MX2009002408A - Elaboracion de vacunas para el virus de la influenza sin utilizar huevos. - Google Patents

Elaboracion de vacunas para el virus de la influenza sin utilizar huevos.

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Abstract

Actualmente, los pasos realizados antes de la liberación de las cepas de la influenza a los fabricantes de vacuna, involucran la transmisión del virus de la influenza a través de huevos. La invención está dirigida a proporcionar procedimientos útiles en la fabricación de vacunas para la influenza, en las cuales se reduce el uso de huevos, y preferentemente es evitado completamente. Por ejemplo, en vez de utilizar huevos de pollo para el asilamiento de la vacuna para la influenza, pueden ser utilizadas células MDCK (células de riñón canino Madin Darby), por ejemplo, se desarrollan en suspensión, se desarrollan en un medio libre de suero, se desarrollan en un medio libre de proteínas, que no son tumorígenas, desarrolladas en ausencia de un medio de cobertura, etc.

Description

ELABORACION DE VACUNAS PARA EL VIRUS DE LA INFLUENZA SIN UTILIZAR HUEVOS Campo de la Invención Esta invención está en el campo de la fabricación de vacunas para proteger contra el virus de la influenza.
Antecedentes de la Invención El proceso actual para preparar vacunas estacionarias contra la infección por el virus de la influenza humana, involucra los siguientes pasos: [1,2] : (a) aislamiento de las cepas virales circulantes; (b) análisis antigénico y genético de los virus aislados; (c) selección de cepas virales para el uso durante la estación entrante; (d) preparación de cepas de semillas de alto rendimiento mediante la reclasificación o el uso de genética inversa; (e) liberación de las cepas de semilla a los fabricantes de vacuna; (f) evaluación por los fabricantes de la adecuación de las cepas para la producción industrial; y (g) el crecimiento de las cepas de semilla para producir virus a partir de los cuales son luego fabricadas las vacunas. Los pasos (a) al (e) de este proceso son realizados por la FDA y los centros de influenza internacionales apropiados por los gobiernos, típicamente bajo los auspicios de la Organización Mundial de la Salud; los pasos (f) y (g) Ref. : 200534 son realizados por los fabricantes mismos. El paso (d) cambia un virus de uno que está naturalmente adaptado para infectar humanos a uno que se desarrollará a altos títulos bajo condiciones de crecimiento industrial. Para el virus de la influenza, este paso involucra típicamente la creación de una cepa de reclasificación 6:2 que incluye los segmentos genómicos que codifican para HA- y NA- provenientes de las cepas seleccionadas en (c) y los seis segmentos genómicos remanentes provenientes de una cepa que crece eficientemente en huevos de pollo, y esta cepa es usualmente A/PR/8/34. El procedimiento de reclasificación es luego seguido por las transmisiones repetidos de la cepa en huevos embrionados para permitir la adaptación del huevo y el aumento del crecimiento Para el virus de la influenza B, las cepas prototipo con buenas características de crecimiento son usualmente obtenidos mediante transmisiones directas y repetidas en huevos embrionados, sin intentar generar reclasificaciones. De este modo, los pasos realizados antes de la liberación a los fabricantes de vacunas, involucrarán la transmisión del virus de la influenza a través de huevos. Incluso si los huevos son desarrollados por un fabricante en el paso (g) sobre un sustrato celular, en vez sobre huevos, el virus habrá sido pasado todavía a través de huevos en una etapa entre el aislamiento desde el paso (a) y la recepción por un fabricante en el paso (e) . Por ejemplo, el paso (a) involucra la exposición de un sustrato a una muestra del paciente, tal que cualquier virus en la muestra infectará el sustrato. El sustrato puede luego amplificar la cantidad de virus presente, y los virus amplificados son luego disponibles para el estudio posterior. Este paso puede tener lugar en huevos o en células de mamífero. Las células conocidas para el uso en el aislamiento primario incluyen las células MRC-5 [3], células Vero [4,5], células MDCK [6], células HepG2 [7], células LLC- K2 [8], etc. En general, no obstante, los huevos de pollo continúan siendo utilizados para aislar cepas de referencia para la fabricación de vacunas para la influenza. El uso de huevos es tan importante para los procedimientos actuales que en la estación de 2003-04 la FDA rechazó el uso de la cepa H3N2 más apropiada (A/Fu ian/411 /2002 ) debido a que ésta originalmente no había sido aislada en huevos [2,9] y no estaban disponibles cepas aisladas en huevo, antigénicamente similares . Se ha propuesto previamente eliminar el uso de los huevos de varias etapas de la fabricación del virus de la influenza . La referencia 10 propone que las vacunas deben ser desarrolladas en cultivo celular utilizando ya sea (i) una cepa de alto crecimiento de un aislado clínico sometido a transmisiones o (ii) un reclasificante derivado de al menos una cepa de virus de la influenza de mamífero, de origen natural, con la condición de que el aislado o el reclasificante no haya sido sometido a transmisiones en huevos de ave. De este modo, el proceso descrito en la referencia 10 comienza con un virus semilla que ha sido ya seleccionado o manipulado para el crecimiento en el cultivo celular de elección. La referencia 11 compara los virus emitidos en transmisiones a través de huevos con aquellos sometidos a transmisiones a través de células MDCK, pero selecciona específicamente los primeros para la fabricación de vacunas. La referencia 12 sugiere que los virus semilla para vacunas de influenza pandémica pudieran ser preparadas mediante la propagación de la cepa pandémica directamente sobre el cultivo de célula de mamífero en vez de por medio de huevos embrionados, pero nótese que la transmisión en huevos fue obligatorio para la fabricación inter-pandémica . La razón para esta transmisión obligatoria en huevos es que se ha creído que actúa como un 'filtro' para los agentes adventicios: las agencias reguladoras han aceptado que una serie de transmisiones en un sistema de ave, entre el aislamiento clínico original desde un humano y la vacuna final para la administración a un humano, prevendrá que los agentes adventicios tipo mamífero se co-repliquen con el virus de la influenza. La invención está dirigida a proporcionar procedimientos adicionales útiles en la fabricación de vacunas para la influenza, en las cuales es reducido el uso de los huevos, y preferentemente es evitado del todo. En un aspecto particular, la invención está dirigida a proporcionar procedimientos adicionales y mejorados, útiles en el aislamiento del virus de la influenza.
Breve Descripción de la Invención Aunque se ha propuesto previamente eliminar el uso de los huevos de las diversas etapas de la fabricación del virus de la influenza, la invención difiere de estas propuestas en varios aspectos.
Preparación de virus semilla Un primer aspecto de la invención proporciona un proceso para la preparación de un virus semilla de la influenza para la fabricación de vacunas, que comprende los pasos de: (i) infectar una linea celular con un virus de la influenza obtenido ya sea directamente de un paciente o de un aislado primario; (ii) pasar el virus desde la linea celular infectada obtenida en el paso (i) al menos una vez; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir virus de la influenza. El virus de la influenza purificado a partir del cultivo del paso (iii) puede ser utilizado como el virus semilla. En contraste a la referencia 12, el virus de la influenza utilizado en el paso (i) es ya sea un virus de la influenza B o es ya sea un virus de la influenza A no pandémico, por ejemplo, en el tiempo actual es una cepa H1N1 o H3N2 de la influenza A. Ninguno de los pasos (i), (ii) ó (iii) involucra el crecimiento o la transmisión de los virus en huevos. Preferentemente, al menos dos de los pasos, e idealmente los tres pasos, tendrá lugar en el mismo tipo celular, por ejemplo, todos en células DCK. La transmisión en el paso (ii) involucrará típicamente: permitir que el virus de la influenza se replique en el cultivo celular; recolectar el virus replicado por ejemplo, desde el sobrenadante de cultivo; y transferir el virus replicado, recolectado, a un cultivo de células no infectadas. Este proceso puede ser repetido. Después de al menos una transmisión, el virus se deja replicar en el paso (iii), y el virus es recolectado, pero el virus es utilizado como un virus semilla en vez de ser transferido a un cultivo no infectado para la transmisión posterior. La línea celular utilizada en el primer aspecto es preferentemente no una línea celular humana. Al evitar el uso de células humanas, la 'filtración' de los agentes adventicios puede ser mantenida incluso sin el uso de huevos. Debido a la estrecha relación con los humanos, la linea celular es también preferentemente no una linea de células de primates, por ejemplo, no es una linea de células Vero (derivadas de riñon de mono) . La referencia 10 propone el uso de células Vero durante la fabricación de la vacuna, pero estas células son permisivas para muchos virus humanos, y asi pues cualesquiera virus humanos adicionales que estén presentes en la muestra del virus de la influenza utilizada en el paso (i) serán capaces de desarrollarse en paralelo con el virus de la influenza, conduciendo la contaminación del virus semilla eventual. Una linea celular preferida para el uso con el primer aspecto de la invención es una linea celular canina, tal como la linea de células MDCK (riñon canino Madin Darby) , de manera contraria a la enseñanza especifica de la referencia 10. Detalles adicionales de las células MDCK se dan más adelante. Se ha encontrado ahora que las células MDCK muestran un efecto de 'filtración' contra los agentes adventicios, que es equivalente a aquel logrado por los huevos de ave. Con base en este hallazgo, por lo tanto, las células MDCK pueden ser utilizadas en lugar de los huevos, sin incrementar el riesgo regulatorio y, a pesar de los reportes en la referencia 13 de que la transmisión en huevos sobre el virus de la influenza, transfiere una ventaja de crecimiento durante el cultivo de MDCK, el crecimiento en huevos es evitado. La referencia 14 describe que las cepas de la influenza aisladas de pacientes humanos, sin cualesquiera transmisiones en huevos o células de cultivo, pueden desarrollarse eficientemente en cultivos de células MDCK, incluyendo en cultivos libres de suero. De este modo, la infección en el paso (i) puede utilizar un virus de la influenza proveniente de una muestra clínica (por ejemplo, proveniente de un frotis faríngeo, etc.) obtenido directamente de un paciente, o puede utilizar un virus que ha sido ya sometido a aislamiento primario. En algunas circunstancias, el aislamiento primario antes del paso (i) puede haber tenido lugar en huevos, pero los aislados primarios preferidos para el uso con la invención son aquellos que fueron obtenidos con el uso de huevos, por ejemplo, en células de mamífero. Las células conocidas para el uso en el aislamiento primario incluyen, pero no están limitadas a células MRC-5 [3], células Vero [4,5], células MDCK [6], células HepG2 [7], células LLC-MK2 [8], etc. Donde la invención utiliza aislados primarios en el paso (i), se prefiere que el aislamiento primario debiera haber tenido lugar en el mismo tipo celular que los pasos (i) al (iii) . Se sabe ya que las células MDCK son adecuadas para el aislamiento primario, la transmisión y el crecimiento del virus de la influenza, pero los mejoramientos en el aislamiento de MDCK son descritos más adelante. Con el fin de lograr al máximo el conocimiento de la historia de un aislado del virus de la influenza, se prefiere utilizar un virus obtenido directamente de un aislado clínico en vez de utilizar aislados primarios. Los sistemas de vigilancia de influenza actuales, involucran el aislamiento primario en hospitales, con cepas de interés que son enviadas a los centros de influenza nacionales e internacionales. Además de utilizar una muestra del paciente para el aislamiento primario, es común que una porción sea separada y almacenada (por ejemplo, mediante congelamiento) tal que es posible regresar al material original para el reaislamiento. Donde tal muestra almacenada es disponible, entonces ésta puede ser utilizada en el paso (i) en lugar del aislado primario. Si la historia de un aislado no es clara, y en particular cuando se comienza con un virus que no es directamente proveniente de una muestra clínica, es posible utilizar genética inversa entre los pasos (i) y (iii) con el fin de generar una nueva cepa viral que tiene al menos un segmento genómico viral proveniente del virus progenitor. Utilizando la genética inversa entre los pasos (i) y (iii) se separan los productos virales utilizados en el paso (i) de los productos virales utilizados en el paso (iii), y así pues se puede actuar como un filtro contra los agentes adventicios que puedan haber sido introducidos antes del paso (i) . Además de ser utilizadas como un 'filtro' de esta manera, las técnicas de genética inversa pueden también ser utilizadas para otras razones, por ejemplo, para generar reclasificantes, para manipular secuencias de codificación, para remplazar segmentos específicos, etc. Los detalles adicionales se dan más adelante en relación al segundo aspecto de la invención.
Uso de genética inversa en conj unto con el cultivo celular del virus de la influenza Un segundo aspecto de la invención proporciona un proceso para la preparación de un virus semilla de la influenza para fabricación de vacunas, que comprende los pasos de: (i) infectar una línea celular con un virus de la influenza obtenido ya sea directamente de un paciente o proveniente de un aislado primario; (ii) el preparar un cADN de al menos un segmento de ARN viral de un virus de la influenza producido por la línea celular infectada obtenida en el paso (i), y utilizar el cADN en un procedimiento de genética inversa para preparar un nuevo virus de la influenza que tiene al menos un segmento de ARN viral en común con el virus de la influenza del paso (i); y (iii) infectar una línea celular con el nuevo virus de la influenza, y luego cultivar la línea celular con el fin de producir el nuevo virus de la influenza. El virus utilizado en el paso (i) puede ser un virus de la influenza A de cualquier subtipo, o puede ser un virus de la influenza B. Los subtipos del virus de la influenza A preferidos son Hl, H3 y H5. Ninguno de los pasos (i), (ii) ó (iii) involucran el crecimiento o la transmisión del virus en huevos. Preferentemente, éstos tienen lugar todos en el mismo tipo de células, por ejemplo, éstos todos tienen lugar en células MDCK. Las características adicionales de este segundo aspecto de la invención son como se describen anteriormente para el primer aspecto. De este modo, el uso de células MDCK es preferido, etc. Las técnicas de genética inversas son descritas con más detalle más adelante. El o los segmentos genómicos transferidos en el paso (ii) incluirán un segmento HA, y pueden incluir el segmento NA y/o uno o más segmentos adicionales .
Virus semilla El primero y segundo aspectos de la invención proporcionan virus semilla. Estos virus semilla pueden ser utilizados de diversas formas. Los virus semilla pueden ser caracterizados por ejemplo, para secuenciar los ácidos nucleicos y/o proteínas, para verificar su parentesco antigénico a otras cepas (por ejemplo, cepas circulantes), para verificar su inmunogenicidad, etc. El secuenciamiento del gen HA viral para revelar la secuencia de aminoácidos de HA es típico. Los virus semilla pueden ser utilizados para producir antisueros. Los virus semilla pueden ser distribuidos a los fabricantes de vacunas. Los virus semilla pueden ser almacenados para el uso futuro. Los virus semilla pueden ser utilizados para preparar lotes de semilla de trabajo. Este sistema permite el almacenamiento seguro del virus semilla original mientras que el uso día con día es realizado con los lotes semilla de trabajo. Las semillas de trabajo pueden ser congeladas hasta que se requiera. La preparación de un lote de semilla de trabajo puede involucrar un paso de crecimiento viral en el cultivo celular, preferentemente sobre el mismo tipo celular que se utiliza en la preparación del virus semilla. El crecimiento en huevo no es utilizado para preparar lotes semilla de trabajo. Los virus semilla pueden ser utilizados para infectar líneas celulares para el crecimiento para proporcionar virus para la fabricación de vacunas o para el uso en la preparación de pruebas de diagnóstico. Los virus semilla de la invención comparten muchas de las características de los virus semilla derivados de huevo, actuales, pero pueden diferir en varias formas. Por ejemplo, los virus semilla de influenza A preferidos de la invención incluyen menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5) segmentos virales provenientes de un virus de la influenza PR/8/34, como se describe con más detalle más adelante .
Producción de vacuna libre de huevo Un tercer aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar un virus de la influenza para la fabricación de vacunas, que comprende los pasos de: (i) obtener un virus de la influenza que es ya sea circulante en la población, o que tiene una hemaglutinina que es ant igénicamente representativa de un virus de la influenza que está circulando en la población; (ii) infectar una línea celular con el virus de la influenza obtenido en el paso (i) ; (iii) someter a transmisión el virus obtenido de la línea celular infectada en el paso (ii) al menos una vez, para dar una cepa de semilla; y (iv) cultivar la cepa de semilla del paso (iii) con el fin de producir el virus de la influenza. De la misma manera que el primero y segundo aspectos difieren uno del otro (ver arriba), un cuarto aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar un virus de la influenza para la fabricación de vacunas, que comprende los pasos de: (i) obtener un virus de la influenza que ya sea circulante en la población o que tiene una hemaglutinina que es antigénicamente representativa de un virus de la influenza que está circulando en la población; (ii) infectar una linea celular con el virus de la influenza obtenido en el paso (i); (iii) preparar un cDNA de al menos un segmento de ARN de un virus de la influenza producido por la linea celular infectada obtenida en el paso (i), y utilizar el cDNA en un procedimiento de genética inversa para preparar un virus semilla de influenza que tiene al menos un segmento de ARN viral en común con el virus de la influenza del paso (i); y (iv) infectar una linea celular con el virus semilla de la influenza, y luego cultivar la linea celular sometida a transmisiones, proveniente del paso (iii) con el fin de producir el virus de la influenza. La invención también proporciona un proceso para preparar una vacuna del virus de la influenza, que comprende estos pasos (i) al (iv) del tercero o cuarto aspectos, seguido por el paso: (v) el tratamiento del virus obtenido en el paso (iv) para dar una vacuna. Los detalles de las técnicas utilizadas en el paso (v) se dan más adelante. Ninguno de los pasos (i), (ii), (iii), (iv) ó (v) involucra el crecimiento o la transmisión del virus en huevos.
El virus utilizado en el paso (i) puede ser un virus de la influenza A de cualquier subtipo, o puede ser un virus de la influenza B. Los subtipos del virus de la influenza A preferidos son Hl, H3 y H5 por ejemplo, un HlNl o H3N2. El virus utilizado en el paso (i) no ha sido propagado sobre huevos desde su aislamiento primario, y preferentemente no es propagado sobre huevos en ninguna etapa entre el paciente quien originalmente presentó el virus, y el comienzo del paso (i) . El término "antigénicamente representativo" es utilizado en la técnica de la vacuna de la influenza para describir las cepas virales que no pueden estar efectivamente en circulación difundida dentro de la población, pero que promueven las respuestas inmunitarias que pueden proteger contra las cepas que están en circulación, mientras que sea conveniente para los procesos de fabricación. Los sueros producidos por una cepa "antigénicamente representativa" serán capaces de inhibir una cepa circulante, por ejemplo, en un ensayo de inhibición de hemaglutinación . El paso (i) puede involucrar el inicio con un número de diferentes cepas, y luego seleccionar una cepa para el uso posterior. Por ejemplo, esto puede involucrar el comienzo con un número de diferentes cepas HlNl del virus de la influenza A y luego seleccionar una cepa para el uso posterior. Este puede involucrar el comienzo con un número de diferentes cepas H3N2 del virus de la influenza A, y luego seleccionar una cepa para el uso posterior. Este puede involucrar el comienzo con un número de diferentes cepas del virus de la influenza B, y luego seleccionar una cepa para el uso posterior. La selección estará basada en los criterios inmunológicos y serológicos que son rutinariamente utilizados cuando se seleccionan cepas para la inclusión en el virus de la influenza, por ejemplo, para elegir una cepa que es antigénicamente representativa de las cepas más comunes y/o patógenas en circulación. El paso (iii) puede ser seguido por un paso que confirma que el virus semilla es antigénicamente representante de la cepa obtenida en el paso (i) . Este paso de verificación puede ser realizado antes de que comience el paso (iv), o puede ser realizado paralelo al paso (iv). La invención también proporciona un proceso para preparar una vacuna del virus de la influenza, que comprende los pasos de: (a) obtener un virus que ha sido preparado por un método que comprende cualquiera de los pasos (i) al (iii) del primer aspecto o los pasos (i) al (iv) del segundo aspecto; y (b) tratar este virus para dar una vacuna. En general, por lo tanto, el tercero y cuarto aspectos de la invención permite la producción de vacunas de la influenza a partir de una muestra del paciente (o un aislado primario) , donde el virus de la influenza utilizado para preparar la vacuna no es sometida a transmisiones a través de huevos en ninguna etapa. Reclasificación viral Un quinto aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar un virus de la influenza reclasificante, que comprende los pasos de: (i) infectar una linea celular con una primera cepa del virus de la influenza que tiene un primer grupo de segmentos genómicos, y una segunda cepa del virus de la influenza que tiene un segundo grupo de segmentos genómicos, en donde la primera cepa tiene un segmento HA que codifica para una hemaglut inina deseada; y (ii) cultivar las células infectadas del paso (i) con el fin de producir virus de la influenza que tiene al menos un segmento proveniente del primer grupo de segmentos genómicos y al menos un segmento proveniente del segundo grupo de segmentos genómicos, con la condición de que al menos un segmento proveniente del primer grupo de segmentos genómicos incluya el segmento HA proveniente de la primera cepa. De este modo, el proceso puede transferir al menos, el segmento HA proveniente de la primera cepa a la segunda cepa, con lo cual se crea una nueva cepa reclasificante con una colección diferente de segmentos genómicos virales provenientes ya sea de la primera o de la segunda cepas, sin utilizar huevos. El virus de la influenza purificada a partir del cultivo del paso (ii) puede ser utilizado como se describe en otro sitio en la presente. Los reclasificantes pueden mostrar características de crecimiento mejoradas con relación a la primera cepa. El reclasificante puede también incluir el segmento NA proveniente de la primera cepa, que codifica para una neuraminidasa deseada. El reclasificante incluirá en general segmentos provenientes de la primera y la segunda cepa en una proporción de 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 ó 7:1. Tener una mayoría de cepas provenientes en la segunda cepa es típico. Este proceso puede ser utilizado para generar reclasificantes del virus de la influenza A y el virus de la influenza B. Para el virus de la influenza A, la segunda cepa en algunas modalidades será PR/8/34, pero es también posible utilizar otras cepas, incluyendo aquellas que comparten únicamente 1, 2, 3, 4 ó 5 de los segmentos NP, M, NS, PA, PB1 ó PB2 en común con PR/8/34. La invención también proporciona un virus de la influenza obtenible mediante un método de reclasificación del quinto aspecto. La invención también proporciona el uso de tal virus en la fabricación de vacunas. Ninguno de los pasos (i) ó (ii) involucra el crecimiento, reclasificación o transmisión del virus en huevos. El proceso de reclasificación puede ser convenientemente realizado en los mismos tipos celulares (por ejemplo, células MDCK) que las que son utilizadas para el aislamiento y las transmisiones, como se describe en otro sitio en la presente. La primera cepa puede ser convenientemente un virus de la influenza obtenido ya sea directamente de un paciente o de un aislado primario.
Aislamiento del virus Como se mencionó anteriormente, existe una fuerte desviación hacia el uso de huevos para el aislamiento del virus de la influenza. En vez de esto, un sexto aspecto de la invención utiliza las células MDCK. En algunas modalidades, las células MDCK son desarrolladas en suspensión En otras modalidades, las células MDCK son desarrolladas en un medio libre de suero o un medio libre de proteina. En otras modalidades, las células MDCK no son tumorigenas. En otras modalidades, las células MDCK no son desarrolladas en presencia de un medio de cobertura. De este modo, la invención proporciona un método para aislar un virus de la influenza proveniente de una muestra del paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión.
De este modo, la invención proporciona un método para aislar un virus de la influenza proveniente de una muestra del paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK está desarrollando en un medio libre de suero . De este modo, la invención proporciona un método para aislar un virus de la influenza proveniente de una muestra del paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK está desarrollando en un medio libre de proteina La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza de una muestra de un paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza de una muestra de un paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK no es proporcionada con un medio de cobertura. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza proveniente de una muestra del paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo de suspensión libre de suero. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza proveniente de una muestra del paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo de suspensión libre de proteina. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza de una muestra de un paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se ha desarrollado en un cultivo en suspensión. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza de una muestra de un paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión libre de suero. La invención también proporciona un método para aislar un virus de la influenza de una muestra de un paciente, que comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión libre de proteina.
La invención también proporciona un virus de la influenza aislado mediante uno de estos métodos, la invención también proporciona el uso de tal virus en la fabricación de vacunas . La incubación de la muestra del paciente y la célula MDCK da como resultado en general la infección de la célula MDCK por un virus de la influenza, tal como un virus de la influenza humana, y en particular un virus de la influenza humana A. El virus puede replicarse en las células, y el virus replicado puede luego ser recolectado. Opcionalmente, éste puede ser utilizado en pasos del método corriente abajo, por ejemplo, la detección, caracterización, análisis del virus semilla, manipulación, etc. Después del aislamiento de células MDCK, un virus puede también ser pasado y/o desarrollado en células MDCK. Como una alternativa, o puede ser pasado y/o desarrollado en células no MDCK, o en huevos, o en otro sustrato. El sexto aspecto de la invención involucra el uso de lineas celulares MDCK. Las lineas celulares MDCK originales está disponible en el ATCC, pero el sexto aspecto de la invención utiliza derivados de esta linea celular. Como se muestra más adelante, el aislamiento de estos derivados han mostrado que es superior al aislamiento en la linea celular MDCK original. Las células MDCK adecuadas y sus características son discutidas con más detalle más adelante . Por ejemplo, algunas modalidades del sexto aspecto utilizan una linea celular MDCK que puede replicarse espontáneamente un cultivo en suspensión. La referencia 30 describe una linea celular MDCK que fue adaptada para el crecimiento en cultivo de suspensión, y esta linea celular ('MDCK 33016') es particularmente útil para los métodos del sexto aspecto. MDCK 33016 pueden desarrollarse en cultivo libre de suero, y pueden desarrollarse sin la necesidad de un medio de cobertura. Otra linea celular MDCK que puede desarrollarse en cultivo de suspensión, incluyendo el cultivo libre de suero, es la linea celular 'B-702' [36; ver más adelante] . Las lineas celulares MDCK no tumorigenas para el uso con el sexto aspecto incluyen aquellas descritas en la referencia 37, tales como 'MDCK-S', ' DCK-SF101 ' , ' DCK-SF102' y ' MDCK-SF103 ' (ver más adelante) . En algunas modalidades del sexto aspecto, las células MDCK se desarrollan en medio de cultivo libre de suero y/o en medio libre de proteina. De manera contraria a ciertos métodos de la técnica anterior, el sexto aspecto de la invención puede evitar la necesidad de utilizar un medio de coberturas durante el aislamiento del virus de la influenza. Se prefiere que un virus no sea desarrollado en huevos antes de ser expuesto a la célula MDCK como se describió anteriormente. Se puede preferir que el virus desarrollado en células MDCK, como se describe anteriormente, no sea subsecuentemente desarrollado en huevos. Para la muestra del paciente utilizado en el sexto aspecto, las muestras clínicas utilizadas en el aislamiento del virus de la influenza pueden tomar varias formas, pero típicamente comprenden secreciones respiratorias, incluyendo pero no limitadas a: aspirados directos; gárgaras; lavados nasales; frotis nasales; frotis de gargantas; frotis laríngeos; etc. Estas son en general tomadas de un paciente sospechoso de tener una infección por el virus de la influenza, incluyendo pacientes quienes pueden estar albergando una nueva cepa del virus de la influenza. Los virus de la influenza aislados mediante los métodos del sexto aspecto pueden ser utilizados para preparar un virus semilla de la influenza para la fabricación de vacunas. De este modo, un método del sexto aspecto puede incluir un paso adicional de pasar el virus desde una línea celular MDCK infectada al menos una vez. El método puede luego incluir un paso de cultivar las células infectadas con el fin de producir virus de la influenza. El virus de la influenza purificado después de este paso de cultivo puede ser utilizado como un segundo virus, como se describe en otro sitio en la presente.
Un virus aislado de acuerdo al sexto aspecto puede ser también utilizado como una fuente de técnicas de genética inversa. De este modo, el cADN puede ser preparado a partir de al menos un segmento de ARN viral de un virus de la influenza aislado de acuerdo al sexto aspecto. El cADN puede ser luego utilizado en un procedimiento de genética inversa para preparar un nuevo virus de la influenza que tiene al menos un segmento de ADN viral en común con el virus de la influenza aislado. Este Nuevo virus de la influenza puede ser luego utilizado para infectar la linea celular, por ejemplo, para cultivo posterior. El sexto aspecto de la invención puede ser utilizado para aislar cualquier virus de la influenza adecuado, incluyendo virus de la influenza humanos. Estos pueden ser virus de influenza A, virus de influenza B o virus de influenza C. Los virus de la influenza A son típicos, y los subtipos útiles del virus de la influenza A son Hl, H3 y H5. En el periodo inter-pandémico actual, las vacunas incluirán típicamente dos cepas de influenza A (H1N1 y H3N2) y una cepa de influenza B. El sexto aspecto puede ser utilizado para aislar tales cepas, o para aislar cepas virales pandémicas, tales como las cepas de los subtipos H2, H5, H7 ó H9. En general, el sexto aspecto puede ser utilizado para aislar un virus de la influenza A que tiene una de los subtipos HA: Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ó H16. Los virus de la influenza aislados de acuerdo al sexto aspecto de la invención pueden incluir la hemaglut inina con una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2 , 6 ) Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (o¡2 , 3 ) Gal .
Ventajosamente, se ha encontrado que los métodos de aislamiento de la invención ayudan en la retención estable de una secuencia HA del virus, y de este modo su preferencia de oligosacárido. Los virus aislados de acuerdo al sexto aspecto pueden ser utilizados en fabricación de vacunas y en métodos de tratamiento. De este modo, la invención también proporciona el uso de un antigeno preparado a partir de un virus aislado de acuerdo al sexto aspecto, en la fabricación de un medicamento para producir una respuesta inmunitaria en un paciente.
Enlace al receptor Los virus de la influenza humana se enlazan a los oligosacáridos del receptor que tienen un disacárido terminal Sia (OÍ2, 6) Gal (ácido siálico enlazado a-2,6 a la Galactosa) , pero los huevos tienen más bien oligosacáridos del receptor con un disacárido terminal Sia (o¡2 , 3 ) Gal . El crecimiento de los virus de la influenza humana en huevos proporciona la presión de selección sobre la hemaglutinina lejos del enlace de Sia(a2,6)Gal hacia el enlace Sia (a2 , 3 ) Gal . Como los huevos, las células Vero expresan predominantemente receptores Sia(a2,3)Gal [15] . En contraste, las células MDCKs y las células PER.C6 expresan Sia (a2, 3) Gal y Sia (a2 , 6 ) Gal . La referencia 16 reporta la transfección de la célula MDCKs para sobreexpresar -2 , 6-sialiltransferasa con el fin de favorecer la selección del enlace de Sia (a2, 6) Gal . Incluso sin tales manipulaciones, no obstante, es posible desarrollar los virus de la influenza sobre la célula MDCKs sin cambiarlas hacia el enlace Sia ( a2 , 3 ) Gal . De este modo, la invención puede utilizar células que expresan Sia(a2,3)Gal y Sia (a2 , 6) Gal, pero pueden producir virus de la influenza que tienen una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2, 6) Gal en comparación a los monosacáridos con un disacárido terminal En modalidades preferidas del primero y segundo aspectos de la invención, los virus de la influenza utilizados para la infección en el paso (i) tienen una preferencia de enlace para los oligosacáridos con el disacárido terminal Sia (a2, 6) Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2 , 3 ) Gal . Esta preferencia de enlace es conservada durante el paso (ii) y el paso (iii), tal que el virus de la influenza producido en el paso (iii) tiene preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia («2, 3) Gal . En modalidades preferidas del tercero y cuarto aspectos de la invención, los virus de la influenza utilizados para la infección en el paso (ii) tienen una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2 , 3 ) Gal . Esta preferencia de enlace es conservada durante el paso (iii) y el paso (iv), tal que el virus de la influenza producido en el paso (iv) tiene una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2, 3) Gal . Para determinar si un virus tiene una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (OÍ2 , 3 ) Gal , en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2 , 3 ) Gal , pueden ser utilizados diversos ensayos. Por ejemplo, la referencia 17 describe un ensayo ligado a enzima en fase sólida para la actividad de enlace al receptor del virus de la influenza, que da mediciones sensibles y cuantitativas de las constantes de afinidad. La referencia 18 utilizó un ensayo en fase sólida en el cual se evaluó el enlace de los virus a dos diferentes sialilglucoproteinas (ovomucoide, con los determinantes de Sia (OÍ2 , 3 ) Gal ; y la 0í2-macroglobulina de cerdo, con determinantes de Sia (a2 , 6) Gal) , y también describe el ensayo en el cual fue evaluado el enlace del virus contra dos análogos del receptor: el ácido siálico libre (Neu5Ac) y la 3 ' -sialil-lactosa (Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc) . La referencia 19 reporta un ensayo que utiliza un arreglo de glicano que fue capaz de diferenciar claramente las preferencias del receptor para los enlaces a2,3 Ó a2,6. La referencia 20 reporta un ensayo basado en la aglutinación de los eritrocitos humanos enzimát icamente modificados para contener ya sea Sia (a2, 6) Gal ó Sia (OÍ2 , 3 ) Gal . Dependiendo del tipo de ensayo, éste puede ser realizado directamente con el virus mismo, o puede ser realizado indirectamente con la hemaglut inina purificada a partir del virus.
Materiales de referencia El actual proceso para fabricar virus de la influenza involucra la preparación de reactivos de referencia para cada cepa, a saber (i) un suero anti-HA y (ii) viriones enteros purificados. Estos reactivos calibrados son utilizados en un ensayo de SRID para determinar el nivel de HA en antigenos a granel producidos por los fabricantes, con lo cual se les permite diluir los graneles para dar vacunas con la cantidad deseada de la HA por dosis. Con el proceso actual, donde las cepas de referencia han sido pasadas a través de huevos y las cepas de producción son optimizadas para el crecimiento en huevos, los sueros y los antigenos en los reactivos de referencia concuerdan muy bien. Se ha encontrado, no obstante, que los sueros pueden ser de una pobre concordancia para antigenos producidos en cultivo celular, presumiblemente debido a las diferentes presiones de selección en los diferentes sistemas. La pobre reactividad entre los sueros de referencia y el antigeno significa que los niveles de HA estarán subestimados, conduciendo a (i) menos dosis a partir de un granel dado y (ii) la sobre-dosificación de HA en una vacuna. Para superar el problema de antigenos que concuerden derivados del cultivo celular con los sueros producidos contra materiales derivados del huevo, la invención proporcionó materiales de referencia basados en virus que no han sido adaptados al crecimiento basado en huevo. De este modo, la invención proporciona un proceso para preparar un antisuero a partir de animal, que comprende los pasos de: (i) administrarle al animal una hemaglutinina del virus de la influenza, purificada; y luego (ii) recuperar del animal el suero que contiene anticuerpos que reconocen la hemaglut inina , caracterizado porque la hemaglutinina utilizada en el paso (i) es proveniente de un virus desarrollado en una linea celular. La hemaglutinina utilizada en el paso (i) es preferentemente proveniente de un virus que nunca ha sido desarrollado en huevos. Por ejemplo, la hemaglutinina puede tener una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia («2 , 3 ) Gal . La hemaglutinina preferida utilizada para producir los antisueros es glucosilada con glicanos obtenibles a partir del crecimiento en una linea celular de mamífero (por ejemplo, las líneas celulares descritas en la presente), tal como MDCK. Los antisueros pueden ser generados para los virus de la influenza A y los virus de la influenza B. El animal es preferentemente un mamífero, tal como una cabra o más preferentemente una oveja. Los antisueros pueden ser convenientemente preparados en ovejas mediante la extracción de HA a partir del virus purificado, mediante tratamiento con bromelaina, seguido por la purificación mediante sedimentación sobre un gradiente de sucrosa. Una dosis de aproximadamente 50 g de hemaglutinina es administrada intramuscularmente a una oveja en combinación con el adyuvante completo de Freund (FCA) . Una dosis de 10 pg puede ser administrada dos semanas después, y luego 2-4 dosis adicionales a intervalos semanales. Después de esto, el suero puede ser recolectado. Antes del uso, éste puede ser diluido (por ejemplo, por el amortiguador de PBS que contiene azida de sodio) y llenado dentro de recipientes. El suero puede ser expuesto a un pH ácido (por ejemplo, pH 5 por dos horas) con el fin de cumplir los reglamentos de enfermedad de pie y boca. La invención también proporciona un proceso para preparar un antisuero proveniente de un animal, que comprende los pasos de: (i) desarrollar el virus de la influenza en una linea celular; (ii) purificar el antigeno hemaglutinina a partir del virus desarrollado en el paso (i); (iii) administrar la hemaglutinina purificada del paso (ii) al animal; y luego (iv) recuperar del animal el suero que contiene los anticuerpos que reconocen la hemaglutinina. La invención también proporciona los antisueros obtenidos mediante estos procesos. La invención también proporciona un gel que incluye este antisuero. De este modo, un proceso como se describe anteriormente para probar un antisuero proveniente de un animal, puede incluir el paso adicional de mezclar el antisuero con un gel. El gel es adecuado para realizar un ensayo de SRID, por ejemplo, éste es un gel de agarosa. Además de proporcionar el antisuero, la invención proporciona los materiales de referencia antigénicos. De este modo, la invención proporciona un proceso para preparar un material de referencia antigeno, que comprende los pasos de: (i) desarrollar el virus de la influenza en una linea celular; (ii) purificar los virus desarrollados en el paso (i) ; y (iii) inactivar el virus, caracterizado porque el virus de la influenza utilizado en el paso (i) nunca ha sido desarrollado en huevos. El proceso puede incluir un paso adicional de: (iv) liofilizar el virus inactivado. El virus utilizado en el paso (i) nunca ha sido desarrollado en huevos. Por ejemplo, su hemaglutinina puede tener una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a oligosacáridos con el disacárido terminal Sia (a2 , 3 ) Gal . El material de referencia está libre de materiales derivados de huevo (por ejemplo, libre de ovalbúmina, libre de ovomucoide, libre de ADN pollo) . Las glucoproteinas en el material de referencia serán glucosiladas con glicanos obtenibles a partir del desarrollo en una linea celular de mamífero (por ejemplo, las líneas celulares descritas en la presente) , tales como DCK. Los materiales de referencia pueden ser generados para los virus de la influenza A y los virus de la influenza B. Los materiales de referencia son usualmente utilizados en pares, y así pues la invención también proporciona un kit que comprende: (i) el antisuero obtenible mediante estos procesos y (ii) el material antigénico de referencia obtenible por estos procesos. La invención también proporciona un proceso para preparar el kit, que comprende los pasos de: (i) elaborar un antisuero como se describe anteriormente; (ii) elaborar un material antigénico de referencia como se describe anteriormente; y (iii) combinar los productos de los pasos (i) y (ii) en un kit. El antigeno y el antisuero son adecuados y están destinados para el uso en ensayos de SRID, y la invención proporciona un ensayo de inmunodifusión radial simple para la hemaglutinina del virus de la influenza, caracterizado porque el ensayo utiliza el antisuero obtenible mediante esos procesos y/o el material de referencia antigénico obtenible mediante estos procesos. El ensayo SRID involucrará los pasos de preparar un gel que incluye el antisuero, aplicar el material de referencia antigénico (reconstituido, donde sea necesario, en un medio acuoso) al gel (típicamente dentro de un pozo) , y luego permitir que el antígeno se difunda radialmente dentro del gel. El antígeno puede ser tratado con un detergente, tal como un detergente Zwittergent, antes del uso.
Virus (incluyendo virus semilla) preparados o aislados mediante técnicas de la invención Los virus preferidos de la influenza A de la invención (incluyendo los virus semilla, virus aislados de muestras de los pacientes utilizando células MDCKs, virus reclasificantes , etc.) incluyen menos de 6 {por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5) segmentos virales provenientes de un virus de la influenza PR/8/34. Preferentemente, éstos incluyen los segmentos PR/8/34. Si cualesquiera segmentos PR/8/34 están presentes, entonces éstos no incluirán el segmento HA de PR/8/34 y usualmente no incluirán el segmento NA de PR/8/34. De este modo, los virus preferidos son aquellos en los cuales al menos uno de los segmentos NP, M, NS, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de PR/8/34. Más preferentemente, al menos uno de los segmentos NP, M, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de PR/8/34. De este modo, la invención puede mejorar las vacunas existentes mediante la adición a los antigenos HA y NA normales, de uno o más antigenos adicionales que contienen epitopo, que es o son representantes de una cepa en circulación . Similarmente, los virus preferidos de la influenza A incluyen menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5) segmentos virales provenientes de un virus de la influenza AA/6/60 (A/Ann Arbor/6/60) . Preferentemente, éstos no incluyen segmentos AA/6/60. Si cualquiera de los segmentos AA/6/60 está/están presentes entonces éste/éstos no incluirán el segmento HA de AA/6/60, y usualmente no incluirán el segmento NA de AA/6/60. De este modo, los virus preferidos son aquellos en los cuales al menos uno de los segmentos NP, M, NS, ??, PB1 y/o PB2 no es derivado de AA/6/60. Más preferentemente, al menos uno de los segmentos NP, M, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de AA/6/60. Los virus preferidos de la influenza B incluyen menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5) segmentos virales provenientes de un virus de la influenza AA/6/66 (B/Ann Arbor/1/66) . Preferentemente, éstos no incluyen segmentos AA/1/66. Si cualquiera de los segmentos AA/1/66 está/están presentes entonces éste/éstos no incluirán el segmento HA de AA/1/66, y usualmente no incluirán el segmento NA de AA/1/66. De este modo, los virus preferidos son aquellos en los cuales al menos uno de los segmentos NP, M, NS, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de AA/1/66. Más preferentemente, al menos uno de los segmentos NP, M, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de AA/1/66. Los virus de la influenza preferidos de la invención (incluyendo virus semilla, virus aislados de muestras de pacientes utilizando células MDCK, virus reclasificantes , etc.) incluyen hemaglutinina con una preferencia de enlace por los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2 , 3 ) Gal . Esta preferencia de enlace es discutida con más detalle anteriormente.
Los virus de la influenza preferidos de la invención (incluyendo virus semilla, virus aislados de muestras de pacientes utilizando células MDCK, virus reclasificantes , etc.) incluyen glucoproteinas (incluyendo la hemaglutinina) con un patrón de glucosilación diferente a partir de los virus derivados de huevos. De este modo, las glucoproteinas comprenderán glucoformas que no son observadas en los virus desarrollados en huevos de pollo, por ejemplo éstos no pueden tener enlaces de azúcar no de ave, incluyendo enlaces de azúcar de mamífero.
Línea celulares La invención involucra el uso de líneas celulares que apoyan la replicación del virus de la influenza, y evita el uso de huevos. La línea celular será típicamente de origen de mamífero. Las células de mamífero adecuadas de origen incluyen, pero no están limitadas a, células de hámster, de res, de primate (incluyendo humanos y monos) y de perro, aunque el uso de células de primate no es preferido. Pueden ser utilizados diversos tipos de enlace, tales como las células de riñon, fibroblastos, células retínales, células de pulmón, etc. Los ejemplos de células de hámster adecuadas son las líneas celulares que tienen los nombres BHK21 ó HKCC. Las células de mono adecuadas son, por ejemplo, las células de mono verde africano, tales como las células de riñon como la linea de células Vero [21-23] . Las células de perro adecuadas son, por ejemplo, células de riñon, como las lineas celulares CLDK y MDCK. De este modo, las lineas celulares adecuadas incluyen, pero no están limitadas a: MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6 [24]; FRhL2; WI-38; etc. Las lineas celulares adecuadas son ampliamente disponibles, por ejemplo, de la colección American Type Cell Culture (ATCC) [25], de Coriell Cell Repositories [26], o de la European Collection of Cell Cultures (ECACC) . Por ejemplo, la ATCC suministra diversas células Vero diferentes bajo los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587, y ésta suministra las células MDCK bajo el número de catálogo CCL-34 PER.C6 está disponible de la ECACC bajo el número de depósito 96022940. Cualquiera de estos tipos celulares puede ser utilizado para el crecimiento, reclasificación y/o transmisiones de acuerdo a la invención. Las lineas celulares más preferidas son aquellas con glucosilación tipo mamífero. Como una alternativa menos preferida a las líneas celulares de mamífero, el virus puede ser desarrollado en líneas celulares de ave [por ejemplo, referencias 27-29], incluyendo las líneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, retina de pato) o gallinas, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo (CEF) , etc., pero el uso de células de mamífero significa que las vacunas pueden estar libres de ADN de ave y proteínas de huevo (tales como ovalbúmina y ovomucoide), reduciendo con esto la alergenicidad. Las líneas celulares más preferidas para el desarrollo del virus de la influenza son las líneas celulares MDCK [30-33], derivadas del riñon canino Madin Darby. La línea celular MDCK original está disponible de la ATCC como CCL-34, pero los derivados de esta línea celular pueden ser también utilizados. Por ejemplo, la referencia 30 describe una línea celular MDCK que fue adaptada para el crecimiento en cultivo en suspensión ('MDCK 33016' ó '33016-PF', depositada como DSM ACC 2219; ver también las referencias 34 y 35) . Similarmente, la referencia 36 describe una línea celular derivada de MDCK que se desarrolla en suspensión en cultivo libre de suero ('B-702', depositada como FERM BP-7449) . La referencia 37 describe las células MDCK no tumorígenas, incluyendo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), ' MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), ' MDCK-SF102 ' (ATCC PTA-6502) y ' MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503) . La referencia 38 describe las líneas celulares MDCKs con alta susceptibilidad a la infección, incluyendo las células ' MDCK.5F1 ' (ATCC CRL-12042) . Cualquiera de estas líneas celulares MDCK puede ser utilizada con la invención. Los virus pueden ser desarrollados sobre células en cultivo adherente o en suspensión. Los cultivos microportadores pueden ser también utilizados. En algunas modalidades, las células pueden ser de este modo adaptadas para el crecimiento en suspensión. Las lineas celulares son preferentemente desarrolladas en medio de cultivo libre de suero y/o medio libre de proteina. En el contexto de la presente invención, un medio es denominado como un medio libre de suero cuando éste no tiene aditivos provenientes del suero de origen humano o animal. Las células que se desarrollan en tales cultivos contienen de manera natural las proteínas mismas, pero se entiende que un medio libre de proteína significa uno en el cual la multiplicación de las células ocurre con la exclusión de (sin adición al medio de cultivo de) las proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos proteicos y proteínas no séricas, pero puede incluir opcionalmente (en los medios de cultivo) proteínas tales como tripsina u otras proteasas que pueden ser necesarias para el crecimiento viral Las líneas celulares que apoyan la replicación del virus de la influenza son preferentemente desarrolladas por debajo de 37°C [39] (por ejemplo, 30-36°C, o aproximadamente a 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C) durante la replicación viral. Por ejemplo, en el sexto aspecto, las células MDCK pueden ser desarrolladas (antes, durante o después del paso de aislamiento) a estas temperaturas, particularmente, durante la replicación viral.
Los métodos para preparar el virus de la influenza en células cultivadas (por ejemplo, para desarrollar el virus de la influenza en células MDCK cultivadas de acuerdo al sexto aspecto) incluye en general los pasos de inocular un cultivo de células con un inoculo de la cepa que va a ser desarrollada, cultivando las células infectadas por un periodo de tiempo deseado para la propagación del virus, tal como por ejemplo, como es determinado por el titulo del virus o la expresión del antigeno (por ejemplo, entre 24 y 168 horas después de la inoculación) y recolectando el virus propagado. Las células cultivadas son inoculadas con un virus (medido por PFU o TCID5o) a la proporción cellar de 1:500 a 1:1, preferentemente 1:100 a 1:5, más preferentemente 1:50 a 1:10. El virus es agregado a una suspensión de las células o es aplicado a una monocapa de las células, y el virus es absorbido sobre las células por al menos 60 minutos pero usualmente menos de 300 minutos, preferentemente entre 90 y 240 minutos a 25°C a 40°C, preferentemente 28°C a 37°C. El cultivo de células infectadas (por ejemplo, monocapas) puede ser removido ya sea mediante congelamiento-descongelamiento o mediante la acción enzimática para incrementar el contenido viral de los sobrenadantes de cultivo cosechados. Los fluidos cosechados son luego ya sea inactivados o bien almacenados congelados. Las células cultivadas pueden ser infectadas a una multiplicidad de infección ("m.o.i.") de aproximadamente 0.0001 a 10, preferentemente 0.002 a 5, más preferentemente de 0.001 a 2. Todavía más preferentemente, las células son infectadas a una a m.o.i de aproximadamente 0.01. Las células infectadas pueden ser cosechadas 30 a 60 horas después de la infección. Preferentemente, las células son cosechadas 34 a 48 horas después de la infección. Todavía más preferentemente, las células son cosechadas 38 a 40 horas después de la infección. Las proteasas (típicamente tripsina) son en general agregadas durante el cultivo celular para permitir la liberación viral, y las proteasas pueden ser agregadas en cualquier etapa adecuada durante el cultivo, por ejemplo, antes de la inoculación, al mismo tiempo que la inoculación, o después de la inoculación [39] . En modalidades preferidas, particularmente con las células MDCK, una línea celular no es sometida a transmisiones desde un banco de células de trabajo maestro, más allá de 40 niveles de duplicación de la población. El inoculo viral y el cultivo viral están preferentemente libres de (por ejemplo, habrán sido probados para y se les habrá dado un resultado negativo para contaminación por) virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza 3, coronavirus SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus , birnavirus, circovirus, y/o parvovirus [40] . Similarmente , las líneas celulares MDCK preferidas con el sexto aspecto están libres de (por ejemplo, habrán sido probados para y se les habrá dado un resultado negativo para contaminación por) virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza 3, coronavirus SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus , birnavirus, circovirus, y/o parvovirus. La ausencia de virus del herpes simple es particularmente preferida. Una linea celular MDCK utilizada con la invención no contiene preferentemente marcador para la resistencia a G418 (ver la referencia 16) . De este modo, la linea celular puede ser sensible al tratamiento con G418. La linea celular utilizada con la invención no contiene preferentemente plásmidos exógenos (ver la referencia 16), excepto por cualquiera que puede ser requerido para las técnicas de genética inversa.
Técnicas de genética inversa Como se mencionó anteriormente, la invención puede ser utilizada directamente con aislados clínicos o aislados primarios. Además, no obstante, la invención puede ser utilizada con cepas reclasificantes , incluyendo aquellas generadas utilizando técnicas de genética inversa [por ejemplo, 41-45] . Las técnicas de genética inversa pueden utilizar manipulación in vitro de los plásmidos para generar combinaciones de segmentos virales, para facilitar la manipulación de las secuencias de codificación o no codificación en los segmentos virales, para introducir mutaciones, etc. Las técnicas pueden ser utilizadas para virus de la influenza A y de la influenza B. La genética inversa involucra típicamente la expresión de (a) moléculas de AND que codifican para las moléculas de ARN virales deseadas, por ejemplo, provenientes de los promotores poli, los promotores de la ARN-polimerasa bacteriana, los promotores de la polimerasa de bacteriófago, etc. y (b) las moléculas de ADN que codifican para las proteínas virales, por ejemplo provenientes de los promotores polll, tal que la expresión de ambos tipos de ADN en una célula conduce al ensamblaje de un virión infeccioso intacto, completo. El ADN proporciona preferentemente todo el ARN viral y las proteínas que es también posible utilizar un virus cooperador para proporcionar algo del ARN y las proteínas. Los métodos basados en plásmidos utilizando plásmidos separados para producir cada ARN viral, son preferidos [46-48], y estos métodos también involucrarán el uso de plásmidos para expresar todas o algunas (por ejemplo, solos las proteínas PB1, PB2, PA y NP) de las proteínas virales, con 12 plásmidos que son utilizados en algunos métodos . Para reducir el número de plásmidos necesarios, un procedimiento reciente [49] combina una pluralidad de casetes de transcripción de ARN-polimerasa I (para la síntesis de la ARN viral) sobre el mismo plásmido (por ejemplo, las secuencias codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 segmentos de mARN del virus de la influenza A) , y una pluralidad de regiones de codificación de proteína con los promotores de ARN-polimerasa II sobre otro plásmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los transcriptos de mARN de la influenza A) . Los aspectos preferidos del método de la referencia 49 involucran: (a) regiones que codifican para el mARn de PB1, PB2 y PA, sobre un plásmido simple; y (b) los 8 segmentos que codifican para el vARN sobre un plásmido simple, incluyendo los segmentos de NA y HA sobre un plásmido y los otros seis segmentos sobre un plásmido pueden también facilitar el asunto. Debido a la especificidad de especie de los promotores poli, el promotor poli canino [50] puede ser utilizado cuando se realiza la genética inversa en células MDCK. Como una alternativa al uso de los promotores poli para codificar los segmentos de ARN viral, es posible utilizar los promotores de polimerasa de bacteriófago [51] . Por ejemplo, los promotores para las polimerasas SP6, T3 ó T7 pueden ser convenientemente utilizados. Debido a la especificidad de especie de los promotores poli, los promotores de la polimerasa de bacteriófago pueden ser más convenientes para muchos tipos celulares (por ejemplo, MDCK) , aunque una célula debe ser también transfectada con un plásmido que codifica para la enzima polimerasa exógena . En otras técnicas es posible utilizar promotores dobles poli y polll para codificar simultáneamente los ARNs virales y para los mARNs expresables provenientes de una plantilla simple [52,53] . Mientras que las cepas utilizadas para el crecimiento en huevos usualmente incluyen seis segmentos de ARN provenientes de un virus de la influenza A PR/8/34 (con los segmentos de HA y N que son provenientes de una cepa de vacuna, por ejemplo, un reclasificante 6:2), la evitación de huevos con la invención significa que pueden ser omitidos los segmentos de PR/8/34. Los virus de la influenza A pueden de este modo incluir menos de 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5) segmentos virales provenientes de un virus de la influenza PR/8/34. De este modo, los virus preferidos son aquellos en los cuales al menos uno de los segmentos NP, M, NS, PA, PB1 y/o PB2 no es derivado de PR/8/34. Un virus puede incluir un segmento NS que se originó en un virus de la influenza aviar. Donde la invención utiliza genética inversa, ésta permite que un segmento de ARN viral proveniente de un virus de la influenza fuente, sea transferido dentro del genoma de un virus de influenza de destino. Estos dos virus tendrán de este modo al menos un segmento de ARN viral en común. El término "en común" significa aquí una copia idéntica del segmento completo, pero puede también extenderse para significar una copia modificada del segmento con modificaciones en las regiones de codificación y/o no codificación. Donde son realizadas las modificaciones en la región de codificación, éstas sustancialmente no cambiarán la inmunogenicidad y/o la actividad de la proteina codificada. De este modo, un segmento de HA puede ser manipulado alrededor del sitio de escisión HA1/HA2 sin cambiar su habilidad para promover anticuerpos efectivos anti-HA cuando se administran a un paciente. De este modo, la genética inversa puede ser utilizada para modificar la HA natural de un virus aislado de acuerdo al sexto aspecto, por ejemplo, para eliminar los determinantes (por ejemplo, las regiones hiper-básicas alrededor del sitio de escisión HA1/HA2) que provocan que un virus sea altamente patógeno en especies de aves .
Preparación de la vacuna Diversas formas de la vacuna del virus de la influenza están actualmente disponibles (por ejemplo, ver capítulos 17 y 18 de la referencia 54) . Las vacunas están en general basadas ya sea en el virus vivo o en el virus inactivado. Las vacunas inactivadas pueden estar basadas en viriones completos, viriones 'divididos' o sobre antígenos superficiales purificados. Los antigenos de la influenza pueden ser presentados en la forma de virosomas. La invención puede ser utilizada cuando se fabrican cualquiera de estos tipos de vacunas. Los virus vivos incluyen el producto FLUMISTMR de Medlmmune (virus vivo trivalente) . La vacuna es preparada mediante un proceso que comprende el desarrollo del virus sobre un sustrato adecuado y luego la purificación de los viriones a partir de los fluidos que contienen viriones. Por ejemplo, los fluidos pueden ser aclarados mediante centrifugación, y estabilizados por amortiguador (por ejemplo, que contiene sucrosa, fosfato de potasio, y glutamato monosódico) . Donde es utilizado un virus inactivado, la vacuna puede comprender el virión completo, el virión dividido, o los antigenos superficiales purificados (incluyendo hemaglut inina y, usualmente, también incluyendo neuraminidasa ) . Los medios químicos para inactivar un virus incluyen el tratamiento con una cantidad efectiva de uno o más de los siguientes agentes: detergentes, formaldehído, ß-propiolactona , azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), etilamina binaria, acetiletilenimina , o combinaciones de las mismas. Los métodos no químicos de la invención viral son conocidos en la técnica, tales como por ejemplo, irradiación de luz UV o gamma.
Los viriones pueden ser cosechados de los fluidos que contienen virus mediante diversos métodos. Por ejemplo, un proceso de purificación puede involucrar la centrifugación zonal utilizando una solución de gradiente lineal de sucrosa que incluye detergente para desintegrar los viriones. Los antigenos pueden ser luego purificados, después de la dilución opcional, mediante diafiltración . Los viriones divididos son obtenidos mediante el tratamiento de los viriones purificados con detergentes (por ejemplo, éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Tritón X-100, Tritón N101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) para producir preparaciones de subviriones, incluyendo el proceso de división por ' Tween-éter ' . Los métodos de división de los virus de la influenza son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ver referencias 55-60, etc. La división del virus es típicamente llevada a cabo mediante la desintegración o fragmentación del virus completo, ya sea que sea infeccioso o no infeccioso, con una concentración de desintegración de un agente de división. La desintegración da como resultado una solubili zación completa o parcial de las proteínas virales, alterando la integridad del virus. Los agentes de división preferidos son surfactantes no iónicos e iónicos (por ejemplo, catiónicos) , por ejemplo, alquilglucósidos , alquiltioglucósidos, acil-azúcares , sulfobetaínas , betaínas, polioxietilenalquiléteres , N, N-dialquil-glucamidas , Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanoles, NP9, compuestos de amonio cuaternarios, sarcosil, CTABs (bromuros de cetil-trimetilamonio) , fosfato de tri-N-butilo, Cetavlon, sales de miristiltrimetilamonio, lipofectina, lipofectamina, y DOT-MA, los octil- o nonilfenoxi-polioxietanoles (por ejemplo, los surfactantes Tritón, tales como Tritón X-100 ó Tritón N101), ésteres de sorbitan de polioxiet ileno (los surfactantes Tween) , éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Un procedimiento de división útil utiliza los efectos consecutivos del desoxicolato de sodio y el formaldehido, y la división puede tener lugar durante la purificación inicial del virión (por ejemplo, en una solución de gradiente de densidad de sucrosa) . De este modo, un proceso de división puede involucrar la clarificación del material que contiene el virión (para eliminar el material no virión) , la concentración de los viriones cosechados (por ejemplo, utilizando un método de adsorción, tal como adsorción con CaHP04), la separación de los viriones enteros del material no virión, la división de los viriones utilizando un agente de división en un paso de centrifugación por gradiente de densidad (por ejemplo, utilizando un gradiente de sucrosa que contiene un agente de división tal como desoxicolato de sodio), y luego la filtración (por ejemplo, ultrafiltración) para eliminar los materiales no deseados. Los viriones divididos pueden ser útilmente resuspendidos en solución de cloruro de sodio isotónica, amortiguada con fosfato de sodio. Los productos de BEGRIVACMR, FLUARIXMR, FLUZONEMR y FLUSHIELDMR son vacunas divididas. Las vacunas de antigeno superficial purificadas comprenden los antigenos superficiales de la influenza hemaglutinina y, típicamente, también neuraminidasa . Los procesos para preparar estas proteínas en forma purificada son bien conocidos en la técnica. Los productos FLUVIRIN™, AGRI PPALMR e INFLUVACMR son vacunas subunitarias . Otra forma más de antígeno inactivado de la influenza es el virosoma [61] (partícula liposómica similares a virus, libres de ácido nucleico) . Los virosomas pueden ser preparados mediante la solubilización del virus de la influenza con un detergente, seguido por la eliminación de la nucleocápside y la reconstitución de la membrana que contiene las glucoproteíñas virales. Un método alternativo para preparar los virosomas involucra la adición de gluproteínas membranales virales a cantidades en exceso de fosfolípidos , para dar liposomas con proteínas virales en su membrana. La invención puede ser utilizada para almacenar virosomas a granel, como en los productos INFLEXALVMR e INVAVACMR. El virus de la influenza puede ser atenuado. El virus de la influenza puede ser sensible a la temperatura. El virus de la influenza puede ser adaptado al frío. Estas tres características son particularmente útiles cuando se utilizan virus vivos como un antígeno. HA es el inmunógeno principal en las vacunas de influenza inactivadas, actuales, y las dosis de vacuna son estandarizadas por referencia a los niveles de HA, típicamente medidos mediante SRID. Las vacunas existentes contienen típicamente aproximadamente 15 g de HA por cepa, aunque pueden ser utilizadas dosis menores, por ejemplo, para niños, o en situaciones pandémicas, cuando se utiliza un adyuvante. Las dosis fracciónales tales como un ½ {por ejemplo, 7.5 yg de HA por cepa), ¼ y 1/8 han sido utilizadas [81,82], por tener dosis más altas (por ejemplo, dosis 3x ó 9x [62,63]) . De este modo, las vacunas pueden incluir entre 0.1 y 150 yg de HA por cepa de influenza, preferentemente entre 0.1 y 50 pg por ejemplo, 0.1-20 pg, 0.1-15 µ?, 0.1-10 g, 0.1-7.5 g, 0.5-5 yg, etc. Las dosis particulares incluyen, por ejemplo, aproximadamente 45, aproximadamente 30, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7.5, aproximadamente 5, aproximadamente 3.8, aproximadamente 1.9, aproximadamente 1.5, etc. por cepa. Para vacunas vivas, la dosificación es medida por la dosis infecciosa mediana del cultivo de tejidos (TCID50) en vez del contenido de HA, y una TCID50 de entre 106 y 108 (preferentemente entre 106'5-107'5) por cepa, es típica. Las cepas utilizadas con la invención pueden tener una HA natural como es encontrada en los virus de tipo silvestre, o una HA modificada. Por ejemplo, es conocido el modificar la HA para eliminar determinantes (por ejemplo, regiones hiper-básicas alrededor del sitio de escisión HA1/HA2) que provocan que un virus sea altamente patógeno en especies de aves. Las cepas del virus de la influenza para el uso en vacunas cambian de estación en estación. En el periodo inter-pandémico actual, las vacunas incluyen típicamente dos cepas de influenza A (HlNl y H3N2) y una cepa de influenza B, y son típicas las vacunas trivalentes. La invención puede también utilizar cepas virales pandémicas (por ejemplo, cepas a las cuales el recipiente de la vacuna y la población humana en general están inmunológicamente intactos, en particular del virus de la influenza A) , tales como las cepas de los subtipos H2, H5, H7 ó H9 y las vacunas de la influenza para las cepas pandémicas pueden ser monovalentes o pueden estar basadas en una vacuna trivalente normal suplementada por una cepa pandémica. Dependiendo de la estación y de la naturaleza del antígeno incluido en la vacuna, no obstante, la invención puede proteger contra uno o más de los subtipos de HA, a saber Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ó H16. La invención puede proteger contra uno o más de los subtipos NA del virus de la influenza A, a saber, NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ó N9.
Así como es adecuado para inmunizar contra las cepas inter-pandémicas , las composiciones de la invención son particularmente útiles para la inmunización contra cepas pandémicas. Las características de una cepa de la influenza que le da el potencial para provocar un brote pandémico son: (a) ésta contiene una nueva hemaglutinina en comparación a las hemaglut ininas en las cepas humanas de circulación actual, por ejemplo, una que no ha sido evidente en la población humana por más de una década (por ejemplo, H2), o no ha sido previamente observada del todo en la población humana (por ejemplo, H5, H6 ó H9, que han sido encontradas en general únicamente en poblaciones de aves) , tal que la población humana estará inmunológicamente virgen a la hemaglutinina de la cepa; (b) ésta es capaz de ser transmitida hori zontalmente en la población humana; y (c) es patógena para los humanos. Un virus con el tipo de hemaglutinina H5 es preferido para inmunizar contra la influenza pandémica, tal como una cepa H5N1. Otras posibles cepas incluyen H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 y H7N7, y cualesquiera otras cepas pandémicas potencialmente emergentes. Dentro del subtipo H5, un virus puede caer en HA clade 1, HA clade 1', HA clade 2 ó HA clade 3 [64], con las clades 1 y 3 que son particularmente relevantes. Otras cepas cuyos antígenos pueden ser útilmente incluidos en las composiciones son las cepas que son resistentes a la terapia antiviral (por ejemplo, resistentes al oseltamivir [65] y/o zanamivir) , incluyendo la cepa pandémica resistentes [66] . Las composiciones de la invención pueden de este modo incluir uno o varios antigenos provenientes de una o más cepas del virus de la influenza (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó más) incluyendo el virus de la influenza A y/o el virus de la influenza B. Donde una vacuna incluye más de una cepa de la influenza, las diferentes cepas son típicamente desarrolladas separadamente y son mezcladas después de que los virus han sido cosechados y los antígenos han sido preparados. De este modo, un proceso de la invención puede incluir el paso de mezclar los antígenos provenientes de más de una cepa de la influenza. Es preferida una vacuna trivalente, incluyendo los antígenos provenientes de dos cepas del virus de la influenza A y una cepa del virus de la influenza B. En algunas modalidades de la invención, las composiciones pueden incluir el antígeno proveniente de una cepa de influenza A simple. En algunas modalidades, las composiciones pueden incluir el antígeno proveniente de dos cepas de influenza A, con la condición de que estas dos cepas no sean H1N1 y H3N2. En algunas modalidades, las composiciones pueden incluir el antígeno proveniente de dos de más cepas de la influenza A. La invención proporciona un proceso para preparar un antígeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, que comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza; (ii) infectar una linea celular con el virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza. El virus obtenido en el paso (iii) puede ser utilizado para preparar vacunas, por ejemplo, mediante métodos que involucran la inactivación, formulación, etc. El virus de la influenza recibido en el paso (i) tendrá una o más de las siguientes características: (a) éste nunca ha sido propagado sorbe un sustrato del huevo; (b) fue aislado en una célula MDCK, tal como una célula MDCK 33016 y/o una célula MDCK que se desarrolla en medio libre de suero; (c) nunca ha sido propagada sobre un sustrato que se desarrolla en un medio que contiene suero; (d) fue generada utilizando técnicas de genética inversa; (e) es un virus de la influenza A con menos de 6 segmentos virales provenientes de un virus de la influenza PR/8/34 y/o menos de seis segmentos virales provenientes de un virus de la influenza AA/6/60, o éste es un virus de la influenza B con menos de seis segmentos virales proveniente de un virus de la influenza AA/1/66; (f) incluye la hemaglutinina con una preferencia de enlace para los oligosacáridos con el disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (o¡2 , 3 ) Gal ; y/o (g) éste tiene las glucoproteínas (incluyendo la hemaglutinina) con un diferente patrón de glucosilación proveniente de los virus derivados de huevo. De este modo, el virus de la influenza recibido en el paso (i) puede haber sido obtenido como se describe en otro sitio en la presente.
ADN de célula hospedera Donde el virus ha sido desarrollado sobre una linea celular, entonces es una práctica estándar reducir al mínimo la cantidad de ADN residual de la línea celular, en la vacuna final, con el fin de reducir al mínimo cualquier actividad oncogénica del ADN. De este modo, una composición de vacuna comparada de acuerdo a la invención, preferentemente contiene menos de 10 ng (preferentemente menos de 1 ng, y más preferentemente menos de 100 pg) de ADN de célula hospedera residual por dosis, aunque pueden estar presentes cantidades en trazas del ADN de la célula hospedera. Vacunas que contenían <10 ng (por ejemplo, < 1 ng, < 100 pg) del AND de la célula hospedera por 15 yg de hemaglutinina , son preferidos, como lo son las vacunas que contienen < 10 ng (por ejemplo, < 1 ng, < 100 pg) del ADN de la célula hospedera por 0.25 mi de volumen. Vacunas que contenían < 10 ng (por ejemplo, < 1 ng, < 100 pg) del AND de la célula hospedera por 50 yg de hemaglutinina , son preferidos, como lo son las vacunas que contienen < 10 ng (por ejemplo, < 1 ng, < 100 pg) del ADN de la célula hospedera por 0.5 mi de volumen. Se prefiere que la longitud promedio de cualquier ADN de célula hospedera residual sea menor de 500 pares de bases, por ejemplo, menor de 400 pares de bases, menor de 300 pares de bases, menor de 200 pares de bases, menor de 100 pares de bases, etc. El ADN contaminante puede ser eliminado durante la preparación de la vacuna utilizando procedimientos de purificación estándares, por ejemplo, cromatografía, etc. La eliminación del ADN de célula hospedera residual puede ser aumentada mediante tratamiento con nucleasa, por ejemplo, mediante el uso de una ADNasa. Un método conveniente para reducir la contaminación por ADN de la célula hospedera, se describe en las referencias 67 y 68, que involucran un tratamiento de dos pasos, primeramente utilizando una ADNasa {por ejemplo, benzonasa), que puede ser utilizada durante el crecimiento viral, y luego un detergente catiónico (por ejemplo, CTAB) , el cual puede ser utilizado durante la desintegración del virión. El tratamiento con un agente alquilante, tal como ß-propiolactona , puede ser también utilizado para eliminar el ADN de la célula hospedera, y ventajosamente puede ser también utilizado para inactivar los viriones [ 69 ] . La medición del ADN de la célula hospedera residual es ahora un requerimiento regulatorio rutinario para productos biológicos está dentro de las capacidades normales de la persona experta en la materia. El ensayo utilizado para medir el ADN será típicamente un ensayo validado [70,71] . Las características del funcionamiento de un ensayo validado pueden ser descritas en términos matemáticos y cuantificables, y sus posibles fuentes de error habrán sido identificadas. El ensayo habrá sido probado en general para las características tales como la precisión, la exactitud y la especificidad. Una vez que un ensayo ha sido calibrado (por ejemplo, contra cantidades estándares conocidas del ADN de la célula hospedera) y probado, entonces pueden ser rutinariamente realizadas mediciones cuantitativas de ADN. Tres técnicas principales para la cuantificación del ADN pueden ser utilizadas: los métodos de hibridación, tales como la transferencia de Southern o las transferencias por ranura [72] ; los métodos de inmunoensayo, tales como los Sistemas ThresholdMR [73]; y PCR cuantitativa [74] . Estos métodos son todos familiares para la persona experta en la materia, aunque las características precisas de cada método pueden depender de la célula hospedera en cuestión, por ejemplo, la elección de las sondas para la hibridación, la elección de los cebadores y/o las sondas para la amplificación, etc. El Sistema ThresholdMR proveniente de Molecular Devices es un ensayo cuantitativo para niveles de picogramos del ADN total, y ha sido utilizado para monitorizar los niveles de ADN contaminante, en productos biofarmacéut icos [73] . Un ensayo típico involucra la formación no específica de secuencia de un complejo de reacción entre la proteína de enlace al ssADN biotinilado, un anticuerpo anti-ssADN conjugado a la ureasa, y el ADN. Todos los componentes de ensayo son incluidos en el kit de ensayo de ADN total completo, disponible del fabricante. Diversos fabricantes comerciales ofrecen ensayos de PCR cuantitativos para detectar el ADN de célula hospedera residual, por ejemplo, AppTecMR Laboratory Services, BioRelianceMR, Althea Technologies, etc. Una comparación de un ensayo de hibridación quimioluminiscente y el Sistema de ADN total ThresholdMR para medir la contaminación por ADN de células hospederas de una vacuna viral humana puede ser encontrado en la referencia 75.
Composiciones farmacéuticas Las composiciones de vacuna fabricadas de acuerdo a la invención son farmacéuticamente aceptables. Estas incluyen usualmente componentes además de los antígenos de la influenza, por ejemplo, éstas incluyen típicamente uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticos. Como se describe más adelante, los adyuvantes pueden ser también incluidos. Una discusión completa de tales componentes está disponible en la referencia 76.
Las composiciones de vacuna estarán en general en forma acuosa. Las composiciones de vacuna pueden incluir conservadores tales como tiomersal o 2-fenoxietanol . No obstante, se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre de (por ejemplo, menos de 5 pg/ml) material mercurial, por ejemplo, libre de tiomersal [59,77] . Las vacunas que no contienen mercurio son las más preferidas, el succinato de a-tocoferol puede ser incluido como una alternativa a los compuestos mercuriales [59] . Las vacunas libres de conservador son particularmente preferidos. Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica tal como una sal de sodio. Se prefiere cloruro de sodio (NaCl) el cual puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen el cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. Las composiciones de vacuna tendrán en general una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferentemente caerán dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg. Se ha reportado previamente que la osmolalidad no tiene un impacto sobre el dolor provocado por la vacunación [78], pero mantener la osmolalidad en ese intervalo es no obstante preferido . Las composiciones de vacuna pueden incluir uno o más amortiguadores. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato; un amortiguador de Tris; un amortiguador de borato; un amortiguador de succinato; un amortiguador de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores serán incluidos típicamente en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición de vacuna estará en general de entre 5.0 y 8.1, y más típicamente entre 6.0 y 8.0 por ejemplo, 6.5 y 7.5, o entre 7.0 y 7.8. Un proceso de la invención puede por lo tanto incluir un paso de ajusfar el pH de la vacuna a granel antes del envasado. La composición de vacuna es preferentemente estéril.
La composición de vacuna es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, conteniendo < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferentemente < 0.1 UE por dosis. La composición de vacuna está preferentemente libre de gluten. Las composiciones de vacuna de la invención pueden incluir detergente, por ejemplo, un surfactante de éster de polioxiet ilensorbitan (conocido como ' Tweens ' ) , un octoxinol (tal como octoxinol-9 (Tritón X-100) o t-octilfenoxipolietoxietanol ) , un bromuro de cetiltrimet ilamonio ( ' CTAB ' ) , o desoxicolato de sodio, particularmente para una vacuna antigénica dividida o superficial. El detergente puede estar presente únicamente en cantidades en trazas. De este modo, la vacuna puede ser incluida en menos de 1 mg/ml de cada uno de octoxinol-10 y polisorbato 80. Otros componentes residuales en cantidades en trazas podrían ser antibióticos (por ejemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B) . Una composición de vacuna puede incluir el material para una inmunización simple, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (por ejemplo, un kit de 'dosis múltiples') . La inclusión de un conservador es preferida en los arreglos de dosis múltiples. Como una alternativa (o en adición) a la inclusión de un conservador en composiciones de dosis múltiples, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación del material. Las vacunas de la influenza son típicamente administradas en un volumen de dosificación de aproximadamente 0.5 mi, aunque una dosis media (por ejemplo, aproximadamente 0.25 mi) puede ser administrada a niños. Las composiciones y los kits son preferentemente almacenados a entre 2°C y 8°C. Estas no deben ser congeladas. Estas deben ser idealmente mantenidas fuera de la luz directa.
Adyuvantes Las composiciones de la invención pueden incluir ventajosamente un adyuvante, el cual puede funcionar para aumentar las respuestas inmunitarias (humoral y/o celular) promovidas en un paciente quien recibe la composición. El uso de adyuvantes con vacunas de la influenza ha sido descrito anteriormente. En las referencias 79 y 80, se utilizó hidróxido de aluminio, y en la referencia 81, se utilizó una mezcla de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. La referencia 82 también describió el uso de adyuvantes de sal de aluminio. El producto FLUADMR de Chiron Vacunas incluye una emulsión aceite en agua. Los adyuvantes que pueden ser utilizados con la invención incluyen, pero no están limitados a: · Una composición que contiene mineral, incluyendo sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de las mismas) . Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas de "CAP" descritas en la referencia 83) . Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., con las sales que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.) . La adsorción de estas sales es preferida. Las composiciones que contienen minerales pueden ser también formuladas como una partícula de sal metálica [84] . Los adyuvantes de sal de aluminio son descritos con más detalle más adelante. Agentes inductores de citocina (ver con más detalle más adelante) . Saponinas [capitulo 22 de la referencia 112], que son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoid que son encontrados en la corteza, hojas, tallos, raices e incluso las flores de una amplia gama de especies vegetales. La saponina proveniente de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido ampliamente estudiada como adyuvante. La saponina puede también ser comercialmente obtenida de Smilax ornata ( zarzaparilla ) , Gypsophilla paniculata (pelo de novia), y Saponaria officianalis (raíz de sapo). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas tales como QS21, asi como formulaciones lipidicas tales como ISCOMs. QS21 es comercializado como StimulonMR. Las composiciones de saponina han sido purificadas utilizando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas especificas utilizando esta técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 es descrito en la referencia 85. Las formulaciones de saponina pueden también comprender un esterol, tal como colesterol [86] . Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden ser utilizadas para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) [capítulo 23 de la referencia 112]. Los ISCOMs también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Cualquier saponina conocida puede ser utilizada en ISCOMs. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs son además descritos en las referencias 86-88. Opcionalmente , los ISCOMS pueden estar desprovistos de detergente adicional [89]. Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponina puede ser encontrada en las referencias 90 y 91. Adyuvantes grasos (ver con más detalle más adelante) . Las toxinas de ribosilación de ADP bacterianas (por ejemplo, la enterotoxina "LT" lábil al calor de E. coli, la toxina del cólera "CT", o la toxina de pertusis "?t") y derivados destoxificados de las mismas, tales como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72 [92]: El uso de las toxinas de ribosilación de ADP destoxificadas , con adyuvantes mucosales se describe en la referencia 93 y como adyuvantes parenterales en la referencia 94. Los bioadhesivos y mucoadhesivos , tales como las microesferas de ácido hialurónico acidificado [95] o quitosano y sus derivados [96]. Micropartículas (por ejemplo, una partícula de ~ 100 nm hasta ~ 150 ym de diámetro, más preferentemente ~ 200 nm hasta ~ 30 µ?t? de diámetro, o ~ 500 nm hasta ~ 10 µp? de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (a-hidroxiácido ) , un ácido polihidroxibutirico, un poliortoéster , un polianhidrido , una policaprolactona, etc. ) , con el poli ( láctido-co-glucólido ) , que es preferido, opcionalmente tratado para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie parcialmente cargada (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB) . Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 112). Los ejemplos de formulaciones liposómicas adecuados para el uso como adyuvantes se describe en las referencias 97-99 Éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [100]. Tales formulaciones incluyen además los surfactantes de éster de polioxietilensorbitan en combinación con un octoxinol [101] así como los surfactantes de éteres o ésteres de polioxietilenalquilo en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol [102] . Los éteres de polioxietileno preferidos son seleccionados del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (lauret 9), éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxitilen-8-esteorolilo, éter de polioxietilen-4- laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23-laurilo. Péptidos de muramilo, tales como N - a ce t i lmu r ami 1 - L -treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP") , N-acetil-no rmu r ami 1 - L - a 1 an i 1 - D- i s og 1 u t ami na (nor-MDP) , N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxipropilamida ("DTP-DPP", o " The r ami deMR ) , N - a ce t i lmurami 1 - L - a 1 a n i 1 - D-isoglutaminil-L-alanin-2- (1 ' -2 'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina ("MTP-PE" ) . Una preparación de proteasoma de proteina de la membrana externa preparada a partir de una primera bacteria gram negativa, en combinación con una preparación de liposacárido derivada de una segunda bacteria gram negativa, en donde el proteosoma proteico de la membrana externa y las preparaciones del liposacárido, forman un complejo adyuvante no covalente, estable. Tales complejos incluyen "IVX-908", un complejo comprendido de la membrana externa de Neisseria meningitídis y 1 i popo 1 i s a cá r i do s . Estos han sido utilizados como adyuvantes para vacunas de la influenza [103] . 5 ' -monofosfato de metil-inosina ("MIMP") [104].
Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilada [105], tal como una que tiene la fórmula: donde R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, los grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo) , alquenilo, alquinilo y arilo lineales o ramificados, no sustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a: casuarina, casuarin- 6-a-D-glucopiranósida , 3-epi- casuarina, 7-epi-casuarina, 3, 7-diepi-casuarina, etc. Una gamma-inulina [106] o derivado de la misma tal como algamulina. • Un ligando CDld, tal como una a-galactosilceramida . Un polímero de polioxidonio [107, 108] u otro derivado de polietilen-piperazina N-oxidado. Estas y otras sustancias adyuvantes-act ivas son discutidas con más detalle en las referencias 112 yll3. Las composiciones pueden incluir dos o más de dichos adyuvantes. Por ejemplo, éstas pueden incluir ventajosamente una emulsión aceite en agua, y un agente inductor de citocina, ya que esta combinación mejora las respuestas de citocina promovidas por las vacunas de la influenza, tal como la respuesta al interferón-?, con el mejoramiento que es mucho mayor que el observado cuando se utiliza ya sea la emulsión o el agente por si solos. Los antigenos y adyuvantes en una composición estarán típicamente en una mezcla. Adyuvantes en emulsión aceite en agua Se ha encontrado que las emulsiones aceite en agua son particularmente adecuadas para el uso en adyuvar 'vacunas del virus de la influenza. Son conocidas diversas de tales emulsiones, y éstas incluyen típicamente al menos une aceite y al menos un surfactante, con el o los aceites y el o los surfactantes que son biodegradables (metabolizable) y biocompat ibles . Las gotitas de aceite en emulsión son en general de menos de 5 im de diámetro, y puede incluso tener un diámetro sub-micrónico , con estos tamaños pequeños que son alcanzados con un microfluidi zador para proporcionar emulsiones estables. Las gotitas con un tamaño menor de 220 nm son preferidas ya que éstas pueden ser sometidas a esterilización por filtración. La invención puede ser utilizada con aceites tales como aquellos provenientes de una fuente animal (tal como de pescado) o vegetal. Las fuentes para aceite vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite de coco y aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifica los aceites de nuez. El aceite de jojoba puede ser utilizado, por ejemplo, obtenido del frijol joroba. Los aceites de semilla incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de ajonjolí, y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros granos de cereal tales como el trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticali y similares pueden ser también utilizados. Los ásteres de ácido graso de 6-10 átomos de carbono del glicerol y el 1,2-propanodiol, mientras que no aparecen de manera natural en aceites de semilla, pueden ser preparados mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados, comenzado a partir de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y aceites provenientes de leche de mamífero son metabolizables y pueden por lo tanto ser utilizadas en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros provenientes de fuentes de animales, son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden ser fácilmente recuperados. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y el aceite de ballena tal como el espermaceti ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden ser realizados en la presente. Un número de aceites de cadena ramificada son sintetizados bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 átomos de carbono y son en general denominados como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado, ramificado, conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2 , 6 , 10 , 14 , 18 , 22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en la presente. El escualeno, el análogo saturado del escualeno, es también un aceite preferido. Los aceites de pescado incluyendo el escualeno y escualeno, son fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos en la materia. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (ver más adelante) . Las mezclas de aceites pueden ser también utilizadas . Los surfactantes pueden ser clasificados por su 1 HLB ' (balance hidrofílico/lipofílico) . Los surfactantes preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención puede ser utilizada con surfactantes que incluyen, pero no están limitados a: surfactantes de ésteres de polioxietilensorbitan (comúnmente denominados como los Tweens) , especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) , y/o óxido de butileno (BO) , vendidos bajo el nombre comercial D0WFAXMR, tales como los copolímeros en bloque de EO/PO lineales; octoxinoles, los cuales pueden variar en el número de grupos etoxi que se repiten (oxi-1, 2-etanodiilo) , con el octoxinol-9 (Tritón X-100, o el t-octilfenoxipolietoxietanol ) que es de interés particular; el ( octilfenoxi ) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; los fosfolipidos tales como la fosfat idilcolina (lecitina) ; los etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie NP de TergitolMR; los éteres grasos de polioxietileno derivados de los alcoholes laurilico, cetilico, estearilico y oleilico (conocidos como surfactantes Brij) , tales como el éter monolaurí lico de trietilenglicol (Brij 30) ; y los ésteres de sorbitan (comúnmente conocidos como los SPANs), tales como el trioleato de sorbitan (Span 85) y el monolaurato de sorbitan. Son preferidos los surfactantes no iónicos. Los surfactantes preferidos para incluirse en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitan) , Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Tritón X-100. Pueden ser utilizadas mezclas de surfactantes, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinación de éster de polioxietilensorbitan tal como el monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80) y un octoxinol tal como el t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100) es también adecuado. Otra combinación útil comprende lauret 9 más un éster de polioxietilensorbitan y/o un octoxinol. Las cantidades preferidas de los surfactantes (% en peso) son: ésteres de polioxietilensorbitan (tales como Tween 80) 0.01 a 1%, en particular aproximadamente 0.1%; octil- o nonilfenoxi-polioxietanoles (tales como Tritón X-100, u otros detergentes en la serie de Tritón) 0.001 a 0.1%, en particular 0.005 a 0.02%; los éteres de polioxietileno (tal como lauret 9) 0.1 a 20 %, preferentemente 0.1 a 10 % y en particular 0.1 a 1 % o aproximadamente 0.5%. Los adyuvantes en emulsión aceite en agua específicos, útiles para la invención incluyen, pero no están limitados a: • Una emulsión submicrónica del escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5% de escualeno, aproximadamente 0.5% de polisorbato 80 y aproximadamente 0.5% de Span 85. En términos de peso, estas proporciones se vuelven 4.3% de escualeno, 0.5% de polisorbato 80 y 0.48% de Span 85. Este adyuvante es conocido como ' F59' [109-111], como se describe con más detalle en el Capítulo 10 de la referencia 112 y el capítulo 12 de la referencia 113. La emulsión MF59 ventajosamente incluye iones citrato, por ejemplo, amortiguador de citrato de sodio 10 mM. Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina amortiguada con fosfato. Ésta puede también incluir Span 85 (por ejemplo, al 1%) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de tocoferol y de 0.3 a 3% de Tween 80, y la proporción en peso de escualeno : tocoferol es preferentemente < 1, ya que esta proporción a una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes en una proporción volumétrica de aproximadamente 5:2. Una emulsión de este tipo puede ser elaborada mediante la disolución de Tween 80 en PBS para dar una solución al 2%, luego mezclando 90 mi de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 mi de escualeno) , luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrónicas , por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm. Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y un detergente de Tritón (por ejemplo, Tritón X-100). La emulsión puede también incluir un 3d-MPL (ver más adelante) . La emulsión puede contener un amortiguador de fosfato. Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente de Tritón (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, succinato de a-tocoferol ) . La emulsión puede incluir estos tres componentes a una proporción en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 g/ml de polisorbato 80, 110 µg/ml de Tritón X-100 y 100 g/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones pueden incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de los antígenos. La emulsión puede también incluir escualeno. La emulsión puede también incluir un 3d-MPL (ver más adelante) . La fase acuosa puede contener un amortiguador de fosfato. Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PluronicMR L121"). La emulsión puede ser formulada en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4. Esta emulsión es un vehículo de distribución útil para los dipéptidos de muramilo, y ha sido utilizada con treonil-MDP con el adyuvante "SAF-I" [114] (0.05-1% de Thr-MDP, 5% de escualeno, 2.5% de Pluronic L121 y 0.2% de polisorbato 80) . Este puede ser también utilizado con Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" [115] (5% de escualeno, 1.25% de Pluronic L121 y 0.2% de polisorbato 80) . Es preferida la microfluidización . Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un surfactante no iónico hidrofílico de éter alquílico de polioxietileno (por ejemplo, éter cetoestearí lico de polioxietileno (12)) y un surfactante no iónico hidrofóbico (por ejemplo, un éster de sorbitan o éster de manide, tal como el monoleato de sorbitan o ' Span 80'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos 90% de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm [116]. La emulsión puede también incluir una o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltósido y/o sucrosa); y/o un alquilpoliglicósido . Tales emulsiones pueden ser liofilizadas . Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [117]. La concentración final (peso) de estos componentes en las vacunas adyuvadas son 5% de escualeno, 4% de poloxámero 105 (poliol pluronic) y 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprilico/cáprico ) . Una emulsión que tiene de 0.5-50% de un aceite, 0.1-10% de un fosfolipido, y 0.05-5% de un surfactante no iónico. Como se describe en la referencia 118, los componentes fosfolipidicos preferidos son fosfatidilcolina , fos fatidiletanolamina , fosfatidilserina, fosfatidilinositol , fosfatidilglicerol , ácido fosfatidico, esfingomielina y cardiolipina . Los tamaños de gotitas submicrónicos son ventajosos. Una emulsión aceite en agua submicrónica de un aceite no metabolizada (tal como aceite mineral ligero) y al menos un surfactante (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80) . Pueden ser incluidos aditivos, tales como la saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 119, producido por la adición de la amina alifática a la desacilsaponina vía el grupo carboxilo del ácido glucurónico) , el bromuro dimetildioctadecilamonio y/o la N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propandiamina . • Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipofilico no iónico, y un surfactante hidrofilico no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o el copolímero en bloque de polioxiet ilen- polioxipropileno) [120] . • Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrofilico no iónico, y un surfactante lipofilico no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o el copolímero en bloque de polioxietilen- polioxipropileno) [120] . Una emulsión en la cual una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) están como micelas helicoidales asociadas [121] . Las emulsiones pueden ser mezcladas con el antígeno extemporáneamente al tiempo de la distribución. De este modo, el adyuvante y el antígeno pueden ser mantenidos separadamente en una vacuna empaquetada o distribuida, lista para la formulación final al tiempo del uso. El antígeno estará en general en una forma acuosa, tal que la vacuna es finalmente preparada mediante el mezclado de dos líquidos. La proporción volumétrica de los dos líquidos para el mezclado puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero es generalmente de aproximadamente 1:1. Después que el antígeno y el adyuvante han sido mezclados, el antigeno de hemaglut inina permanecerá en general en una solución acuosa pero puede distribuirse a si mismo alrededor de la interfaz aceite/agua. En general, poca si es que nada de la hemaglut inina entrará a la fase aceitosa de la emulsión. Donde una composición incluye un tocoferol, puede ser utilizado cualquiera de los tocoferoles a, ß, ?, d, e o ?, pero son preferidos los a-tocoferóles . El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. El D-a-tocoferol y el DL-a-tocoferol pueden ser utilizados. Los tocoferoles son ventajosamente incluidos en vacunas para el uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo, de edades de 60 años o más) debido a que se ha reportado que la vitamina E tiene un efecto positivo sobre la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes [122] . Estos también tienen propiedades anti-oxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [123] . Un a-tocoferol preferido es el DL-a-tocoferol , y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Se ha encontrado que la sal de succinato coopera con los ligandos relacionados a TNF in vivo. Además, se sabe que el succinato de a-tocoferol es compatible con las vacunas de la influenza y es conservador útil como una alternativa a los compuestos mercuriales [59] .
Agentes inductores de citocina Los agentes inductores de citocina para la inclusión de las composiciones de la invención son capaces de, cuando son administrados en un paciente, promover el sistema inmunitario para liberar citocinas, incluyendo interferones e interleucinas . Se sabe que las respuestas de citocina están involucradas en las etapas temprana y decisiva de la defensa del hospedero contra la infección por influenza [124] . Los agentes preferidos pueden promover la liberación de uno o más de: interferón-?; interleucina-1 ; interleucina-2; interleucina-12 ; TNF- ; TNF-ß; y GM-CSF. Los agentes preferidos promueven la liberación de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria tipo Thl, por ejemplo, inteferón-?, TNF-a, interleucina-2. Se prefiere la estimulación del interferón-? y la interleucina-2. Como un resultado de la recepción de una composición de la invención, por lo tanto, un paciente tendrá solo células T que, cuando son estimuladas con un antigeno de la influenza, liberarán la o las citocinas deseadas de una manera especifica del antigeno. Por ejemplo, las células T purificadas de su sangre liberarán el ?-interferón cuando sean expuestas in vitro a la hemaglut inina del virus de la influenza. Los métodos para medir tales respuestas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son conocidos en la técnica, e incluyen ELISA, ELISPOT, citometria de flujo y PCR en tiempo real. Por ejemplo, la referencia 125 reporta un estudio en el cual las respuestas inmunitarias mediadas por células T, especificas del antigeno, contra el toxoide titánico, específicamente las respuestas del ?-interferón, fueron monitori zadas , y se encontró que el ELISPOT era el método más sensible para discriminar las respuestas inducidas por TT, específicas del antígeno, de las respuestas espontáneas, pero que la detección de la citocina intracitoplásmica mediante citometria de flujo fue el método más eficiente para detectar los efectos de re-es t imu 1 a c i ón . Los agentes inductores de citocina adecuados incluyen, pero no están limitados a: Un oligonucleótido inmunoestimulado , tal como uno que contiene una porción CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citocina no metilada enlazada por un enlace fosfato a una guanosina) , o un ARN de doble hebra, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica , o un oligonucleótido que contiene una secuencia poli (dG) . El monofosforil-lípido A 3-0-desacilado ('3dMPL' también conocido como 'MPLMR') [126-129].
Un compuesto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R-837") [130,131] , Resiquimod ("R-848") [132] , y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato) . Detalles adicionales respecto a las imida zoquinol inas inmunoestimuladoras pueden ser encontradas en las referencias 133 a 137. Un compuesto de t i o s emi c a rba z on a , tales como aquellos descritos en la referencia 138. Los métodos de formulación, fabricación y selección para los compuestos activos son también descritos en la referencia 138. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de células monon u c 1 e a r e s de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a. Un compuesto de t r i p t a n t r i na , tales como aquellos descritos en la referencia 139. Los métodos de formulación, fabricación, y selección para los compuestos activos, son también descritos en la referencia 139. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de las células mononuc 1 e a r e s de célula periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a. Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina) : y profármacos del mismo; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos descritos en las referencias 140 al 142; (f) un compuesto que tiene la fórmula: en donde : Ri y R2 son cada uno independientemente hidrógeno, halo, -NRaRb, -OH, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, arilo sustituido de 6 a 10 átomos de carbono, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono; R3 es ausente, hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, arilo sustituido de 6 a 10 átomos de carbono, heterociclilo o heterociclilo sustituido ; R4 y R5 son cada uno independientemente hidrógeno, halo, heterociclilo, heterociclilo sustituido, -C(0)-Rd, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono o se enlazan entre si para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5: X2 R -5 siendo logrado el enlace en las uniones indicadas por «AW XI y X2 son cada uno independientemente N, C, 0, ó S; Rs es hidrógeno, halo, -OH, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, -OH, -NRaRb, - (CH2) n-0-Rc, -0-(alquilo de 1 a 6 átomos de carbono), -S(0)pRe, o -C(0)- R9 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, heterociclilo, heterociclilo sustituido o Rga, en donde R9a es: siendo logrado el enlace en la unión indicada por ·???/ IO y R11 son cada uno independientemente hidrógeno, halo, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, -NRaRb, u -OH; cada Ra y Rb es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, -C(0)Rd, arilo de 6 a 10 átomos de carbono; cada Rc es independientemente hidrógeno, fosfato, difosfato, trifosfato, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, o alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono; cada Rd es independientemente hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, -NH2, -NH (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono), -NH (alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono), -N (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) 2, -N (alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono) 21 arilo de 6 a 10 átomos de carbono o heterociclilo; cada Re es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, arilo sustituido de 6 a 10 átomos de carbono, heterociclilo o heterociclilo sustituido; cada Rf es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, -C(0)Rd, fosfato, difosfato, o trifosfato; cada n es independientemente O, 1, 2, ó 3; cada p es independientemente 0, 1, ó 2; ó ó (g) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f), un tautómero de cualquiera de (a) a (f), o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. • Loxorribina ( 7-alil-8-oxoguanosina ) [143]. • Los compuestos descritos en la referencia 144, incluyendo: los compuestos de acilpiperazina, compuestos de indoldiona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ) , compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobencimidazol- quinolinona (ABIQ) [145,146], compuestos de hidraftalamida , compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol [147], compuestos de antraquinona , compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina , y compuestos de benzazol [148]. • Los compuestos descritos en la referencia 149. · Un derivado de fosfato de aminoalquil-glucosaminida , tal como RC-529 [150, 151] . • Un fosfazeno, tal como poli [di (carboxilatofenoxi ) fosfazeno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en la referencias 152 y 153. · Inmunopotenciadores de molécula pequeña (S IPs) tales como : N2-metil-l- (2-metilpropil) -1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-2 , 4 -diamina N2 , 2-dimetil-l- (2-metilpropil ) -1H-imidazo [4,5-c]quinolin-2, 4 -diamina N2-etil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [ 4 , 5-c]quinolin-2, 4 -diamina N2-metil-l- (2-metilpropil ) -N2-propil-lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina 1- (2-metilpropil) -N2-propil-lH-imidazo [4,5-c]quinolin-2 , 4 -diamina N2-butil-l- (2-metilpropil ) -1H-imidazo [4, 5-c]quinolin-2 , 4 -diamina N2-butil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil ) -N2-pentil-lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N2-prop-2-enil-lH-imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4-diamina 1- (2-metilpropil) -2- [ (fenilmetil) tio] -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4 -amina 1- (2-metilpropil ) -2- (propiltio) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina 2- [ [ 4-amino-l- (2-metilpropil ) -lH-imidazo [4, 5-c] quinolin 2-il] (metil ) amino] etanol acetato de 2- [ [ 4 -amino-1- ( 2-metilpropil ) -lH-imidazo [ 4 , 5- c]quinolin-2-il] (metil) amino ] etilo 4 -amino-1- ( 2-metilpropil ) -1 , 3-dihidro-2H-imidazo [4,5- c] quinolin-2-ona N2-butil-l- (2-metilpropil) -N4,N4-bis ( fenilmetil ) -1H- imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4 -diamina N2-butil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -N4,N4- bis ( fenilmetil ) -1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4 -diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N4,N4-bis (fenilmetil) -1H- imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4 -diamina N2,N2-dimetil-l- (2-metilpropil) -N4,N4-bis (fenilmetil) - 1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4 -diamina 1- { 4-amino-2- [metil (propil) amino] -1H-imidazo [4,5- c]quinolin-l-il} -2-metilpropan-2-ol 1- [4-amino-2- (propilamino ) -1H-imidazo [4,5-c]quinolin-l- il] -2-metilpropan-2-ol N4,N4-dibencil-l- ( 2-metoxi-2-metilpropil ) -N2-propil-lH- imidazo [4, 5-c] quinolin-2, 4 -diamina . Los agentes inductores de citocinas para el uso en la presente invención pueden ser moduladores y/o agonistas de receptores similares a peage (TLR) . Por ejemplo, éstos pueden ser agonistas de una o más de las proteínas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4 , TLR7, TLR8, y/o TLR9 humanas. Los agentes preferidos son agonistas de TLR7 (por ejemplo, imidazoquinolinas ) y/o TLR9 (por ejemplo, oligonucleótidos de CpG) . Estos agentes son útiles para activar las vías de inmunidad innatas. El agente inductor de citocina puede ser agregado a la composición en diversas etapas durante su producción. Por ejemplo, esto puede estar dentro de una composición antigénica, y esta mezcla puede ser luego agregada a una emulsión aceite en agua. Como una alternativa, ésta puede estar dentro de una emulsión aceite en agua, en cuyo caso el agente puede ser agregado ya sea a los componentes de la emulsión antes de la emulsificación, o bien puede ser agregado a la emulsión después de la emulsificación . Similarmente, el agente puede ser coacervado dentro de gotitas de la emulsión. La localización y distribución del agente inductor de citocina dentro de la composición final dependerá de sus propiedades hidrofilicas/lipofilicas, por ejemplo, el agente puede estar localizado en la fase acuosa, en la fase aceitosa y/o en la interfaz aceite-agua. El agente inductor de citocina puede ser conjugado a un agente separado, tal como un antigeno (por ejemplo, CR 197). Una revisión general de las técnicas de conjugación para las moléculas pequeñas se proporciona en la referencia 154. Como una alternativa, los adyuvantes pueden ser no covalentes asociados con agentes adicionales, tales como por medio de interacciones hidrofóbicas o iónicas. Dos agentes inductores de citocina preferidos son (a) los oligonucleótidos inmunoestimuladores y (b) 3dMPL. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones de nucleótidos/análogos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o (excepto para el ARN) de una sola hebra. Las referencias 155, 156 y 157 describen las posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, el reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina . El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG es además discutido en las referencias 158-163. Una secuencia de CpG puede ser dirigida a TLR9, tal como la porción GTCGTT ó TTCGTT [164] . La secuencia CpG puede ser especifica para inducir una respuesta inmunitaria de Thl, tal como el ODN CpG-A (oligodesoxinucleótido) , o puede ser más especifica para inducir una respuesta de células B, tal como ODN CpG-B. Los ODNs CpG-A y CpG-B ODNs son discutidos en las referencias 165-167. Preferentemente, CpG es un ODN CpG-A. Preferentemente, el oligonucleótido CpG está construido de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente , pueden ser enlazadas dos secuencias oligonucleotidicas CpG en sus extremos 3' para formar los "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, las referencias 164 y 168-170. Un adyuvante de CpG útiles es CpG7909, también conocido como ProMuneMR (Coley Pharmaceut ical Group, Inc. ) . Como una alternativa, o en adición al uso de las secuencias de CpG, las secuencias de TpG pueden ser utilizadas [171] . Estos oligonucleótidos pueden estar libres de porciones CpG no metiladas. El oligonucleótido inmunoest imulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, éste puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se describe en la referencia 171), y/o puede tener una composición de nucleótidos con más de 25% de timidina (por ejemplo, >35%, >40%, >50% >60%, >80%, etc.) . Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citocina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se describe en la referencia 171) , y/o puede tener una composición nucleotidica con más de 25% de citocina (por ejemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.) . Estos oligonucleótidos pueden estar libres de porciones CpG no metiladas. Los oligonucleótidos inmunoest imuladores comprenderán típicamente al menos 20 nucleótidos. Estos pueden comprender menos de 100 nucleótidos. El 3dMPL (también conocido como monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado o 3-0-desacil-4 ' -monofosforil-lípido A) es un adyuvante en cuya posición 3 de la glucosamina del extremo reductor en el monofosforil-lípido A, ha sido desacilada. 3dMPL ha sido preparado a partir de un mutante sin heptosa de Salmonella Minnesota , y es químicamente similar al lípido A, pero carece de un grupo fosforilo lábil al ácido y un grupo acilo lábil a la base. Este activa células de la linea de monocitos-macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-OÍ y GM-CSF (ver también referencia 172) . La preparación de 3dMPL fue originalmente descrita en la referencia 173. 3dMPL puede tomar la forma de una mezcla de moléculas relacionadas, que varían por su acilación (por ejemplo, teniendo 3, 4, 5 ó 6 cadenas acilo, que pueden ser de longitudes diferentes) . Los dos monosacáridos de glucosamina (también conocidos como 2-desoxi-2-amino-glucosa ) están N-acilados en sus carbonos de la posición 2 (por ejemplo, las posiciones 2 y 2') , y existe también O-acilación en la posición 3' . El grupo enlazado al carbono 2 tiene la fórmula -NH-CO-CHz-CR ' . El grupo enlazado al carbono 2' tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2 ' . El grupo enlazado al carbono 3' tiene la fórmula -0-CO-CH2-CR3R3. En una estructura representativa A es: Los grupos R1, R2 y R3 son cada uno independientemente - (CH2)n- H3. El valor de n está preferentemente entre 8 y 16, más preferentemente entre 9 y 12, y lo más preferentemente 10. Los grupos R1', R2' y R3' cada uno independientemente son: (a) -H; (b) -OH; ó (c) -O-CO-R4, donde R4 es ya sea -H ó -(CH2)m-CH3, en donde el valor de m está preferentemente entre 8 y 16, y es más preferentemente de 10, 12 ó 14. En la posición 2, m es preferentemente 14. En la posición 2', m es preferentemente 10. En la posición 3', m es preferentemente 12. Los grupos R1' , R2' y R3' son de este modo preferentemente grupos -O-acilo provenientes del ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico o ácido hexadecanoico. Cuando todos de R1' , R2' y R3' son -H, entonces el 3dMPL tiene únicamente 3 cadenas de acilo (una en cada una de las posiciones 2, 2' y 3'). Cuando únicamente dos de R1', R2' y R3' son -H entonces el 3dMPL puede tener 4 cadenas de acilo. Cuando únicamente uno de R1', R2' y R3' es -H, entonces 3d PL puede tener 5 cadenas de acilo. Cuando ninguno de R1', R2' y R3' es -H, entonces 3dMPL puede tener 6 cadenas de acilo. El adyuvante de 3dMPL utilizado de acuerdo a la invención puede ser una mezcla de estas formas, con 3 a 6 cadenas de acilo, pero se prefiere incluir 3dMPL con 6 cadenas de acilo en la mezcla, en particular para asegurar que la cadena de hexaacilo constituya al menos 10% en peso del total de 3dMPL, por ejemplo, >20%, >30%, >40%, >50% ó más. 3dMPL con 6 cadenas de acilo ha sido encontrada como la forma más activa como adyuvante . De este modo, la forma más preferida de 3dMPL para la inclusión en las composiciones de la invención tiene la fórmula (IV), mostrada más adelante. Donde 3dMPL es utilizado en la forma de una mezcla, entonces, las referencias a cantidades o concentraciones de 3dMPL en las composiciones de la invención, se refieren a las especies de 3dMPL combinadas en la mezcla. En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelados o partículas en diferentes tamaños, por ejemplo, con un diámetro <150 nm ó >500 nm. Uno o ambos de éstos pueden ser utilizados con la invención, y las mejores partículas pueden ser seleccionadas mediante ensayo rutinario. Partículas más pequeñas (por ejemplo, lo suficientemente pequeñas para dar una suspensión acuosa clara de 3d PL) son preferidas para el uso de acuerdo a la invención, debido a su actividad superior [174] . Las partículas preferidas tienen un diámetro medio de 220 nm, más preferentemente menor de 200 nm o menor de 150 nm o menor de 120 nm, y pueden tener cada uno un diámetro medio menor de 100 nm. En la mayoría de los casos, no obstante, el diámetro medio será no menor de 50 nm. Estas partículas son lo suficientemente pequeñas para ser adecuadas para la esterilización por filtración. El diámetro de partícula puede ser evaluado mediante la técnica rutinaria de dispersión de luz dinámica, la cual revela un diámetro de partícula media. Donde se dice que una particular tiene un diámetro de x nm, existirá en general una distribución de partículas alrededor de esta media, pero al menos 50% en número (por ejemplo, >60%, >70%, >80%, >90%, ó más) de las partículas tendrán un diámetro dentro del intervalo de x ± 25%. 3dMPL puede ser ventajosamente utilizado en combinación con una emulsión aceite en agua. Sustancialmente todo el 3dMPL puede estar localizado en la fase acuosa de la emulsión. El 3dMPL puede ser utilizado por si solo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, es conocido utilizar 3dMPL en combinación con la saponina QS21 [175] (incluyendo en una emulsión aceite en agua [176]), con un oligonucleótido inmunoestimulador, con QS21 y un oligonucleótido inmunoestimulador, con el fosfato de aluminio [177], con el hidróxido de aluminio [178], o con fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio.
Fórmula (IV) Adyuvantes grasos Los adyuvantes grasos que pueden ser utilizados con la invención incluyen las emulsiones aceite en agua descritas anteriormente y también incluyen, por ejemplo: • Un compuesto de la fórmula I, II ó III, ó una sal del mismo : II ?? como se define en la referencia 179, tales como ' ER 803058', 'ER 803732', ' ER 804053', ' ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', ' ER 804680', ' ER 804764', 'ER 803022 ó 'ER 804057' por ejemplo: E 804057 Los derivados del lipido A de Escherichia coli tales como OM-174 (descrito en las referencias 180 yl81) . Una formulación de un lipido catiónico y un co-lipido (usualmente neutro) , tal como el bromuro de aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanamini-dif itanoí lf osf atidil-etanolamina ( " Va x f e c t i nMR" ) o el bromuro de aminopropil-dimetil-bis-dodecí loxi-propanaminio-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE: DO PE") Las formulaciones que contienen las sales de (±)-N - (3-aminopropil) -N,N-dimetil-2, 3-bis (sin-9-t e t r ade ce n e i 1 o x i ) - 1 -p r opanami n i o son preferidas [182] . El mono f o s f o r i 1 - 1 ip i do A 3 -O- de s a c i 1 a do (ver arriba) . Los compuestos que contienen lipidos enlazados a una cadena principal aciclica que contiene fosfato, tales como el E5564 antagonista de TLR4 [ 183 , 184 ] : Adyuvantes de sales de aluminio Los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio pueden ser utilizados. Estos nombres son convencionales, pero son utilizados por conveniencia únicamente, ya que ninguno es una descripción precisa del compuesto químico efectivo que está presente (por ejemplo, ver capítulo 9 de la referencia 112) . La invención puede utilizar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o "fosfato" que están en uso general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, las cuales son usualmente al menos parcialmente cristalinas. El oxihidróxido de aluminio, el cual puede ser representado por la fórmula AIO(OH), puede ser distinguido de otros compuestos de aluminio tales como el hidróxido de aluminio Al (OH) 3 , mediante espectroscopia de infrarrojo (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorción a 1070 cm"1 y un hombro fuerte a 3090-3100 crrf1 [capitulo 9 de la referencia 112] . El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidroxido de aluminio es reflejada por la anchura de la banda de difracción a la altura media (WHH) , con partículas pobremente cristalinas que muestran mayor ensanchamiento lineal debido a los tamaños más pequeños de cristalito. El área superficial se incrementa conforme se incrementa la WHH, y los adyuvantes con valores más altos de WHH han mostrado que tienen mayor capacidad para la adsorción del antígeno. Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en las microfotografías electrónicas de transmisión) es típica para los adyuvantes de hidroxido de aluminio. El pl de los adyuvantes de hidroxido de aluminio es de aproximadamente 11, por ejemplo, el adyuvante mismo tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Las capacidades adsortivas de entre 1.8-2.6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7.4, han sido reportadas para los adyuvantes de hidroxido de aluminio. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, a menudo conteniendo también una pequeña cantidad de sulfato (por ejemplo, sulfato de hidroxifosfato de aluminio) . Estos pueden ser obtenidos mediante precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen el grado de sustitución del fosfato para el hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen en general una proporción molar P04/A1 entre 0.3 y 1.2. Los hidroxifosfatos pueden ser distinguidos del A1P04 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro de IR a 3164 cm-1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200°C) indica la presencia de hidroxilos estructurales [capitulo 9 de la referencia 112] . La proporción molar P04/A13+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estará en general entre 0.3 y 1.2, preferentemente entre 0.8 y 1.2, y más preferentemente de 0.95 ± 0.1. El fosfato de aluminio será en general amorfo, particularmente para las sales de hidroxifosfato . Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar a PO4/AI entre 0.84 y 0.92, incluida en 0.6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio será en general particulado (por ejemplo, morfología en forma de placas como se observa en las microfotografías electrónicas de transmisión) . Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0.5-20 µp? (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción del antígeno. Las capacidades adsortivas de entre 0.7-1.5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7.4, han sido reportadas para los adyuvantes de fosfato de aluminio. El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está inversamente relacionada al grado de sustitución del fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos utilizados para preparar la sal mediante precipitación. PZC es también alterado para cambiar la concentración de los iones fosfato libre en solución (más fosfato = más PZC ácido) o por la adición de un amortiguador tal como el amortiguador de histidina (hace más básico a PZC) . Los fosfatos de aluminio utilizados de acuerdo a la invención tendrán en general una PZC de entre 4.0 y 7.0, más preferentemente entre 5.0 y 6.5, por ejemplo, de aproximadamente 5.7. Las suspensiones de las sales de aluminio utilizadas para preparar las composiciones de la invención pueden contener un amortiguador (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un amortiguador de Tris), pero esto no es siempre necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógeno. Una suspensión puede incluir iones fosfatos acuosos libres, por ejemplo, presentes a una concentración de entre 1.0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente de 10 mM. Las suspensiones pueden también comprender cloruro de sodio. La invención puede utilizar una mezcla de hidróxido de aluminio y un fosfato de aluminio [81] . En este caso, puede existir más fosfato de aluminio que hidróxido de aluminio, por ejemplo, una proporción en peso de al menos 2:1 por ejemplo, > 5:1, > 6:1, > 7:1, > 8:1, > 9:1, etc. La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente, es preferentemente menor de 10 mg/ml, por ejemplo, < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido está entre 0.3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0.85 mg/dosis. Asi como se incluye en uno o más adyuvantes de sal de aluminio, el componente adyuvante puede incluir uno o más agentes adyuvantes o inmunoest imuladores adicionales. Tales componentes adicionales incluyen, pero no están limitados a: el adyuvante de monofosforil-lipido A 3-O-desacilado ( ' 3d-MPL') ; y/o una emulsión aceite en agua.
Empaquetamiento de composiciones de vacuna Los recipientes adecuados para las composiciones de la invención (o componentes de kit) incluyen frascos viales, jeringas (por ejemplo, jeringas desechables ) , rocíos nasales, etc. Estos recipientes deben ser estériles. Donde una composición/componente está localizada en un vial, el vial es preferentemente elaborado de un material de vidrio o de plástico. El vial es preferentemente esterilizado antes de que sea agregada a ésta la composición. Para evitar problemas con los pacientes sensibles al látex, los viales son preferentemente sellados con un tapón libre de látex, y se prefiere la ausencia de látex en todo el material de envasado. El vial puede incluir una dosis simple de vacuna, o puede incluir más de una dosis (un vial de "dosis múltiples") por ejemplo 10 dosis. Los viales preferidos son elaborados de vidrio incoloro. Un vial puede tener una tapa (por ejemplo un seguro Luer) adaptado tal que una jeringa pre-llenada puede ser insertada dentro de la tapa, el contenido de la jeringa puede ser expulsado hacia el vial (por ejemplo, para reconstituir el material liofilizado en éste), y los contenidos del vial pueden ser extraídos hacia la jeringa. Después del retiro de la jeringa del vial, puede ser entonces acoplada una aguja y la composición puede ser administrada a un paciente. La tapa está preferentemente localizada dentro de un sello o cubierta, tal que el sello o cubierta tiene que ser retirado antes de que pueda ser accedida la tapa. Un vial puede tener una tapa que permita el retiro aséptico de sus contenidos, particularmente para viales de dosis múltiples. Donde un componente es envasado dentro de una jeringa, la jeringa puede tener una aguja acoplada a ésta. Si la aguja no está acoplada, puede ser suministrada una aguja separada con la jeringa para el ensamblaje y uso. Tal aguja puede estar protegida. Las agujas de seguridad son protegidas. Son típicas las agujas de calibre 23 de 2.5 cm (1 pulgada), calibre 25 de 2.5 cm (1 pulgada) y de calibre 25 de 1.58 cm (5/8 de pulgada) . Las jeringas pueden ser provistas con etiquetas desprendibles sobre las cuales puede ser impreso el número de lote, la estación de la influenza y la fecha de expiración de los contenidos, para facilitar el mantenimiento de registros. El émbolo en la jeringa tiene preferentemente un tapón para prevenir que el émbolo sea accidentalmente retirado durante la aspiración. Las jeringas pueden tener una tapa de caucho de látex y/o un émbolo. Las jeringas desechables contienen una dosis simple de vacuna. La jeringa tendrá en general una tapa de punta para sellar la punta antes del acoplamiento a una aguja, y la tapa de punta es preferentemente elaborada de un caucho de butilo. Si la jeringa y la aguja son empaquetadas separadamente, entonces la aguja está preferentemente ajustada con una protección o blindaje de caucho de butilo. Las jeringas preferidas son aquellas comercializadas bajo el nombre comercial "Tip-LokMR". Los recipientes pueden estar marcados para mostrar un volumen de dosis media, por ejemplo, para facilitar la administración a niños. Por ejemplo, una jeringa que contiene una dosis de 0.5 mi puede tener una marca que muestre un volumen de 0.25 mi. Donde se utiliza un recipiente de vidrio (por ejemplo una jeringa o un vial), entonces se prefiere utilizar un recipiente elaborado de un vidrio de borosilicato en vez de un vidrio de sosa y cal.
Un kit o composición puede ser empaquetado (por ejemplo en la misma caja) con un folleto que incluya los detalles de la vacuna, por ejemplo, las instrucciones para la administración, los detalles de los antigenos dentro de la vacuna, etc. Las instrucciones pueden también contener advertencias, por ejemplo para mantener una solución de adrenalina fácilmente disponible en el caso de una reacción anafiláctica después de la vacunación, etc.
Métodos de tratamiento y administración de la vacuna La invención proporciona una vacuna fabricada de acuerdo a la invención. Las composiciones de vacuna fabricadas de acuerdo a la invención son adecuadas para la administración a pacientes humanos, y la invención proporciona un método para producir una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende el paso de administrar una composición de la invención al paciente . La invención también proporciona una composición de la invención para el uso como un medicamento. La invención también proporciona el uso de un antigeno del virus de la influenza preparado de acuerdo a la invención, en la fabricación de un medicamento para producir una respuesta inmunitaria en un paciente. La respuesta inmunitaria producida mediante estos métodos y usos incluirá en general una respuesta de anticuerpo, preferentemente una respuesta de anticuerpo protector. Los métodos para evaluar ¦ las respuestas de anticuerpo, la capacidad neutralizadora y la protección después de la vacunación para el virus de la influenza, son bien conocidos en la materia. Los estudios en humanos han mostrado que los títulos de anticuerpo contra la hemaglut inina del virus de la influenza humana están correlacionados con la protección (un título de inhibición de hemaglutinina de la muestra de suero de aproximadamente 30-40, da alrededor de una protección del 50% a partir de la infección por un virus homólogo) [185] . Las respuestas de anticuerpo son típicamente medidas mediante la inhibición de la hemaglutinación, mediante microneutralización, mediante inmunodifusión radial simple (SRID) , y/o mediante hemolisis radial simple (SRH) . Estas técnicas de ensayo son bien conocidas en la técnica. Las composiciones de la invención pueden ser administradas de varias formas. La ruta de inmunización más preferida es mediante inyección intramuscular (por ejemplo dentro el brazo o la pierna) , pero otras rutas disponibles incluyen inyección subcutánea, intranasal [186-188], oral [189], intradérmica [190, 191], transcutánea , transdérmica [192], etc. Las vacunas preparadas de acuerdo a la invención pueden ser utilizadas para tratar a niños y adultos. Las vacunas de la influenza son actualmente recomendadas para el uso en inmunización pediátrica y de adultos, desde la edad de 6 meses. De este modo, el paciente puede ser menor de 1 año de edad, de 1 a 5 años de edad, de 5 a 15 años de edad, de 15 a 55 años de edad, o al menos de 55 años de edad. Los pacientes preferidos para la recepción de las vacunas son los ancianos (por ejemplo > 50 años de edad, >60 años de edad, y preferentemente >65 años), los pacientes jóvenes (por ejemplo, =5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores del cuidado de la salud, personal del servicio armado y del ejercito, mujeres embarazadas, pacientes crónicamente enfermos, pacientes inmunodeficientes , pacientes quienes han tomado un compuesto antiviral (por ejemplo un compuesto de oseltamivir o zanamivir; ver más adelante) en los 7 días previos a la recepción de la vacuna, las personas con alergias al huevo y las personas que viajan al extranjero. No obstante, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, y pueden ser utilizadas más en general en una población. Para cepas pandémicas, se prefiere la administración a todos los grupos de edad. Las composiciones preferidas de la invención satisfacen 1, 2 ó 3 de los criterios de CPMP para la eficacia. En adultos (18 a 60 años), estos criterios son: (1) >70% de seroprotección ; (2) (40% de seroconversión; y/o (3) un incremento GMT de (2.5 veces. En personas de edad avanzada (>60 años), estos criterios son: (1) (60% de seroprotección; (2) (30% de seroconversión; y/o (3) un incremento GMT de (2 veces. Estos criterios están basados en estudios de etiqueta abierta con al menos 50 pacientes. El tratamiento puede ser mediante un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples pueden ser utilizadas en un programa de inmunización primaria, y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples, las diversas dosis pueden ser administradas mediante la misma o diferentes rutas, por ejemplo, un aprestamiento parenteral y un refuerzo mucosal, un aprestamiento mucosal y un refuerzo parenteral, etc. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en pacientes inmunológicamente vírgenes, por ejemplo para personas quienes nunca han recibido una vacuna de la influenza antes, o para la vacunación contra un nuevo subtipo de HA (como en brote pandémico) . Las dosis múltiples serán típicamente administradas al menos con 1 semana de separación (por ejemplo aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.) .
Las vacunas producidas por la invención pueden ser administradas a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo durante la misma consulta médica o visita a un profesional del cuidado de la salud o un centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para el sarampión, una vacuna para las paperas, una vacuna para la rubéola, una vacuna para MMR, una vacuna para la varicela, una vacuna para MMRV, una vacuna para la difteria, una vacuna para el tétanos, una vacuna para pertusis, una vacuna DTP, una vacuna conjugada para H. influenzae tipo b, una vacuna inactivada para el poliovirus, una vacuna para el virus de la hepatitis B, una vacuna meningocócica conjugada (tal como una vacuna tetravalente A-C-2135-Y), una vacuna para el virus sincitial respiratorio, una vacuna conjugada de neumococo, etc. La administración sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para el neumococo y/o una vacuna para meningococo es particularmente útiles en pacientes de edad avanzada. Similarmente , las vacunas de la invención pueden ser administradas a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional del cuidado de la salud) un compuesto antiviral, y en particular un compuesto antiviral activo contra el virus de la influenza (por ejemplo oseltamivir y/o zanamivir) . Estos antivirales incluyen inhibidores de la neuraminidasa, tales como el ácido ( 3R, 4 , 5S ) -4 -acet ilamino-5-amino-3 ( 1-etilpropoxi ) -1-ciclohexen-l-carboxí lico o el ácido 5- (acetilamino) -4- [ (aminoiminometil) -amino] -2, 6-anhidro-3, 45-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, incluyendo ésteres de los mismos (por ejemplo ásteres de etilo) y sales de los mismos (por ejemplo las sales de fosfato) . Un compuesto antiviral preferido es el ácido ( ER, 4R, 5S ) -4 -acetilamino-5-amino-3 (1-etilpropoxi) -1-ciclohexen-l-carboxilico, éster etílico, fosfato (1:1), también conocido como el fosfato de oseltamivir (TAMIFLUMR) .
General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que consiste" de X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir de algo adicional, por ejemplo X + Y. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x+10%. A no ser que se establezca específicamente de otro modo, un proceso que comprende un paso de mezclar dos o más componentes, no requieren ningún orden especifico de mezclado De este modo, los componentes pueden ser mezclados en cualquier orden. Donde existan tres componentes, entonces dos componentes pueden ser combinados uno con el otro, y luego la combinación puede ser combinada con el tercer componente, etc. Donde son utilizados materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de las células, éstas deben ser obtenidas de fuentes que estén libres de las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs), y en particular, libres de la encefalopatía epongiforme bovina (BSE) . En general, se prefiere cultivar las células en ausencia total de materiales derivados de animales. Donde se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición, entonces ese compuesto puede ser alternativamente reemplazado por un profármaco adecuado.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra el esquema de aislamiento del virus de la influenza a partir de especímenes clínicos. La Figura 2 compara los títulos de HA de 9 muestras virales aisladas en células MDCK-33016. En cada muestra, la barra a mano izquierda es en la transmisión 2, y la barra a mano derecha es en la transmisión 5. La Figura 3 compara los títulos de HA de 10 muestras del virus de la influenza desarrollados en tres diferentes tipos de células MDCK. Para cada muestra, las tres barras son: izquierda, 33016 en suspensión, intermedia, 33016 adherente; y derecha, células MDCK CCL-34. Las Figuras 4A-4C muestran el enlace de tres virus a las lectinas SNA o MAA. La Figura 4A muestra el enlace de un aislado original, 4B muestra el enlace después del crecimiento en células MDCK 33016, y 4C muestra el enlace después del crecimiento en huevos. Las Figuras 5 y 6 muestran el enlace de los virus a 3-SL o 6-SLN. En ambas figuras, existen seis grupos de columnas: las tres más a la izquierda muestran el enlace a 3-SL a diferentes concentraciones (1 µ?, 0.5 µ?, 0.25 µ?) y las tres más a la derecha muestran el enlace a 6-SLN a diferentes concentraciones (0.25 µ?, 0.125 µ?, 0.0625 µ?) . Dentro de cada uno de los seis grupos, cada columna muestra un virus diferente. En la Figura 5, las tres columnas son, de izquierda a derecha: (i) un virus aislado de células, (ii) un virus aislado de huevo; y (iii) un virus de ave. En la Figura 6, las cuatro columnas son, de izquierda a derecha: (i) el virus después de dos transmisiones en huevos; (ii) el virus después de dos transmisiones en MDCK; (iii) el virus después de cinco transmisiones en huevos; (iv) el virus después de cinco transmisiones en MDCK.
Descripción Detallada de la Invención Aislamiento del virus a partir de muestras de pacientes Los especímenes clínicos (frotis nasales o de garganta) que contenían los subtipos del virus de la influenza A y/o B fueron obtenidos de niños y adultos durante la estación de influenza en el hemisferio norte de 2006-2007. La susceptibilidad y la conflabilidad de la línea celular DCK 33016 ( DSM ACC 2219) desarrollados en cultivos de suspensión libre de suero, fue comparada con la línea celular MDCK CCL 34 establecida (ATCC) y con huevos de pollo, mediante la determinación de los títulos de hemaglut inina (HA) , la reacción en cadena de polimerasa ( PCR por sus siglas en inglés), y la titulación del virus. 248 muestras positivas a la influenza fueron identificadas mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) de diagnóstico. La susceptibilidad y la conflabilidad de la replicación y aislamiento del virus de la influenza, fueron evaluadas en la línea celular MDCK 33016 y en huevos de pollo mediante: (i) títulos de hemaglut inina (HA) ; (ii) reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR) para la medición de la carga viral; y (iii) titulación del virus. La precisión de la replicación en las células fue evaluada mediante el secuenciamiento del gen HA en los especímenes clínicos originales y también en aislados provenientes del segunda transmisión en células MDCK y huevos de pollo. Los títulos del virus obtenidos a partir de los aislados desarrollados en las células en suspensión MDCK 33016 fueron comparados a aquellos de las células MDCK 33016 adheridas sobre placas. Los resultados indicaron que la capacidad de aislamiento de la línea celular en suspensión MDCK 33016 es superior a la línea celular MDCK CCL 34 establecida, y mucho mayor que aquella de los huevos de pollo. Después día transmisión de las muestras de virus en las células MDCK 33016, no fueron identificadas sustituciones de aminoácidos en los aislados. En contraste, casi todos los virus pasados en huevo contenían una o más sustituciones de aminoácidos, predominantemente en el gen HA1. Las mutaciones en el sitio de enlace al anticuerpo del gen HA, observadas después día transmisión en huevos, pueden dar como resultado modificaciones a la ant igenicidad del virus de la influenza. 55% de las muestras clínicas obtenidas de pacientes con enfermedad respiratoria aguda fueron identificadas como positivas a la influenza, con los siguientes tipos virales: 79% A/H3N2; 12.5% A/H1N1; 1.6% B, 0.4% H3/B y 6.5% no tipificable. El aislamiento viral a partir de los especímenes clínicos fue posible utilizando las células MDCK 33016 (Figura 1) . En contraste, de los virus inyectados en los huevos de especímenes clínicos, ninguno fue exitosamente aislado. Fueron logrados resultados negativos similares con fibroblastos de embrión de pollo recién preparados (CEF) . El aislamiento y establecimiento del virus de la influenza en huevos pudo ser únicamente logrado utilizando los sobrenadantes de los cultivos de células MDCK 33016 con un titulo de HA positivo. La primera cosecha proveniente de cada célula fue además inoculada en huevos, para fines de referencia. El número de aislamiento del virus exitoso, utilizando cada procedimiento, es mostrado en los recuadros en la Figura 1, con el número de diferentes tipos virales inyectados, que es también mostrado. Los tres subtipos de virus aislados de las células MDCK 33016, obtuvieron HA razonable (>32) y titulo viral (>lxl05) después del segunda transmisión en huevos, con ambos títulos que se incrementan con las transmisiones adicionales (Figura 2) . Las células MDCK 33016 que se desarrollan en suspensión fueron superiores a la línea celular adherente (CCL-34) para el aislamiento del virus de la influenza a partir de frotis clínicos para los tres subtipos. La línea celular en suspensión mostró una más alta sensibilidad para el material de frotis positivo a la influenza, como es demostrado por la proporción de recuperación (Tabla 1) . Las secuencias de HA fueron comparadas entre las diferentes transmisiones en células MDCK 33016 y los huevos al aislado original (Tabla 2), y no fueron encontradas mutaciones para las cepas de influenza A aisladas en las células MDCK 33016 después de 5 transmisiones, mientras que las cepas de la influenza A aisladas en huevos mostraron mutaciones en el sitio de enlace al anticuerpo de la proteina HA después de 2 transmisiones. No fueron encontradas mutaciones para las cepas de influenza B aisladas en células MDCK 33016 o huevos. Fueron encontrados rendimientos más altos de los virus, de al menos un nivel logarítmico, después de la replicación de los aislados en las células MDCK 33016 en suspensión, en comparación con las células MDCK 33016 adheridas (Figura 3) . De este modo, la línea celular en suspensión MDCK 33016 es un sistema ideal para el aislamiento y replicación de las cepas de la influenza de tipo silvestre, ya que ofrece una mayor capacidad de aislamiento en comparación con los huevos de pollo. Además, debido a la alta precisión de replicación, el uso de los aislados basados en células para la producción de una vacuna para el virus de la influenza, puede conducir a una vacuna más auténtica. La concordancia mejorada entre las cepas tipo silvestre en circulación y aquellas contenidas en la vacuna, debe ofrecer mayor protección contra la influenza para el que ha sido vacunado. En conclusión: (a) todas las cepas virales fueron exitosamente aisladas en células MDCK 33016 en comparación a los huevos; (b) las cepas virales aisladas de las células MDCK 33016 pudieron ser propagadas exitosamente en huevos; (c) la proporción de recuperación de los tres subtipos del virus de la influenza es superior en las células MDCK 33016 desarrolladas en suspensión, cuando se comparan a las células adherentes; y (d) las sustituciones del gen HA, cuando se compara al material original, no estuvieron presentes en ninguno de los aislados desarrollados en células MDCK 33016 pero estuvieron presentes después del segunda transmisión en huevos. De este modo, la linea celular en suspensión MDCK 33016 es un sustrato muy adecuado para el aislamiento y propagación de subtipos del virus de la influenza humana ya que es altamente confiable para la transmisión de los virus de la influenza de tipo silvestre provenientes de aislados clínicos, y preserva un carácter auténtico del virus de tipo silvestre.
Enlace al receptor Las preferencias del receptor de los virus aislados originales, de los virus desarrollados en huevo y de los virus desarrollados de células MDCK, fueron investigadas. Los estudios utilizaron lectinas con enlaces 2,3-sialilo (MAA) o enlaces 2,6-sialilo (SNA), o los cialilglucopolímeros 2 , 3-sialil-lactosa (3-SL, un análogo del receptor de huevo) y 2 , 6-sialil-N-acetil-lactosamina (6-SLN, un análogo del receptor humano) [193] . Las Figuras 4A-4C muestran los resultados de un estudio representativo. Los picos marcados muestran el enlace a las lectinas SNA o MAA. El virus original (Figura 4A) y el virus desarrollado sobre MDCK 33016 (Figura 4B) tienen picos distintos para SNA y MAA, mientras que los picos de SNA y MAA sustancialmente se traslapan para el virus desarrollado en huevo (Figura 4C) . La especificidad de enlace fue también examinada en experimentos adicionales utilizando 3-SL y 6-SLN. Un resultado ejemplar es mostrado en la Figura 5. El enlace sobre el lado izquierdo de la gráfica indica una preferencia del receptor de ave, mientras que el enlace a la derecha indica una preferencia del receptor humano. Como es visible en la Figura 5, el virus aislado en células favorece fuertemente los receptores humanos. La Figura 6 muestra los datos utilizando un aislado de Stuttgart (A/H1N1) después de 2 ó 5 transmisiones en huevos o en MDCK 33016 desarrolladas en suspensión. Los virus pasados en MDCK muestran una fuerte preferencia para 6-SLN. En conclusión, todos los virus humanos A y B clínicos desarrollados en células MDCK se enlazan a 6-SLN en vez de a 3-SL, excepto que se encontró que algunos aislados tampoco se enlazan en este ensayo. De manera contraria a los aislados clínicos originales, los virus adaptados en huevo se enlazan ya sea a 3-SL o tampoco a 3-SL ni a 6-SLN.
Cambios debidos al crecimiento en huevos Diversas cepas de los virus de la influenza A y B fueron aisladas en las células MDCK y luego pasadas hasta cinco veces a través de uno de los siguientes sustratos: huevos; células MDCK CCL34; células DCK 33016; células Vero; o células HEK 293-T. El gen HA de los virus fue secuenciado después de cada transmisión y se midieron los títulos de HA. Aunque la secuencia de HA para algunas cepas (por ejemplo A/H1N1 /Bayern/ /95 ) fue estable durante la transmisión a través de los huevos y a través de las células MDCK 33016, para otras no lo fue. Por ejemplo, la secuencia HA de A/H1N1 ) Nordrhein Westfalen/1/05 adquirió una mutación D203N en el sitio D de enlace al anticuerpo después de 2 transmisiones a través de huevos, y después de 2 transmisiones más adquirió adicionalmente un R329K. En contraste, la secuencia no fue alterada en virus pasados en paralelo a través de MDCK 33016. Para esta cepa A/H1N1/NR2/1/05, el crecimiento no fue observado cuando se cultivó con las células Vero. Los otros cuatro sustratos pudieron apoyar su crecimiento, pero los títulos de HA variaron. Por ejemplo, los títulos de 32-256 fueron observados en huevos, pero las células 293-T dieron títulos más bajos (16-32) y MDCK 33016 dieron títulos más altos (32-512) . Se entenderá que la invención ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que se permanezca dentro del alcance y espíritu de la invención.
TABLA 1 : Proporción de recuperación después de la primera transmisión de las muestras positivas a la influenza en las líneas celulares MDCK 33016 y ATCC (CCL-34) Proporción de recuperación n (%) de acuerdo a la cepa viral Total n=248* (%) A H 1 N 1 (n=31 ) A/H3N2 (n=196) B (n=4) No tipificable (n=16) 33016 178 (72) 26 (83.9) 150 (76.5) 14(100) 9 (56.3) CCL-34 156 (63) 23 (74.2) 135 (68.9) 2 (50) 4 (25.0) 1 doble infectado (H3/B) que puede ser aislado en ambas lineas de células MDCK TABLA 2: Comparación de las secuencias de hemaglutinina después de 2 ó 5 transmisiones en las células MDCK 33016-PF o los huevos al aislado original Aislado (serotipo) Transmisión Comparación al Comparación al (hospedero) material original material original (nucleótido) (aminoácido) 295 (H1 N 1 P2 (MDCK) 0* 0* P2 (huevo) 1 * D203N* 124 (H3N2) P2 (MDCK) 0 0 P5 (MDCK) 0 0 P2 (huevo) 1 L210P 128 (H3N2) P2 (MDCK) 0 0 P5 (MDCK) 0 0 P2 (huevo) 3 L210P 146 (H3N2) P2 (MDCK) 0 0 P5 (MDCK) 0 0 P2 (huevo) 1 L210P 171 (H3N2) P2 (MDCK) 0 0 P5 (MDCK) 0 0 P2 (huevo) 1 H199L 215 (B) P5 (MDCK) 0** 0** P2 (huevo) 0** 0** 419032 (B) P2 (MDCK) 0 0 P2 (huevo) 0 0 0 = sin mutación detectable * para el aislado original únicamente fue disponible la secuencia de HA1 ** comparación al aislado P2 (MDCK 33016) REFERENCIAS (los contenidos de las cuales son incorporados por referencia en la presente) [1] Gerdil (2003) Vaccine 21:1776-9. [2] Palese (2006) Emerging Infectious Diseases 12:61-65. [3] de Oña et al. (1995) J Clin Microbiol 33:1948-49. [4] Monto et al. (1981) J Clin Microbiol 13(1): 233-235. [5] Govorkova et al. (1995) J Infect Dis. 172 ( 1 ): 250-3. [6] Tobita et al. (1975) Med Microbiol Immunol (Berl) . 162 (1) : 9-14 and 23-2 . [7] Ollier et al. (2004) J Clin Microbiol 42 ( 12 ) : 5861-5. [8] Schepetiuk & Kok (1993) J Virol Methods 42(2-3)1241-50. [9] WHO (2003) Weekly epidemiological record 78:73-80 [10] Patente de los Estados Unidos 6,344,354. Ver también O97/38094. [11] Patente de los Estados Unidos 5,162,112 [12] Medema et al. (2004) Virus Res. 103 ( 1-2 ) : 9-15. [13] Robertson et al. (1995) Vaccine 13:1583-8. [14] erten et al. (1996) Advances in Experimental Biology 397 : 141-151. [15] Govorkova et al. (1996) J. Virol, 70:5519-24. [16] Mastrosovich et al. (2003) J Virol 77:8418-25. [17] Gambaryan & Matrosovich (1992) J Virol Methods 39(1- 2) : 111-23. [18] Mastrosovich et al. (1999) J Virol 73: 1146-55. [19] Stevens et al. (2006) J Mol Biol 355: 1143-55. [20] Couceiro & Baum (1994) Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4) :587- 91. [21] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8. [22] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110. [23] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58. [24] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21. [25] http://www.atcc.org/ http : / /locus . umdn . edu/ WO03/076601. WO2005/042728. WO03/043415. WO97/37000. Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100. Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7. Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50. WO03/023021 WO03/023025 EP-A-1260581 (WO01/64846) . WO2006/071563. WO2005/113758. WO97/37001. O2006/027698. Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170. Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200. Liu et al. (2003) Virology 314:580-590. Ozaki et al (2004) J. Virol 78: 1851-1857. Webby et al (2004) Lancet 363: 1099-1 103. WOOO/60050. WO01/04333. Patente de los Estados Unidos 6649372. Neumann et al (2005) Proc Nati Acad Sci USA 102: 16825-9, WO2007/002008.
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Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (51)

  1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un proceso para preparar un virus semilla de influenza para la fabricación de una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) infectar una linea celular con un virus de la influenza obtenido ya sea directamente de un paciente o de un aislado primario; (ii) la transmisión del virus a partir de la linea celular infectada obtenida en el paso (i) al menos una vez; y (iii) cultivar la linea celular infectada del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza para el uso como un virus semilla, en donde el virus de la influenza es utilizado en el paso (i) es ya sea un virus de la influenza B o es una cepa Hl o H3 del virus de la influenza A.
  2. 2. Un proceso para preparar un virus semilla de influenza para la fabricación de una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) infectar una linea celular con un virus de la influenza obtenido ya sea directamente de un paciente o de un aislado primario; (ii) la preparación de un cADN de al menos un segmento de ARN viral de un virus de la influenza producido por la linea celular infectada obtenida en el paso (i), y el uso del cADN en un procedimiento de genética inversa para preparar un nuevo virus de la influenza que tiene al menos un segmento de ARN viral en común con el virus de la influenza del paso (i) ; y (iii) la infección de una linea celular con el nuevo virus de la influenza, y luego el cultivo de la linea celular con el fin de producir el nuevo virus de la influenza para el uso como un virus semilla.
  3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso en el paso (ii) es a través del mismo tipo de célula que se utilizó en el paso ( i ) .
  4. 4. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque ninguno de los pasos (i), (ii) o (iii) involucra el crecimiento o la transmisión del virus de la influenza en huevos.
  5. 5. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la linea celular es una linea celular de mamífero no humana.
  6. 6. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la línea celular es una línea de células MDCK.
  7. 7. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el virus semilla es secuenciado.
  8. 8. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el virus semilla es utilizado para producir antisueros.
  9. 9. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el virus semilla es utilizado para preparar lotes de siembra de trabajo.
  10. 10. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el virus semilla es utilizado para fabricación de vacunas.
  11. 11. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el genoma del virus semilla no tiene segmentos PR/8/34.
  12. 12. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el virus semilla tiene una hemaglutinina con una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (o¡2 , 3 ) Gal .
  13. 13. Un proceso para preparar un virus de la influenza para la fabricación de una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) obtener un virus de la influenza que es ya sea circulante en la población o que tiene una hemaglutinina que es antigénicamente representativa de un virus de la influenza que está circulando en la población; (ii) infectar una linea celular con el virus de la influenza obtenido en el paso (i) ; (iii) pasar el virus desde la linea celular infectada obtenida en el paso (ii) al menos una vez, para dar una cepa semilla; y (iv) cultivar la cepa semilla del paso (iii) con el fin de producir el virus de la influenza .
  14. 14. Un proceso para preparar un virus de la influenza para la fabricación de una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) obtener un virus de la influenza que es ya sea circulante en la población o que tiene una hemaglut inina que es antigénicamente representativa de un virus de la influenza que está circulando en la población; (ii) infectar una linea celular con el virus de la influenza obtenido en el paso (i) ; (iii) preparar un cADN de al menos un segmento de ARN viral de un virus de la influenza producido por la linea celular infectada obtenida en el paso (i) y el uso del cADN en un procedimiento de genética inversa para preparar un virus semilla de la influenza que tiene al menos un segmento de ARN viral en común con el virus de la influenza del paso (i); y (iv) la infección de una linea celular con el virus semilla de la influenza, y luego el cultivo de la linea celular pasado del paso (iii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  15. 15. Un proceso para preparar una vacuna del virus de la influenza, caracterizado porque comprende los pasos (i) al (iv) de conformidad con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, y luego: (v) tratar el virus obtenido en el paso (iv) para dar una vacuna.
  16. 16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el paso (v) involucra la inactivación del virus.
  17. 17. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la vacuna es una vacuna de virión completo.
  18. 18. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la vacuna es una vacuna de virión dividido.
  19. 19. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la vacuna es una vacuna de antigeno superficial.
  20. 20. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la vacuna es una vacuna virosomal.
  21. 21. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque la vacuna contiene menos de 10 ng de ADN de célula hospedera residual por dosis.
  22. 22. Un proceso para elaborar una vacuna multivalente de la influenza, caracterizado porque comprende la realización del proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, para una pluralidad de cepas individuales del virus de la influenza, y mezclar las vacunas individuales para elaborar la vacuna mult ivalente de la influenza .
  23. 23. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la vacuna multivalente de la influenza tiene dos cepas del virus de la influenza A y una cepa del virus de la influenza B.
  24. 24. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque la vacuna está sustancialmente libre de mercurio.
  25. 25. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque la vacuna incluye un adyuvante.
  26. 26. Un proceso para preparar un antisuero a partir de un animal, comprende los pasos de: (i) administrar al animal una hemaglut inina purificada del virus de la influenza; y luego (ii) recuperar del animal el suero que contienen los anticuerpos que reconocen la hemaglut inina , caracterizado porque la hemaglutinina utilizada en el paso (i) es proveniente de un virus desarrollado en una linea celular.
  27. 27. Un proceso para preparar un antisuero a partir de un animal, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) desarrollar el virus de la influenza en una linea celular; (ii) purificar el antigeno hemaglutinina del virus desarrollado en el paso (i) ; (iii) administrar la heraaglut inina purificada del paso (ii) al animal; y luego (iv) recuperar del animal el suero que contiene los anticuerpos que reconocen la heraaglut inina .
  28. 28. El proceso de conformidad con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, caracterizado porque el animal es una oveja.
  29. 29. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, caracterizado porque incluye el paso adicional de mezclar el antisuero con un gel adecuado para un ensayo de SRID.
  30. 30. Un antisuero, caracterizado porque es obtenible mediante el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
  31. 31. Un proceso para preparar un material de referencia antigénico, que comprende los pasos de: (i) desarrollar el virus de la influenza en una linea celular; (ii) purificar los virus desarrollados en el paso (i) ; (iii) inactivar el virus, caracterizado porque el virus de la influenza utilizado en el paso (i) nunca ha sido desarrollado en huevos; y (iv) liofilizar el virus inactivado.
  32. 32. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula DCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo de suspensión.
  33. 33. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un medio libre de suero.
  34. 34. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un medio libre de proteina.
  35. 35. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena.
  36. 36. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK no está provista con un medio de cobertura.
  37. 37. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión libre de suero.
  38. 38. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión libre de proteina.
  39. 39. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión.
  40. 40. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se está desarrollando en cultivo en suspensión libre de suero.
  41. 41. Un método para aislar un virus de la influenza a partir de una muestra de un paciente, caracterizado porque comprende un paso en el cual la muestra del paciente es incubada con una célula MDCK no tumorigena, en donde la célula MDCK se está desarrollando en un cultivo en suspensión libre de proteina.
  42. 42. Un virus de la influenza, caracterizado porque es aislado mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 41.
  43. 43. Un proceso para preparar un virus de la influenza reclasificante, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) infectar una linea celular con una primera cepa del virus de la influenza que tiene un primer grupo de segmentos genómicos, y una segunda cepa del virus de la influenza que tiene un segundo grupo de segmentos genómicos, en donde la primera cepa tiene un segmento de HA que codifica para una hemaglut inina deseada; y (ii) cultivar las células infectadas del paso (i) para producir el virus de la influenza que tiene al menos un segmento proveniente del primer grupo de segmentos genómicos, y al menos un segmento proveniente del segundo grupo de segmentos genómicos, con la condición de que al menos un segmento proveniente del primer grupo de segmentos genómicos incluye el segmento HA proveniente de la primera cepa.
  44. 44. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza que nunca ha sido propagado en un sustrato de huevo; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  45. 45. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza que fue aislado en una célula MDCK 33016; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  46. 46. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza que nunca ha sido propagado sobre un sustrato que se desarrolla en un medio que contiene suero; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  47. 47. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza que fue generado utilizando técnicas de genética inversa; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  48. 48. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza A con menos de 6 segmentos virales provenientes de un virus de influenza PR/8/34; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  49. 49. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque conprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza A con menos de 6 segmentos virales provenientes de un virus de influenza ??/6/60; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
  50. 50. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza con una hemaglutinina que tiene una preferencia de enlace para los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia(a2,6)Gal en comparación a los oligosacáridos con un disacárido terminal Sia (a2, 3) Gal; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza .
  51. 51. Un proceso para preparar un antigeno del virus de la influenza para el uso en una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) recibir un virus de la influenza con glucoformas de hemaglutinina y/o neuraminidasa que no son observadas en huevos de pollo; (ii) infectar una linea celular con este virus de la influenza; y (iii) cultivar las células infectadas del paso (ii) con el fin de producir el virus de la influenza.
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