KR20130109004A

KR20130109004A - 동결건조하지 않는 인플루엔자 백신 항원의 농축

Info

Publication number: KR20130109004A
Application number: KR1020127032675A
Authority: KR
Inventors: 수쉬마 콤마레디; 아만다 스캄피니; 바바라 보드너; 데렉 오하간; 만모한 싱
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2013-10-07
Also published as: JP5959508B2; ES2825712T3; EP2575872A2; KR20180096829A; CA2801149A1; DK2575872T3; EP3827843A1; HUE051711T2; WO2011151723A3; KR20220163497A; KR102113512B1; KR20200057097A; BR112012030619A2; KR20210154996A; PT2575872T; EA201291437A1; EP2575872B1; KR102471356B1; AU2011262309B2; US20130224245A1

Abstract

항원 농축 과정은 최종 조제 및/또는 전달 전에 벌크 항원의 동결건조를 수반하지 않는다. 따라서 백신을 제조하는 방법은 (i) 농축된 항원을 제공하기 위하여, 항원을 포함하는 액체 조성물에서 항원의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) 농축된 항원으로부터 백신을 조제하는 단계를 포함한다. 농축된 항원은 단계 (i) 및 (ii) 사이에 또는 중에 동결건조되지 않는다. 본 발명은 고체 백신 형태를 제조하는데 특히 유용하다.

Description

동결건조하지 않는 인플루엔자 백신 항원의 농축{CONCENTRATION OF INFLUENZA VACCINE ANTIGENS WITHOUT LYOPHILIZATION}

이 출원은 미국 가출원 61/396, 719 (2010년 6월 1일 출원됨) 및 61/465, 405 (2011년 3월 18일 출원됨)의 이익을 주장하고, 이것의 완벽한 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 백신에 사용되는 항원 용액 방법의 분야에 있다.

백신 제조 중에 제조하는 벌크에서 항원의 농도는 최종 환자 제형의 농도를 초과해서, 방법은 벌크가 희석되는 단계를 수반하는 경우가 종종 있다. 하지만, 일부 경우에서, 수성 벌크에서 항원 농도를 증가시키는 것이 필요하고, 본 발명은 항원을 농축하는 방법과 관련된다. 유용한 방법은 면역원성을 파괴하지 않고 항원의 농도를 증가시켜야 한다.

항원 농축이 필요한 경우는 새로운 전달 기술로 소량의 물질만이 전달되는 경우이다. 예를 들어, 백신은 미세 바늘에 의해 [2, 3] 또는 박막 (thin film) 또는 스트립에 의해 [1, 14-17] 전달될 수 있다. 이 기술은 0.5 ml의 전형적인 근육 내 주사보다 훨씬 작은 부피를 전달하지만 그것들은 같은 양의 항원이 필요할 수도 있는데, 이것은 종종 더 농축된 벌크 항원이 필요할 것이다.

개개의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)의 농도를 125-500 μg/ml에서 14 mg/ml로 증가시킬 수 있는 기존의 한 농축 방법은 10 mg/ml의 농도로 수성 물질의 시작 부피의 접선 유동 여과 (tangential flow filtration; TFF), 다음에 동결건조, 다음에 시작 부피보다 작은 수성 부피로 동결건조물 (lyophilisate)의 복원을 수반한다. 이 방법은 세 개의 다른 1가 HA 벌크에서 수행될 수 있고, 단일 3가 수성 조성물로서 그것들의 복원은 42 mg/ml의 최종 HA 농도를 제공할 수 있다.

백신 제조에서 사용되는 물질에서, 및 특히 인플루엔자 백신 제조, 예를 들어, 근육 내 주사에 의해 전달되지 않는 인플루엔자 백신에 대하여 항원의 농도를 증가시키는 추가의 및 향상된 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

항원 농축이 큰 수성 부피의 동결건조 후 더 작은 수성 부피의 동결건조물의 복원에 의존적인 기존의 방법과 달리, 본 발명은 최종 조제 및/또는 전달 전 벌크 항원의 동결건조를 수반하지 않는 항원 농축 과정을 제공한다. 본 발명자는 동결건조 과정이 원하는 농도에 도달하는 동안 항원의 반감기를 향상시킬 수 있지만, 그것은 복원 후 회수되는 기능적 항원의 양이 예상된 것보다 작은 손상을 항원에 줄 수 있다. 게다가, 동결건조된 항원은 종종 가용성 항원을 사용하여 확립된 표준 검정 (예를 들어, 헤마글루티닌 정량을 위한 SRID 검정)에서 잘 작용하지 않는다. 따라서 동결건조하지 않는 농축 과정은 최종 백신 생성물을 향상시키고, 표준 검정의 사용을 허용하고, 또한 최종 백신에 동결방지제 (예를 들어, 수크로스)를 추가할 필요를 방지할 수 있다.

따라서 본 발명은 (i) 농축된 항원을 제공하기 위하여, 항원을 포함하는 액체 조성물에서 항원의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) 농축된 항원으로부터 백신을 조제하는 단계를 포함하는, 백신을 제조하는 방법을 제공하는데, 농축된 항원은 단계 (i) 및 (ii) 사이 또는 중에 동결건조되지 않는다.

본 발명은 또한 이 방법에 의해 제조된 백신을 제공한다. 본 발명은 고체 백신 형태를 제조하는데 특히 유용하다.

본 발명은 또한 (i) 농축된 항원을 제공하기 위하여, 헤마글루티닌을 포함하는 액체 조성물에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) 농축된 항원으로부터 인플루엔자 백신을 조제하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 제공하는데, 농축된 항원은 단계 (i) 및 (ii) 사이 또는 중에 동결건조되지 않는다.

본 발명은 또한 (i) n 개의 별도의 농축된 항원을 제공하기 위하여, 다른 균주의 헤마글루티닌을 각각 포함하는, n 개의 별도의 액체 조성물에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) n 개의 별도의 농축된 항원으로부터 다가의 인플루엔자 백신을 조제하는 단계를 포함하는, n 개의 다른 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 백신을 제조하는 방법을 제공하는데, n 개의 별도의 농축된 항원들 중 아무것도 단계 (i) 및 (ii) 사이 또는 중에 동결건조되지 않는다. n의 값은 2 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5)이지만 전형적으로 3 (즉, 3가 인플루엔자 백신) 또는 4 (즉, 4가 인플루엔자 백신)일 것이다.

본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 12 mg/ml/균주이고 (b) 백신은 실질적으로 수크로스가 없다.

항원

본 발명은 다양한 공급원의 항원을 농축하는데 유용하다. 항원은 박테리아, 바이러스, 균류, 또는 기생충으로부터 올 수도 있다. 따라서 백신은 박테리아, 바이러스, 균류, 및/또는 기생충에 의해 발생한 질환으로부터 보호할 수도 있다.

본 발명에 사용되는 전형적인 박테리아는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

● 백일해균 (B. Pertussis)과 같은, 보르데텔라 (Bordetella).

● 씨. 테타니 (C.tetani) 및 씨. 보툴리눔 (C. botulinum)과 같은, 클로스트리디아 (Clostridia).

● 씨. 디프테리애 (C. diphtheriae)와 같은, 코리네박테리아 (Corynebacteria).

● 해모필루스 인플루엔자균 (Haemophilus influenzae)와 같은, 파스퇴렐라 (Pasteurella).

● 엠. 투버쿨로시 (M. tuberculossi), 엠. 보비스 (M.bovis)와 같은, 미코박테리아 (Mycobacteria) 및 감소한 칼메트-게렝균 (Bacillus Calmette Guerin).

● 수막염균 (N. meningitidis) 및 임균 (N. gonorrhoeae)과 같은, 엔. 나이세리아 (N. Neisseria).

● 티푸스균 (S. typhi), 파라티푸스균 (S. paratyphi), 쥐티푸스균 (S.typhimurium), 장염균 (S.enteritidis)과 같은, 살모넬라 (Salmonella)

● 폐렴균 (S.pneumoniae (폐렴 구균 (pneumococcus)), B군 연쇄상구균 (S.agalactiae) 및 화농연쇄상구균 (S.pyogenes)과 같은, 연쇄상구균 (Streptococci).

본 발명에 사용되는 전형적인 바이러스는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

● 인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스와 같은, 오르토믹소바이러스 (Orthomyxovirus). 인플루엔자 A 또는 B 바이러스는 유행기 사이의 (연주기/계절 주기) 균주이거나, 유행성 발병을 일으키는 잠재력을 갖는 균주 (즉, 현재 순환하는 균주의 헤마글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 균주, 또는 조류 대상체에서 병원성이고 사람 집단에 동종으로 전염될 잠재력을 갖는 인플루엔자 균주, 또는 사람에 병원성인 인플루엔자 균주)일 수도 있다. 특정 계절 및 균주의 성질에 의존적으로, 인플루엔자 A 바이러스는 다음 헤마글루티닌 서브타입 중 하나 이상으로부터 유래할 수도 있다: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16. 더 상세한 것은 하기 제공된다.

● 뉴모바이러스 (Pneumovirus; RSV), 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus; PIV) 및 모르빌리바이러스 (Morbillivirus (홍역 (Measles))과 같은, 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae).

● 뉴모바이러스 또는 메타뉴모바이러스 (metapneumo virus), 예를 들어, 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus; RSV), 소 호흡기 합포체 바이러스 (Bovine respiratory syncytial virus), 쥐의 폐렴 바이러스 (Pneumonia virus), 칠면조 비기관염 바이러스 (Turkey rhinotracheitis virus). 바람직하게, 뉴모바이러스는 RSV 또는 사람 메타뉴모바이러스 (HMPV)이다.

● 파라인플루엔자 바이러스 (Parainfluenza virus; PIV) 타입 1, 2, 3 또는 4, 볼거리 바이러스 (Mumps), 센다이 바이러스 (Sendai virus), 유인원 바이러스 5 (Simian virus 5), 소 파라인플루엔자 바이러스 (Bovine parainfluenza virus) 및 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle disease virus)와 같은, 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus). 바람직하게, 파라믹소바이러스는 PIV 또는 볼거리 바이러스이다.

● 엔테로바이러스 (Enterovirus), 리노바이러스 (Rhinovirus), 헤파르나바이러스 (Heparnavirus), 카르디오바이러스 (Cardiovirus) 및 아프토바이러스 (Aphthovirus)와 같은, 피코르나바이러스 (Picornavirus). 엔테로바이러스는 폴리오 바이러스 (Polio virus) 타입 1, 2 도는 3, 콕사키 A 바이러스 (Coxsackie A virus) 타입 1 내지 22 및 24, 콕사키 B 바이러스 (Coxsackie B virus) 타입 1 내지 6, 에코바이러스 (Echovirus; ECHO) 타입 1 내지 9, 11 내지 27 및 29 내지 34 및 엔테로바이러스 68 내지 71을 포함한다. 바람직하게, 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 예를 들어, Mahoney 또는 Brunenders와 같은, 타입 1 균주, MEF-1과 같은 타입 2 균주, 또는 Saukett과 같은 타입 3 균주이다. 헤파르나바이러스 (또한 헤파토바이러스 (Hepatovirus)로 명명됨)는 A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus)이다.

● 루비바이러스 (Rubivirus), 알파바이러스 (Alphavirus), 또는 아테리바이러스 (Arterivirus)과 같은, 토가바이러스 (Togavirus). 루벨라 바이러스 (Rubella virus)와 같은, 루비바이러스가 바람직하다. 불활성화에 유용한 알파바이러스는 수성 (aquatic) 알파바이러스, 연어 췌장 질환 바이러스 (salmon pancreas disease virus) 및 수면 질환 바이러스 (sleeping disease virus)를 포함한다.

● 진드기-매개 뇌염 바이러스 (Tick-borne encephalitis; TBE), 뎅구 바이러스 (Dengue (타입 1, 2, 3 또는 4), 황열병 바이러스 (Yellow Fever), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis), 웨스트 나일 뇌염 바이러스 (West Nile encephalitis), 세인트루이스 뇌염 바이러스 (St. Louis encephalitis), 러시아 봄-여름 뇌염 바이러스 (Russian spring-summer encephalitis), 포와산 뇌염 바이러스 (Powassan encephalitis)과 같은, 플라비바이러스 (Flavivirus).

● C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus; HCV).

● 소 바이러스성 설사증 바이러스 (Bovine viral diarrhea; BVDV), 돼지 콜레라 (Classical swine fever; CSFV) 또는 보더병 (Border disease; BDV)과 같은, 페스티바이러스 (Pestivirus).

● B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus)와 같은, 헤파드나바이러스 (Hepadnavirus).

● 리사바이러스 (Lyssavirus (예를 들어, 라비바이러스 (rabies virus)) 및 수포성 바이러스 (Vesiculovirus; VSV)와 같은, 라브도바이러스 (Rhabdovirus).

● 노르워크 바이러스 (Norwalk virus)와 같은, 칼리시비리대 (Caliciviridae), 및 하와이 바이러스 (Hawaii Virus) 및 스노우 마운틴 바이러스 (Snow Mountain Virus)와 같은, 노로 바이러스 (Norwalk-like virus), 및 돼지 수포성 발진 바이러스 (Vesicular Exanthema of Swine Virus)와 같은, 베시바이러스 (Vesivirus).

● SARS, 사람 호흡기 코로나바이러스 (Coronavirus), 닭 전염성 기관지염 (Avian infectious bronchitis; IBV), 마우스 간염 바이러스 (Mouse hepatitis virus; MHV), 및 돼지 전염성 위장염 바이러스 (Porcine transmissible gastroenteritis virus; TGEV)와 같은, 코로나바이러스.

● 온코바이러스 (Oncovirus), 렌티바이러스 (Lentivirus) 또는 스푸마바이러스 (Spumavirus)와 같은, 레트로바이러스 (Retrovirus). 온코바이러스는 HTLV-1, HTLV-2 또는 HTLV-3일 수도 있다. 렌티바이러스는 SIV), HIV-1 또는 HIV-2일 수도 있다.

● 오르토레오바이러스 (Orthoreovirus), 로타바이러스 (Rotavirus), 오르비바이러스 (Orbivirus), 또는 콜티바이러스 (Coltivirus)와 같은, 레오바이러스 (Reovirus).

● 파르보바이러스 (Parvovirus) B19, 또는 보카바이러스 (Bocavirus)와 같은, 파르보바이러스.

● 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex virus; HSV), 수두대상포진바이러스 (Varicella-zoster virus; VZV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus; EBV), 시토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus; CMV), 사람 헤르페스바이러스 6 (HHV6), 사람 헤르페스 바이러스 7 (HHV7), 및 사람 헤르페스 바이러스 8 (HHV8)과 같은, 사람 헤르페스 바이러스 (Human Herpesvirus).

● 파필로마바이러스 (Papillomavirus) 및 폴리마바이러스 (Polyomavirus)와 같은, 파포바바이러스 (Papovavirus). 파필로마바이러스는 HPV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 및 65을 포함한다.

● 사람 아데노바이러스 (adenovirus) A, B, C, D, E, F 또는 G를 포함하는, 아데노비리대 (Adenoviridae).

본 발명은 바이러스, 및 특히 백신 항원이 바이러스성 표면 당단백질인 경우의 바이러스에 대한 백신의 제조에 이상적이다. 따라서 본 발명은 하기 더 상세히 설명되는 바와 같이, 인플루엔자 백신의 제조를 위하여 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 압축하는데 이상적이다. 농축 단계는 5 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 20 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 및 30 mg/ml 이상의 HA 함량을 갖는 인플루엔자 백신 항원을 제공할 수 있다.

액체 조성물

본 발명의 방법은 액체 조성물에서 항체의 농도를 증가시키고, 이로 인해 조제의 목적을 위한 농축된 항원을 제공한다.

바람직한 액체 조성물은 동결건조되지 않았던 것이다.

바람직한 액체 조성물은 실질적으로 동결방지제가 없을 수도 있다. 따라서 조성물은 실질적으로 외인성 당알콜 (특히: 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 에리트리톨, 자일리톨) 및/또는 외인성 이당류 (특히: 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락툴로스, 락토스, 셀로비오스)가 실질적으로 없을 수도 있다. 따라서 액체 조성물에서 (소르비톨, 만니톨, 말티톨, 에리트리톨, 자일리톨, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락툴로스, 락토스, 셀로비오스)의 결합한 농도는 10 mg/ml 미만 (즉, 1% 미만)일 수도 있고 이상적으로 1 mg/ml 미만, 예를 들어, 0.1 mg/ml미만이다.

전형적인 액체 조성물은, 예를 들어, 적어도 500명의 별도의 사람에 백신의 단위 투여를 위해 충분한 항원을 함유하는 벌크 백신이다.

액체 조성물은 1가 (즉, 단지 하나의 병원체로부터 보호하는 백신 항원을 함유) 또는 다가 (즉, 하나 이상의 다른 비-교차-보호적 병원체, 예를 들어, 여러 뇌수막염균 (meningococcal) 혈청형, 또는 여러 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 타입이 있는 경우를 포함하는, 하나 이상의 병원체로부터 보호하는 백신 항원을 함유)일 수도 있다. 그것은 바람직하게 1가이다.

본 발명은 다양한 백신 항원 농도를 갖는 액체 샘플과 함께 사용될 수 있다. 전형적으로 액체 조성물은 적어도 1 μg/ml의 농도인 백신 항원을 포함할 것이다.

농축 단계

본 발명의 방법은 항원의 농도가 증가하는 단계를 수반한다. 원심분리 여과; 초여과; 또는 접선 유동 여과 (교차 흐름 여과 (crossflow filtration)로 또한 알려짐)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 기술이 이 농축 단계에 사용될 수 있다. 바람직한 방법은 필요한 동결건조 없이 좋은 농축을 이룰 수 있기 때문에 TFF를 사용한다.

원심분리 여과는 필터를 통한 액체의 원심분리를 수반한다. 필터는 농축된 항원을 유지하지만 용매 또는 더 작은 용질을 유지하지 않는다. 여과물의 부피가 증가하기 때문에, 농축물에서 항원의 농도가 또한 증가한다. 이 기술은 전형적으로 고정각 로터 (fixed angle rotor)를 사용한다. 다양한 적합한 원심분리 여과 장치, 예를 들어, 상표 Centricon™, Vivaspin™ 및 Spintek™로 팔린 제품이 상업적으로 사용 가능하다. 필터의 컷-오프는 관심 있는 항원이 농축물에 남아있는 것이 선택될 것이다.

초여과는 반투과성 막에 대하여 액체를 가하는 정수압의 사용을 수반한다. 필터는 농축된 항원을 유지하지만 용매 또는 더 작은 용질을 유지하지 않는다. 정수압의 지속적인 적용은 여과물의 부피를 증가시키고, 따라서 농축물에서 항원의 농도가 또한 증가한다. 많은 초여과막이 상업적으로 사용 가능하다. 초여과막의 분자량 컷-오프 (MWCO) 용질이 막을 통과할 수 있는지 (즉, 여과물로) 및 어느 것이 유지되는지 (즉, 농축물에서) 결정한다. 본 발명 내에 사용된 필터의 MWCO는 실질적으로 모든 관심 있는 항원이 농축물 내에 남아있는 것이 선택될 것이다.

접선 유동 여과 (TFF)는 필터 막에 걸쳐 액체가 접선으로 통과하는 것을 수반한다. 샘플 측면은 전형적으로 여과물 측면에 관하여 정압에서 유지된다. 액체가 필터를 지나서 흐르기 때문에, 그 안에 성분은 여과물 내로 막을 통해 지나갈 수 있다. 연이은 흐름은 여과물의 부피를 증가시키고, 따라서 농축물에서 항원의 농도가 증가한다. TFF는 막힘 흐름 여과와 대조를 이루는데, 샘플은 그것에 접선으로 통과하는 대신에 막을 통해 통과한다. 많은 TFF 시스템은 상업적으로 사용 가능하다. TFF 막의 MWCO는 어느 용질이 막을 통과할 수 있는지 (즉, 여과물 내로) 및 유지되는지 (즉, 농축물 내) 결정한다. 본 발명에 사용된 TFF 필터의 MWCO는 실질적으로 원하는 모든 항원이 농축물에 남는 것으로 선택될 것이다.

이 세 가지 농축 기술은 서로 배타적이지 않다, 예를 들어, 본 발명은 접선 유동 초여과를 사용할 수 있다.

어떤 기술이 선택되든지, 그것은 바람직하게 원하는 항원의 농도를 적어도 n배 증가시키는데, 여기서 n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 이상이다.

조제 단계

항원 농축 후, 본 발명의 방법은 중간에 동결건조 하지 않고, 백신으로서 농축된 항원을 조제한다. 조제 단계는 또한 항원의 동결건조를 수반하지 않는다. 이상적으로, 조제 후 동결건조는 없다, 즉, 백신 항원은 환자에 투여를 통한 농축의 시작의 동결건조를 방지한다.

본 발명은 다양한 백신 제형을 제조하는데 사용될 수 있다. 농축 단계의 사용은 본 발명이 환자에 소량의 물질의 전달을 수반하는 기술에 대하여 이상적이다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명은 0.1 ml 이하의 단위 투여량을 갖는 액체 백신 제형 (예를 들어, 피부 내 주사)을 제조하는데 유용하다. 본 발명은 또한 고체 (동결건조되지 않은) 백신 제형을 제조하는데 유용한데, 이것들은 높은 항원 농도가 필요하기 때문이다. 하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 적합한 고체 제형은 고체 생분해성 (biodegradable) 미세 바늘, 코팅된 미세 바늘, 및 구강용 박막을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명의 방법에서 조제 단계는 동결건조된 백신 항원으로부터 고체 백신을 제조하는 단계를 포함할 수도 있다. 이 단계는 건조하는 단계를 수반할 수도 있지만, 동결건조하는 단계는 아니다, 예를 들어, 그것은 증발을 수반할 수도 있다 [11].

동결건조제는 종종 동결건조와 관련되지 않은 이유로 (예를 들어, 코팅을 향상시키기 위하여) 제형에 추가되지만, 본 발명의 조제된 백신은 가끔 실질적으로 동결건조제가 없다. 그러므로, 일부 구체예에서, 본 발명의 조제된 백신은 실질적으로 당 알콜 (특히: 소르비톨 만니톨, 말티톨, 에리트리톨, 자일리톨) 및/또는 이당류 (특히: 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락툴로스, 락토스, 셀로비오스)가 없다. 따라서 조제된 백신에서 (소르비톨, 만니톨, 말티톨, 에리트리톨, 자일리톨, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락툴로스, 락토스, 셀로비오스의 결합한 농도는 10 mg/ml 미만 (즉, 1% 미만), 예를 들어, 1 mg/ml 미만 또는 0.1 mg/ml 미만일 수도 있다.

농축된 항원이 적합한 효능을 유지한다는 것을 보장하기 위하여, 조제 단계는 이상적으로 농축 단계의 4주 내에 (예를 들어, 2주 내에) 일어난다.

본 발명의 백신은 이상적으로 이눌린이 없다. 또한, 본 발명의 백신은 이상적으로 바이러스성 항원을 캡슐화하는 계면활성제 소낭을 포함하지 않는다.

고체 생분해성 미세 바늘

본 발명을 사용하여 제조될 수 있는 하나의 유용한 고체 제형은 고체 생분해성 미세 바늘이다. 이것들은 전형적으로 단독으로 투여되지 않지만, 정확히 말하면, 예를 들어, 복수의 미세 바늘을 함유하는 피부 패치로서 여러 바늘이 동시에 투여된다.

미세 바늘은 고체이기 때문에, 그것들은 저장 중에 그것들의 구조적 온전성을 유지하고 패치가 적용될 때 대상체의 피부를 투과할 수 있다. 피부 투과에 필요한 기계적 성질은 문제의 유기체에 의존적이지만, 그것들은 보통 사람 피부를 투과할 정도의 충분한 힘을 가질 것이다. 적합한 고체 바늘을 형성하는 물질은 쉽게 사용 가능하고 어느 특정 필요를 위하여 적절한 농도 등을 결정하기 위해 테스트될 수 있다. 미세 바늘은 생가용성 (biosoluble) 및 생분해성이다. 따라서 참고문헌 2 & 3에 사용된 코팅된 미세 바늘과 달리, 고체 물질은 패치가 적용된 후 피부에서 용해된다 (하기 참조). 용해되면, 물질은 무해한 최종 생성물을 제공하기 위해 대사 작용을 할 것이다. 패치의 적용 후 용해되는 기간은 다를 수 있지만, 용해는 전형적으로 패치의 적용 후 즉시 (예를 들어, 10초 이내) 시작될 것이고 미세 바늘이 완벽히 용해될 때까지, 예를 들어, 최대 1분, 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 5시간, 10시간, 또는 24시간 동안 계속될 수도 있다. 적합한 생체 내 용해 동역학을 갖는 물질은 쉽게 사용 가능하고 이것은 다양할 수도 있고 어느 원하는 용해 프로필을 위하여 적절한 농도 등을 결정하기 위해 테스트될 수도 있다.

미세 바늘의 형성에 적합한 매트릭스 물질은 전형적으로 생가용성 및 생분해성 폴리머일 것이고, 이것들은 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 물질은 셀룰로스, 덱스트린, 덱스트란, 이당류, 키토산, 키틴, 등, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 다른 GRAS 물질은 또한 사용될 수도 있다.

적합한 셀룰로스는 셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 덱스트린은 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로덱스트린, 이코덱스트린, 옐로 덱스트린, 및 화이트 덱스트린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 투라노스, 및 셀로비오스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생가용성 및 생분해성 미세 바늘을 형성에 적합한 물질은 덱스트린/트레할로스 혼합물이다.

미세 바늘은 피부를 투과할 수 있다. 그것들은 진피 내로 물질을 전달하기 위하여 (즉, 피부 내 전달) 표피를 통해 투과할 정도로 충분히 길어야 하지만, 그것들이 피하조직으로 또는 이를 통해 투과할 만큼 이상적으로 길지 않다. 그것들은 전형적으로 100-2500 μm 길이, 예를 들어, 1250-1750 μm 길이, 또는 약 1500 μm일 것이다. 전달의 시점에 팁은 진피를 투과할 수도 있지만, 바늘의 베이스는 표피에 남아있을 수도 있다.

미세 바늘은 다양한 모양 및 기하학적 특징을 가질 수 있다. 그것들은 전형적으로, 예를 들어, 피라미드 또는 원뿔과 같은 모양의 피부-직면한 지점으로 가늘어질 것이다. 500 μm 미만의 가장 넓은 지름을 갖는 가늘어진 미세 바늘이 전형적이다. 단일 패치는 전형적으로 패치 당 복수, 예를 들어, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 750 이상, 1000 이상의 미세 바늘을 포함할 것이다. 패치가 복수의 미세 바늘을 포함하는 경우, 그것은 모든 미세 바늘이 부착되는 배킹 (backing) 층을 포함할 수도 있다. 20개 이상의 돌출 미세 바늘이 있는 단일 배킹 층이 전형적이다. 패치가 복수의 미세 바늘을 포함하는 경우, 이것들은 규칙적으로 반복되는 패턴 또는 어레이로 배열될 수 있거나, 불규칙하게 배열될 수도 있다.

패치는 전형적으로 3 cm² 이하, 예를 들어, 2 cm² 미만 또는 1 cm² 미만의 면적을 가질 것이다. 0.5 cm 내지 1.5 cm의 지름의 원형 패치는 유용하다.

패치 상에 미세 바늘의 밀도는 다를 수 있지만, 10cm^-2 이상, 20cm^-2 이상, 30cm^-2 이상, 40cm^-2이상, 50cm^-2 이상, 60cm^-2 이상, 70cm^-2 이상, 80cm^-2 이상일 수도 있다.

본 발명의 패치는 피부-직면한 내측면 및 환경-직면한 외측면을 갖는다. 내측면은 대상체의 피부에 부착을 가능하게 하는 접착물질을 포함할 수도 있다. 존재할 때, 그것은 미세 바늘 자체에 존재하지 않는다, 즉, 미세 바늘은 접착물질이 없다. 내측면 상에 접착물질을 갖는 것 외에, 패치는 예를 들어, 부착 플라스터 (plaster) 또는 니코틴 패치에서 보이는 바와 같이, 피부에 패치를 부착하는 외측 접착물질 마진 (margin)을 제공하는 추가의 배킹을 가질 수도 있다.

상기 설명된 바와 같이 패치는 참고문헌 4-8의 기술 및 안내 다음에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 1.5 mm 길이의 미세 바늘 구멍이 있는 주형이 제조될 수 있다. 덱스트린 및 트레할로스의 매트릭스 물질은 인플루엔자 백신과 결합될 수 있고 이 수성 물질은 고체 미세 바늘의 어레이를 형성하기 위해 원심력으로 주형에 주조할 수 있다. 셀룰로스 겔은 패치 상에 배킹 층을 형성하기 위해 매트릭스/백신 혼합물 (예를 들어, 혼합물이 필름을 형성하는)을 덮을 수 있다. 이 배킹 층이 건조될 때, 그것은 고체 미세 바늘이 돌출하는 패치를 제공하기 위해 제거될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에서 조제 단계는 (a) 보통 동결건조된 백신 항원에 의해, 생가용성 및 생분해성 매트릭스 물질과 백신 항원을 혼합하는 단계; 및 (b) 미세 바늘을 형성하기 위해 구멍을 함유한 주형에 단계 (a)의 혼합물을 추가하는 단계를 포함할 수도 있다. 그것은 (c) 고체 미세 바늘을 형성하기 위해, 혼합물을 주형에 설정되게 하는 단계; (d) 선택적으로, 배킹 층을 제공하기 위해 물질을 세트 미세 바늘에 적용하는 단계; 및 (e) 미세 바늘 (및 선택적 배킹 층)을 주형에서 제거하는 단계를 더 포함할 수도 있다.

패치는 개개의 파우치에 포장될 수도 있다, 예를 들어, 질소 하에 밀폐되고, 열이 밀폐된다. 그것들은 미세 바늘에 대한 손상을 피하기 위해 조심스럽게 저장되어야 한다.

코팅된 미세 바늘

본 발명을 사용하여 제조될 수 있는 또 다른 유용한 고체 제형은 코팅된 미세 바늘이다. 이것들은 전형적으로 단독으로 투여되지 않지만, 정확히 말하면, 예를 들어, 복수의 미세 바늘을 통해 여러 바늘이 동시에 투여된다. 하나의 적합한 제품은 Macroflux™ (Zosano)의 상표명 하에 판매된다.

미세 바늘은 고체이기 때문에, 그것들은 저장 중에 그것들의 구조적 온전성을 유지하고 대상체의 피부를 투과할 수 있다. 피부 투과에 필요한 기계적 성질은 문제의 유기체에 의존적이지만, 그것들은 보통 사람 피부를 투과할 정도의 충분한 힘을 가질 것이다. 미세 바늘은 고체이고 환자의 피부 내로 삽입 후에 온전함을 유지한다 (상기 논의된 생분해성 미세 바늘과 달리). 적합한 고체 바늘을 형성하는 물질은 쉽게 사용 가능하고 이것들은 어느 특정 필요, 예를 들어, 금속 (스텐레스 강과 같은) 또는 폴리머 (폴리카르보네이트, 이상적으로 의료용 등급과 같은)를 위하여 테스트 되고 선택될 수 있다. 금속 바늘은 레이저 커팅 및 전해 연마 (electro-polishihg)를 사용함으로써 조작될 수 있다. 폴리머 바늘은 미세 복제 및/또는 미세 주형 (주사 몰딩 (molding))에 의해 조작된다. 적합한 미세 바늘은 참고 2, 3, 및, 9-13에 개시된다.

본 발명의 농축된 항원은 미세 바늘 상에 코팅될 수 있다. 이 코팅은, 필요한 만큼 반복되는, 간단한 방법, 예를 들어, 딥-코팅 (dip-coating), 예를 들어, 디핑 단계 후 건조 단계 (예를 들어, 증발에 의해)에 의해 이루어질 수 있다. 다른 유용한 코팅 기술은 참고문헌 11에 개시된다. 따라서 본 발명의 방법에서 조제 단계는 백신의 주사를 위한 코팅된 미세 바늘 장치를 제공하기 위해 하나 이상의 고체 미세 바늘 표면에 동결건조된 백신 항원을 적용하는 단계를 포함할 수도 있다.

미세 바늘에 적용하는 코팅 용액은 하나 이상의 생가용성 및 생분해성 매트릭스 물질을 포함할 수 있고, 이것들은 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 물질은 셀룰로스, 덱스트린, 덱스트란, 이당류, 키토산, 키틴, 등, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 다른 GRAS 물질이 또한 사용될 수도 있다. 적합한 셀룰로스, 덱스트린 및 이당류는 상기 나열된다. 따라서 본 발명의 방법에서 조제 단계는 (a) 보통 동결건조된 백신 항원을 복원함으로써, 생가용성 및 생분해성 매트릭스 물질을 혼합하는 단계; 및 (b) 백신의 주사를 위한 코팅된 미세 바늘 장치를 제공하기 위해 하나 이상의 고체 미세 바늘 표면에 단계 (a)의 혼합물을 적용하는 단계를 포함할 수도 있다. 코팅은 참고문헌 11에 설명된 바와 같이 하나 이상의 "침착 향상 성분"을 사용함으로써 향상될 수도 있다.

상기 논의된 적용 단계는 적용 서브-단계 후 건조 서브-단계를 포함할 수도 있고, 이 서브-단계의 쌍은 한 번 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10번 이상 수행될 수 있다.

장치의 미세 바늘은 적용될 때 피부를 투과할 수 있다. 그것들은 진피 내로 물질을 전달하기 위하여 표피를 통해 투과할 정도로 충분히 길어야 하지만, 피하조직으로 또는 이를 통해 투과할 수 있을 정도로 이상적으로 길지 않다. 그것들은 전형적으로 100-2500 μm 길이, 예를 들어, 250-750 μm 길이, 또는 약 1500 μm일 것이다. 전달의 시점에 팁은 진피를 투과할 수도 있지만, 바늘의 베이스는 표피에 남아있을 수도 있다. 바늘은 30초 및 30분 동안 환자의 피부에 적용되고, 다음에 제거될 수 있다. 미세 바늘은 다양한 모양 및 기하학적 특징을 가질 수 있다. 그것들은 전형적으로 피부-직면한 지점, 예를 들어, 피라미드 또는 원뿔과 같은 모양으로 가늘어질 것이다. 500 μm 미만의 가장 넓은 지름을 갖는 가늘어진 미세 바늘이 전형적이다.

미세 바늘 장치는 전형적으로 장치당 복수, 예를 들어, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 750개 이상, 1000개 이상, 1500개 이상, 2000개 이상 (예를 들어, 장치당 300-1500)의 미세 바늘을 포함할 것이다. 장치가 복수의 미세 바늘을 포함하는 경우, 이것들은 전형적으로 모두 규칙적으로 반복되는 패턴 또는 어레이로 배열될 수 있거나, 불규칙하게 배열될 수도 있다.

미세 바늘 장치는 전형적으로 3 cm² 이하, 예를 들어, 2 cm² 미만 또는 1 cm² 미만의 면적을 가질 것이다. 0.5 cm 내지 1.5 cm의 지름의 원형 장치는 유용하다.

미세 바늘의 밀도는 다를 수 있지만, 10cm^-2 이상, 20cm^-2 이상, 30cm^-2 이상, 40cm^-2이상, 50cm^-2 이상, 60cm^-2 이상, 70cm^-2 이상, 80cm^-2 이상일 수도 있다. 각각의 미세 바늘 사이에 2 mm, 및 14 미세 바늘/cm2의 밀도를 갖는 장치가 바람직하다.

미세 바늘 장치는 피부-직면한 내측면 및 환경-직면한 외측면을 갖는다. 내측면은 대상체의 피부에 부착을 가능하게 하는 접착물질을 포함할 수도 있다. 존재할 때, 그것은 미세 바늘 자체에 존재하지 않는다, 즉, 미세 바늘은 접착물질이 없다. 내측면 상에 접착물질을 갖는 것 외에, 장치는 피부에 장치를 부착하는 외측 접착물질 여백을 제공하는 추가의 배킹을 가질 수도 있다.

박막

본 발명을 사용하여 제조될 수 있는 또 다른 유용한 고체 제형은 박막, 예를 들어, 구강용 박막이다. 이 필름은 타액 및 구강 점막과 접촉하여 신속하게 젖고 용해되므로, 입에서 백신 항원을 방출한다. 이 박막의 주요 성분은 전형적으로 하나 이상의 친수성 폴리머인데, 이것은 완벽하게 용해될 때까지 구강 조직에 강한 접착력을 제공하는 좋은 점막 접착성 (mucoadhesive) 성질을 가질 수 있다. 유사한 필름은 비-구강 전달, 예를 들어, 참고문헌 14에 개시된 바와 같이 경피성 전달에 사용될 수 있다.

적합한 박막은 초기에 적용될 때 전형적으로 10-500 μm 두께, 예를 들어, 75-150 μm 두께이다. 그것들의 다른 차원이 환자의 입에, 예를 들어, 성인 사람 입에 또는 유아 사람 입에 딱 맞게 적합할 수도 있다.

하나의 적합한 타입의 필름은 참고문헌 15에 개시된다. 이 필름은 (i) 점막 접착층으로서 Noveon 및 Eudragit S-100 및 (ii) 불침투성 배킹 층으로서 약학적 왁스가 있는 점막 접착성 이중층 필름을 포함한다. 이 필름들의 추가의 상세한 것은 참고문헌 16에 있다.

또 다른 적합한 타입의 필름은 참고문헌 17에 개시된다. 이 필름은 (a) 하나 이상의 수용성 폴리머; (b) 하나 이상의 점막 접착성 폴리머; (c) 미립자 내에 캡슐화된 백신 항원을 포함한다. 적합한 수용성 폴리머는 풀루란, 히드록시프로필 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 알긴산염 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 잔탄 검, 트라가칸트 검 (tragacanth gum), 구아 검 (guar gum), 아카시아 검 (acacia gum), 아라비아 검 (Arabic gum), 폴리아크릴산, 메틸메타크릴레이트 코폴리머, 카르복시비닐 폴리머, 아밀라제, 높은 아밀라제 전분, 히드록시프로필화 높은 아밀라제 전분, 덱스트린, 펙틴, 키틴, 레반, 엘시난, 콜라겐, 젤라틴, 제인, 글루텐, 콩 단백질 분리체, 유청 (whey) 단백질 분리체, 및 카세인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 점막 접착성 폴리머는 키토산, 히알루론산염, 알긴산염, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리(L-리신), 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌옥시드), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트), 및 이들의 유도체 또는 코폴리머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유용한 미립자는 입에 존재하는 동안 입자의 캡슐화된 성분 (즉, 백신 항원)을 방출하는 물질로 이루어진다.

참고문헌 14의 필름은 경피성 전달을 위해 양이온의 폴리(β-아미노 에스테르)를 포함한다.

본 발명에 유용한 구강 필름은 투여 중에 백신을 더 맛있게 만들기 위해 향미제를 포함할 수도 있다.

박막은 용매 주조; 핫-멜트 압출 (hot-melt extrusion); 고체분산체 압출 (solid dispersion extrusion); 및 롤링 (rolling)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다양한 과정으로 만들어질 수 있다.

본 발명의 방법에서 조제 단계는 (a) 농축된 백신 항원을 하나 이상의 구강-가용성 폴리머와 혼합하는 단계; 및 (b) 백신의 구강 투여에 적합한 박막을 제공하기 위해 단계 (a)의 혼합물을 사용하여 필름을 형성하는 단계를 포함할 수도 있다.

본 발명의 방법에서 조제 단계는 (a) 농축된 백신 항원을 하나 이상의 국부적-가용성 폴리머, 예를 들어, 폴리(β-아미노 에스테르)와 혼합하는 단계; 및 (b) 백신의 경피성 투여에 적합한 박막을 제공하기 위해 단계 (a)의 혼합물을 사용하여 필름을 형성하는 단계를 포함할 수도 있다.

이 필름들은 개개의 단위 투여 파우치에 포장될 수도 있다, 예를 들어, 질소 하에 밀폐되고, 열이 밀폐된다. 파우치들은 저장 중에 필름을 건조하게 유지하기 위해 방수여야 한다.

치료 방법, 및 백신의 투여

본 발명의 조제된 백신은, 예를 들어, 피부를 통해, 구강 점막을 통해, 등으로 대상체에 전달될 수 있다. 따라서 본 발명은 대상체에 본 발명의 조제된 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다. 이것은, 예를 들어, 대상체의 피부에 미세 바늘이 대상자의 진피를 투과하는, 미세 바늘 패치 또는 장치를 적용하는 단계 또는 대상체의 점막 조직 또는 혀에 박막을 적용하는 단계를 수반할 수도 있다.

본 발명은 또한 대상체를 백신 접종하는 방법에 사용되는 농축된 비-동결건조 항원을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응을 일으키는 약제의 제조에서 농축된 비-동결건조 항원의 사용을 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 아이 및 성인 모두를 치료하는데 사용될 수도 있다.

치료는 일회 투여 계획 또는 다회수 투여 계획에 의해 일어날 수 있다. 다회수 투여는 1차 면역화 계획 및/또는 촉진 면역화 계획에 사용될 수도 있다. 다회수 투여는 전형적으로 적어도 1주 간격으로 (예를 들어, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 10 주, 약 12 주, 약 16 주, 등) 투여될 것이다.

인플루엔자 백신 접종

본 발명의 방법은 인플루엔자 백신을 제조하는데 이상적이다. 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신은 현재 사용 가능하고 (예를 들어, 참고문헌 18의 17 & 18장 참조) 현재 백신은 불활성화 또는 생 약독화 바이러스에 기초한다. 불활성화 백신 (전체 바이러스, 분할 비리온, 또는 표면 항원)은 근육 내 또는 피부 내 주사에 의해 투여되지만, 생백신은 비강 내에 투여된다. 본 발명은 모든 백신 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예는 표면 항원 인플루엔자 백신 (불활성화)을 사용한다. 이러한 백신은 분할 또는 전체 비리온 백신보다 더 작은 바이러스성 성분을 함유한다. 그것들은 표면 항원 헤마글루티닌, 및 전형적으로, 또한 뉴라미니다제를 포함한다. 인플루엔자 바이러스로부터 정제된 형태의 이 단백질을 제조하는 방법은 업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 표면 항원 인플루엔자 백신의 예이다.

본 발명이 표면 항원 인플루엔자 백신을 사용하는 경우, 이 바이러스는 난 (egg)에서 또는 세포 배양에서 자랄 수도 있다 (하기 참조). 백신을 위한 인플루엔자 바이러스 성장에 대한 현재 표준 방법은 난 성분 (요막액 (allantoic fluid))으로부터 정제된 바이러스가 있는, 부화 SPF 암탉 계란을 사용한다. 난-기반의 바이러스성 성장이 사용되면 하나 이상의 아미노산은 바이러스와 함께 난의 요막액으로 도입될 수도 있다 [24]. 바이러스는 처음 난에서 자란다. 그것은 감염된 난으로부터 수확된다. 비리온은 다양한 방법에 의해 요막액으로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 과정은 비리온을 분열시키는 세제를 포함하는 선형 수크로스 구배 용액을 사용하는 띠원심분리 (zonal centrifugation)을 수반할 수도 있다. 선택적 희석 후에, 항원은 정용 여과 (diafiltration)에 의해 정제될 수도 있다. 바이러스를 불활성화시키는 화학적 수단은 다음 시약 중 하나 이상의 유효량으로 치료를 포함한다: 세제, 포름알데히드, β-프로피올락톤, 메틸렌 블루, 솔라렌, 카르복시풀러렌 (C60), 이성분 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 예를 들어, UV 광 또는 감마선 조사와 같은, 바이러스성 불활성화의 비-화학적 방법은 업계에 알려져 있다.

본 발명의 일부 구체예는 전체 바이러스, 분할 바이러스, 비로솜, 생 약독성 바이러스, 또는 재조합 헤마글루티닌을 사용할 수 있다. 이 백신들은 그것들의 항원을, 예를 들어, 추가의 인플루엔자 바이러스 단백질의 존재에 대해 테스트함으로써 표면 항원 백신으로부터 쉽게 구별될 수 있다.

전체 불활성화된 바이러스는 바이러스-함유 유동체로부터 비리온을 수확함으로써 얻을 수 있고 (예를 들어, 난으로부터 또는 배양 배지로부터 얻은) 상기 설명된 바와 같이 그들을 치료한다.

분할 비리온은 서브비리온 조제물을 생산하기 위해 정제된 비리온에 세제 (예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 디옥시콜산염, 트리-엔-부틸 인산염, Triton X-100, Triton Ν101, 브롬화 세틸트리메틸암모늄, Tergitol NP9, 등)를 처리함으로써 얻을 수 있고 'Tween-에테르' 분할 방법을 포함한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 분할 방법은 업계에 잘 알려져 있다고, 예를 들어, 참고문헌 19-24, 등을 참조한다. 바이러스의 분할은 전형적으로 분열시키는 분할 시약의 농도로 감염성 또는 비-감염성인, 전체 바이러스를 분열시키거나 단편화함으로써 수행된다. 분열은 바이러스 단백질의 전체의 또는 부분적인 가용화를 발생시키고, 바이러스의 온전함을 변화시킨다. 바람직한 분할 시약은 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌-알킬에테르, N, N-디알킬-글루카미드, 헤카메그, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 제 4 암모늄 화합물, 사코실, CTABs (브롬화 세틸 트리메틸 암모늄), 트리-N-부틸 인산염, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸-또는 노닐페녹시폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은, Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르, 등이다. 한 유용한 분할 과정은 디옥시콜산염 나트륨 및 포름알데히드의 연이은 효과를 사용하고, 분할은 초기 비리온 정제 중에 일어날 수 있다 (예를 들어, 수크로스 밀도 구배 용액). 따라서 분할 방법은 원하지 않는 물질을 제거하기 위해 비리온-함유 물질의 정화 (비-비리온 물질을 제거하기 위해), 수확된 비리온의 농축 (예를 들어, CaHPO4 흡착과 같은, 흡착 방법을 사용하여), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할 시약을 사용하여 비리온의 분할, 및 여과 (예를 들어, 초여과)를 수반할 수 있다. 분할 비리온은 인산 나트륨-완충된 등장성 염화 나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. 분할 백신의 예는 BEGRIVAC™, INTANZA™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제폼이다.

비로솜은 핵산 없는 바이러스-유사 리포솜의 입자이다 [25]. 그것들은 세제로 바이러스의 가용화 후 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스성 당단백질을 함유하는 막의 복원에 의해 제조된다. 비로솜을 제조하는 대안의 방법은 바이러스성 단백질과 함께 리포솜을 제공하기 위해, 바이러스성 막 당단백질에 인지질의 초과량을 추가하는 단계를 수반한다.

생 약독화 바이러스는 바이러스 (난에서 또는 세포 배양에서 자란)로부터 얻지만, 바이러스는 불활성화되지 않는다. 자세히 말하면, 바이러스는, 예를 들어, 사람 인플루엔자 감염의 페릿 (ferret) 모델에서 인플루엔자-유사 질환을 생산하지 않기 위해서 감소한다 ("att"). 그것은 또한 저온-적응 ("ca") 균주일 수도 있다, 즉, 그것은 많은 야생형 인플루엔자 바이러스의 복제에 대해 제한된 온도인, 25℃에서 효과적으로 복제할 수 있다. 그것은 또한 온도-민감성 ("ts")일 수도 있다, 즉, 많은 야생형 인플루엔자 바이러스가 효과적으로 자라는 온도 (37-39℃)에서 그것의 복제가 제한된다. Ca, ts 및 att 표현형의 누적 효과는 전형적인 사람 환자에서 보호용 면역력을 유발하기 위해 약독화 백신에서 바이러스가 비인두 (nasopharynx)에서 복제할 수 있다는 것이지만, 그것은 질환을 유발하지 못한다, 즉, 그것은 표적 사람 집단에 일반적인 투여에 대해 안전하다. 이 바이러스는 비리온-함유 유동체로부터 비리온을 정제함으로써, 예를 들어, 원심분리, 다음에 완충액 (예를 들어, 수크로스, 인산 칼륨, 및 일나트륨 글루타메이트를 함유)으로 안정화에 의한 유동체의 정화 후 제조될 수 있다. 생백신은 FLUMIST™ 제품을 포함한다. 생백신이 본 발명에 사용될 수 있지만, 비-생백신을 사용하는 것이 바람직하다. 비리온으로부터 얻은 항원을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 헤마글루티닌은 재조합 숙주 (예를 들어, Sf9와 같은, 곤충 세포주에서, 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여)에서 발현될 수 있고 정제된 형태 [26-28] 또는 바이러스-유사 입자 (VLPs; 예를 들어, 참고문헌 29 & 30 참조)의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예는, 난 대신에, 세포 배양에서 자란 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신을 사용한다. 세포 배양이 사용될 때, 바이러스의 성장 기질은 전형적으로 포유동물 기원의 세포주일 것이다. 적합한 포유동물 세포의 기원은 햄스터, 소, 영장류 (사람 및 원숭이를 포함) 및 개 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 세포 타입, 예를 들어, 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포, 폐 세포, 등이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포의 예는 이름 BHK21 또는 HKCC를 갖는 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는, 예를 들어, 사바나 원숭이 (African green monkey) 세포, 예를 들어, Vero 세포주에서와 같은 신장 세포이다. 적합한 개 세포는, 예를 들어, MDCK 세포주와 같은 신장 세포이다. 따라서 적합한 세포주는 MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인플루엔자 바이러스를 성장시키는데 바람직한 포유동물 세포주는 Madin Darby 개 신장에서 유래한, MDCK 세포 [31-34]; 사바나 원숭이 (세르코피테쿠스 애티옵스; Cercopiihecus aethiops) 신장으로부터 유래한, Vero 세포 [35-37]; 또는 사람 배아 망막모세포로부터 유래한, PER.C6 세포 [38]를 포함한다. 이 세포주들은, 예를 들어, American Type Cell Culture (ATCC) 콜렉션으로부터, Coriell Cell Repositories로부터, 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)로부터 널리 사용 가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하에 다양한 다른 Vero 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL-34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6는 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 사용 가능하다. 포유동물 세포주에 대한 덜 바람직한 대안으로서, 바이러스는 오리 (예를 들어, 오리 망막) 또는 암탉으로부터 유래한 세포주를 포함하는, 조류 세포주에서 자랄 수 있다 [예를 들어, 참고문헌 39-41]. 조류 세포주의 예는 조류 배아 줄기 세포 [39, 42] 및 오리 망막 세포 [40]를 포함한다. 적합한 조류 배아 줄기 세포는, 닭 배아 줄기 세포, BB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유래한 EBx 세포주를 포함한다 [43]. 닭 배아 섬유모세포 (CEF)가 또한 사용될 수도 있다.

인플루엔자 바이러스를 성장시키는데 가장 바람직한 세포주는 MDCK 세포주이다. 원래의 MDCK 세포주는 CCL-34로서 ATCC로부터 사용 가능하지만, 이 세포주의 유도체가 또한 사용될 수도 있다. 예를 들어, 참고문헌 31은 현탁 배양에서 성장에 대해 적응된 MDCK 세포주를 개시한다 (DSM ACC 2219로 기탁된, 'MDCK 33016'). 유사하게, 참고문헌 44는 혈청 없는 배양액의 현탁에서 자라는 MDCK-유래 세포주 (PERM BP-7449로 기탁된, 'B-702')를 개시한다. 참고문헌 45는 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101 (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (PTA-6503)를 포함하는, 비-종양 형성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 46은 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL-12042)를 포함하는, 감염에 고도로 민감한 MDCK 세포주를 개시한다. 이 MDCK 세포주 중에 어느 것도 사용될 수 있다.

바이러스가 포유동물 세포주에서 성장한 경우 본 발명의 생성물은 유리하게 난 단백질 및 닭 DNA가 없음으로 인해, 잠재적인 알레르기 유발원을 감소시킬 것이다.

본 발명의 세포-유래 생성물의 헤마글루티닌은 난-유래 바이러스에서 보이는 패턴과 다른 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 따라서 HA (및 다른 당단백질)는 닭 난에서 보이지 않는 당질형태 (glycoform)를 포함할 수도 있다. 유용한 HA는 개 당질형태를 포함한다.

난-유래 물질 및 닭 당질형태의 부재는 세포 배양에서 자란 바이러스로부터 제조된 백신이 난-유래 생성물과 구별될 수 있는 방법을 제공한다.

바이러스가 세포주에서 성장하는 경우, 성장을 위한 배양, 및 또한 배양을 시작하는데 사용된 바이러스성 접종물은 바람직하게 단순 헤르페스 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스 (polyomavirus), 비르나바이러스 (birnavirus), 써코바이러스 (circovirus), 및/또는 파르보바이러스가 없을 것이다 (즉, 이들에 의한 오염에 대하여 특정 부정적인 결과에 대해 테스트될 것이다) [47]. 단순 헤르페스 바이러스의 부재는 특히 바람직하다.

MDCK 세포주에서와 같이, 세포주에서 성장을 위해, 바이러스는 현탁 [31, 48, 49] 또는 부착 배양의 세포에서 자랄 수도 있다. 현탁 배양에 대해 적합한 하나의 MDCK 세포주는 MDCK 33016이다 (DSM ACC 2219로 기탁됨). 대안으로서, 미세담체 배양이 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바람직하게 혈청 없는 배양 배지 및/또는 단백질 없는 배지에서 자란다. 배지는 사람 또는 동물 기원의 혈청의 첨가제가 없는 본 발명의 맥락에서 혈청 없는 배지가 바람직하다. 단백질 없는 것은 세포의 분열이 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질을 제외와 함께 일어나지만, 선택적으로 트립신과 같은 단백질 또는 바이러스의 성장에 필수적일 수도 있는 다른 프로테아제를 포함할 수 있는 배지를 의미한다고 이해된다. 이러한 배양에서 자라는 세포는 자연스럽게 단백질 자체를 함유한다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바이러스 복제 중에 바람직하게 37℃ 이하, 예를 들어, 30-36℃, 31-35℃, 또는 33 ± 1℃에서 자란다.

배양된 세포에서 바이러스를 증식시키는 방법은 일반적으로 배양된 세포에 배양될 균주의 접종 단계, 예를 들어, 바이러스 적정 농도 또는 항원 발현에 의해 설명된 바와 같이, 바이러스 증식에 대하여 원하는 기간 동안 (예를 들어, 접종 후 24 내지 168시간) 감염된 세포의 배양 단계 및 증식한 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게 1:100 내지 1:5, 더 바람직하게 1:50 내지 1:10의 세포 비율로 바이러스가 접종된다 (PFU 또는 TCID₅₀에 의해 측정됨). 바이러스는 세포의 현탁액에 추가되거나 세포의 단층에 적용되고, 세포에서 바이러스는 25℃ 내지 40℃, 바람직하게 28℃ 내지 37℃에서 적어도 60분 하지만 보통 300분 이하, 바람직하게 90 내지 240분 동안 흡수된다. 감염된 세포 배양액 (예를 들어, 단층)은 수확된 배양 상층액의 바이러스 함량을 증가시키기 위해 동결-해동에 의해 또는 효소 작용에 의해 제거될 수 있다. 수확된 유동체는 불활성화되거나 얼려서 저장된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게 0.002 내지 5, 더 바람직하게 0.01 내지 2의 감염다중도 (multiplicity of infection; "m.o.i."로 감염될 수도 있다. 더 바람직하게, 세포는 약 0.01의 m.o.i.로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60시간에 수확될 수도 있다. 바람직하게, 세포는 감염 후 34 내지 48시간에 수확된다. 더 바람직하게, 세포는 감염 후 38 내지 40시간에 수확된다. 프로테아제 (전형적으로 트립신)는 일반적으로 바이러스 방출을 허용하기 위해 세포 배양 중에 추가되고, 프로테아제는 배양 중에 어느 적합한 단계에서도 배양될 수 있다.

소량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수도 있지만, 세포 배양으로부터 제조된 백신을 포함하는 백신 생성물은 바람직하게 투여 당 10 ng 이하 (바람직하게 1 ng 이하, 및 더 바람직하게 100 pg 이하)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유한다.

어느 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이가 500 bp 이하, 400 bp 이하, 300 bp 이하, 200 bp 이하, 100 bp 이하, 등이다.

백신 제조 중에 DNA를 오염시키는 것은 표준 정제 과정, 예를 들어, 크로마토그래피, 등을 사용하여 제거될 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예를 들어, DN아제의 사용에 의해 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 참고문헌 51 52에 개시되고, 두-단계 처리, 첫 번째 바이러스 성장 중에 사용될 수도 있는, DN아제 (예를 들어, 벤조나제)를 사용하는 단계, 및 다음에 바이러스 분열 중에 사용될 수도 있는, 양이온성 세제 (예를 들어, CTAB)를 사용하는 단계를 수반한다. 알킬화제, 예를 들어, β-프로피오락톤의 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하는데 사용될 수 있고, 또한 유리하게 비리온을 불활성화시키는데 사용될 수도 있다 [53].

본 발명의 일부 구체예는 1가 인플루엔자 백신을 사용하지만 일부 구체예에서 그것은 다가 백신, 예를 들어, 2가 백신, 3가 백신, 4가 백신, 또는 4가 이상의 백신 (즉, 네 개 이상의 다른 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함)일 수도 있다. 1가 및 다가 백신은 다양한 HA 타입에 대한 테스트에 의해, 아미노산 서열화, 등에 의해 쉽게 구별될 수 있다.

유행기 중에 또는 사전-유행성의 경우에, 1가 백신은 특히 유행성 또는 잠재적-유행성 균주에 대한 면역화에 유용하다. 이 균주들의 특징은 다음과 같다: (a) 그것들은 현재 순환하는 사람 균주의 헤마글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌, 즉, 10년 이상 동안 사람 집단에서 증거가 아니었거나 (예를 들어, H2), 사람 집단에서 전혀 보인 적이 없는 (예를 들어, 일반적으로 새 집단에서만 발견되는, H5, H6 또는 H9) 것을 함유하는데, 사람 집단은 면역학적으로 균주의 헤마글루티닌에 대해 나이브할 것이다; (b) 그것들은 사람 집단에서 동족으로 전염될 수 있다; 및 (c) 그것들은 사람에 대하여 병원성이다. 이 균주들은 인플루엔자 A HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16 중에 어느 것을 가질 수도 있다. H5 헤마글루티닌을 갖는 바이러스는 유행성 인플루엔자, 또는 H2, H7 또는 H9 서브타입에 대한 면역화에 대하여 바람직하다. 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9, 및 어느 다른 최근 발생한 잠재적으로 유행성 균주 중 하나 이상으로부터 보호할 수도 있다.

다가 백신은 계절 설정에서 더 전형적이다, 예를 들어, 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주, 예를 들어, H1N1 인플루엔자 A 균주, H3N2 인플루엔자 A 바이러스 균주, 및 인플루엔자 B 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 3가 백신이 전형적이다. 예를 들어, 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 균주, 또는 세 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주를 포함하는 4가 백신은 또한 유용하다 [54]. 따라서 백신은 2가, 3가, 4가, 등일 수도 있다. 1가 백신을 제외하고, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 것이 보통이다. 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주만을 포함하는 백신에서, 이것들은 보통 하나의 H1 균주 (예를 들어, H1N1 균주) 및 하나의 H3 균주 (예를 들어, H3N2 균주)일 것이다. 하지만, 일부 구체예에서, 하나의 유행성 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 H1 균주, 또는 하나의 유행성 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 H3 균주가 있을 수도 있다.

백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주는 전형적으로 독립적으로 성장하였고 바이러스가 수확된 후 혼합되었고 항원이 제조되었다. 따라서 본 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주의 시약을 혼합하는 단계를 포함할 수도 있다.

참고문헌 54에 설명된 바와 같이, 전형적인 4가 백신은 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 균주 ('A-A-B-B'), 또는 세 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주 ('A-A-A-B')의 헤마글루티닌을 포함할 수 있다.

인플루엔자 B 바이러스는 현재 다른 HA 서브타입을 나타내지 않지만, 인플루엔자 B 바이러스 균주는 두 개의 뚜렷한 혈통으로 나누어진다. 이 혈통들은 1980년대 후반에 나타났고 항원에 관하여 및/또는 유전적으로 서로 구별될 수 있는 HA를 갖는다 [55]. 현재 인플루엔자 B 바이러스 균주는 B/Victoria/2/87-유사 또는 B/Yamagata/16/88-유사하다. 본 발명의 백신이 두 개의 인플루엔자 B 균주를 포함하는 경우, 이것은 보통 하나의 B/Victoria/2/87-유사 균주 및 하나의 B/Yamagata/16/88-유사 균주일 것이다. 이 균주들은 보통 항원에 관하여 구별되지만, 아미노산 서열의 차이는 또한 두 개의 혈통을 구별하기 위해 설명되었다, 예를 들어, B/Yamagata/16/88-유사 균주는 종종 (항상은 아님) 'Lee40' HA 서열에 관하여 번호 매겨진, 아미노산 잔기 164에서 삭제를 갖는 HA 단백질을 갖는다 [56].

바람직한 A-A-B-B 백신은 (i) H1N1 균주; (ii) H3N2 균주; (iii) B/Victoria/2/87-유사 균주; 및 (iv) B/Yamagata/16/88-유사 균주의 헤마글루티닌을 포함한다.

세 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주를 포함하는 백신에서, 이것들은 보통 하나의 H1 균주 (예를 들어, H1N1 균주) 및 두 개의 H3 균주 (예를 들어, 두 개의 H3N2 균주)일 것이다. 두 개의 H3 균주는 항원에 관하여 뚜렷한 HA 단백질, 예를 들어, A/Moscow/10/99와 교차-반응하는 하나의 H3N2 균주 및 A/Fujian/411/2002와 교차-반응하는 하나의 H3N2 균주를 가질 것이다. 두 개의 H3 균주는 다른 클레이드 (clade)일 수도 있다 (H3N2 균주의 클레이드 A, B 및 C는 참고문헌 57에 개시된다). 하지만, 일부 구체예에서, 이 균주들 (즉, H1, 또는 두 개의 H3 균주들 중 하나) 중 하나는 유행성 균주에 의해 대체될 수도 있다.

따라서 하나의 바람직한 A-A-A-B 백신은 (i) H1N1 균주; (ii) A/Moscow/10/99-유사 H3N2 균주, (iii) A/Fujian/411/2002-유사 H3N2 균주; 및 (iv) 인플루엔자 B 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함하는데, 이것은 B/Victoria/2/87-유사 또는 B/Yamagata/16/88-유사할 수도 있다.

또 다른 바람직한 A-A-A-B 백신은 (i) H1N1 균주; (ii) H3N2 균주, (iii) H5 균주 (예를 들어, H5N1 균주) 및 (iv) 인플루엔자 B 균주의 헤마글루티닌을 포함한다.

또 다른 바람직한 A-A-A-B 백신은 (i) 두 개의 다른 H1 균주, (ii) H3N2 균주, 및 (iii) 인플루엔자 B 균주의 헤마글루티닌을 포함한다.

둘 이상의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원이 존재하는 경우, 적어도 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 균주는 뚜렷한 헤마글루티닌을 가질 수도 있지만 뉴라미니다제와 관련된다. 예를 들어, 그것들은 모두 B/Victoria/2/87-유사 뉴라미니다제를 가질 수도 있거나 [58] 모두 B/Yamagata/16/88-유사 뉴라미니다제를 가질 수도 있다. 예를 들어, 두 개의 B/Victoria/2/87-유사 뉴라미니다제는 모두 다음 서열 특성 중 하나 이상을 가질 수도 있다: (1) 잔기 27에 세린이 아니고, 바람직하게 루신; (2) 잔기 44에 글루타메이트가 아니고, 바람직하게 리신; (3) 잔기 46에 트레오닌이 아니고, 바람직하게 이소루신; (4) 잔기 51에 프롤린이 아니고, 바람직하게 세린; (5) 잔기 65에 아르기닌이 아니고, 바람직하게 히스티딘; (6) 잔기 70에 글리신이 아니고, 바람직하게 글루타메이트; (7) 잔기 73에 루신이 아니고, 바람직하게 페틸알라닌; 및/또는 (8) 잔기 88에 프롤린이 아니고, 바람직하게 글루타민. 유사하게, 일부 구체예에서 뉴라미니다제는 잔기 43에서 삭제를 가질 수도 있거나, 그것은 트레오닌을 가질 수도 있다; 최근 균주가 Thr-43을 회복하였지만, NA 유전자에서 트리뉴클레오티드 삭제로부터 발생한, 잔기 43에서 삭제는 B/Victoria/2/87-유사 균주의 특징으로서 보고되었다 [58]. 물론, 반대로, 반대 특징은 두 개의 B/Yamagata/16/88-유사 뉴라미니다제, 예를 들어, S27, E44, T46, P51, R65, G70, L73, 및/또는 P88에 의해 공유될 수도 있다. 이 아미노산들은 'Lee40' 뉴라미니다제 서열에 관하여 번호 매겨졌다 [59]. 따라서 본 발명의 A-A-B-B 백신은 HA (하나의 B/Yamagata/16/88-유사, 하나의 B/Victoria/2/87-유사)에 대하여 항원에 관하여 뚜렷하지만, NA (B/Yamagata/16/88-유사, 또는 B/Victoria/2/87-유사 모두)에 관련되는 두 개의 B 균주를 사용할 수도 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 각각의 A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wyoming/03/2003 (H3N2) 및 B/Jiangsu/10/2003 균주의 헤마글루티닌을 함유하는 3가 분할 백신을 포함하지 않는다.

항원이 조성물에 유용하게 포함될 수 있는 균주는 항바이러스성 치료에 저항성 (예를 들어, 오셀타미비르 [60] 및/또는 자나미비르에 저항성)인 균주를 포함하고, 저항성 유행성 균주를 포함한다 [61].

본 발명의 일부 구체예에서, 백신은 소량의 수은-기반 보존제, 예를 들어, 티오메르살 또는 메르티올레이트를 포함할 수도 있다. 존재할 때, 이러한 보존제는 전형적으로 5 μg/ml 미만의 수은을 제공할 것이고, 더 낮은 레벨, 예를 들어, 1 μg/ml 미만, 0.5 μg/ml 미만이 가능하다. 바람직한 백신은 티오메르살이 없고, 더 바람직하게 수은이 없다 [23, 62]. 이러한 백신은 비-수은성 보존제를 포함할 수도 있다. 티오메르살에 대한 비-수은성 대안은 2-페녹시에탄올 또는 α-토코페롤 숙신산염을 포함한다 [23]. 가장 바람직하게, 백신은 보존제가 없다.

일부 구체예에서, 백신은 안정한 양, 예를 들어, 0.1% 미만의 젤라틴을 포함할 수도 있다. 하지만 또 다른 구체예에서, 백신은 젤라틴이 없다. 젤라틴의 부재는 백신이 작은 비율의 젤라틴-민감성 환자에 안전하다는 것을 보장할 수 있다 [63, 64].

일부 구체예에서, 백신은 하나 이상의 항생제, 예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 백신은 항생제가 없다.

일부 구체예에서, 백신은 포름알데히드를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 백신은 포름알데히드가 없다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 구체예에서 백신은 난 성분 (예를 들어, 오발부민 및 오보뮤코이드)을 포함할 수도 있지만, 바람직한 구체예는 난 성분이 없다.

어떤 성분 및 첨가제를 사용하지 않는 백신의 제조는 참고문헌 65에 개시되고, 이로 인해 이 물질들이 잔량에 존재하지 않는다는 것을 보장한다.

헤마글루티닌 (HA)은 현재 불활성화된 인플루엔자 백신의 주요 면역원이고, 백신은 전형적으로 SRID에 의해 측정되는, HA 레벨에 대한 참고에 의해 표준화된다. 예를 들어, 아이들을 위해, 또는 유행성 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때, 더 낮은 투여량이 사용될 수 있지만, 기존의 백신은 전형적으로 균주 당 약 15 μg의 HA를 함유한다. 더 높은 투여량 (예를 들어, 3x 또는 9x 투여량 [66, 67])을 갖는 바와 같이, 단편적인 투여, 예를 들어, ½ (즉, 균주 당 7.5 μg HA), ¼ 및 ⅛이 사용되었다. 이 백신들은 0.5 ml의 투여 부피, 즉, 30 μg/ml/균주의 전형적인 HA 농도를 갖는다. 3가 INTANZA™ 제품은 0.1 ml 부피에 균주 당 9 μg의 HA, 즉, 90 μg/ml/균주의 HA 농도를 함유하고, 270 μg/ml의 전체 HA 농도를 제공한다.

본 발명의 생성물은 투여 당 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 50 μg의 HA, 바람직하게 0.1 내지 50 μg, 예를 들어, 1-20 μg을 포함할 수 있다. 이상적으로 생성물은 균주 당 16 μg 이하, 예를 들어, 1-15 μg, 1-10 μg, 1-7.5 μg, 1-5 μg, 등의 헤마글루티닌을 갖는다. 균주 당 특정 HA 투여 예를 들어, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다.

표면 항원 백신에서, HA는 조성물에서 전체 단백질의 50% 이상 (중량비), 예를 들어, 면역원성 조성물에서 전체 인플루엔자 단백질의 60-100%, 60-90% 또는 60-80%를 구성할 수 있다.

생백신에 대하여, 투여는 HA 함량, 예를 들어, 투여 당 균주 당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게 10^6.5-10^7.5 사이)의 TCID50 대신에 중간 조직 배양 감염성 투여량 (median tissue culture infectious dose; TCID₅₀)에 의해 측정된다.

본 발명 내에 사용된 인플루엔자 균주는 야생형 바이러스에서 발견된 바와 같은 자연 발생의 HA, 또는 변형된 HA를 가질 수도 있다. 예를 들어, 조류 종에서 바이러스가 고도로 병원성이 되도록 하는 결정 요인 (예를 들어, HA1/HA2 분할 부위 주변의 과-염기 영역)을 제거하기 위해 HA를 변형하는 것이 알려져 있다. 역유전학의 사용은 이러한 변형을 가능하게 한다.

본 발명의 백신 생성물은 인플루엔자 백신 항원 외에 성분을 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 예를 들어, 그것들은 생가용성 및 생분해성 매트릭스 물질, 또는 구강의 필름 폴리머를 포함할 수 있다.

백신 생성물은 세제를 포함할 수도 있다. 세제의 레벨, 예를 들어, HA의 μg 당 0.01-50 μg 세제 ('μg/μg') 또는 0.05-50 μg는 다양할 수 있다. 낮은 레벨, 예를 들어, 0.05-1 μg/μg 또는 0.1-1 pg/pg, 또는 높은 레벨, 예를 들어, 5-30 μg/μg의 세제가 사용될 수 있다. 세제는 단일 세제 (예를 들어, 포리소르베이트 80, 또는 CTAB) 또는 혼합물 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 및 CTAB)일 수도 있다. 바람직한 세제는 비-이온성, 예를 들어, 폴리소르베이트 80 ('Tween 80') 또는 옥틸 페놀 에톡실레이트 ('Triton X100')이다. 폴리소르베이트 80은 HA의 μg 당 0.05-50 μg, 예를 들어, 0.05-0.75 μg/μg, 0.1-1 μg/μg, 0.1-0.8 μg/μg, 0.1-0.5 μg/μg, 5-40 μg/μg, 5-30 μg/μg, 또는 8-25 μg/μg 폴리소르베이트 80으로 존재할 수도 있다. CTAB는 작은 부피, 예를 들어, 0.1 μg/μg 미만, 0.05 μg/μg 미만으로 존재할 수도 있다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 백신 생성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수도 있지만, 바람직한 백신은 수은, 또는 보존제가 없다.

백신 생성물은 생리학적 염, 예를 들어, 나트륨염을 포함할 수도 있다. 염화 나트륨 (NaCl)이 바람직한데, 이것은 1 내지 20 mg/ml에서 존재할 수도 있다. 존재할 수도 있는 다른 염은 염화 칼륨, 이수소 인산 칼륨, 인산 이나트륨 무수물, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 등을 포함한다.

백신 생성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수도 있다. 전형적인 완충액은 인산염 완충액; Tris 완충액, 붕산염 완충액, 숙신산염 완충액, 히스티딘 완충액 (특히 수산화 알루미늄 보조제와 함께); 또는 시트르산 완충액을 포함한다. 완충액은 전형적으로 5-20 mM 범위에 포함될 것이다.

백신 생성물은 바람직하게 멸균된다. 예를 들어, 투여 당 1 미만의 EU (내독소 단위, 표준 측정), 및 바람직하게 투여 당 0.1 미만의 EU를 함유하는 백신 생성물은 바람직하게 비-발열성이다. 백신 생성물은 바람직하게 글루텐이 없다.

백신 생성물은 면역자극 분자를 포함할 수 있다. 이것들은 패치를 제조하기 전에 항원과 혼합될 수 있다. 적합한 클래스의 면역 자극 분자는 TLR3 작용제; TLR4 작용제; TLR5 작용제; TLR7 작용제; TLR8 작용제; TLR9 작용제; 및 CD1d 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 면역 자극 분자는 이미다조퀴놀린, 예를 들어, 이미퀴모드 ("R-837") [68, 69] 및 레시퀴모드 ("R-848") [70], 또는 이들의 염 (예를 들어, 염산염); 아미노알킬 글루코사미니드 인산염 유도체, 예를 들어, RC-529 [71, 72]; α-글리코실세라미드, 예를 들어, α-갈락토실세라미드; 참고문헌 73의 'ER 804057'; E5564 [74, 75]; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

인플루엔자 바이러스 백신 접종 후 항체 반응, 중화력 및 보호를 평가하는 방법은 업계에 알려져 있다. 사람 연구는 사람 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 적정 농도가 보호와 관련된다는 것을 나타내었다 (약 30-40의 혈청 샘플 헤마글루티닌화-억제 적정 농도는 상동성 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호를 제공한다) [76]. 항체 반응은 전형적으로 헤마글루티닌화 억제에 의해, 미세중화에 의해, 일원 방사 면역 확산법 (single radial immunodiffusion; SRID)에 의해, 및/또는 단일 방사 용혈작용 (single radial hemolysis; SRH)에 의해 측정된다. 이 검정 기술들은 업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 백신은 효능에 대한 1, 2 또는 3의 CPMP 기준을 만족시킨다. 성인 (18-60살)에서, 이 기준은 (1) 70% 이상의 혈청 방어율 (seroprotection); (2) 40% 이상의 혈청 전환율 (seroconversion); 및/또는 (3) 2.5배 이상의 GMT 증가이다. 노인들 (60살 이상)에서, 이 기준은 (1) 60% 이상의 혈청 방어율; (2) 30% 이상의 혈청 전환율; 및/또는 (3) 2배 이상의 GMT 증가이다. 이 기준은 적어도 50명의 환자들에 대한 개방 연구에 기초한다.

인플루엔자 백신은 현재 6개월부터의 소아 및 성인 면역화에 사용을 위하여 추천된다. 따라서 사람 대상체는 1살 미만, 1-5살, 5-15살, 15-55살, 또는 적어도 55살일 수도 있다. 백신을 받기에 바람직한 대상체는 노인들 (예를 들어, 50살 이상, 60살 이상, 및 바람직하게 65살 이상), 유아 (예를 들어, 5살 이하), 입원한 대상체, 의료계 종사자, 군사 및 군 인사, 임신한 여성, 만성 질환, 면역결핍 대상체, 백신을 받기 전 7일 안에 항바이러스성 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 섭취한 대상체, 계란 알레르기가 있는 사람 및 해외로 여행중인 사람이다. 하지만, 백신은 이 그룹들에 대하여 단독으로 적합하지 않고, 더 일반적으로 집단에 사용될 수도 있다. 유행성 균주에 대하여, 모든 나이 그룹에 투여는 바람직하다.

한 번 이상의 투여 (전형적으로 두 번의 투여)는 특히 면역학적으로 나이브 환자에, 예를 들어, 전에 인플루엔자 백신을 받지 않은 사람에 대하여, 또는 새로운 HA 서브타입에 대하여 백신 접종에 대하여 (유행성 발병에서와 같이) 유용하다.

벌크 액체 백신

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 12 mg/ml이고 (b) 백신은 실질적으로 수크로스가 없다. 이 벌크 백신은 비-근육 내 루트에 의한 전달에 대하여 백신의 제조 중에 유용한 중간물일 수 있다. HA 농도는 12 mg/ml 이상, 예를 들어, 15 mg/ml 이상, 20 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상, 35 mg/ml 이상, 40 mg/ml 이상, 45 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상일 수도 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml이고, (b) 헤마글루티닌은 H1 또는 H3 헤마글루티닌이 아니다. 바람직하게, 백신은 (c) 실질적으로 수크로스가 없다. H1 및 H3 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 모두를 함유하지 않는, 이 벌크 백신은 비-근육 내 루트에 의한 전달에 대하여 백신의 제조 중에 유용한 중간물일 수 있다. HA 농도는 2 mg/ml 이상, 예를 들어, 3 mg/ml 이상, 4 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 6 mg/ml 이상, 7 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 9 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 12 mg/ml 이상, 14 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 16 mg/ml. ≥18 mg/ml 이상, 20 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상, 35 mg/ml 이상, 40 mg/ml 이상, 45 mg/ml 이상, 50 mg/ml일 수도 있다. 헤마글루티닌은 H5일 수도 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml이고, (b) 헤마글루티닌은 B/Shandong/7/97 헤마글루티닌이 아니다. 바람직하게, 백신은 (c) 실질적으로 수크로스가 없다. H1 및 H3 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 모두를 함유하지 않는, 이 벌크 백신은 비-근육 내 루트에 의한 전달에 대하여 백신의 제조 중에 유용한 중간물일 수 있다. HA 농도는 2 mg/ml 이상, 예를 들어, 3 mg/ml 이상, 4 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 6 mg/ml 이상, 7 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 9 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 12 mg/ml 이상, 14 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 16 mg/ml 이상, 18mg/ml 이상, 20 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상, 35 mg/ml 이상, 40 mg/ml 이상, 45 mg/ml 이상, 50 mg/ml 일 수도 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml이고, (b) 헤마글루티닌은 B/Yamagata/16/88-유사 균주이다. 바람직하게, 백신은 (c) 실질적으로 수크로스가 없다. H1 및 H3 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 모두를 함유하지 않는, 이 벌크 백신은 비-근육 내 루트에 의한 전달에 대하여 백신의 제조 중에 유용한 중간물일 수 있다. HA 농도는 2 mg/ml 이상, 예를 들어, 3 mg/ml 이상, 4 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 6 mg/ml 이상, 7 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 9 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 12 mg/ml 이상, 14 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 16 mg/ml 이상, 18mg/ml 이상, 20 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상, 35 mg/ml 이상, 40 mg/ml 이상, 45 mg/ml 이상, 50 mg/ml 일 수도 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스의 적어도 두 개의 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 벌크 액체 백신을 제공하는데, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml/균주이고 (b) 백신은 실질적으로 수크로스가 없다. HA 농도는 2 mg/ml/균주 이상, 예를 들어, 3 mg/ml/균주 이상, 4 mg/ml/균주 이상, 5 mg/ml/균주 이상, 6 mg/ml/균주 이상, 7 mg/ml/균주 이상, 8 mg/ml/균주 이상, 9 mg/ml/균주 이상, 10 mg/ml/균주 이상, 12 mg/ml/균주 이상, 14 mg/ml/균주 이상, 15 mg/ml/균주 이상, 16 mg/ml/균주 이상, 18 mg/ml/균주 이상, 20 mg/ml/균주 이상, 25 mg/ml/균주 이상, 30 mg/ml/균주 이상, 35 mg/ml/균주 이상, 40 mg/ml/균주 이상, 45 mg/ml/균주 이상, 50 mg/ml/균주 이상일 수도 있다. 이 수크로스가 없는 벌크 다가의 백신은 이상적으로 2가, 3가 또는 4가이다. 그러므로, 3가 백신에서, 전체 HA 농도는 적어도 6 mg/ml이다.

이 벌크 액체 백신에서 HA 농도는 바람직하게 SRID에 의해, 예를 들어, 주기적으로-인증되는 참고 시약을 사용하여 측정된 바와 같은 HA 농도이다. SRID는 조제 전에 (예를 들어, 코팅 또는 필름 형성 전에) 벌크 백신에서 수행될 수 있지만, 일부 구체예에서 그것은 이미 조제된 생성물로부터 (예를 들어, 코팅된 바늘로부터 항원의 회수 후에) 회수된 물질에서 수행된다. SRID의 장점은 그것이 단일 샘플의 다른 HA들 사이에서 구별될 수 있다, 예를 들어, 3가 백신에서 각각의 HA가 동시에 분석될 수 있다는 것이다. 그러므로, 조성물이 특정 HA를 포함하는 경우, 그것의 함량은 다른 HA의 존재시 검정될 수 있다.

실질적으로 수크로스가 없는 것 외에, 이 벌크는 실질적으로 만니톨이 없을 수도 있다. 벌크는 실질적으로 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락툴로스, 락토스, 셀로비오스, 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 에리트리톨 및 자일리톨이 없을 수도 있다. 일부 구체예에서, 벌크는 실질적으로 이당류 및 당 알콜이 없다.

일반

용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포함한다, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X를 오직 X로 구성될 수도 있거나 추가적인 어떤 것, 예를 들어, X + Y.을 포함할 수도 있다.

단어 "실질적으로"는 "완벽히"를 제외하지 않는다, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완벽히 없을 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수도 있다.

숫자 값 x에 관하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, x ± 5%를 의미한다.

특별히 진술되지 않으면, 둘 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 방법은 어느 특이적 순서도 필요로 하지 않는다. 따라서 성분은 어느 순서로도 혼합될 수 있다. 세 개의 성분이 있는 경우 두 개의 성분은 서로 결합될 수 있고, 조합은 세 번째 성분, 등과 조합될 수도 있다.

동물 (및 특히 소) 물질이 세포의 배양에 사용되는 경우, 그것들은 전염성 해면양뇌증 (transmissible spongiform encephalopathies; TSE)이 없는, 및 특히 광우병 (bovine spongiform encephalopathy; BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어야 한다. 전체적으로, 동물-유래 물질의 전체 부재시 세포를 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명은 동결건조 없는 농축 절차를 제공한다. 이것은 본 발명이 동결건조하지 않고 농축되고 조제된 항원을 사용한다는 것을 의미한다. 보호의 범위는 동결건조된 항원이 백신에 추가되는 경우를 제외하려고 하지 않고 적어도 일부의 백신 항원은 동결건조하지 않고 농축되고 조제되고 있다는 것을 제공한다. 따라서 본 발명의 동결건조 없는 농축 절차를 또한 수행하는 중에 동결건조물의 사용은 전체적인 보호의 의도된 범위 밖에 있지 않다.

화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되는 경우 그 화합물은 대안으로 적합한 프로드러그 (prodrug)에 의해 대체될 수도 있다.

도 1은 1가 인플루엔자 B 바이러스 벌크 항원의 SEC 크로마토그래프를 나타낸다. 벌크는 수크로스의 존재시 (a) 동결건조 전에, (b) 동결건조 후에, 또는 (c) 수크로스 및 만니톨의 존재시 동결건조 후에 분석되었다. x-축은 농축 시간 (분)을 나타내고 y-축은 흡광도 단위를 나타낸다.
도 2는 (A) H1N1 Brisbane (B) H3N2 Brisbane (C) B Florida에 대한 혈청 HI 적정 농도를 나타낸다. 4 쌍의 막대는, 왼쪽부터 오른쪽까지, 보조 되지 않은 3가; 보조된 3가; 보조 되지 않은 1가; 및 PBS 음성 대조군이다. 각각의 쌍에서 왼쪽 막대는 비-농축된 1가 벌크이고; 오른쪽 막대는 TFF-농축된 항원이다.

인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에서 동결건조의 영향

1가 인플루엔자 바이러스 벌크 항원을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였고, 동결건조 및 복원 후 다시 분석하였다. 두 가지의 다른 동결건조 과정을 테스트하였다: 동결방지제로서 수크로스 단독을 갖는 하나, 및 수크로스 및 만니톨 모두를 갖는 하나. 도 1의 결과는 5분에 현저한 피크 (도 1a)가 복원된 물질에서 사라진다는 것을 나타낸다 (도 1b & 1c). 따라서 동결건조 처리가 명백하게 백신 항원을 변화시키기 때문에 항원 농축은 동결건조를 방지해야한다

항원 농축 기술의 비교

1가 인플루엔자 바이러스 벌크에서 시작 HA 농도는 약 0.5 mg/ml이었다. 다양한 벌크의 농축을 위하여 세 가지의 다른 방법을 사용하였다; 원심분리 여과; 초여과; 및 TFF. 원심분리 여과는 5000 rpm에서 45분 동안 작동되는, 10 kDa 컷-오프를 갖는 Millipore™ 장치를 사용하였다. 초여과는 가압 질소 하에 1시간 동안 작동되는, 재생된 셀룰로스로 만들어진 10kDa 컷오프 막을 갖는 Amicon™ 교반 세포 농축기를 사용하였다. TFF는 45 ml 시작 부피를 1.5 ml로 농축하도록 작동되는, 30 kDa 컷-오프를 갖는 변형된 폴리에테르술폰 유공 섬유 (hollow fiber) 필터를 사용하였다. 이루어질 수 있는 농도를 증가시키기 위하여 원심분리 및 초여과 방법을 또한 동결건조와 결합하였다.

원심분리 여과는 자체로 10배까지 농축을 이루었다. 동결건조 다음에, 추가의 SEC 피크가 나타났고 복원된 샘플은 가시적 응집체를 함유하였다.

초여과 후 동결건조, 및 다음에 시작 부피로 복원은 시작 물질과 비교 가능한 HA 농도 (SRID에 의해 측정된 바와 같은)를 갖는 물질을 제공하는데, 기능적 항원의 손실이 없다는 것을 나타낸다. 복원된 물질은 2주 초과 동안 안정하였다.

이 두 방법은 높은 농도 (예를 들어, 30배)를 이루기 위해 동결건조를 필요로 하였지만, 이것은 TFF를 사용할 때 단일 단계에서 이루어질 수 있다. 게다가, 농축된 물질은 2주 초과 동안 안정하다. 그러므로, 동결건조의 필요 없이 높은 항원 농도를 이루기 위해, TFF가 바람직한 기술이다.

TFF 및 동결건조

인플루엔자 A 및 B 바이러스의 세 개의 난-성장 균주의 1가 벌크는 (i) 수크로스의 처리; (ii) 수크로스 존재시 동결건조, 원래의 부피로 복원; (iii) (ii)에서와 같이 같은 동결건조이지만, 원래 부피의 반으로 복원; (iv) TFF에 의한 농축; 또는 (v)에서와 같이 TFF에 의한 농축 후, (ii)에서와 같이 동결건조 및 복원이 처리되었다. 각각의 경우에서 HA 함량을 SRID에 의해 평가하였고 절대값으로서 및 또한 각각의 시작 벌크 (이것은 311 내지 437 μg/ml 범위의 HA 농도를 갖는다)에 관하여 농축 인자로서 하기 나타난다. (i) 또는 (ii)에서 농축 인자가 1 미만이면, 동결방지제 및/또는 동결건조는 HA 결합을 방해하고 있다; (iii)에서 인자가 2 미만이거나, (v)에서 인자가 (iv)에서 보다 작으면 같은 것이 적용된다.

한 세트의 실험의 결과는 다음과 같았다:

그러므로, 모든 경우에서, 균주 2의 처리 (i)의 효과가 매우 작지만, 처리 (i) 내지 (iii)은 검출 가능한 HA의 감소로 이어졌다. 게다가, 동결방지제 단독의 추가는 HA의 감소로 이어졌지만, 복원 후 감소는 더 컸다, 즉, HA 레벨의 감소는 항상 처리 (i)보다 처리 (ii) 후에 더 크다. 균주 2를 제외하고, TFF 후에 유사한 효과를 나타낸다, 즉, 동결건조는 SRID-검출 가능한 HA 함량을 감소시킨다.

처리 (iv) 및 (v)만 사용하는, 별도의 세트의 실험의 결과는 다음과 같았다:

따라서 TFF 단독은 50배 초과의 농축을 이룰 수 있다. 하지만, 상기 나타난 바와 같이, 동결건조의 추가적인 단계는 항상 SRID-측정 HA 함량의 감소로 이어졌다.

면역원성 연구

2008/2009 시즌의 인플루엔자 1가 벌크를 TFF로 농축하였다. 농축된 인플루엔자 항원을 생체 내에서 그것들의 면역원성에 대하여 평가하였고 원래의 1가 벌크 물질에 대하여 비교하였다. 항원을 1가 백신으로서 (0.3 μg HA), 3가 백신으로서 (0.3 μg HA), 또는 보조된 3가 백신으로서 (MF59 수중유 에멀젼 보조제와 함께 0.3 μg HA) 근육 내 투여하였다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 기능적 항-인플루엔자 항체 적정 농도를 헤마글루티닌화 억제 (HI)로 평가하였다.

인플루엔자 1가 벌크를 TFF에 의해 29, 28 및 20 mg/ml HA로 농축하였다. 세 개의 농축물 모두는 0.6-0.8 (단백질 μg 당 HA μg)의 범위의 전체 단백질과 HA 비율을 갖는다. Tween 80 (폴리소르베이트 80)을 항원에 따라 농축하였고 8-14 mg/ml로서 추정하였다. 농축된 항원에 대한 HA와 Tween 80의 비율은 HA μg 당 0.1-0.2 μg였는데, 이것은 전형적인 1가 벌크에서와 같다. Tween 80과 달리, CTAB는 방법 중에 농축되지 않았고 가공되지 않은 1가 벌크에 존재하는 레벨 이하였다 (HA μg 당 0.01 μg 미만 세제). 농축된 항원은 4℃의 용액에서 3-4주 동안 SRID에 의해 안정하였다.

2차 면역화 2주 후 HI 적정 농도는 도 2에 나타난다. 모든 세 개의 균주 (H1N1 Brisbane; H3N2 Brisbane; B Florida)에 대하여 농축된 항원의 면역원성은 농축되지 않은 1가 벌크와 비교 가능하였다).

본 발명은 예시의 방법으로만 설명되었고 변형은 본 발명의 범위 및 사상 내에 유지하는 동안 이루어질 수도 있다는 것으로 이해될 것이다.

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Claims

(i) 농축된 항원을 제공하기 위하여, 항원을 포함하는 액체 조성물에서 항원의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) 농축된 항원으로부터 백신을 조제하는 단계를 포함하며, 농축된 항원은 단계 (i) 및 (ii) 사이에 또는 중에 동결건조시키지 않는, 백신을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 백신은 박테리아, 바이러스, 균류, 및/또는 기생충에 의해 발생하는 질환으로부터 보호하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 백신은 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, (i) 농축된 항원을 제공하기 위하여, 헤마글루티닌을 포함하는 액체 조성물에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) 농축된 항원의 인플루엔자 백신을 조제하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신을 제조하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, (i) n 개의 별도의 농축된 항원을 제공하기 위하여 다른 균주의 헤마글루티닌을 각각 포함하는, n 개의 별도의 액체 조성물에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 농도를 증가시키는 단계, 및 (ii) n 개의 별도의 농축된 항원으로부터 다가의 인플루엔자 백신을 조제하는 단계를 포함하며, n 개의 별도의 농축된 항원들 중 아무것도 단계 (i) 및 (ii) 사이 또는 중에 동결건조시키지 않는 것을 특징으로 하는 n 개의 다른 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 백신의 제조 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물은 실질적으로 외인성 당 알콜 및/또는 외인성 이당류가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 농도는 원심분리 여과에 의해, 초여과에 의해, 또는 접선 유동 여과에 의해 단계 (i)에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 항원 농도는 접선 유동 여과에 의해 단계 (i)에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 적어도 10배까지 항원 농도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물은 세제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 세제는 이온성 세제 (예를 들어, CTAB) 또는 비-이온성 세제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 세제는 단계 (i)에서 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 세제는 항원이 농축되는 정도보다 낮은 정도로 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 세제는 단계 (i)에서 농축되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 고체 백신 형태를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 단계 (ii)는 증발에 의한 건조를 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 농축된 항원으로부터 고체 생분해성 미세 바늘을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 고체 미세 바늘을 농축된 항원으로 코팅하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 미세 바늘은 금속 또는 플라스틱인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 단계 (ii)는 백신의 주사를 위해 코팅된 미세 바늘 장치를 제공하기 위하여 하나 이상의 고체 미세 바늘의 표면에 농축된 항원을 도포하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 미세 바늘은 100-2500 μm 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 농축된 항원으로부터 박막을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 단계 (ii)는 백신의 구강 투여에 적합한 박막을 제공하기 위하여 하나 이상의 구강-가용성 폴리머와 농축된 항원을 혼합한 다음, 상기 혼합물을 사용하여 필름을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 단계 (ii)는 백신의 경피성 투여에 적합한 박막을 제공하기 위하여 하나 이상의 국부적-가용성 폴리머와 농축된 항원을 혼합한 다음, 상기 혼합물을 사용하여 필름을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 필름은 10-500 μm (예를 들어, 75-150 μm) 두께인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 필름 내의 미립자 내부에 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 제 15항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 방법에 의해 고체 백신을 제조하는 단계; 다음에 (ii) 개개의 단위 투여 파우치에 고체 백신을 포장하는 단계를 포함하는 포장된 백신을 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하고, 헤마글루티닌 함량은 SRID의 사용에 의해 조제 단계 전에 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하고, 헤마글루티닌 함량은 SRID의 사용에 의해 조제 단계 후에 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 백신.
대상체에 제 30항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 면역 반응을 일으키는 방법.
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 액체 백신으로서, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 12 mg/ml이고 (b) 백신은 실질적으로 수크로스가 없는 액체 백신.
인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 액체 백신으로서, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml이고 (b) 헤마글루티닌은 H1 또는 H3 헤마글루티닌이 아닌 액체 백신.
인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 액체 백신으로서, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml이고 (b) 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata/16/88-유사 균주인 액체 백신.
제 33항 또는 제 34항에 있어서, 백신은 실질적으로 수크로스가 없는 것을 특징으로 하는 액체 백신.
인플루엔자 바이러스의 적어도 두 개의 균주의 헤마글루티닌을 포함하는 액체 백신으로서, (a) 헤마글루티닌 농도는 적어도 2 mg/ml/균주이고 (b) 백신은 실질적으로 수크로스가 없는 액체 백신.
제 32항, 제 35항 또는 제 36항에 있어서, 실질적으로 만니톨이 없는 것을 특징으로 하는 액체 백신.
제 32항, 제 35항, 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 실질적으로 이당류 및 당 알콜이 없는 것을 특징으로 하는 액체 백신.