto para la inyección de la vacuna.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde las microagujas tienen una longitud de 100­ 2500 mm.

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el paso (ii) prepara una película delgada a partir del antígeno concentrado; por ejemplo, en donde el paso (ii) comprende mezclar el antígeno concentrado con uno o más polímeros solubles por vía oral, y luego formar una película usando la mezcla para proporcionar una película delgada adecuada para la administración bucal de la vacuna; o, en donde el paso (ii) comprende mezclar el antígeno de vacuna concentrado con uno o más polímeros solubles tópicamente, y luego formar una película usando la mezcla para proporcionar una película delgada adecuada para la administración transcutánea de la vacuna.

11. Un proceso para preparar una vacuna empaquetada, que comprende: (i) preparar una vacuna sólida mediante el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10; luego (ii) empaquetar una vacuna sólida en una bolsa de dosis unitaria individual.

12. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde el contenido de hemaglutinina se mide después del paso de formulación usando SRID.