PT2185191E

PT2185191E - Vacinas contra a gripe com baixo teor de aditivos

Info

Publication number: PT2185191E
Application number: PT08806940T
Authority: PT
Inventors: Jens-Peter Gregersen; Holger Luebben; Juergen Vorlop
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2012-11-27
Also published as: EP2484377A1; EP2185191A2; KR20100045437A; US20190142927A1; US20170119871A1; CN101784283A; SI2185191T1; BRPI0813866A2; US20100183671A1; ES2393162T3; EA201070066A1; DK2185191T3; WO2009001217A3; CA2692200A1; JP2010531348A; SG182957A1; WO2009001217A2; NZ582595A; EP2185191B1; PL2185191T3

Description

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DESCRIÇÃO

"VACINAS CONTRA A GRIPE COM BAIXO TEOR DE ADITIVOS" CAMPO TÉCNICO

Esta invenção insere-se no campo das vacinas para proteger contra a infeção pelo vírus da gripe, e em particular vacinas gue contêm baixos níveis de aditivos farmacêuticos.

ARTE ANTECEDENTE Várias formas de vacina contra o vírus da gripe estão atualmente disponíveis (por exemplo, ver os capítulos 17 e 18 da referência 1) . As vacinas são geralmente baseadas ou no vírus vivo ou num vírus inativado. As vacinas inativadas podem ser baseadas em viriões inteiros, viriões 'fragmentados', ou em antígenos de superfície purificados.

Além do seu conteúdo antigénico, as vacinas atuais contra a gripe incluem vários aditivos farmacêuticos ou outros contaminantes, tais como: conservantes antibacterianos, por exemplo, timerosal; detergentes, por exemplo, CTAB, polissorbato 80, octoxinol 10, etc.; antibióticos, por exemplo, neomicina, canamicina; formaldeído; e materiais derivados de ovo incluindo proteínas de ovo (por exemplo, mucoide de ovo) e ADN de galinha.

Para a época 2006/07, por exemplo, as bases de dados dos fabricantes para as guatro vacinas inativadas utilizadas nos Estados Unidos revelam a seguinte informação:__

Vacina Conservante Antibiótico(s) Formaldeído Materiais à base de ovo ,—| -i .TM Fluarix Timerosal Gentamicina Sim Sim Fluvirin™ Timerosal Não Não Sim Fluzone™ Opcional thimerosal Não Sim Sim FluLaval™ Timerosal Não Sim Sim 2

De modo análogo ao produto Fluvirin™ 2006-07, a referência 2 preparou uma vacina livre de formaldeido, mas que continha timerosal e produtos de ovo. A referência 59 utiliza BPL, em vez de formaldeido, para inativar vírus da gripe crescidos em cultura celular. A vacina pode ser livre de mercúrio.

É um objeto da invenção providenciar vacinas contra a gripe adicionais e melhoradas, e processos para o seu fabrico, que reduzem ou eliminam a quantidade e/ou número destes aditivos farmacêuticos, dando assim um produto da vacina mais puro. REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção, uma vacina contra a gripe carece de um conservante mercúrico; um antibiótico; formaldeido; e materiais derivados de ovo.

Assim, numa forma de realização, a invenção providencia uma vacina estéril que compreende um antígeno do vírus da gripe inativado, em que a vacina não contém conservante à base de mercúrio, nem antibiótico nem formaldeido nem materiais derivados de ovo.

Vacinas preferidas também têm um conteúdo muito baixo em endotoxina, por exemplo, inferior a 0,1 IU/ml, e preferencialmente inferior a 0,05 IU/ml. A unidade internacional para a medição de endotoxina é bem conhecida e pode ser calculada para uma amostra por, por exemplo, comparação com um padrão internacional [3,4], tal como o 2o Padrão Internacional (Código 94/580 - IS) disponível a partir do NIBSC. As vacinas atuais preparadas a partir do vírus crescido em ovos têm níveis de endotoxina na região dos 0,5-5 IU/ml. A invenção também providencia um processo para preparar uma formulação de antígeno de vírus da gripe estéril, que compreende as etapas de: (i) crescer vírus da gripe num sistema de cultura de células, na ausência de materiais derivados do ovo e de antibióticos; (ii) inativar os vírus da gripe crescidos na etapa (i), na ausência de formaldeido; e 3 (iii) preparar uma formulação de antígeno da vacina a partir dos virus da gripe inativos, na ausência de timerosal. A formulação de antigeno resultante pode produzir um antigeno da vacina aumentado que pode ser utilizado para preparar vacinas monovalentes ou multivalentes.

Componentes de antígeno A invenção utiliza antígenos do virus da gripe preparados a partir de viriões da gripe.

Os viriões são inativados sem utilizar formaldeído. Os meios químicos para inativar um vírus incluem tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes: detergentes, β-propiolactona, ou luz UV. Meios químicos adicionais para inativação incluem tratamento com azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60) ou uma combinação de qualquer dos mesmos. Outros métodos de inativação virai são conhecidos na arte, tais como por exemplo, etilamina binária, acetil etileneimina, ou irradiação gama.

Os viriões podem ser colhidos a partir de fluídos contendo vírus por vários métodos. Por exemplo, um processo de purificação pode envolver centrifugação zonal utilizando uma solução de gradiente de sacarose linear que inclui detergente para interromper os viriões. Os antigenos podem então ser purificados, depois de diluição opcional, por diafiltração.

Os viriões divididos são obtidos tratando viriões purificados com detergentes (por exemplo, éter de etilo, polissorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, Tergitol NP9, etc.) para produzir preparações de subvirião, incluindo o processo de divisão 'Tween-éter' . Os métodos para fragmentar os vírus da gripe são bem conhecidos na arte, por exemplo, ver referências 5-10, etc. A fragmentação do vírus é tipicamente realizada interrompendo ou fragmentando o virus inteiro, seja infecioso ou não infecioso, com uma concentração desestabilizadora de um agente de fragmentação. A interrupção resulta numa solubilização inteira ou parcial das proteínas do vírus, 4 alterando a integridade do vírus. Os agentes de divisão preferidos são tensoativos não iónicos e iónicos (por exemplo, catiónicos), por exemplo, alquilglicosídeos, alquiltioglicosídeos, açúcares acilo, sulfobetaínas, betainas, poli-oxietilenealquiléteres, N,N-dialquil-Glucamidas, Hecameg, alquilfenoxipolietoxietanóis, compostos de amónio quaternário, sarcosilo, CTABs (brometos de cetil trimetil amónio), fosfato de tri-N-butilo, Cetavlon, sais de miristiltrimetilamónio, lipofectina, lipofectamina, e DOTMA, os octil- ou nonilfenoxipolioxietanóis (por exemplo, os tensoativos Triton, tais como Triton X-100 ou Triton N101), ésteres de polioxietileno sorbitano (os tensoativos Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Um procedimento de divisão útil utiliza os efeitos consecutivos do sódio desoxicolato e formaldeído, e a divisão pode ocorrer durante a purificação inicial do virião (por exemplo, numa solução de gradiente de densidade de sacarose). Os viriões divididos podem ser ressuspensos proveitosamente em solução de cloreto de sódio isotónico tamponada com fosfato de sódio. As vacinas de antígeno de superfície purificado compreendem a hemaglutinina dos antígenos de superfície da gripe e, tipicamente, também neuraminidase. Os processos para preparar estas proteínas na forma purificada são bem conhecidos.

Os antígenos da gripe também podem ser apresentados na forma de virossomas [11] (ácido nucleico livre de partículas lipossomais tipo virais) , como nos produtos INFLEXAL λ/™ e INVAVAC™. 0 vírus da gripe pode ser atenuado. 0 vírus da gripe pode ser sensível à temperatura. 0 vírus da gripe pode ser adaptado ao frio. Estas três características estão, contudo, associadas mais com vacinas de vírus vivo.

As estirpes do vírus da gripe humanas para utilização em vacinas mudam de estação para estação. No período interpandémico atual, as vacinas tipicamente incluem duas estirpes de gripe A (H1N1 5 e H3N2) e uma estirpe de gripe B, e as vacinas trivalentes são típicas. A invenção pode também utilizar HA a partir de estirpes pandémicas (isto é, estirpes para as quais um recetor da vacina e a população humana em geral são imunologicamente ingénuos), tais como estirpes de subtipo H2, H5, H7 ou H9 (em particular do vírus da gripe A) , e as vacinas da gripe para estirpes pandémicas podem ser monovalentes ou podem ser baseadas numa vacina trivalente normal suplementada por uma estirpe pandémica. Dependendo da estação e da natureza do antígeno incluído numa vacina, contudo, a invenção pode proteger contra um ou mais HA dos subtipos Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16 (vírus da gripe A) . A invenção pode proteger contra um ou mais subtipos Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ou N9 do vírus NA da gripe A.

Além de serem adeguadas para imunizar contra estirpes interpandémicas, as composições da invenção são particularmente úteis para imunizar contra estirpes pandémicas. As características de uma estirpe de gripe que lhe dão o potencial para causar um surto pandémico são: (a) contém uma nova hemaglutinina comparada com as hemaglutininas nas estirpes humanas que circulam atualmente, isto é, uma que não tem sido evidente na população humana há mais de uma década (por exemplo, H2) ou que não foi previamente observada de todo na população humana (por exemplo, H5, H6 ou H9, que têm sido geralmente encontradas em populações de aves), e/ou contém uma nova neuraminidase comparada com as neuraminidases nas estirpes humanas que circulam atualmente, de tal modo que a população humana será imunologicamente ingénua à hemaglutinina e/ou neuraminidase da estirpe; (b) é capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e (c) é patogénica para humanos. É preferido um vírus com hemaglutinina tipo H5 para imunizar contra gripe pandémica, tal como uma estirpe H5N1. Outras estirpes possíveis incluem H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, e quaisquer outras estirpes pandémicas potencialmente emergentes. 6

Dentro do subtipo H5, um vírus pode cair no HA ciado 1, HA ciado 1', HA ciado 2 ou HA ciado 3 [12], com os ciados 1 e 3 sendo particularmente relevantes.

Outras estirpes cujos antígenos podem proveitosamente ser incluídos nas composições são estirpes que são resistentes à terapêutica antiviral (por exemplo, resistentes ao oseltamivir [13] e/ou zanamivir), incluindo estirpes pandémicas resistentes [14],

Composições da invenção podem incluir antígeno(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do vírus da gripe, incluindo vírus da gripe A e/ou vírus da gripe B. Podem ser preparadas vacinas monovalentes, como podem divalentes, trivalentes, tetravalentes, etc.. Onde uma vacina inclui mais de uma estirpe de gripe, as diferentes estirpes são tipicamente crescidas separadamente e são misturadas depois dos vírus terem sido colhidos e os antígenos terem sido preparados. Assim, um processo da invenção pode incluir a etapa de misturar antígenos a partir de mais de uma estirpe de gripe, e este processo pode ser realizado em condições não refrigeradas. Uma vacina trivalente é preferida, incluindo antígenos de duas estirpes do vírus da gripe A e uma estirpe do vírus da gripe B.

Em algumas formas de realização da invenção, as composições podem incluir antígeno a partir de uma única estirpe da gripe A.

Em algumas formas de realização, as composições podem incluir antígeno de duas estirpes da gripe A, desde que estas duas estirpes não sejam H1N1 nem H3N2. Em algumas formas de realização, as composições podem incluir antígeno de mais de duas estirpes de gripe A. 0 vírus da gripe pode ser uma estirpe que sofreu rearranjo, e pode ter sido obtida através de técnicas de genética reversa. As técnicas de genética reversa [por exemplo, 15-19] permitem que os vírus da gripe com segmentos de genoma desejados sejam preparados in vitro utilizando plasmídeos. Tipicamente, isso envolve expressar (a) moléculas de ADN que codificam moléculas 7 de ARN virai desejadas, por exemplo, a partir de promotores poli, e (b) moléculas de ADN que codificam proteínas virais, por exemplo, a partir de promotores poIII, de tal modo que a expressão de ambos tipos de ADN numa célula conduz à montagem de um virião infecioso intacto completo. 0 ADN preferencialmente providencia todo o ARN virai e proteínas, mas também é possível utilizar um vírus auxiliar para providenciar algum do ARN e proteínas. Os métodos baseados em plasmídeo utilizando plasmídeos separados para produzir cada ARN virai são preferidos [20-22] , e estes métodos também envolverão o uso de plasmídeos para expressar todas ou algumas (por exemplo, só as proteínas FBI, PB2, PA e NP) das poteínas virais, com até 12 plasmídeos sendo utilizados em alguns métodos. Para reduzir o número de plasmídeos necessários, uma abordagem recente [23] combina uma pluralidade de cassetes de transcrição da ARN polimerase 1 (para síntese do ARN virai) no mesmo plasmídeo (por exemplo, sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos de ARNv da gripe A) , e uma pluralidade de regiões codificantes de proteína com promotores de ARN polimerase II num outro plasmídeo (por exemplo, sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de ARNm da gripe A) . Os aspetos preferidos do método da referência 23 envolvem: (a) regiões PB1, PB2 e PA codificantes de ARNm num único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos codificantes de ARNv num único plasmídeo. Incluir os segmentos NA e HA num plasmídeo e os outros seis segmentos num outro plasmídeo também pode facilitar a matéria.

Como uma alternativa à utilização de promotores poli para codificar os segmentos de ARN virai, é possível utilizar promotores de polimerase de bacteriofago [24] . Por exemplo, os promotores para as polimerases SP6, T3 ou T7 podem ser convenientemente utilizados. Por causa da especificidade pela espécie dos promotores poli, os promotores de polimerase de bacteriofago podem ser mais convenientes para muitos tipos de células (por exemplo, MDCK), apesar de uma célula ter também de ser transfetada com um plasmídeo que codifica a enzima polimerase exógena.

Noutras técnicas é possível utilizar promotores poli e poIII duais para codificar simultaneamente os ARN virais e para ARNm expressíveis de um único molde [25,26].

Assim o vírus, particularmente um vírus de gripe A, pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma estirpe de vacina, isto é, um ressortido 6:2). Pode também incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/WSN/33, ou de qualquer outra estirpe de vírus útil para gerar vírus ressortidos para a preparação de vacinas. Tipicamente, a invenção protege contra uma estirpe que é capaz de transmissão humano-a-humano, e por isso o genoma da estirpe incluirá normalmente, pelo menos, um segmento de ARN que se originou num vírus da gripe de mamífero (por exemplo, num humano). Pode incluir segmento NS que se originou num vírus da gripe aviária.

Como mencionado anteriormente, os vírus utilizados como a fonte de antígenos são geralmente crescidos em cultura de células, evitando assim a contaminação com componentes de ovos de galinha embrionados. Assim, as vacinas da invenção podem estar livres de ADN de galinha, bem como estar livres de proteínas do ovo (tais como ovalbumina e mucoide do ovo). 0 substrato celular será tipicamente uma linha de células com origem de mamífero. Células de mamífero adequadas de origem incluem, mas não se limitam a, células de hamster, gado, primata (incluindo humanos e macacos) e de cão. Podem ser utilizados vários tipos de células, tais como células renais, fibroblastos, células da retina, células do pulmão, etc. Exemplos de células de hamster adequadas são as linhas de células que têm os nomes BHK21 ou HKCC. Células de macaco adequadas são, por exemplo, células de macaco verde Africano, tais como células do rim como na linha de células Vero. Células de cão adequadas são, por exemplo, células de rim, como na linha de células MDCK. Assim, linhas de células adequadas incluem, 9 mas não se limitam a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc.

Linhas de células de mamíferos preferidas para crescer vírus da gripe incluem: células MDCK [27-30] , derivadas de rim canino Madin Darby; células Vero [31-33], derivadas de rim de macaco verde Africano (Cercopithecus aethiops); ou células PER.C6 [34] , derivadas de retinoblastos embriónicos humanos. Estas linhas de células estão amplamente disponíveis, por exemplo, a partir da Coleção Americana de Cultura de Células Tipo (ATCC) [35] , dos Repositórios de Células Coriell [36], ou da Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece várias células Vero diferentes sob os números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob o número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponível a partir de ECACC sob o número de depósito 96022940. Como uma alternativa às linhas de células de mamíferos, os vírus podem ser crescidos em linhas de células de aves [por exemplo, as referências 37-39], incluindo células estaminais embriónicas de aves [37,40] e linhas de células derivadas de patos (por exemplo, retina de pato), ou de galinhas. Células estaminais embriónicas de aves adequadas, incluem a linha de células EBx derivada de células estaminais embriónicas de galinha, EB45, EB14, e EB14-074 [41]. Fibroblastos de embrião de galinha (CEF), também podem ser utilizados, etc.

As linhas de células mais preferidas para crescer vírus da gripe são as linhas de células MDCK. A linha de células MDCK original está disponível a partir da ATCC como CCL-34, mas derivados desta linha de células também podem ser utilizados. Por exemplo, a referência 27 revela uma linha de células MDCK que foi adaptada para crescimento em cultura de suspensão ('MDCK 33 016 ', depositada como DSM ACC 2219) . De forma análoga, a referência 42 revela uma linha de células derivadas de MDCK que cresce em suspensão em cultura livre de soro ('B-702', depositada como FERM BP-7449) . A referência 43 revela células MDCK não tumorigénicas, incluindo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 10 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) e 'MDCK-SF103' (PTA-6503). A referência 44 revela linhas de células MDCK com alta suscetibilidade à infeção, incluindo células 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Quaisquer destas linhas de células MDCK podem ser utilizadas. A cultura para crescimento celular, e também o inoculo virai utilizado para começar a cultura, será preferencialmente livre de (isto é, terá sido testado para e dado um resultado negativo para contaminação por) vírus herpes simplex, vírus sincicial respiratório, vírus da parainfluenza 3, coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, reovírus, poliomavírus, birnavírus, circovírus, e/ou parvovírus [45]. A ausência de vírus herpes simplex é particularmente preferida.

Os vírus podem ser crescidos em células em suspensão [2 7, 46, 47] ou em cultura aderente. Numa forma de realização, as células podem ser adaptadas para crescimento em suspensão. Uma linha de células MDCK adequada que está adaptada para crescimento em cultura de suspensão é a MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219) . Em alternativa, a cultura de células microcarrier pode ser utilizada.

As linhas de células que suportam a replicação do vírus da gripe são preferencialmente crescidas em meio de cultura livre de soro e/ou meio livre de proteína. Um meio refere-se a um meio livre de soro no contexto da presente invenção na qual não há quaisquer aditivos do soro de origem humana ou animal. Livre de proteína é entendido como culturas nas quais a multiplicação das células ocorre com exclusão de proteínas, fatores de crescimento, outros aditivos proteicos e proteínas não serosas, mas podem opcionalmente incluir proteínas tais como tripsina ou outras proteases que podem ser necessárias para o crescimento virai. As células que crescem em tais culturas naturalmente contêm proteínas elas próprias.

As linhas de células que suportam a replicação do vírus da gripe são preferencialmente crescidas abaixo dos 37°C [48] (por exemplo, 30-36°C) durante a replicação virai. 11 0 método para propagar o vírus em células cultivadas geralmente inclui as etapas de inocular as células cultivadas com a estirpe a ser cultivada, cultivando as células infetadas durante um período de tempo desejado para a propagação do vírus, tal como, por exemplo, como determinado pelo título do vírus ou expressão do antígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e recolhendo o vírus propagado. As células cultivadas são inoculadas com um vírus (medido por PFU ou TCID50) para uma razão celular de 1:500 para 1:1, preferencialmente 1:100 para 1:5, mais preferencialmente 1:50 para 1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou é aplicado a uma monocamada das células, e o vírus é absorvido nas células durante, pelo menos, 60 minutos mas normalmente menos de 300 minutos, preferencialmente entre 90 e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferencialmente 28°C a 37°C. A cultura de células infetada (por exemplo, monocamadas) pode ser removida ou por congelamento-descongelamento ou por ação enzimática para aumentar o conteúdo virai dos sobrenadantes da cultura colhidos. Os fluidos colhidos são então ou inativados ou armazenados congelados. As células cultivadas podem ser infetadas a uma multiplicidade de infeção ("m.o.i.") de cerca de 0,0001 a 10, preferencialmente 0,002 a 5, mais preferencialmente a 0,001 a 2. Ainda mais preferencialmente, as células são infetadas a uma m.o.i de cerca de 0,01. As células infetadas podem ser colhidas 30 a 60 horas depois da infeção. Preferencialmente, as células são colhidas 34 a 48 horas depois da infeção. Ainda mais preferencialmente, as células são colhidas 38 a 40 horas depois da infeção. As proteases (tipicamente tripsina) são geralmente adicionadas durante a cultura das células para permitir a libertação virai, e as proteases podem ser adicionadas a qualquer fase adequada durante a cultura. De acordo com a invenção, os antibióticos podem ser evitados durante a cultura.

As vacinas contra a gripe são atualmente padronizadas por referência a níveis HA, tipicamente medidos por SRID. As 12 vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 pg de HA por estirpe, apesar de poderem ser utilizadas doses mais baixas (por exemplo, quando se usa um adjuvante). Doses fraccionárias tais como 1/2 (isto é, 7,5 pg HA por estirpe), 1/4 e l/g têm sido usadas [62,63], como têm doses mais elevadas (por exemplo, doses 3x ou 9x mais elevadas [49,50] ) . Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por estirpe de gripe, preferencialmente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Doses particulares incluem, por exemplo, cerca de 90, cerca de 45, cerca de 30, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 1,9, cerca de 1,5, etc. por estirpe. Os componentes das vacinas, kits e processos da invenção (por exemplo, os seus volumes e concentrações) podem ser selecionados para providenciar estas doses de antigeno nos produtos finais. 0 HA utilizado com a invenção pode ser um HA natural como encontrado num virus, ou pode ter sido modificado. Por exemplo, é sabido modificar-se HA para remover determinantes (por exemplo, regiões hiperbásicas, tais como à volta do local de clivagem entre HA1 e HA2).

Além de incluir hemaglutinina, as composições da invenção podem incluir proteínas adicionais de vírus da gripe. Por exemplo, incluirão tipicamente a glicoproteína neuraminidase. Também podem incluir uma proteína da matriz, tal como Ml e/ou M2 (ou um fragmento da mesma), e/ou nucleoproteína. ADN da célula hospedeira

Onde o vírus foi crescido numa linha de células então é prática comum minimizar a quantidade de ADN residual da linha de células na vacina final, de maneira a minimizar qualquer atividade oncogénica do ADN. Assim, a composição contém preferencialmente menos de 10 ng (preferencialmente menos de 1 ng, e mais preferencialmente menos de 100 pg) de ADN residual da célula hospedeira por dose, apesar de quantidades residuais do ADN da célula hospedeira poderem estar presentes. Em geral, o ADN da célula hospedeira que é desejável excluir das 13 composições da invenção é ADN que é mais longo do que 100 bp. A medição do ADN residual da célula hospedeira é agora um requisito regulador de rotina para biológicos e está dentro das capacidades normais da pessoa habilitada. O teste utilizado para medir o ADN será tipicamente um teste validado [51,52]. As caracteristicas de desempenho de um teste validado podem ser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, e é possível que as fontes de erro tenham sido identificadas. O teste terá sido geralmente testado para características tais como exatidão, precisão, especificidade. Assim que um teste tiver sido calibrado (por exemplo, contra quantidades padrão conhecidas do ADN da célula hospedeira) e testadas então podem ser realizadas de forma rotineira as medições quantitativas do ADN. Podem ser utilizadas três técnicas principais para a quantificação do ADN: métodos de hibridização, tais como Southern blots ou slot blots [53]; métodos de imunoensaio, tais como o sistema Threshold™ [54] ; e PCR quantitativa [55] . Estes métodos são todos familiares à pessoa habilitada, apesar das características precisas de cada método poderem depender da célula hospedeira em questão, por exemplo, a escolha de sondas para hibridização, a escolha dos iniciadores e/ou sondas para amplificação, etc. 0 sistema Threshold™ da Molecular Devices é um teste quantitativo para níveis de picogramas do ADN total, e tem sido utilizado para monitorizar níveis de ADN contaminante em biofarmacêuticos [54] . Um teste típico envolve a formação não específica de sequência de um complexo de reação entre uma proteína de ligação ADNss biotinilada, um anticorpo anti-ADNss conjugado com urease, e ADN. Todos os componentes do teste estão incluídos no Kit de Teste de ADN Total completo disponível do fabricante. Vários fabricantes comerciais oferecem ensaios de PCR quantitativos para detetar ADN residual da célula hospedeira, por exemplo, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. Uma comparação de um ensaio de hibridação quimioluminescente e o sistema Threshold™ de ADN total para medir a contaminação do ADN da célula 14 hospedeira de uma vacina virai humana pode ser encontrada na referência 56 . 0 ADN contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina utilizando um procedimento de purificação padrão, por exemplo, cromatograf ia, etc. A remoção do ADN residual da célula hospedeira pode ser aumentada por tratamento com nuclease, por exemplo, utilizando uma ADNase. Um método conveniente para reduzir a contaminação por ADN da célula hospedeira é revelado nas referências 57 e 58, envolvendo um tratamento em duas etapas, primeiro utilizando uma ADNase (por exemplo, Benzonase) , que pode ser utilizada durante o crescimento virai, e depois um detergente catiónico (por exemplo, CTAB), que pode ser utilizado durante a rotura do virião. 0 tratamento com um agente alquilante, tal como β-propiolactona, também pode ser utilizado para remover ADN da célula hospedeira, e vantajosamente pode também ser utilizado para inativar viriões [59] enquanto evita o uso de formaldeído.

As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutinina são preferidas, como o são vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,25 ml de volume. As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 50 pg de hemaglutinina são mais preferidas, como o são vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,5 ml de volume.

Adjuvantes

As composições da invenção podem vantajosamente incluir um adjuvante, que pode funcionar para aumentar as respostas imunes (humoral e/ou celular) despoletadas num paciente que recebe a composição. O uso de adjuvantes com vacinas conra a gripe foi descrito previamente. Nas referências 60 e 61, foi utilizado hidróxido de alumínio, e na referência 62, foi utilizada uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. A referência 63 também descreveu o uso de adjuvantes de sal de 15 alumínio. 0 produto FLUAD™ das Vacinas Chiron inclui uma emulsão óleo-em-água.

Adjuvantes que podem ser utilizados com a invenção incluem, mas não se limitam a: • Uma composição contendo mineral, incluído sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas dos mesmos). Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas "CAP" reveladas na referência 64) . Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os sais tomando qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.) . A adsorção a estes sais é preferida. As composições contendo mineral também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [65] . Adjuvantes de sal de alumínio são descritos com mais detalhe em baixo. • Agentes indutores de citosina (ver em mais detalhe embaixo) . • Saponinas [capítulo 22 da referência 101], que são um grupo heterólogo de glicosidas de esterol e glicosidas de triterpenóide que são encontradas na casca, folhas, caules, raízes e até nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. As saponinas da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foram amplamente estudadas como adjuvantes. A saponina também pode ser obtida comercialmente a partir da Smilax ornata (cerveja de raiz), Gypsophllla paniculata (véu de noiva), e Saponaria officianalis (raiz de sabonete). As formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, bem como formulações lipídicas, tais como ISCOMs. QS21 é comercializada como Stimulon™. As composições de saponina foram purificadas utilizando HPLC e RP-HPLC. Foram identificadas frações purificadas específicas utilizando estas técnicas, incluindo QS7, QS 17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C.

Preferencilmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na referência 66. É possível utilizar a fração A de Quil A junto com, pelo menos, um outro adjuvante [67] . As formulações de saponina também podem compreender um esterol, tal como colesterol [68]. As combinações de saponinas e 16 colesteróis podem ser utilizadas para formar partículas únicas chamadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capitulo 23 da referência 101]. Os ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipido tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser utilizada nos ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui uma ou mais de QuilA, QHA e QHC. Os ISCOMs são descritos adicionalmente nas referências 68-70. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional [71] . É possível utilizar uma mistura de, pelo menos, dois complexos ISCOM, cada complexo compreendendo essencialmente uma fração de saponina, onde os complexos são complexos ISCOM ou complexos da matriz de ISCOM [72] . Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseados na saponina pode ser encontrada nas referências 73 e 74. • Adjuvantes gordos (ver com mais detalhe em baixo). • Toxinas ribosilantes de ADP bacteriano (por exemplo, a enterotoxina "LT" termolábil da E.coli, a toxina "CT" da cólera, ou a toxina "pt" da tosse convulsa) e derivados desintoxicados dos mesmos, tais como as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [75]. O uso de Toxinas ribosilantes de ADP desintoxicadas como adjuvantes mucosais é descrito na referência 76 e como adjuvantes parentéricos na referência 77. • Bioadesivos e mucoadesivos, tais como microsferas de ácido hialurónico esterifiçadas [78] ou quitosano e seus derivados [79] . • Micropartículas (ist é, uma particular de -100 nm a -150 pm em diâmetro, mais preferencialmente -200 nm a -30 pm em diâmetro, ou -500 nm a -10 pm em diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um poli(ácido α-hidroxi), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polanidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactido-co-glocolido) a ser preferido, opcionalmente tratado para ter uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente 17 (por exemplo, com um detergente catiónico, tal como CTAB). • Lipossomas (Capítulos 13 e 14 da referência 101). Exemplos de formulações de lipossoma adequadas para uso como adjuvantes são descritos nas referências 80-82. • Emulsões óleo-em-água (ver com mais detalhe em baixo). • Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [83].

Tais formulações incluem ainda tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol [84] bem como éteres de polioxietileno alquilo ou tensoativos de éster em combinação com, pelo menos, um tensoativo não iónico adicional tal como um octoxinol [85]. Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados a partir do grupo seguinte: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxietileno-8-esteoril, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, éter de e polioxietileno-23-laurilo. • Péptidos muramilo, tais como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-di palmitoxipropilamida ("DTP-DPP", ou "Theramide™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2 ' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE") . • Uma preparação de proteossoma de proteína da membrana exterior preparada a partir de uma primeira bactéria Gram-negativa em combinação com uma preparação lipossacarídica derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que proteossoma de proteína da membrana exterior e preparações lipossacarídicas formam um complexo adjuvante não covalente estável. Tais complexos incluem "IVX-908", um complexo compreendido de membrana exterior de Neisseria meningitidis e lipossacarideos. Têm sido usados como adjuvantes para vacinas contra a gripe [86]. 18 • Metilinosina 5'-monofosfato ("MIMP") [87]. , tal como • Um composto de pirrolizidina polihidroxilado um com a seguinte fórmula: ----HO—H- -ΘΗ-----

RO N.

OH

CHaOH onde R é selecionado a partir do grupo que compreende hidrogénio, grupos acilo, alquilo (por exemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo e arilo, lineares ou ramificados, não substituídos ou substituídos, saturados ou insaturados, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo. Exemplos incluem, mas não se limitam a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc. • Uma gama inulina [89] ou derivado da mesma, tal como algamulina. • Um ligando CDld, tal como um α-glicosilceramida, por exemplo, α-galactosilceramida.

Estas e outras substâncias ativas adjuvantes são discutidas com mais detalhe nas referências 101 e 102.

As composições podem incluir dois ou mais de ditos adjuvantes. Por exemplo, podem vantajosamente incluir ambas emulsão óleo-em-água e um agente inductor de citosina, já que esta combinação melhora as respostas da citosina despoletadas pelas vacinas contra a gripe, tais como a resposta do interferão-γ, com a melhoria a ser muito maior do que observada quando tanto a emulsão como o agente são usados isoladamente.

Antígenos e adjuvantes numa composição estarão tipicamente misturados.

Onde uma vacina inclui um adjuvante, pode ser preparada de forma extemporânea, no momento da entrega. Assim, a invenção providencia kits incluindo os componentes antígeno e adjuvante prontos para mistura. O kit permite o adjuvante e o antígeno de serem mantidos separadamente até ao momento da utilização. Os componentes são separados fisicamente um do outro dentro do 19 kit, e esta separação pode ser conseguida de várias maneiras. Por exemplo, os dois componentes podem estar em dois recipientes separados, tais como frascos para injetáveis. Os conteúdos dos dois frascos para injetáveis podem depois ser misturados, por exemplo, removendo os conteúdos de um frasco e adicionando-os ao outro frasco, ou removendo separadamente os conteúdos de ambos os frascos e misturando-os num terceiro recipiente. Num arranjo preferido, um dos componentes do kit está numa seringa e o outro num recipiente, tal como um frasco para injetáveis. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir os seus conteúdos no segundo recipiente para mistura, e a mistura pode depois ser retirada para a seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem então ser administrados a um paciente, tipicamente através de uma nova agulha estéril. Acondicionar um componente numa seringa elimina a necessidade de utilizar uma seringa separada para a administração ao paciente. Num outro arranjo preferido, os dois componentes do kit são detidos em conjunto mas separadamente na mesma seringa, por exemplo, uma seringa de dupla câmara, tais como aguelas reveladas nas referências 90-97 etc. Quando a seringa é ativada (por exemplo, durante a administração a um paciente) então os conteúdos das duas câmaras são misturados. Este arranjo evita a necessidade da etapa de mistura separada no momento do uso. Adjuvantes de emulsão óleo-em-água

Verificou-se que as emulsões óleo-em-água eram particularmente adequadas para uso em adjuvantar vacinas contra o vírus da gripe. São conhecidas várias de tais emulsões, e estas tipicamente incluem, pelo menos, um óleo e, pelo menos, um tensoativo, sendo o óleo(s) e tensoativo(s) biodegradávis (metabolisáveis) e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão são geralmente inferiores a 5 ym em diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro sub-micrónico, com estes pequenos tamanhos a serem conseguidos com um microfluidisador para providenciar emulsões estáveis. As gotículas com um tamanho inferior a 220 nm são preferidas já que podem ser sujeitas a esterilização por filtração. 20 A invenção pode ser utilizada com óleos tais como aqueles de fonte animal (tais como peixe) ou vegetal. Fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e azeite, os mais vulgarmente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo, obtido a partir do feijão de jojoba. Óleos de sementes incluem óleo de açafrão, óleo de caroço de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e afins. No grupo dos grãos, o óleo de milho é o mais prontamente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereal tais como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, tritical e afins também podem ser utilizados. Ésteres de ácido gordo com 6-10 carbono de glicerol e 1,2-propanediol, enquanto não ocorrem naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados começando a partir da noz e óleos de sementes. As gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, por isso, ser utilizados na prática desta invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros de fontes animais são bem conhecidos na arte. A maior parte dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser rapidamente recuperados. Por exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia, tal como espermacete, exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser utilizados aqui. Um número de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno com 5-carbonos e são geralmente referenciados como terpenóides. 0 óleo de fígado de tubarão contém terpenóides ramificados, insaturados conhecidos como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é particularmente preferido aqui. O esqualano, o análogo saturado do esqualeno, é também um óleo preferido. Óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos 21 por métodos conhecidos na arte. Outros óleos preferidos são os tocoferóis (ver em baixo). Podem ser utilizadas misturas de óleos.

Os tensoativos podem ser classificados pelo seu 'HLB' (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensoativos preferidos da invenção têm um HLB de, pelo menos, 10, preferencialmente pelo menos 15, e mais preferencialmente pelo menos 16. A invenção pode ser utilizada com tensoativos incluindo, mas não limitado a: tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (vulgarmente referidos como os Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o marca comercial DOWFAX™, tais como copolímeros de bloco linear EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etoxi repetidos (oxi-1,2-etanediil), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxetanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tais como fosfatidilcolina (lecitina); derivados de éteres de polioxietileno gordo conhecidos como tensoativos Brij), tais como trietileneglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de sorbitano (vulgarmente conhecidos como os SPANs), tais como sorbitano trioleato (Span 85) e sorbitano monolaurato. Tensoativos preferidos para incluir na emulsão são Tween 80 (polioxietileno sorbitano monooleato), Span 85 (sorbitano trioleato), lecitina e Triton X-100. Como mencionado anteriormente, os detergentes tais como Tween 80 podem contribuir para a estabilidade térmica observada nos exemplos em baixo.

Podem ser utilizadas misturas de tensoativos, por exemplo, misturas Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, tal como polioxietileno sorbitano monooleato (Tween 80), e um octoxinol, tal como t-octilfenoxipol-ietoxietanol (Triton X-100), também é adequada. Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol. 22

Quantidades preferidas de tensoativos (% por peso) são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como Tween 80) 0,01 a 1%, em particular cerca de 0,1 %; octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (tais como Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1 %, em particular 0, 005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (tais como laureth 9) 0,1 a 20 %, preferencialmente 0,1 a 10 % e em particular 0,1 a 1 % ou cerca de 0,5%.

Adjuvantes de emulsão óleo-em-água específicos úteis com a invenção incluem, mas não se limitam a: • Uma emulsão submicrónica de esqualeno, Tween 80, e Span 85. A composição da emulsão por volume pode ser cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de pesos, estas razões tornam-se 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de Span 85. Este adjuvante é conhecido por 'MF59' [98-100], como descrito com mais detalhe no Capítulo 10 da referência 101 e capítulo 12 da referência 102. A emulsão MF59 inclui vantajosamente iões de citrato, por exemplo, 10 mM tampão de citrato de sódio. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a razão em peso de esqualeno:tocoferol é preferencialmente <1 já que esta providencia uma emulsão mais estável. O esqualeno e Tween 80 podem estar presentes numa razão em volume de cerca de 5:2. Uma tal emulsão pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS para dar uma solução a 2%, depois misturando 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-a-tocof erol e 5 ml de esqualeno), microfluidisando depois a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo submicrónicas, por exemplo, com um diâmetro médio de entre 100 e 250 nm, preferencialmente cerca de 180nm. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) . A emulsão pode também 23 incluir um 3d-MPL (ver em baixo). A emulsão pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão compreendendo um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um α-tocoferol sucinato) . A emulsão pode incluir estes três componentes a uma razão em massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 pg/ml de polissorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 e 100 pg/ml de α-tocoferol sucinato), e estas concentrações deveriam incluir qualquer contribuição destes componentes dos antigenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver em baixo). A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxâmero 401 ("Pluronic™ L121") . A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veiculo de entrega útil para dipéptidos muramilo, e tem sido utilizada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [103] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80) . Também pode ser utilizada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [104] (5% de esqualano, 1,25% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). A microfluidisação é preferida. • Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um tensoativo de éter de polioxietileno aquilo hidrofílico não iónico (por exemplo, éter de polioxietileno (12) cetostearilo) e um tensoativo hidrofóbico não iónico (por exemplo, um éster sorbitano ou éster manida, tal como sorbitano monoleato ou ' Span 80') . A emulsão é preferencialmente termorreversivel e/ou tem, pelo menos, 90% da goticulas de óleo (por volume) com um tamanho inferior a 200 nm [105] . A emulsão podem também incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotetor (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilmaltosida e/ou sacarose); e/ou uma alquilpoliglicosida. Tais emulsões podem ser liofilizadas. • Uma emulsão tendo de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipido, e 0,05-5% de um tensoativo não iónico. Como 24 descrito na referência 106, componentes fosfolípidos preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Tamanhos submicrónicos de gotículas são vantajosos. • Uma emulsão óleo-em-água submicrónica de um óleo não metabolizável (tal como óleo mineral leve) e, pelo menos, um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80) . Aditivos podem ser incluídos, tais como QuilA saponina, colesterol, um conjugado saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 107, produzido por adição de amina alifática para desacilsaponina por via do grupo carboxilo do ácido glucurónico), brometo de dimetiidioctadecilamónio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanediamina. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico, e um tensoativo hidrofílico não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero em bloco polioxietileno-polioxipropileno) [108] . • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico e um tensoativo lipofílico não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero em bloco polioxietileno-polioxipropileno) [108]. • Uma emulsão na qual uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estão associados como micelas helicais [109].

As emulsões podem ser misturadas com antígeno de forma extemporânea, no momento da entrega. Assim, o adjuvante e antígeno podem ser mantidos separadamente numa vacina embalada ou distribuída, pronta para formulação final no momento do uso. O antígeno estará geralmente na forma aquosa, de tal maneira que a vacina é finalmente preparada misturando dois líquidos. A razão em volume dos dois líquidos para misturar pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5) mas é geralmente cerca de 1:1.

Depois do antígeno e adjuvante terem sido misturados, o antígeno da hemaglutinina permanecerá geralmente em solução 25 aquosa mas pode distribuir-se à volta da interface óleo/água. Em geral, pouca, se alguma, hemaglutinina entrará na fase oleosa da emulsão.

Onde uma composição inclui um tocoferol, qualquer dos α, β, γ, δ, ε ou ξ tocoferóis pode ser utilizado, mas α-tocoferóis são preferidos. 0 tocoferol pode tomar diversas formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Sais incluem sais orgânicos, tais como sucinato, acetato, nicotinato, etc. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ambos ser utilizados. Os tocoferóis são vantajosamente incluídos em vacinas para uso em pacientes mais idosos (por exemplo, com 60 anos de idade ou mais velhos) porque foi reportado que a vitamina E tem um efeito positivo na resposta imune neste grupo de pacientes [110]. Também têm propriedades antioxidantes que podem ajudar a estabilizar as emulsões [111]. Um α-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol, e o sal preferido deste tocoferol é o sucinato. Verificou-se que o sal sucinato coopera com ligandos relacionados com TNF in vivo. Além disso, o α-tocoferol sucinato é conhecido por ser compatível com vacinas contra a gripe e por ser um conservante útil como uma alternativa a compostos mercúricos [8] . Agentes indutores de citosina

Os agentes indutores de citosina para inclusão nas composições da invenção são capazes, quano administrados a um paciente, de despoletar no sistema imune a libertação de citosinas, incluindo interferões e interleucinas. As respostas da citosina são conhecidas por estarem envolvidas nas fases iniciais e decisivas da defesa do hospedeiro contra a infeção pela gripe [112] . Os agentes preferidos podem despoletar a libertação de um ou mais de: interferão-y; interleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-a; TNF-p; e GM-CSF. Os agentes preferidos provocam a libertação de citosinas associadas com uma resposta imune de tipo Thl, por exemplo, interferão-y, TNF-a, interleucina-2. A estimulação de ambos interferão-y e interleucina-2 é preferida.

Como um resultado de receber uma composição da invenção, por 26 isso, um paciente que tem células T que, quando estimuladas com um antigeno da gripe, libertará as citosina(s) desejadas de uma maneira específica de antigeno. Por exemplo, as células T purificadas do seu sangue libertarão y-interferão quando expostas in vitro a hemaglutinina do vírus da gripe. Métodos para medir tais respostas em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são conhecidos na arte, e incluem ELISA, ELISPOT, citometria de fluxo e PCR em tempo real. Por exemplo, a referência 113 reporta um estudo no qual respostas imunes mediadas por células T específicas de antigeno contra toxóide do tétano, especificamente respostas y-interferão, foram monitorizadas, e verificou-se que ELISPOT era o método mais sensível em discriminar respostas induzidas por TT específicas de antigeno das respostas espontâneas, mas que a deteção da citosina intracitoplásmica por citometria de fluxo foi o método mais eficiente para detetar efeitos re-estimulantes.

Agentes indutores de citosina adequados incluem, mas não se limitam a: • Um oligonucleotídeo imunoestimulador, tal como um contendo um motivo CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a uma guanosina), ou um ARN de cadeia dupla, ou um oligonu cleotídeo contendo uma sequência palindrómica, ou um oligonucleotídeo contendo uma sequência poli(dG). • 3-0-deacilado monofosforilo lípido A ('3dMPL', também conhecido por 'MPL™') [114-117]. • Um composto imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R-837") [118,119], Resiquimod ("R-848") [120], e seus análogos; e sais dos mesmos (por exemplo, os sais hidrocloreto) . Mais detalhes acerca de imidazoquinolinas imunoestimuladoras podem ser encontrados nas referências 121 a 125. • Um composto tiosemicarbazona, tais como aqueles revelados na referência 126. Métodos de formulação, fabrico, e classificação de compostos ativos estão também descritos na referência 126. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na 27 estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citosinas, tais como TNF-a. • Um composto triptantrina, tal como aquele revelado na referência 127. Métodos de formulação, fabrico, e classificação de compostos ativos estão também descritos na referência 127. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citosinas, tais como TNF-a. • Um análogo nucleosideo, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

O

e pró-fármacos dos mesmos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos revelados nas referências 128 a 130; (f) um composto tendo a fórmula:

em que:

Rl e R-2 são cada independentemente H, halo, -NRaRj~l, -OH, C]__g alcoxi, C]__g alcoxi substituído, heterociclilo, heterociclilo substituído, Cg_]_Q arilo, Cg_io arilo substituído, C]__g alquilo, ou C]__g alquilo substituído; R3 está ausente, H, C]__g alquilo, C]__g alquilo substituído, Cg_10 arilo, Cg_]_Q arilo substituído, heterociclilo, ou heterociclilo substituído; R4 e R5 são cada independentemente H, halo, heterociclilo, heterociclilo substituído, -C(0)-Rq, C]__g alquilo, C]__g alquilo substituído, ou ligados juntos para formar um anel com 5 membros como em R4-5: 28

R4-5 r9 sendo a ligação conseguida nas ligações indicadas por um -χ.···\ Xl e X2 são cada independentemente N, C, 0, ou S;

Rg é H, halo, -OH, C]__5 alquilo, C2-g alquenilo, C2-g alquinilo, -OH, -NRaRjg, -(CH2)n-O-Rc, -0-(Ci_g alquilo), -S(0)pRe, ou -C(0)-Rd; R9 é H, C]_-g alquilo, C]_-g alquilo substituído, heterociclilo, heterociclilo substituído ou Rga, em que Rga é:

R10 ^11 sendo a ligação conseguida na ligaçao indicada por um AAA RlO e Rn são cada independentemente H, halo, C]_-g alcoxi, Ci_g alcoxi substituído, - NRaRjg, ou -OH; cada Ra e Rp> é independentemente H, C]__g alquilo, C]__g alquilo substituído, —C (0) Rç[, Cg_]_o arilo; cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, C]__g alquilo, ou C]__g alquilo substituído; cada R^ é independentemente H, halo, C]__g alquilo, Ci_g alquilo substituído, C]__g alcoxi, C]__g alcoxi substituído, -NH2, -NH (C]__g alquilo), -NH(C]__g alquilo substituído), -N(C]__g alquilo) 2r _N(Ci-g alquilo substituído) 2r Cg_]_Q arilo, ou heterociclilo; cada Re é independentemente H, C]__g alquilo, C]__g alquilo substituído, Cg_]_o arilo, Cg_]_g arilo substituído, heterociclilo, ou heterociclilo substituído; cada Rf é independentemente H, Cq_g alquilo, Cq_g alquilo substituído, -C(0)Rd, fosfato, difosfato, ou trifosfato; cada n é independentemente 0, 1, 2, ou 3; cada p é independentemente 0, 1, ou 2; ou ou (g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer de (a) a (f) , um tautómero de qualquer de (a) a (f), ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautómero. 29 • Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [131]. • Compostos revelados na referência 132, incluindo: compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona, compostos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos de benzociclodiona, compostos de aminoazavinilo, compostos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [133,134], compostos de hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos de isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona, compostos de pirrolo [135], compostos de antraquinona, compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos de pirazalopirimidina, e compostos de benzazol [136]. • Um polímero polioxidónio [137,138] ou outro derivado N-oxidizado polietileno-piperazina. • Compostos revelados na referência 139. • Um derivado de aminoalquilo glucosaminida fosfato, tal como RC-529 [140,141]. • Um ligando CDld, tal como uma a-glicosilceramida [142-149] (por exemplo, α-galactosilceramida) , a-glicosilceramidas contendo fitosfingosina, OCH, KRN7000 [(2S, 3S, 4R)-1-0-(α-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilami no)-1,3,4-octadecanetriol], CRONY-101, 3"-0-sulfogalactosilceramida, etc. • Um fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] ("PCPP") como descrito, por exemplo, nas referências 150 e 151. • Pequenas moléculas imunopotenciadoras (SMIPs) tais como: N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-d iamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-ΙΗ-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-etil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinoli na-2,4-diamina N2-meti1-1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quino lina-2,4-diamina 1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4- 30 diamina N2-butil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-d iamina N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinol ina-2,4-diamina N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-pentil-lH-imidazo[4,5-c]quino lina-2,4-diamina N2-meti1-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina 1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-lH-imidazo[4, 5-c]quin olina-4-amina 1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina 2- [[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2-il](metil)amino]etanol 2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4, 5-c]quinolina-2-il](metil)amino]etil acetato 4-amino-l-(2-metilpropil)-1, 3-dihdro-2H-imidazo[4,5-c]quino lina-2-ona N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-N2-meti1-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-im idazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina -{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolina -1-il}-2-metilpropan2-ol 1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-l-il] -2-metilpropan-2-ol N4,N4-dibenzil-l-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-lH-imid azo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.

Os agentes indutores de citosina para uso na presente invenção podem ser moduladores e/ou agonistas de recetores de tipo toll 31 (TLR) . Por exemplo, podem ser agonistas de uma ou mais das proteínas humanas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, e/ou TLR9. Agentes preferidos são agonistas de TLR7 (por exemplo, imidazoquinolinas) e/ou TLR9 (por exemplo, CpG oligonucleotídeos). Estes agentes são úteis para ativar vias de imunidade inata. 0 agente indutor de citosina pode ser adicionado à composição em várias fases durante a sua produção. Por exemplo, pode estar dentro de uma composição de antígeno, e esta mistura pode depois ser adicionada a uma emulsão óleo-em-água. Como uma alternativa, pode estar dentro de uma emulsão óleo-em-água, em cujo caso o agente pode ser ou adicionado aos componentes da emulsão antes da emulsificação, ou pode ser adicionado à emulsão depois da emulsif icação. De modo análogo, o agente pode ser conservado dentro das goticulas da emulsão. A localização e distribuição do agente indutor de citosina dentro da composição final dependerá das suas propriedades hidrofilicas/lipofilicas, por exemplo, o agente pode estar localizado na fase aquosa, na fase oleosa, e/ou na interface óleo-água. 0 agente indutor de citosina pode ser conjugado com um agente separado, tal como um antígeno (por exemplo, CRM197). Uma revisão geral de técnicas de conjugação para pequenas moléculas é providenciada na referência 152. Como uma alternativa, os adjuvantes podem estar associados não covalentemente com agentes adicionais, tais como por meio de interações hidrofóbicas ou iónicas.

Dois agentes indutores de citosinas preferidos são (a) oligonucleotídeos imunoestimuladores e (b) 3dMPL.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores podem incluir modificações/análogos nucleotídeos tais como modificações fosforotioato e podem ser de cadeia dupla ou (exceto para o ARN) de cadeia simples. As referências 153, 154 e 155 revelam possíveis substituições análogas, por exemplo, substituição de guano si na com 2' -deoxi-7-deazaguanosina . 0 efeito adjuvante de 32 oligonucleotídeos CpG é ainda discutido nas referências 156-161. Uma sequência CpG pode estar dirigida a TLR9, tal como no motivo GTCGTT ou TTCGTT [162] . A sequência CpG pode ser especifica para induzir uma resposta imune Thl, tal como um CpG-A ODN (oligodeoxinucleotideo) , ou pode ser mais especifica para induzir uma resposta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidas nas referências 163-165. Preferencialmente, o CpG é um CpG-A ODN. Preferencialmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de maneira que a extremidade 5' está acessível para reconhecimento do recetor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleotídeo CpG podem ser anexadas às suas extremidades 3' para formar "imunómeros". Ver, por exemplo, as referências 162 e 166-168. Um adjuvante CpG útil é CpG7909, também conhecido por ProMune™ (Grupo Farmacêutico Coley, Inc.). Como uma alternativa, ou em adição, a utilizar sequências CpG, podem ser utilizadas sequências TpG [169] . Estes oligonucleotídeos podem ser livres de motivos CpG não metilados. 0 oligonucleotídeo imunoestimulador pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, pode compreender mais de um nucleotídeo timidina consecutivo (por exemplo, TTTT, como revelado na referência 169), e/ou pode ter uma composição de nucleotídeo com >25% de timidina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Por exemplo, pode compreender mais de um nucleotídeo citosina consecutivo (por exemplo, CCCC, como revelado na referência 169), e/ou pode ter uma composição de nucleotídeo com >25% de citosina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Estes oligonucleotídeos podem ser livres de motivos CpG não metilados.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores compreenderão tipicamente pelo menos 20 nucleotídeos. Podem compreender menos de 100 nucleotídeos. O 3dMPL (também conhecido por 3 de-O-acilado monofosforilo lípido A ou 3-0-desacil-4'-monofosforilo lípido A) é um adjuvante em cuja posição 3 da glucosamina da extremidade 33 redutora em monofosforilo lípido A foi desacilada. 0 3dMPL foi preparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente semelhante ao lípido A mas carece de um grupo fosforilo lábil perante ácidos e um grupo acilo lábil perante bases. Ativa células da linhagem monócito/macrófago e estimula a libertação de várias citosinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-α e GM-CSF (ver também a referência 170). A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 171. 3dMPL pode tomar a forma de uma mistura de moléculas relacionadas, variando na sua acilação (por exemplo, tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias de acilo, que podem ser de comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos de glucosamina (também conhecidos por 2-deoxi-2-amino-glicose) são N-acilados nos seus carbonos na posição 2 (isto é, nas posições 2 e 2'), e há também 0-acilação na posição 3'. O grupo anexado ao carbono 2 tem fórmula -NH-C0-CH2-CR1R1,. O grupo anexado ao carbono 2' tem fórmula -NH-CO-CH2-CR3R3'. o grupo anexado ao carbono 3' tem fórmula -0-C0-CH2-CR3R3'. uma estrutura representativa é:

Os grupos R1, R2 e R3 são cada independentemente -(CH2)n-CH3· O valor de n está preferencialmente entre 8 e 16, mais preferencialmente entre 9 e 12, e é mais preferencialmente 10. Os grupos Έ0-', R2 , e R3, podem cada independentemente ser: (a) -H; (b) -OH; ou (c) -O-CO-R4, onde R4 é quer -H ou - (CH2) m-CH3, em que o valor de m está preferencialmente entre 8 e 16, e é 34 mais preferencialmente 10, 12 ou 14. Na posição 2, m é preferencialmente 14. Na posição 2', m é preferencialmente 10. Na posição 3', m é preferencialmente 12. Os grupos r!', r2' e R3 ' são, assim, preferencialmente -grupos O-acilo de ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico ou ácido hexadecanóico. Quando todos os R1', R2' e R3' sao -H então o 3dMPL tem apenas cadeias acilo (uma em cada das posições 2, 2' e 3'). Quando apenas dois de R^, R2' e R3, são -H então o 3dMPL pode ter 4 cadeias acilo. Quando apenas um de R1,, R2 , e R3 A é -H então o 3dMPL pode ter 5 cadeias acilo. Quando nenhum de R^, R2, e R3, é -H então o 3dMPL pode ter 6 cadeias acilo. O adjuvante 3dMPL utilizado de acordo com a invenção pode ser uma mistura destas formas, com desde 3 a 6 cadeias acilo, mas é preferido que inclua 3dMPL com 6 cadeias acilo na mistura, e em particular para assegurar que a forma da cadeia hexaacilo constitua, pelo menos, 10% por peso do 3dMPL total, por exemplo, á20%, á30%, á40%, ^50% ou mais. Verificou-se que 3dMPL com 6 cadeias acilo era a forma mais ativa de adjuvante.

Assim, a forma mais preferida de 3dMPL para inclusão em composições da invenção é: 35

Onde 3dMPL é utilizado na forma de uma mistura então as referências a quantidades ou concentrações de 3dMPL em composições da invenção referem-se às espécies 3dMPL combinadas na mistura.

Em condições aquosas, o 3dMPL pode formar agregados micelados ou partículas com diferentes tamanhos, por exemplo, com um diâmetro <150 nm ou >500 nm. Um ou ambos destes pode ser utilizado com a invenção, e as melhores partículas podem ser selecionadas por ensaio de rotina. Partículas mais pequenas (por exemplo, pequenas o suficiente para dar uma suspensão aquosa clara de 3dMPL) são preferidas para uso de acordo com a invenção por causa da sua atividade superior [172]. As partículas preferidas têm um diâmetro médio inferior a 220 nm, 36 mais preferencialmente inferior a 200 nm ou inferior a 150 nm ou inferior a 120 nm, e podem mesmo ter um diâmetro médio inferior a 100 nm. Na maioria dos casos, contudo, o diâmetro médio não será inferior a 50 nm. Estas partículas são pequenas o suficiente para serem adequadas para esterilização por filtração. O diâmetro das partículas pode ser avaliado pela técnica de rotina de difusão dinâmica da luz, que revela um diâmetro de partícula médio. Onde se diz que uma partícula tem um diâmetro de x nm, haverá geralmente uma distribuição de partículas à volta desta média, mas pelo menos 50% por número (por exemplo, >60%, >70%, >80%, >90%, ou mais) das partículas terá um diâmetro dentro do intervalo x±25%. 3dMPL pode ser utilizado com vantagem em combinação com uma emulsão óleo-em-água. Substancialmente todo o 3dMPL pode estar localizado na fase aquosa da emulsão. O 3dMPL pode ser utilizado isoladamente, ou em combinação com um ou mais compostos adicionais. Por exemplo, é sabido utilizar 3dMPL em combinação com a QS21 saponina [173] (incluindo numa emulsão óleo-em-água [174]), com oligonucleotídeo imunoestimulador, com ambos QS21 e um oligonucleotídeo imunoestimulador, com fosfato de alumínio [175], com hidróxido de alumínio [176], ou com ambos fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

Adjuvantes gordos

Os adjuvantes gordos que podem ser utilizados com a invenção incluem as emulsões óleo-em-água descritas anteriormente, e incluem também, por exemplo: • Um composto da fórmula I, II ou III, ou um sal do mesmo: 37

37 I II III /- T HO—P=0 1 0 -R1—Y^ O D=Í>-OH ( O J&A, ? ? a«-|í—«“ n" --J» tf1 V <j> !Ç>«e (»«»· V V HÍ <m&r e1-( (Wrfs y~%. (Wfc jft1 > 1 β» \y Tx1, x r V H

Como definido na referênciac 177, tal como 'ER 803058 ', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 ou 'ER 804057', por exemplo: o

1

Derivados de lipido A da Escherichia coli tais como OM-174 (descrito nas referências 178 e 179). • Uma formulação de um lipido catiónico e um (normalmente 38 neutro) co-lípido, tal como aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-pro-panaminio brometo-difitanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin™") ou aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanaminio brometo-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE"). Formulações que contêm sais de (6)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradecene iloxi)-1-propanaminio são preferidas [180]. • 3-O-deacilado monofosforilo lípido A (ver em baixo). • Compostos que contêm lipidos ligados a uma estrutura principal acíclica contendo fosfato, tal como o TLR4 antagonista E5564 [181,182]:

Adjuvantes de sal de alumínio

Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, podem ser utilizados. Estes nomes são convencionais, mas são utilizados apenas por conveniência, já que nenhum é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, ver capítulo 9 da referência 101) . A invenção pode utilizar qualquer do "hidróxido" ou "fosfato," adjuvantes que estão geralmente em uso como adjuvantes.

Os adjuvantes conhecidos por "hidróxido de alumínio" são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são normalmente, pelo menos, parcialmente cristalinos. O oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AIO(OH), pode ser distinguido de outros compostos de alumínio, tais como hidróxido de alumínio Al(OH)3, por espectroscopia infra-vermelha (IR), em particular pela 39 presença de uma banda de adsorção a 1070 cm-1 e um forte ombro a 3090-3100cm“l [capítulo 9 da referência 101]. O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio é refletido pela largura da banda de difração a meia altura (WHH) , com partículas fracamente cristalinas a mostrar uma linha mais larga devido a tamanhos de cristais mais pequenos. A área da superfície aumenta à medida que aumenta WHH, e verificou-se que os adjuvantes com maiores valores de WHH têm maior capacidade para adsorção do antígeno. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como observada em micrográficos eletrónicos de transmissão) é típica para os adjuvantes de hidróxido de alumínio. O pi dos adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente cerca de 11, isto é, o próprio adjuvante tem uma carga de superfície positiva no pH fisiológico. As capacidades de adsorção de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 foram reportadas para adjuvantes de hidróxido de alumínio.

Os adjuvantes conhecidos por "fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, também contendo frequentemente uma pequena quantidade de sulfato (ito é, sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Podem ser obtidos por precipitação, e as condições da reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição do fosfato pelo hidroxilo no sal. Os hidroxifosfatos geralmente têm uma razão molar PO4/AI entre 0,3 e 1,2. Os hidroxifosfatos podem ser distinguidos do AIPO4 estrito pela presença de grupos hidroxilo. Por exemplo, uma banda no espectro IV a 3164cm_l (por exemplo, quando aquecido a 200°C) indica a presença de hidroxilos estruturais [capítulo 9 da referência 101] A razão molar PO4/AI3+ de um adjuvante de fosfato de alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2, preferencialmente entre 0,8 e 1,2, e mais preferencialmente 0, 95±0,1. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo, particularmente para os sais hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com uma razão molar PO4/AI entre 0,84 e 0,92, incluíd a 0,6 mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio será 40 geralmente particulado (por exemplo, morfologia tipo placa como observado nos micrográficos eletrónicos de transmissão). Diâmetros tipicos de partículas estão no intervalo 0,5-20 pm (por exemplo, cerca de 5-10 pm) após gualquer adorção de antigeno. As capacidades de adsorção de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de A1+++ a pH 7,4 foram reportadas para adjuvantes de fosfato de alumínio. O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio está inversamente relacionado com o grau de substituição do fosfato pelo hidroxilo, e este grau de substituição pode variar dependendo das condições da reação e concentração dos reagentes utilizados para preparar o sal por precipitação. O PZC é também alterado modificando a concentração dos iões de fosfato livres em solução (mais fosfato = mais PZC acídico) ou adicionando um tampão, tal como um tampão de histidina (que torna o PZC mais básico) . Os fosfatos de alumínio utilizados de acordo com a invenção terão geralmente um PZC de entre 4,0 e 7,0, mais preferencialmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7. Suspensões de sais de alumínio utilizadas para preparar composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um tampão fosfato ou histidina ou um Tris) , mas isto não é sempre necessário. As suspensões são preferencialmente estéreis e livres de pirogénio. Uma suspensão pode incluir iões de fosfato aquosos livres, por exemplo, presentes numa concentração entre 1,0 e 20 mM, preferencialmente entre 5 e 15 mM, e mais preferencialmente cerca de 10 mM. As suspensões também podem compreender cloreto de sódio. A invenção pode utilizar uma mistura de ambos hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio [62] . Neste caso, pode haver mais fosfato de alumínio do que hidróxido de alumínio, por exemplo, uma razão em peso de, pelo menos, 2:1, por exemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc. A concentração de A1+++ numa composição para administração a um paciente é preferencialmente inferior a 10 mg/ml por exemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. 41

Um intervalo preferido é entre 0,3 e 1 mg/ml. Um máximo de 0,85 mg/dose é preferido.

Além de incluir um ou mais adjuvantes de sal de aluminio, o componente adjuvante pode incluir um ou mais adjuvantes adicionais ou agentes imunoestimuladores. Tais componentes adicionais inclue, mas não se limitam a: um adjuvante 3-O-deacilado monofosforilo lípido A ('3d-MPL'); e/ou uma emulsão óleo-em-água. 3d-MPL também tem sido referido como 3 de-O-acilado monofosforilo lípido A ou como 3-0-desacil-4'-monofosforilo lípido A. O nome indica que a posição 3 da glucosamina da extremidade redutora no monofosforilo lípido A é desacilada. Foi preparada a partir de um mutante sem heptose de S. minnesota, e é quimicamente semelhante ao lípido A mas carece de um grupo fosforilo lábil perante ácidos e um grupo acilo lábil perante bases. Ativa células da linhagem monócito/macrófago e estimula a libertação de várias citosinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF. A preparação de 3d-MPL foi originalmente descrita na referência 171, e o produto tem sido fabricado e vendido pela Corixa Corporation sob o nome MPL™. Detalhes adicionais podem ser encontrados nas referências 114 a 117.

Composições farmacêuticas

As composições da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Normalmente incluem componentes além dos antígenos, por exemplo, tipicamente incluem um ou mais veículo (s) e/ou excipiente(s) farmacêuticos. Uma discussão completa de tais componentes está disponível na referência 183. As composições estarão geralmente na forma aquosa. A composição não inclui material mercúrico. Pode incluir um conservante tal como 2-fenoxietanol, mas as vacinas livres de conservantes são mais preferidas.

Para controlar a tonicidade, é preferido incluir um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. O cloreto de sódio (NaCl) é preferido, que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, 42 fosfato de dihidrogénio de potássio, fosfato de dissódio dehidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.

As composições terão geralmente uma osmolalidade de entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferencialmente entre 240-360 mOsm/kg, e cairão mais preferencialmente no intervalo de 290-310 mOsm/kg. A osmolalidade foi previamente reportada como não tendo um impacto na dor causada pela vacinação [184], mas mantendo a osmolalidade neste intervalo é, ainda assim, preferido.

As composições podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampão sucinato; um tampão histidina; ou um tampão citrato. Os tampões estarão tipicamente incluídos no intervalo 5-20 mM. O tampão pode estar na fase aquosa da emulsão. O pH de uma composição estará geralmente entre 5, 0 e 8, 1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo, 6,5 e 7,5, ou entre 7, 0 e 7, 8 . Um processo da invenção pode, assim, incluir uma etapa de ajustar o pH do grosso da vacina antes do acondicionamento. A composição é estéril. A composição é preferencialmente livre de glúten. A vacina é livre de antibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (isto é, uma composição 'multidose'). Os arranjos multidose normalmente incluem um conservante na vacina. Para evitar esta necessidade, uma vacina pode ser contida num recipiente tendo um adaptador assético para remoção do material.

As vacinas contra a gripe são tipicamente administradas num volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, apesar de meia dose (isto é, cerca de 0,25 ml) poder ser administrada a crianças, e doses unitárias serão selecionadas em conformidade, por exemplo, uma dose unitária para dar uma dose de 0,5 ml para administração a um paciente.

Acondicionamento das composições ou components do kit 43

Os processos da invenção podem incluir uma etapa na qual a vacina é colocada num recipiente, e em particular num recipiente para distribuição para uso por médicos. Após acondicionamento em tais recipientes, o recipiente não é refrigerado.

Recipientes adequados para as vacinas incluem frascos para injetáveis, vaporizadores nasais e seringas descartáveis, que deveriam ser estéreis.

Onde uma composição/componente está localizado num frasco para injetáveis, o frasco é preferencialmente feito de um vidro ou material plástico. 0 frasco é preferencialmente esterilizado antes da composição lhe ser adicionada. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são preferencialmente selados com uma rolha livre de látex, e a ausência de látex em todo o material embalador é preferida. 0 frasco pode incluir uma única dose da vacina, ou pode incluir mais do que uma dose (um frasco 'multidose') , por exemplo, 10 doses. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma cápsula de fecho (por exemplo, uma fechadura Luer) adaptada de tal maneira que que uma seringa pré-enchida pode ser inserida na cápsula de fecho, os conteúdos da seringa podem ser expelidos para o frasco, e os conteúdos do frasco podem ser removidos de novo para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, pode então ser anexada uma agulha e a composição pode ser administrada a um paciente. A cápsula de fecho está preferencialmente localizada dentro de um selo ou cobertura, de tal maneira que o selo ou cobertura tem de ser removido antes de se poder aceder à cápsula de fecho. Um frasco pode ter uma cápsula de fecho que permite a remoção assética dos seus conteúdos, particularmente para frascos multidose.

Onde uma composição/componente é acondicionado numa seringa, a seringa pode ter uma agulha anexada a ela. Se não está anexada uma agulha, pode ser fornecida uma agulha separada com a seringa para montagem e uso. Tal agulha pode ter uma bainha. As agulhas de segurança são preferidas. Agulhas de calibre 23 com 2,54 cm, 44 calibre 25 com 2,54 cm e calibre 25 com 12, 7/20,32 cm são típicas. As seringas podem ser providenciadas com rótulos destacáveis onde podem estar impressos o número do lote, estação da gripe e data de validade dos conteúdos, para facilitar a manutenção dos registos. O desentupidor na seringa tem preferencialmente uma rolha para prevenir o desentupidor de ser acidentalmente removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma cápsula de fecho e/ou desentupidor de borracha de látex. As seringas descartáveis contêm uma única dose da vacina. A seringa terá geralmente uma cápsula de fecho na ponta para selar a ponta antes de anexar uma agulha, e a cápsula de fecho na ponta é preferencialmente feita de borracha de butilo. Se a seringa e agulha são acondicionadas separadamente então a agulha é preferencialmente protegida com um escudo de borracha de butilo. Seringas preferidas são aquelas comercializadas com a marca comercial "Tip-Lok"™.

Os recipientes podem ser marcados para mostrar o volume correspondente a meia dose, por exemplo, para facilitar a entrega a crianças. Por exemplo, uma seringa contendo uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostra um volume de 0,25 ml. Onde um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou frasco para injetáveis) é utilizado, então é preferido usar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de vidro sódico-cálcico.

Uma composição pode ser combinada (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto que inclui os detalhes da vacina, por exemplo, instruções para administração, detalhes dos antígenos dentro da vacina, etc. As instruções também podem conter avisos, por exemplo, de manter uma solução de adrenalina prontamente disponível no caso de uma reação anafilática após a vacinação, etc. Métodos de tratamento, e administração da vacina

As composições da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos. A invenção também providencia uma composição da invenção 45 para uso como um medicamento. A resposta imune provocada pelos métodos e usos da invenção incluirá geralmente uma resposta de anticorpo, preferencialmente uma resposta de anticorpo protetora. Os métodos para avaliar as respostas de anticorpo, capacidade neutralizadora e proteção após a vacinação contra o vírus da gripe são bem conhecidos na arte. Os estudos em humanos mostraram que os títulos de anticorpo contra a hemaglutinina do vírus da gripe humana estão correlacionados com a proteção (uma amostra de soro de título de inibição da hemaglutinação de cerca de 30-40 confere cerca de 50% de proteção contra a infeção por um vírus homólogo) [185] . As respostas de anticorpo são tipicamente medidas por inibição da hemaglutinação, por microneutralização, por imunodifusão radial única (SRID) , e/ou por hemólise radial única (SRH). Estas técnicas de ensaio são bem conhecidas na arte.

As composições da invenção podem ser administradas de várias maneiras. A via de imunização mais preferida é por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna) , mas outras vias disponíveis incluem a injeção subcutânea, intranasal [186-188], oral [189], intradérmica [190,191], transcutânea, transdérmica [192], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser utilizadas para tratar ambos crianças e adultos. As vacinas contra a gripe são atualmente recomendadas para uso na imunização pediátrica e adulta, desde a idade dos 6 meses. Assim, o paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou, pelo menos, 55 anos de idade. Pacientes preferidos para receber as vacinas são os mais idosos (por exemplo, >50 anos de idade, >60 anos de idade, e preferencialmente >65 anos de idade) , os jovens (por exemplo, <5 anos de idade), pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, serviços armados e pessoal militar, mulheres grávidas, os doentes crónicos, pacientes imunodeficientes, pacientes que tomaram um composto antiviral 46 (por exemplo, um composto oseltamivir ou zanamivir; ver em baixo) nos 7 dias anteriores a receber a vacina, pessoas com alergias ao ovo e pessoas que viajam para o estrangeiro. As vacinas não são apenas adequadas para estes grupos, contudo, e podem ser utilizadas mais geralmente numa população. Para estirpes pandémicas, a administração a todos os grupos de idade é preferida.

As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2 ou 3 dos critérios CPMP para eficácia. Em adultos (18-60 anos de idade), estes critérios são: (1) >70% seroproteção; (2) >40% seroconversão; e/ou (3) um aumento do GMT de >2,5 vezes. Nos mais idosos (>6 0 anos de idade), esses critérios são: (1) >60% seroproteção; (2) >30% seroconversão; e/ou (3) um aumento de GMT de >2 vezes. Estes critérios estão baseados em estudos de rótulo aberto com pelo menos 50 pacientes. O tratamento pode ser por um esquema de dose unitária ou em esquema de dose múltipla. Doses múltiplas podem ser utilizadas num esquema de imunização primário e/ou num esquema de imunização de reforço. Num esquema de dose múltipla as várias doses podem ser dadas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, um primórdio parentérico e reforço mucosal, um primórdio mucosal e reforço parentérico, etc. A administração de mais do que uma dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente ingénuos, por exemplo, para pessoas que nunca receberam uma vacina contra a gripe, ou para vacinar contra um novo subtipo HA (como num surto pandémico). As doses múltiplas serão tipicamente administradas, pelo menos, com uma semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.).

As vacinas produzidas pela invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a msma consulta médica ou visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação) outras vacinas, 47 por exemplo, substancialmente ao mesmo tempo que uma vacina contra o sarampo, uma vacina contra a caxumba, uma vacina contra a rubéola, uma vacina MMR, uma vacina contra a varicela, uma vacina MMRV, uma vacina contra a difteria, uma vacina contra o tétano, uma vacina contra a tosse convulsa, uma vacina DTP, uma vacina conjugada contra H. influenzae tipo b, uma vacina inativada contra poliovirus, uma vacina contra o vírus da hepatite B, uma vacina conjugada meningocócica (tal como uma vacina tetravalente A C W135 Y), uma vacina contra o vírus sincicial respiratório, uma vacina conjugada pneumocócica, etc. A administração substancialmente ao mesmo tempo do que uma vacina pneumocócica e/ou uma vacina meningocócica é particularmente útil em pacientes mais idosos.

De forma análoga, as vacinas da invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde) um composto antiviral, e em particular um composto antiviral ativo contra o vírus da gripe (por exemplo, oseltamivir e/ou zanamivir) . Estes antivirais incluem inibidores da neuraminidase, tais como um ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohe xeno-l-carboxílico ou ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4, 5-trideoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, in cluindo ésteres dos mesmos (por exemplo, os ésteres de etilo) e sais dos mesmos (por exemplo, os sais de fosfato). Um antiviral preferido é ácido (3R,4R, 5 S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico, éster de etilo, fosfato (1:1), também conhecido como oseltamivir fosfato (TAMIFLU™).

Geral 0 termo "compreendendo" abrange "incluindo" bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. 48 A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%. A menos que indicado especificamente, um processo compreendendo uma etapa de misturar dois ou mais componentes não requer qualquer ordem especifica de mistura. Assim, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Onde existem três componentes então dois componentes podem ser combinados um com o outro, e depois a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc. Onde materiais animais (e particularmente bovinos) são utilizados na cultura de células, deveriam ser obtidos a partir de fontes que são livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livres da encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, é preferido cultivar células na ausência total de materiais derivados de animais.

Onde um composto é administrado ao corpo como parte de uma composição então aquele composto pode, em alternativa, ser substituído por um pró-fármaco adequado.

Onde um substrato celular é utilizado para rearranjo ou procedimentos de genética reversa, é preferencialmente um que foi aprovado para uso na produção de vacinas humanas, por exemplo, como em Ph Eur capítulo geral 5.2.3. A identidade entre sequências polipeptídicas é preferencialmente determinada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando uma pesquisa de intervalo de afinidade com parâmetros gap open penalty=12 e gap extension penalty=l.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Em vez de utilizar ovos, os vírus da gripe A e B foram crescidos em células MDCK numa cultura em suspensão, seguindo os 49 ensinamentos das referências 27 e 47. A cultura não incluiu qualquer antibiótico. 0 meio de cultura final foi clarificado para providenciar viriões, que foram depois sujeitos a cromatografia e ultrafiltração/diafiltração.

Em vez de utilizar formaldeído para a inativação, os viriões no material resultante foram inativados utilizando β-propiolactona (concentração final 0,05% v/v; incubados durante 16-20 horas a 2-8°C, e depois hidrolizados incubando a 37°C durante 2-2,5 horas), seguindo os ensinamentos da referência 59. CTAB foi depois utilizado para dividir os viriões, e várias etapas de processamento adicionais deram uma vacina volumosa final monovalente contendo proteínas de superfície purificadas. O grosso do material final não continha conservante mercúrico, nem um antibiótico, nem formaldeído, nem materiais derivados do ovo.

Doses individuais da vacina foram preparadas a partir do volume, cada contendo 15 pg de HA de uma estirpe A/H1N1, A/H3N2 e B. Esta vacina foi administrada a pacientes num ensaio clínico, com pacientes controlo que receberam Agrippal™ derivado do ovo (que pode incluir formaldeído e quantidades residuais de antibiótico). A vacina derivada de MDCK foi bem tolerada, altamente imunogénica (imunologicamente não inferior a Agrippal), e correspondeu aos critérios CHMP e CBER de avaliação das vacinas contra a gripe. Imunogenicidade e perfis de segurança semelhantes foram induzidos por três lotes diferentes da vacina derivada de MDCK, confirmando que a tecnologia do fabrico da cultura de células é capaz de gerar resultados clínicos consistentes.

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[192] Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6. 57

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente formação do de patente o, o IEP não s erros ou pedido de patente foi elaborada apenas para in leitor. Não é parte integrante do documento europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboraçã assume qualquer responsabilidade por eventuai omissoes. • wo 9714434 A [0131] •wo 0228422 A [0131] • wo 02067983 A [0131] • wo 02074336 A [0131] • wo 02097072 A [0131] • wo 2005113756 A [0131] •wo 0121151 A [0131] • wo 0060050 A [0131] • wo 0104333 A [0131] • us 6649372 B [0131] •wo 2006067211 A [0131] •wo 0183794 A [0131] •wo 9737000 A [0131] •wo 03076601 A [0131] •wo 2005042728 A [0131] •wo 03043415 A [0131] •wo 0185938 A [0131] •wo 2006108846 A [0131] •EP 1260581 A [0131] •wo 0164846 A [0131] •wo 2006071563 A [0131] •wo 2005113758 A [0131] •wo 2006027698 A [0131] •wo 03023021 A [0131] •wo 03023025 A [0131] •wo 9737001 A [0131] •EP 0870508 B [0131] •us 5948410 A [0131] 58 wo 2007052 163 A [0131] us 6372223 B [0131] wo 0015251 A [0131] wo 0122992 A [0131] us 6355271 B [0131] wo 0023105 A [0131] us 5057540 A [0131] wo 2005002 620 A [0131] wo 9633739 A [0131] EP 0109942 A [0131] wo 9611711 A [0131] wo 0007621 A [0131] wo 2004004 762 A [0131] wo 9517211 A [0131] wo 9842375 A [0131] wo 9927960 A [0131] us 6090406 A [0131] us 5916588 A [0131] EP 0626169 A [0131] wo 9952549 A [0131] wo 0121207 A [0131] wo 0121152 A [0131] wo 0207201 2 A [0131] wo 2004064 715 A [0131] wo 2005089 837 A [0131] us 6692468 B [0131] wo 0007647 A [0131] wo 9917820 A [0131] us 5971953 A [0131] us 4060082 A [0131] EP 0520618 A [0131] wo 9801174 A [0131] wo 9014837 A [0131] us 2007014 805 A [0131] wo 9511700 A [0131] 59 • us 6080725 A [0131] • wo 2006113373 A [0131] • wo 2005097 181 A [0131] • us 6630161 B [0131] • us 4680338 A [0131] • us 4988815 A [0131] • wo 9215582 A [0131] • us 4689338 A [0131] • us 4929624 A [0131] • us 5238944 A [0131] • us 5266575 A [0131] • us 5268376 A [0131] • us 5346905 A [0131] • us 5352784 A [0131] • us 5389640 A [0131] • us 5395937 A [0131] • us 5482936 A [0131] • us 5494916 A [0131] • us 5525612 A [0131] • us 6083505 A [0131] • us 6440992 B [0131] • us 6627640 B [0131] • us 6656938 B [0131] • us 6660735 B [0131] • us 6660747 B [0131] • us 6664260 B [0131] • us 6664264 B [0131] • us 6664265 B [0131] • us 6667312 B [0131] • us 6670372 B [0131] • us 6677347 B [0131] • us 6677348 B [0131] • us 6677349 B [0131] • us 6683088 B [0131] • us 6703402 B [0131] 60 • us 6743920 B [0131] • us 6800624 B [0131] • us 6809203 B [0131] •us 6888000 B [0131] • us 6924293 B [0131] •wo 2004060308 A [0131] • wo 2004064759 A [0131] • us 6924271 B [0131] • us 20050070556 A [0131] • us 5658731 A [0131] • us 5011828 A [0131] • wo 200487153 A [0131] • us 6605617 B [0131] •wo 0218383 A [0131] • wo 2004018455 A [0131] • wo 03082272 A [0131] •FR 2859633 [0131] • wo 2006002 422 A [0131] • us 5936076 A [0131] • us 2005019 2248 A [0131] • wo 2005102 049 A [0131] • wo 0310576 9 A [0131] • wo 0226757 A [0131] • wo 9962923 A [0131] •wo 9840100 A [0131] • us 6207646 B [0131] • us 6239116 B [0131] • us 6429199 B [0131] • wo 0195935 A [0131] • wo 0303583 6 A [0131] •wo 0122972 A [0131] •GB 2220211 A [0131] • wo 9421292 A [0131] • wo 9400153 A [0131] • wo 9517210 A [0131] 61 •WO 9626741 A [0131] •WO 9319780 A [0131] •WO 03011223 A [0131] •US 6586409 B [0131] •US 20050215517 A [0131]

Documentos de patente referidos na descrição

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma vacina estéril que compreende um antígeno do vírus da gripe inativado, em que a vacina não contém conservante à base de mercúrio, nem antibiótico, nem formaldeido nem materiais derivados de ovo.

2. A vacina de qualquer reivindicação precedente, tendo menos de 0,1 IU/ml de endotoxina.

3. A vacina de qualquer reivindicação precedente, tendo menos de 10 ng de ADN da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutinina.

4. A vacina de qualquer reivindicação precedente, em que o antígeno é um antígeno de vírus fragmentado.

5. A vacina de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o antígeno é un antígeno de glicoproteína de superfície purificado.

6. A vacina de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o antígeno é um virossoma.

7. A vacina de qualquer reivindicação precedente, incluindo antígeno de mais de uma estirpe de vírus da gripe.

8. A vacina de qualquer reivindicação precedente compreendendo ainda um adjuvante.

9. A vacina da reivindicação 8 em que o adjuvante é uma emulsão óleo-em-água.

10. A vacina da reivindicação 9, em que a emulsão óleo-em-água compreende esqualeno. 2

11. Um processo para preparar uma formulação de antígeno do vírus da gripe estéril que não contém conservante á base de mercúrio, nem antibiótico, nem formaldeído nem materiais derivados de ovo, compreendendo as etapas de: (i) crescer vírus da gripe num sistema de cultura de células, na ausência de materiais derivados de ovo e de antibióticos; (ii) inativar os vírus da gripe crescidos na etapa (i), na ausência de formaldeído; e (iii) preparar uma formulação de antígeno da vacina a partir de vírus da gripe inativados, na ausência de timerosal.

12. 0 processo da reivindicação 11, em que os vírus da gripe na etapa (ii) são tratados com um agente alquilante.

13. 0 processo da reivindicação 11 ou da reivindicação 12 em que os vírus da gripe são crescidos em células MDCK.

14. 0 processo da reivindicação 13 em que as células MDCK são MDCK 33016 depositadas como DSM ACC2219.

15. O processo de qualquer uma das reivindicações 10 a 14 em que a etapa (i) é realizada em meio livre de soro.