CN102802666A - 猪流感血凝素变异体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含流感血凝素和神经氨酸酶变异体的多肽、多核苷酸、方法、组合物和疫苗。

Description

猪流感血凝素变异体
相关申请的交叉引用
本申请依据美国法典第35篇第119条(e)款(35 U.S.C.§119(e))要求以下美国临时申请的权益：2009年6月25日提交的第61/220,426号、2009年7月23日提交的第61/227,986号、2009年8月14日提交的第61/234,021号和2009年11月6日提交的第61/258,890号。这些申请的每一个均明确地通过引用整体并入。
发明背景
2009年4月猪源性A型流感(H1N1)病毒在人类中的全球性传播标志着41年来的首次流感大流行。截止2009年6月15日，35,000多人感染了这种新型H1N1病毒。上个世纪，H1N1流感病毒也引起了1918-1919毁灭性大流行。另外，1976年源自猪的H1N1病毒引起了流产大流行。1918年春，1918流感病毒引起温和爆发并且于当年秋天引起了全球性致命波动，导致全世界50,000,000人死亡。虽然在2009年早期，2009猪源性H1N1流感病毒被认为是温和的，但是这种病毒可能突变并且于2009年秋其毒性变得更强。因此急需研发一种有效的疫苗来防治2009H1N1病毒引起的严重大流行。
已分离了用于疫苗(活疫苗和致死疫苗)研发的6:2重配流感病毒(具有猪源性A型流感(H1N1)病毒的HA和NA片段和减毒流感病毒的“骨架”片段)，然而至今为止多数分离株表现出在卵中的滴度很低。相同分离物感染MDCK细胞不良并形成CPE较差的微空斑。另外，在病毒过滤之后观察到病毒效力严重丧失。因此，最初分离的H1N1重配流感病毒株是研发疫苗株的较差候选。
本发明提供新的和/或新分离的猪流感H1血凝素变异体，所述变异体能用于生成多种类型的疫苗以及用于研究、诊断等。本发明进一步提供提高H1流感病毒的复制效率的方法。经查看下文许多其它益处将显而易见。
发明概述
如本文所述，适合用于研发H1N1疫苗的6:2重配流感株通过反向遗传学产生。最初分离的包含野生型HA和NA基因组片段的重配病毒，在卵中生长差，经修饰以致在卵中的生长明显改善。经修饰重配病毒的序列分析表明位于H1猪血凝素的位置119、153、154和186上的氨基酸变化导致卵和MDCK细胞的生长优势。还发现先前所示增强猪1976病毒复制的HA残基155处氨基酸取代增强卵中重配A/CA/7/09病毒复制。在HA残基119和186处有氨基酸变化的病毒增强卵生长，而不明显改变病毒抗原性。本文所述的H1HA变异体使包含PR8或A/Ann Arbor/6/60病毒株的6个内部基因组片段的6:2重配病毒具有生长增强的表现型。而且，雪貂中包含ca A/AnnArbor/6/60骨架的变异病毒和在HA残基119或186处有氨基酸取代的H1 HA变异体是减毒的并且极具免疫原性。这些数据表明包含位于HA残基119和/或186处的氨基酸取代的重配流感病毒变异体适于研发人用H1N1猪流感疫苗。
发明详述
本发明包括流感血凝素的多肽和多聚核苷酸序列以及包含此序列的载体、病毒、疫苗、组合物等，及它们的使用方法。本文更详细地描述了本发明另外的特征。
在一些方面，本发明提供分离或重组血凝素多肽。在一个实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽为H1 HA多肽。在另一实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可为猪流感HA多肽。
在一个实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可在与SEQ IDNO：1的氨基酸残基位置119相对应的位置上或在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置186相对应的位置上包含非天然存在的氨基酸。在另一实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置119相对应的位置上和在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置186相对应的位置上包含非天然存在的氨基酸。在又一实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽包含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代。
在一个特定实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽包含含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一特定实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可在与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处包含谷氨酸(E)和在与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处包含天冬氨酸(D)。在又一特定实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可在与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处包含天冬酰胺(N)和在与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处包含天冬氨酸(D)。
在又一实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可还包含H273Y取代。
在又一实施方案中，本发明的分离或重组HA多肽可还包含D222G和/或Q223R取代。
在一个特定实施方案，本发明的HA多肽包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的HA多肽包含与SEQ IDNO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。
在一个特定实施方案，本发明的HA多肽包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的HA多肽包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。
本发明还涵盖编码本发明多肽的核酸和包含本发明的此类多肽和/或核酸的重配或重组流感病毒。
在一个特定实施方案，本发明的核酸包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明的核酸包含与SEQ ID NO：7的核苷酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的核苷酸序列。在又一实施方案中，本发明的核酸包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
在一个特定实施方案，本发明的核酸包含SEQ ID NO：7的残基84至1064的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明的核酸包含与SEQ ID NO：7的残基84至1064的核苷酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的核苷酸序列。在又一实施方案中，本发明的核酸包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO：7的残基84至1064的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段、编码包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
在另一实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段、编码包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
在一个实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的6个内部基因组片段、编码包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
在另一实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的6个内部基因组片段、编码包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第一基因组片段可编码包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
在一个实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段、包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在另一实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/AnnArbor/6/60的6个内部基因组片段、包含SEQ ID NO：7的残基84-1064的核苷酸序列的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在又一实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的6个内部基因组片段、包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在另一实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的6个内部基因组片段、包含SEQ ID NO：7的残基84-1064的核苷酸序列的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。在一个特定实施方案中，所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在一个特定实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
在其它方面，本发明包括具有一种或多种上文所列多肽或其片段的无菌组合物。本发明还涵盖包含免疫有效量的一种或多种上述多肽的免疫原性组合物，以及用于刺激个体的免疫系统以对流感病毒产生保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用免疫有效量的一种或多种上述多肽。在一个特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的多肽。在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在又一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的多肽。在一个特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的多肽。在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在又一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含单个重配流感病毒的单价免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含3个重配流感病毒的三价免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含2个重配A型流感病毒和1个重配B型流感病毒的三价免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含1个H1型重配A型流感病毒、1个H3型重配A型流感病毒和1个重配B型流感病毒的三价免疫原性组合物。在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含4个重配流感病毒的四价免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含2个重配A型流感病毒和2个重配B型流感病毒的四价免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物为包含1个H1型重配A型流感病毒、1个H3型重配A型流感病毒、1个Victoria谱系重配B型流感病毒和1个Yamagata谱系重配B型流感病毒的四价免疫原性组合物。在一个特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含与SEQ IDNO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含编码HA多肽的基因组片段的重配或重组流感病毒，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。
另外，本发明涵盖包含编码一种或多种上述多肽的基因组片段的重配流感病毒。此外，本发明涵盖包含免疫有效量的此种重配流感病毒的免疫原性组合物。用于刺激个体的免疫系统以对流感病毒产生保护性免疫应答的方法也是本发明的一部分，所述方法包括施用免疫有效量的在生理学上可接受的载体中的此种重配流感病毒。在一个实施方案中，本发明的重配流感病毒为6：2重配病毒，包含来自一种或多种供体病毒(例如A/AA/6/60或A/Puerto Rico/8/34，更常称为PR8)的6个内部基因组并且还包含2个基因组片段(通常并且优选编码HA和NA或其片段)。包含此重配(重组)病毒的免疫原性组合物也是本发明的特征。
在一个实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/AnnArbor/6/60的6个内部基因组片段和编码HA多肽的基因组片段。所述HA多肽可包含具有至少一个取代、缺失或插入的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有H273Y取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段和编码包含具有D222G、K119E和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段和编码包含具有Q223R和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段和编码包含具有Q223R、H273Y和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段和编码包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽的HA基因组片段。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。
在一个实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/PuertoRico/8/34(PR8)的6个内部基因组片段和编码HA多肽的基因组片段。所述HA多肽可包含具有至少一个取代、缺失或插入的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有H273Y取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6个内部基因组片段和编码包含具有D222G、K119E和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6个内部基因组片段和编码包含具有Q223R和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6个内部基因组片段和编码包含具有Q223R、H273Y和A186D取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HA多肽的基因组片段。在一个特定实施方案中，本发明的重配或重组流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6个内部基因组片段和编码包含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽的HA基因组片段。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含与SEQ IDNO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一个特定实施方案中，所述HA基因组片段可编码包含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。
包含编码本发明的多肽的多聚核苷酸的重配流感病毒也在本发明内。在一个实施方案中，此重配病毒为6:2重配病毒，其包含来自一种或多种供体病毒(例如A/AA/6/60或A/Puerto Rico/8/34)的6个内部基因组片段、编码本发明的血凝素多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。包含免疫有效量的此种重配/重组流感病毒的免疫原性组合物也在本发明的范围之内。
本发明的重配或重组病毒在组织培养物或含胚卵中显示出高复制率。在一个实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。在另一实施方案中，重配或重组流感病毒生长到在组织培养物中至少约7.5log10PFU/ml、至少约8log10PFU/ml、至少约8.5log10PFU/ml、至少约9log10PFU/ml、至少约9.5log10PFU/ml、至少约10log10PFU/ml、至少约10.5log10PFU/ml或至少约11log10PFU/ml的滴度。
还包括了通过培养本发明的锚定多聚核苷酸的宿主细胞来生成重配/重组流感病毒的方法。
在本文的其它实施方案中，本发明包括具有免疫有效量的一种或多种本发明上述重配流感病毒的免疫原性组合物。在一个实施方案中中，本发明的免疫原性组合物包含本发明的活病毒。其它实施方案包括用于刺激个体的免疫系统以对流感病毒产生保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用免疫有效量的一种或多种上述重配流感病毒(任选在生理学上有效的载体中)。
本发明还涵盖包含本发明的重组或重配流感病毒的疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗为裂解疫苗或灭活疫苗。在另一实施方案中，本发明的疫苗为减毒流感病毒活疫苗。在又一实施方案中，本发明的疫苗可为单价、二价、三价或四价疫苗。
本发明还包括生产流感病毒疫苗的方法。在一个实施方案中，本发明的疫苗可为单价、二价、三价或四价疫苗。
本发明还涉及用于提高例如在鸡含胚卵和/或细胞培养物中流感病毒的复制能力的方法和组合物。本发明部分基于与复制能力提高相关的特定H1蛋白质氨基酸的鉴定。通过使用编码包含一种或多种这些特定氨基酸的H1 HA蛋白质的H1 HA基因，可实现流感病毒产量的提高。在一个实施方案中，提供了一种用于提高重配或重组流感病毒的复制能力的方法，所述方法包括改变在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置119或186相对应的位置上的血凝素多肽的氨基酸残基，从而提高所述重配或重组流感病毒的复制能力。还提供了通过所述方法生成的重组流感病毒。
本发明还涉及用于提高例如在鸡含胚卵和/或细胞培养物中H1N1重配流感病毒的复制能力的方法和组合物。在一个实施方案中，提供了用于提高H1N1重配或重组流感病毒的复制能力的方法，包括改变在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置119或186相对应的位置上的血凝素多肽的氨基酸残基，从而提高所述重配或重组流感病毒的复制能力。还提供了通过所述方法生成的一种重组流感病毒。
在一个实施方案中，相对于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本发明血凝素多肽的本发明重配或重组流感病毒的复制能力提高至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在另一实施方案中，相对于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本发明血凝素多肽的本发明重配或重组流感病毒的复制能力提高2至10倍、2至20倍、2至40倍、2至100倍、5至10倍、5至20倍、5至40倍或5至100倍。
在一个实施方案中，相对于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本发明血凝素多肽的本发明重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在另一实施方案中，相对于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本发明血凝素多肽的本发明重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍、2至20倍、2至40倍、2至100倍、5至10倍、5至20倍、5至40倍或5至100倍。
在一个特定实施方案中，提供了一种重组流感病毒，其包含H1N1病毒的HA多肽，所述多肽包含选自K119E、K119N和A186D的氨基酸。在一个特定实施方案中，提供了一种重组流感病毒，其包含H1N1病毒的HA多肽，所述多肽包含选自K119X和A186X的氨基酸，其中X为所述H1N1病毒中的任一非天然存在的氨基酸。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒为6:2重配病毒，其包含减毒病毒的至少5个或6个片段(或源自所述减毒病毒的至少5个或6个片段)。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒为6:2重配病毒，其包含选自Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的减毒病毒的至少5个或6个片段(或源自所述减毒病毒的至少5个或6个片段)。在一个特定实施方案中，本发明的重配流感病毒包含含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在另一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒包含含SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在另一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含与SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒为包含本发明的HA多肽的6:2或7:1重配病毒。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒为6:2或7:1重配病毒，其包含本发明的HA多肽和选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的减毒病毒的至少5个或6个片段(或源自所述减毒病毒的至少5个或6个片段)。在一个实施方案中，本发明的重组流感病毒包含具有1、2或3个取代(例如在位置119、186上)的A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽(或源自所述A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽)。在一个实施方案中，本发明的重组流感病毒包含在氨基酸位置119处具有谷氨酸或天冬酰胺且在位置186具有天冬氨酸的A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽(或源自所述A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽)。在一个实施方案中，本发明的重组流感病毒包含在氨基酸位置119和位置186处有氨基酸取代的A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽(或源自所述A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽)。在一个实施方案中，本发明的重组流感病毒包含在氨基酸位置119和位置186处有氨基酸取代的H1N1猪流感病毒的HA多肽(或源自所述H1N1猪流感病毒的HA多肽)。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒包含含SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的HA多肽。在另一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，本发明的重组流感病毒包含含SEQ IDNO：6或8的残基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在另一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含与SEQID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明的重组流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6或8的残基1-327的氨基酸序列。
本领域的技术人员将认识到氨基酸的精确位置可根据本发明的所述载体、方法和病毒中使用的特定流感株而改变。例如，特定流感株的HA蛋白在编码所述HA蛋白的HA基因中可包含插入或缺失，使得例如在所述特定流感株的HA蛋白的残基93或97处发现与SEQID NO：1的位置119相对应的位置。尤其，如表3所示，A/CA/07/09HA多肽(SEQ ID NO：1)的位置119和186分别与A/South Dakota/6/07H1HA多肽的位置118和185相对应。本领域的技术人员使用本领域的常规技术可容易地认识到特定氨基酸位置是否与改变时与复制能力提高有关的位置相对应。此种常规技术之一为使用本领域可用的算法比对SEQ ID NO：1和特定流感株HA多肽的氨基酸序列。
结合附图和权利要求阅读以下详述时本发明的这些及其它目标和特征将更加显而易见。
附图简述
图1选自MDCK细胞的变异体和含引入的氨基酸变化的指示变异体的空斑形态(A)。对在33℃下孵育4天的MDCK细胞进行空斑测定，并且用抗A型流感病毒的多克隆抗血清进行免疫染色。图B中比较双重突变体V5-119E/186D的空斑形态与单个119E和186D突变体。
图2A/California/7/09、A/Swine/Iowa/1/1976(核苷酸序列登记代码CY022069)、A/Swine/1931(核苷酸序列登记代码CY009628)和A/South Dakota/6/07的HA1蛋白质序列比较。在位置119、153、154、155、186和278上的氨基酸突出显示。
图3从含胚卵纯化的病毒制剂的蛋白质组成。
图4从含胚卵纯化的病毒制剂的蛋白质组成。
图5在(A)48h和(B)60h从含胚卵收获的纯化病毒制剂的蛋白质组成。
图6由在含胚卵中由两种重配H1N1病毒生成的HA1蛋白质的定量比较。
定义
除非另外定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意思。以下定义补充本领域的定义并且针对本申请，并且不必归于任一相关或不相关的案例，例如任一共有专利或申请。虽然与本文所述方法和材料相似或等效的任何方法和材料可用于实践中用于测试本发明，但本文描述了优选材料和方法。因此，本文所使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，并非旨在限制。全文定义并描述了另外的术语。
在两种核酸或多肽(例如，编码HA或NA分子的DNA，或HA或NA分子的氨基酸序列)的情况下，短语“大致相同”指如使用序列比较算法或通过肉眼检查测定，比较和比对最大一致性时，两个或或更多个序列或子序列具有至少约90％、优选91％、最优选92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的核苷酸或氨基酸残基同一性。
关于多肽的术语“变异体”指相对于参考序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。所述变异体可具有“保守”变化，其中经取代氨基酸具有相似结构或化学性质，例如异亮氨酸代替亮氨酸。可选地，变异体可具有“非保守”变化，例如色氨酸代替甘氨酸。相似较小变化也可包括氨基酸缺失或插入或二者。使用本领域熟知的计算机程序，例如DNASTAR软件可找到确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不丧失生物或免疫活性的指导。本文还描述了保守取代的实例。
本发明的“神经氨酸酶”多肽表现出与来自流感病毒的一种或多种已知神经氨酸酶分子的免疫交叉反应性。文献中充满此类已知神经氨酸酶的实例(例如，在GenBank、来自CDC的出版物等中)。相似地，本发明的“血凝素”多肽可表现出与来自流感病毒的一种或多种已知血凝素分子的免疫交叉反应性。并且，文献中充满此类已知血凝素分子的实例。
基因还包括非表达核酸片段，例如形成其它蛋白质的识别序列的非表达核酸片段。非表达调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白(例如转录因子)结合“启动子”和“增强子”，引起相邻或邻近序列的转录。“组织特异性”启动子或增强子是调节特异性组织类型或细胞类型的转录的启动子或增强子。
“基因表达”或“核酸表达”通常指DNA转录为RNA(任选地包括RNA修饰，例如剪接)或RNA转录为mRNA、RNA翻译为多肽(可能包括多肽的后续修饰，例如翻译后修饰)或如上下文所示的转录和翻译。
“开放阅读框”或“ORF”为DNA或RNA(例如基因)的可能翻译阅读框，所述阅读框能够被翻译为多肽。即，所述阅读框未被终止密码子中断。然而，应注意术语ORF未必指实际上翻译为多肽的多聚核苷酸。
术语“载体”指可通过其在生物体、细胞或细胞组分之间传播和/或转移核酸的工具。载体包括自主复制或可整合至宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体还可为非自主复制的裸露RNA多聚核苷酸、裸露DNA多聚核苷酸、由相同链中DNA和RNA组成的多聚核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。在多数(但非全部)常见实施方案中，本发明的所述载体为质粒。
“表达载体”为能够促进并入其中的核酸的表达以及复制的载体，例如质粒。通常，待表达的核酸“可操作地连接”启动子和/或增强子，并且受所述启动子和/或增强子的转录调节控制。
“双向表达载体”的特征是相对于位于两启动子之间的核酸两个选择性启动子相反方向定向，以致可朝两个方向开始表达，引起例如正(+)链或有义链和负(-)链或反义链RNA转录。
在本发明的上下文中，术语“分离的”是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白质)。所述分离的生物材料任选地包含在其天然环境(例如，细胞或野生型病毒)中所述生物材料未发现具有的另外的材料。例如，如果所述材料处于其天然环境(例如细胞)中，所述材料可能已经置于对在那种环境中发现的这种材料来说非天然的细胞中的一个部位(例如基因组或基因成分)。例如，如果通过非天然存在的方式将天然存在的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)引入至对该核酸来说非天然的基因组(例如，载体(例如质粒或病毒载体)或扩增子)的基因座，那么所述天然存在的核酸被分离。此类核酸也被称为“异源”核酸。分离的病毒处于不同于野生型病毒的天然环境(例如，感染个体的鼻咽部)的环境中(例如细胞培养系统或从细胞培养物中纯化)。
在提及病毒时，术语“嵌合”或“嵌合体”指病毒包括源自一种以上的亲本病毒株或来源的基因和/或多肽组分。相似地，提及病毒蛋白时，术语“嵌合”或“嵌合体”指蛋白质包括源自一种以上的亲本病毒株或来源的多肽组分(即，氨基酸子序列)。如本文中显而易见，此类嵌合病毒通常为重配/重组病毒。因此，在一些实施方案中，嵌合体可任选地包括(例如)来自置于由B流感病毒(例如，B/AA/1/66等)组成或构建或源自B流感病毒的骨架中的A流感病毒的(例如HA和/或NA)序列或置于A流感病毒骨架(即，供体病毒)(例如，A/AA/6/60等)中的B流感病毒序列。
术语“重组体”指已通过人为干预而人工或合成(非天然)改变的材料(例如，核酸或蛋白质)。可对处于或从天然环境或状态移除的材料进行改变。特别地，例如，通过重组核酸表达生成流感病毒时，该流感病毒为重组体。例如，“重组核酸”为(例如)在克隆、DNA改组或其它步骤期间通过重组核酸或通过化学或其它诱变制备的核酸；“重组多肽”或“重组蛋白质”为通过重组核酸表达生成的多肽或蛋白质；和通过重组核酸表达生成“重组病毒”，例如重组流感病毒。
提及病毒(本文中通常为流感病毒)时，术语“重配体”指包括源自一种以上的亲本病毒株或来源的基因和/或多肽组分。例如，7:1重配体包括源自第一亲本病毒的7个病毒基因组片段(或基因片段)和例如编码本文所述血凝素或神经氨酸酶的单个互补病毒基因组片段。6:2重配体包括6个基因组片段(最常见的是来自第一亲本病毒的6个内部基因组片段)和2个互补片段(例如，来自一个或多个不同亲本病毒的血凝素和神经氨酸酶基因组片段)。根据本文的上下文，重配病毒也可称为“嵌合”和/或“重组体”。
提及异源或分离的核酸时，术语“引入”指将核酸并入真核或原核细胞，其中可将核酸并入所述细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中。所述术语包括如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”等方法。在本发明的上下文中，可采用各种方法将核酸引入细胞，所述方法包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染(脂质转染)等。
术语“宿主细胞”指含异源核酸(例如载体或病毒)并支持所述核酸复制和/或表达的细胞。宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或包括人细胞的哺乳动物细胞)。示例性宿主细胞可包括例如Vero(非洲绿猴肾)细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、鸡原肾(PCK)细胞、马-达氏犬肾(MDCK)细胞、马-达氏牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞(例如，COS1、COS7细胞)等。在其它实施方案中，宿主细胞可任选地包括卵(例如鸡蛋、鸡含胚卵等)。
流感病毒的“免疫有效量”是足以增强个体(例如，人)对随后暴露于流感病毒的自身免疫应答的量。例如，可通过(例如)空斑中和、补体结合、酶联免疫吸附或微量中和检测测量中和分泌和/或血清抗体的量来监控诱导的免疫水平。
对流感病毒的“保护性免疫应答”指个体随后暴露于野生型流感病毒或感染野生型流感病毒时个体(例如，人)表现出的预防疾病的免疫应答。在一些情况下，所述野生型(例如，自然循环)流感病毒仍可引起感染，但不会引起严重或威胁生命的感染。通常，保护性免疫应答产生可检水平的宿主产生的血清和分泌抗体，能够中和体外和体内相同菌株和/或亚群的病毒(也可能为不同非疫苗株和/或亚群的病毒)。
如本文所使用的“抗体”为包含大体上或部分由免疫球蛋白基因或其片段编码的一个或多个多肽的蛋白质。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。典型免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚物。每个四聚物由两对相同多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端界定约100至110或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。抗体以完整免疫球蛋白或通过用各种多肽酶消化而产生的大量良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下的抗体而生成F(ab)′2，Fab的二聚体其本身为通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′2以断开铰链区中的二硫键，从而将(Fab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上为具有部分铰链区的Fab(其它抗体片段的更多详细描述参见FundamentalImmunology，W.E.Paul编，Raven Press，N.Y.(1999))。虽然根据完整抗体的消化定义各种抗体片段，但技术人员应了解可经化学或利用重组DNA方法重新合成此类Fab′片段。因此，如本文所使用的术语抗体包括通过修饰全抗体生成的或使用重组DNA方法重新合成的抗体或片段。抗体包括(例如)多克隆抗体、单克隆抗体、多链或单链抗体和人源化抗体或嵌合抗体，所述多链或单链抗体包括其中可变重链和可变轻链(直接或通过多肽连接子)连在一起形成连续多肽的单链Fv(sFv或scFv)抗体。
流感病毒
本发明的多肽和多聚核苷酸为流感HA和/或NA序列的变异体。参见，例如，下图1和2中的序列表。通常，流感病毒由含分段单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心和衬有基质蛋白的外部脂蛋白包膜组成。流感病毒的基因组由编码免疫原性血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白质的直(-)链核糖核酸(RNA)的8个片段，和6个内部核心多肽：核壳体核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)和3个RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。复制期间，将基因组病毒RNA转录到在宿主细胞核中的(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。所述8个基因组片段的每一个均被装配到除了包含RNA以外还包含NP和聚合酶复合体(PB1、PB2和PA)的核糖核蛋白复合体中。血凝素分子由表面糖蛋白组成并且起结合宿主细胞表面受体上的也称为唾液酸的N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)的作用。在本文的一些实施方案中，本发明的多肽(和由本发明的多聚核苷酸编码的多肽)可起结合体外或体内NeuNAc的作用。在一些实施方案中，保持血凝素活性的血凝素片段也可起这种作用。血凝素由两个亚基HA1和HA2组成，并且整个结构的长度为约550个氨基酸和约为220kD。神经氨酸酶分子从流感病毒的细胞表面受体裂解末端唾液酸残基，从而从感染细胞释放病毒粒子。神经氨酸酶还从新造血凝素和神经氨酸酶分子中去除唾液酸。在本文的一些实施方案中，本发明的所述多肽(和由本发明的多聚核苷酸编码的多肽)可起裂解体外或体内唾液酸残基的作用。在一些实施方案中，保持神经氨酸酶活性的神经氨酸酶片段也可起这种作用。本发明的所述神经氨酸酶多肽表现出与来自流感病毒的一种或多种已知神经氨酸酶的免疫交叉反应。文献中充满此类已知神经氨酸酶的实例(例如，在GenBank、来自CDC的出版物等中)。相似地，本发明的所述血凝素多肽表现出与来自流感病毒的一种或多种已知血凝素分子的免疫交叉反应性。再次，文献中充满此类已知血凝素分子的实例。
流感通常分为A类流感和B类流感以及通常次要的C类流感。A型流感和B型流感病毒各自含具有负极性的8个单链RNA片段。A型流感基因组编码11种多肽。片段1-3编码组成RNA依赖型RNA聚合酶的3个多肽。片段1编码聚合酶复合蛋白PB2。其余聚合酶蛋白PB1和PA分别由片段2和片段3编码。另外，一些流感株的片段1编码由PB1编码区内的选择性阅读框生成的小分子蛋白PB1-F2。片段4编码涉及感染期间细胞附着和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。片段5编码核壳体核蛋白(NP)多肽，与病毒RNA相关的主要结构组分。片段6编码神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。片段7编码由差别剪接mRNA翻译的两种基质蛋白(标为M1和M2)。片段8编码由选择性剪接mRNA变异体翻译的两种非结构蛋白NS1和NS2。所述B型流感的8个基因组片段编码11种蛋白。最大的3个基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。片段4编码HA蛋白。片段5编码NP。片段6编码NA蛋白和NB蛋白。NA和NB两种蛋白均由双顺反子mRNA的重叠阅读框翻译。病毒B的片段7也编码两种蛋白：M1和BM2。最小片段编码两种产物：由全长RNA翻译成NS1，而由剪接mRNA变异体翻译成NS2。
A型和B型流感通常与人类种群中的流感爆发有关。然而，A型流感也感染其它物种，例如鸟类、猪和其它动物。根据其血凝素和神经氨酸酶表面糖蛋白抗原中的差别将A型病毒分为亚型。A型病毒中的血凝素有16个已知亚型并且神经氨酸酶有9个已知亚型。在人类中，目前仅已知约4种不同血凝素和2种不同神经氨酸酶亚型，例如H1、H2、H3、H5、N1和N2。尤其，A型流感的两种主要亚型即H1N1和H3N2已在人中起作用。然而，最近H1N2受到关注。根据其血凝素和神经氨酸酶蛋白未将B型流感病毒分为亚型。
根据例如流感凝集血红细胞(RBC或红血球)的能力可对不同流感株分类。对特定流感株有特异性的抗体可结合所述病毒并且从而防止这种凝集。根据这种抑制确定菌株类型的检测通常称为血凝素抑制检测(HI检测或HAI检测)并且是本领域表征流感株的标准已知方法。当然，本领域的技术人员将熟悉其它检测，例如ELISA、间接荧光抗体检测、免疫组织化学法、蛋白免疫印迹检测等，通过这些检测标准流感株，不必将本文对HI检测的讨论看作限制。
简言之，在典型HI检测中，将雪貂中常生成的用于分型或分类的血清加入各种稀释度(例如，2倍等)的红血球样品中。然后不管红血球凝结在一起(即，凝集)还是悬浮(即，非凝集)均进行光学测定。如果细胞未凝结，由于血清中对所述流感有特异性的抗体的抑制，不会发生凝集。因此，所述类型的流感定义为存在于相同菌株中。在一些情况下，将一种菌株描述为与其它菌株相似，例如，菌株x为“y样”菌株等。例如，通过HI检测测定，两种样品的滴度互成4倍，则可将这两种样品描述为属于相同菌株(例如，均属于“NewCaledonia”株或均属于“Moscow样”株等)。换言之，菌株通常根据其免疫或抗原方面分类。通常将HAI滴度定义为完全抑制血凝集的最高血清稀释度。参见，例如Schild等，Bull.Wld Hlth Org.，1973，48：269-278等。并且，本领域的技术人员十分熟悉将流感分类和分级为菌株以及分类和分级的方法。
由上文应了解本发明不仅包括本文所列特异性序列，还包括各种载体(例如，用于质粒重配和救援的载体，参见下文)内的这种序列以及在与本文所列序列相同的菌株内的血凝素和神经氨酸酶序列。同样，还包括各种载体(例如，通常用于质粒重配和救援的载体，例如A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55或B/England/2608/76等)内的这种相同菌株。
如本文所使用的术语“相似株”应用于指与第二流感病毒相同或相关株的第一流感病毒。在典型实施方案中，通常通过使用HAI检测确定这种相关性。因此，HAI检测中滴度互成4倍的流感病毒为“相似株”。然而，本领域的技术人员将熟悉其它检测(例如)FRID、中和检测等以确定相似株。本发明还包括本文各种质粒、载体、病毒、方法等中的这种相似株(即，与本文序列表中存在的菌株相似的菌株)。因此，除非上下文清楚指出，本文中特定序列(例如，所述序列表中的序列)或其片段的描述也应被视为包括来自与那些相似的菌株(即，与具有本文那些质粒、载体、病毒等中的序列的那些菌株相似的菌株)的序列。同样，因此应了解“相似株”之间比较时，这种相似株内的NA和HA多肽为“相似多肽”。
流感病毒疫苗
本文的序列、组合物和方法主要但并非仅涉及生产用于疫苗的流感病毒。在历史上，主要使用所选病毒株或根据相关菌株的经验性预测在鸡含胚卵中生产流感病毒疫苗。最近，在经核准的减毒、温度敏感主菌株的情况下，已生产并入所选的血凝素和/或神经氨酸酶抗原的重配病毒。通过在鸡蛋中多次传代培养病毒之后，回收流感病毒并任选(例如)使用甲醛和/或β-丙内酯灭活(或可选地用于减毒活疫苗)。因此，应了解HA和NA序列(如本发明中的HA和NA序列)在构建流感疫苗中十分有用。
在细胞培养物中生成重组和重配疫苗的尝试受一些经核准用于疫苗生产的菌株在标准细胞培养条件下不能有效生长的阻碍。然而，发明人及其同事先前的工作提供了在培养时生成重组和重配病毒的载体系统和方法，从而使得可能快速生成疫苗，所述疫苗相应于病毒的一种或多种所选抗原株，例如包含本文HA和NA序列的A或B株、各种亚型或次代株等。参见，2002年10月23日提交的美国申请第60/420,708号、2003年4月25日提交的美国申请第10/423,828号和2004年5月24日提交的美国申请第60/574,117号，全部所述申请的标题均为“Multi-Plasmid System for the Production of InfluenzaVirus(用于生产流感病毒的多质粒系统)”。通常，在使用温度调节器(例如恒温器)以确保温度不超过35℃的恒温下在受控制的湿度和CO2的条件下，将培养物保存在系统例如细胞培养恒温箱中。通过引入相应于主流感病毒的基因组片段的载体的亚组与源自目标株(例如，本文的HA和NA抗原变异体)的互补片段的组合，可易于获得重配流感病毒。通常，根据与疫苗施用有关的所需性质选择主菌株。例如，对于疫苗生产，例如对于减毒活疫苗生产，可选择减毒表现型、冷适应和/或温度敏感的主供体病毒株。如本文别处所说明和例如在美国专利申请第10/423,828号等中，本发明的各种实施方案中利用A/AnnArbor(AA)/6/60或B/Ann Arbor/1/66或A/Puerto Rico/8/34或B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55或B/England/2608/76流感株作为“骨架”，在所述流感株上添加HA和/或NA基因(例如，本文所列的那些序列等)以生成所需重配病毒。因此，例如在6:2重配体中，2个基因(即，NA和HA)来自需要对其产生免疫原性反应的流感株，而其它6个基因来自Ann Arbor株或其它骨架病毒株等。Ann Arbor病毒对于其冷适应、减毒、温度敏感属性有用。当然，应了解本文的HA和NA序列能够与许多其它病毒基因或病毒类型(例如，含重配体中存在的其它流感基因(即，非HA和非NA基因)的许多不同“骨架”(例如A/PuertoRico/8/34等))重配。最近美国批准了抗人流感病毒的减毒A型流感病毒活疫苗。参见上文。这种疫苗为重配H1N1和H1N2病毒，其中A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(ca)病毒的内部蛋白基因使重配病毒(即，具有来自非Ann Arbor株的血凝素和神经氨酸酶基因的重配病毒)具有AA ca病毒的冷适应、减毒和温度敏感表现型。在本文的一些实施方案中，重配体也可包括7:1重配体。换言之，仅HA或NA不是来自骨架或MDV病毒株。据报道，先前的工作报道有任选在本发明各种实施方案中的适合的骨架供体病毒株。参见，例如，2002年10月23日提交的美国申请第60/420,708号、2003年4月25日提交的美国申请第10/423,828号和2004年5月25日提交的美国申请第60/574,117号，全部所述申请的标题均为“Multi-Plasmid System for theProduction of Influenza Virus(用于生产流感病毒的多质粒系统)”；Maassab等，J.of Inf.Dis.，1982，146：780-790；Cox等，Virology，1988，167：554-567；Wareing等，Vaccine，2001，19：3320-3330；Clements等，JInfect Dis.，1990，161(5)：869-77等。
在一些实施方案中，本文所述的序列可任选地使特定区域去除(在核酸序列或氨基酸序列二者中或在任一核酸序列或氨基酸序列中)。例如，对于具有多碱价裂解位点的那些分子而言，可任选去除这些位点。在本文的一些实施方案中，与野生型序列相比这些裂解部位的序列(例如)被修饰或改变(例如，以使得不能裂解或减少其裂解等)，其中裂解序列源自野生型序列。在不同菌株或序列中，由于起始序列中裂解位点的各个序列，这些修饰/改变可不同。例如，在一些HA序列中通常将4个多碱残基(RRKK)去除(与wt相比)。在各种实施方案中，可通过多种方式(其全部包括在本发明中)修饰这些多碱价裂解位点。例如，多碱价裂解位点可一次去除一个氨基酸(例如，去除1个R、去除2个R、去除RRK或去除RRKK)。另外，也可去除或改变裂解位点直接上游的氨基酸残基(例如，从R改为T等)；同样，也可修饰编码裂解位点直接下游的氨基酸残基的核苷酸。本领域的技术人员将熟悉去除这些特异性区域的各种方法。所生成的截短序列也包含在本发明中。参见，例如，Li等，J.of Infectious Diseases，179：1132-8，1999。
本领域熟知适用于任选地涵盖本序列的病毒(通常用作疫苗或用于疫苗生产)的术语“温度敏感”、“冷适应”和“减毒”。例如，术语“温度敏感”(ts)指(例如)对A型流感株而言相对于33□下，病毒在39□下表现出滴度降低100倍或更多，或对B型流感株而言相对于33□下，病毒在37□下表现出滴度降低100倍或更多。术语“冷适应”(ca)指病毒表现出在25□下的生长是在33□下生长的100倍以内，而术语“减毒”(att)指病毒在雪貂的上呼吸道复制，但在肺部组织中不可检测，并且不会引起动物流感样疾病。应了解，具有中间表现型的病毒，即表现出在39□(对于A株病毒而言)或37□(对于B株病毒而言)下的滴度降低100倍以下或在25□下的生长比在33□下的生长快100倍(例如，在200倍、500倍、1000倍以内、10,000倍以下)和/或表现出与在雪貂上呼吸道内的生长相比在肺部中的生长减慢(即，部分减毒)和/或减少动物流感样疾病的病毒也是有用的病毒并且可与本文的HA和NA序列联合使用。
因此，本发明可利用例如在适当培养条件下与在培养细胞中体内生成疫苗有关的所需性质(例如，减毒病原性或表现型、冷适应、温度敏感等)的病毒株(A和B株流感病毒)的生长。可通过将并入克隆病毒基因组片段的多种载体引入宿主细胞，并且在不超过35℃的温度下培养细胞来生产流感病毒。当转染包括流感病毒基因组的载体时，通过标准纯化方法可回收适于用作疫苗的重组病毒。使用本发明的载体系统和方法，可在组织培养物中快速且有效地生产并入选择具有对疫苗生产而言所需性质的病毒株的6个内部基因片段和来自所选(例如)病原株的免疫原性HA和NA片段(例如本文序列表中的那些片段)的重配病毒。因此，在重组和重配A型和B型流感病毒的细胞培养物中，本文所述系统和方法可用于快速生产，所述重配A型和B型流感病毒包括适于用作疫苗的病毒，所述疫苗包括减毒活疫苗，例如适于鼻内施用的疫苗。
在这些实施方案中，通常选择单个主供体病毒(MDV)株的每个A和B亚型。在减毒活疫苗的情况下，通常选择主供体病毒株与疫苗生产有关的有利性质，例如温度敏感、冷适应和/或减毒。例如，示例性主供体株分别包括A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66的温度敏感、减毒和冷适应株以及全文提到的其它菌株。
例如，由组成病毒基因组的多种克隆病毒cDNA生成所选主供体A型病毒(MDV-A)或主供体B型病毒(MDV-B)。实施方案包括由8个克隆病毒cDNA生成的重组病毒。任选地将表示PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS的所选MDV-A或MDV-B序列的8个病毒cDNA克隆至双向表达载体，例如质粒(例如，pAD3000)中，使得可由来自一条链的RNA聚合酶I(pol I)启动子转录病毒基因组RNA，并且可由来自另一条链的RNA聚合酶II(pol II)启动子合成病毒mRNA。任选地，任何基因片段均可被修饰，所述基因片段包括HA片段(例如，用于去除多碱基裂解位点(也称为多碱价裂解位点))。
将携带8个病毒cDNA的质粒转染至适当宿主细胞(例如，Vero细胞、共培养MDCK/293T或MDCK/COS7细胞)之后可回收感染的重组MDV-A或MDV-B病毒。使用本文所述的质粒和方法，例如2002年10月23日提交的美国申请第60/420,708号、2003年4月25日提交的美国申请第10/423,828号和2004年5月24日提交的美国申请第60/574,117号，全部所述申请的标题均为“Multi-Plasmid System for theProduction of Influenza Virus(用于生产流感病毒的多质粒系统)”；Hoffmann，E.，2000，PNAS，97(11)：6108-6113；Hoffmann，美国公开专利申请第20020164770号；和Palese等，2003年4月8日发表的USPN6,544,785，本发明对(例如)通过将所选病毒(例如，MDV-A、MDV-B)的6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和源自不同相应类型(A或B)流感病毒(例如，如本文序列表所示)的HA和NA一起共转染生成6:2重配流感疫苗是有用的。例如，如常规地进行疫苗生产，从病原相关H1、H3或B菌株有利地选出了HA片段。相似地，HA片段可选自作为病原株的具有新出现的关联性的菌株，例如本文序列表中所列片段。也可生产并入MDV的7个基因组片段和所选菌株的HA或NA基因的重配体(7:1重配体)。应了解，如全文所详述，本发明的分子可任选地组合为任一所需组合物。例如，可将本文的HA和/或NA序列置于(例如)6:2重配体或7:1重配体等中的重配体骨架中，例如A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34(即，PR8)等。因此，如以下更全面的解释，存在来自供体病毒(再次例如A/AA/6/60等)的6个内部基因组片段和来自第二株(例如，野生型菌株，非供体病毒)的2个基因组片段。这2个基因组片段优选为HA和NA基因。7:1重配体中出现相似情况，然而其中存在来自供体病毒的7个基因组片段和来自不同病毒(通常为野生型或需要对其有免疫应答的类型)的1个基因组片段(HA或NA)。同样，应了解在本文的不同实施方案中本文的序列(例如，图1序列表中的那些序列等)可按不同方式组合。因此，在本文的任一序列可很少存在于7:1重配体中(即，本发明序列与7个供体病毒基因组片段一起存在)和/或可与6:2重配体中的本发明另一序列一起存在。在这种6:2重配体中，本发明的任一序列可任选地与本发明的任一其它序列一起存在。然而，典型的和优选的实施方案包括来自相同来源的野生型菌株(或经修饰野生型菌株，例如那些具有经修饰多碱价裂解位点的野生型菌株)的HA和NA。例如，典型的实施方案可包括具有来自供体病毒(例如A/AA/6/60)的6个内部基因组片段和本文所述HA和NA基因组片段的6:2重配体。当然，同样应了解本发明还包括这种重配病毒，其中HA和NA基因组片段来自相似病毒株。出于所有目的，例如尤其为了有关质粒、病毒(流感病毒)的质粒救援、用于病毒救援/生产的多质粒系统等的教导，特别将以上参考以其整体并入本文。
再次，本发明的HA和NA序列任选地用于这种质粒重配疫苗(和/或其它ts、cs、ca和/或att病毒和疫苗)中。然而，应注意到本发明的HA和NA序列等不限于特异性疫苗组合物或生产方法，并且因此大体上可用于任何疫苗类型或疫苗生产方法中，所述方法利用菌株特异性HA和NA抗原(例如，本发明的序列)。
Figure BDA0000123166940000321
如上所述，存在许多流感病毒的实例和类型。示例性流感疫苗为FluMist(MedImmune Vaccines Inc.，Mt.View，CA)，这是预防儿童和成人遭受流感疾病的减毒活疫苗(Belshe等(1998)The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine inchildren N Engl J Med 338：1405-12；Nichol等(1999)Effectiveness oflive，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，workingadults：a randomized controlled trial JAMA 282：137-44)。在典型的和优选实施方案中，本发明的方法和组合物优选适于/用于生产FluMist疫苗。然而，本领域的技术人员应了解本文的序列、方法、组合物等也适于生产相似或甚至不同的病毒疫苗。
FluMist疫苗株包含例如源自野生型菌株的HA和NA基因片段和来自常见主供体病毒(MDV)的6个基因片段PB1、PB2、PA、NP、M和NS，其中疫苗导向野生型菌株(或在一些情况下，导向相关菌株)。因此，本文的HA和NA序列任选地为各种FluMist制剂的一部分。在接连降低的温度下，通过在鸡肾组织原代培养中系列传代野生型A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60)菌株而生成FluMist流感A菌株的MDV(MDV-A)(Maassab(1967)Adaptation and growth characteristicsof influenza virus at 25 degrees CNature 213：612-4)。MDV-A在25℃下有效复制(ca，冷适应)，但在38℃和39℃下其生长受到限制。另外，在受感染雪貂的肺部中该病毒不复制(att，减毒)。人们认为ts表现型通过在除呼吸道最冷区域外的全部区域限制疫苗的复制而有助于疫苗的减毒。在动物模型和临床研究中已证明了这种性质的稳定性。与通过化学诱变生成的流感菌株的ts表现型相反，在感染的仓鼠或在来自儿童的排出分离物中传代之后MDV-A的ts性质不会恢复(对于近期评论，参见Murphy & Coelingh(2002)Principles underlying thedevelopment and use of live attenuated cold-adapted influenza A and Bvirus vaccines Viral Immunol 15：295-323)。
对超过20,000成人和儿童进行涉及12种分离6:2重配株的临床研究已显示这些疫苗是减毒、安全、有效的(Belshe等(1998)Theefficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenzavirus vaccine in children N Engl J Med 338：1405-12；Boyce等(2000)Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunitinfluenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine19：217-26；Edwards等(1994)A randomized controlled trial of coldadapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza Adisease J Infect Dis 169：68-76；Nichol等(1999)Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adults：a randomized controlled trial JAMA 282：137-44)。携带MDV-A的6个内部基因和野生型病毒的两个HA和NA基因片段的重配体(即，6:2重配体)始终保持ca、ts和att表现型(Maassab等(1982)Evaluation of acold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J.Infect.Dis.146：780-900)。
使用B型流感株生产这种重配病毒更加困难，然而最近研究(参见，例如，2002年10月23日提交的美国申请第60/420,708号、2003年4月25日提交的美国申请第10/423,828号和2004年5月24日提交的美国申请第60/574,117号，全部所述申请的标题均为“Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus(用于生产流感病毒的多质粒系统)”)示出了用于完全来自克隆cDNA的B型流感病毒生成的8个质粒系统。还示出了用于适于疫苗制剂(例如用于鼻内施用的活病毒疫苗制剂)的A型和B型减毒流感活疫苗的生产方法。
先前描述的系统和方法对在重组和重配A型和B型流感病毒的细胞培养物中进行快速生成是有用的，所述流感病毒包括适于用作疫苗的病毒，所述疫苗包括减毒活疫苗，例如适于鼻内施用的疫苗。本发明的序列、方法等任选地连同或组合涉及(例如)用于疫苗生产的重配流感病毒的先前研究一起使用以生产用于疫苗的病毒。
预防性施用疫苗的方法和组合物
如上所述，可选地或除了用于生产FluMistTM疫苗以外，本发明还可用于其它疫苗制剂。通常，可预防性地施用免疫有效量的且在适当载体或赋形剂中的本发明重组和重配病毒以刺激由HA和/或NA序列确定的对一种或多种流感病毒株有特异性的免疫应答。通常，所述载体或赋形剂为药学上可接受的载体或赋形剂，例如无菌水、含水盐溶液、含水盐缓冲液、含水葡萄糖溶液、含水甘油溶液、乙醇、来自未感染鸡蛋的尿囊液(即，正常尿囊液或NAF)或其组合。根据本领域确定的方法实现这些溶液的制备，确保无菌、pH、等渗性和稳定性。通常，选择载体或赋形剂以将过敏和其它非期望的作用降到最低并适应特定施用途径，例如皮下、肌内、鼻内等。
本发明的相关方面提供用于刺激个体的免疫系统以对流感病毒产生保护性免疫应答的方法。在所述方法中，向个体施用在生理上可接受的载体中的免疫有效量的重组流感病毒(例如，本发明的HA和/或NA分子)、免疫有效量的本发明多肽和/或免疫有效量的本发明核酸。
通常，以足以刺激对一种或多种流感病毒株(即，对本发明的HA和/或NA菌株)有特异性的免疫应答的量施用本发明流感病毒。优选地，施用流感病毒引起对这些菌株的保护性免疫应答。本领域的技术人员已知引起对一种或多种流感株起保护性免疫应答的剂量和方法。参见，例如，USPN 5,922,326；Wright等，Infect.Immun.37：397-400(1982)；Kim等，Pediatrics 52：56-63(1973)；和Wright等，J.Pediatr.88：931-936(1976)。例如，提供约1-1000HID50(人感染剂量)范围的流感病毒，即每剂量施用约105-108pfu(空斑形成单位)。通常，根据(例如)年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用时间和其它临床因素在此范围内调整剂量。例如通过使用针和注射器或无针注射装置皮下或肌内注射全身性施用预防性疫苗制剂。可选地，以滴剂、大粒度气雾剂(大于约10μm)或喷雾剂经鼻内将疫苗制剂施用至上呼吸道内。虽然以上任何递送途径均引起系统保护性免疫应答，但鼻内施用使得在流感病毒的进入部位引起粘膜免疫力的益处增加。对于鼻内施用，通常优选减毒病毒活疫苗，例如减毒、冷适应和/或温度敏感的重组或重配流感病毒。参见上文。虽然优选用单次剂量刺激保护性免疫应答，可通过相同或不同途径施用另外的剂量，以达到预期保护效果。
通常，如用于疫苗中的本发明的减毒重组流感充分减毒，使得在经减毒流感病毒免疫(或以其它方式感染)的多数个体中不会出现感染症状或至少不会出现严重的感染症状。在一些情况下，减毒流感病毒仍然能够产生轻微疾病(例如，轻微上呼吸道疾病)的症状和/或传播给未接种疫苗的个体。然而，其毒性被充分消除，使得在接种疫苗的宿主或偶见宿主中不会出现严重的下呼吸道感染。
可选地，可通过在离体或体内用包含本文所述序列的流感病毒靶向树突细胞来刺激免疫应答。例如，将增殖树突细胞暴露于足够量的病毒中并且足够长时间以使树突细胞捕获流感抗原。然后通过静脉内移植法将细胞转移到待接种疫苗的受治疗者体内。
虽然优选用单次剂量刺激保护性免疫应答，但还可通过相同或不同途径施用另外的剂量，以达到预期保护效果。在新生儿和婴儿中，例如，可能需要多次施用以引起足够的免疫力水平。整个儿童时期可不时继续施用，因为必须保持对野生型流感感染的足够预防水平。相似地，尤其易受反复或严重流感感染的成人，例如卫生保健工作者、日托工作者、幼儿的家庭成员、老人和心肺功能受损的个体可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。例如，可通过测定中和分泌抗体和血清抗体的量以及引起和维持预期预防水平所必须的调节剂量或重复接种来监控诱导的免疫力水平。
任选地，作流感病毒预防性施用的制剂还含有一种或多种用于增强对流感抗原免疫应答的佐剂。适合佐剂包括：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂角苷、矿物胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂)、复合多元醇、聚阴离子、肽类、油或烃乳液、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和合成佐剂QS-21和MF59。
若需要，流感病毒的预防性疫苗施用可与一种或多种免疫刺激分子的施用一起进行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子(例如白细胞间素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13))、生长因子(例如，粒细胞巨噬细胞(GM)-菌落刺激因子(CSF))和其它免疫刺激分子，例如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可在与流感病毒相同的制剂中施用，或者可单独施用。可施用蛋白质(例如，本发明的HA和/或NA多肽)或编码所述蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效果。
上述方法通过将包含编码治疗或预防有效的HA和/或NA多肽(或肽)的异源多聚核苷酸或HA和/或NARNA(例如，反义RNA或核糖酶)的本发明载体引入在体外、离体或体内的靶细胞群中用于治疗性和/或预防性治疗疾病或病症(通常为流感)。通常，编码多肽(或肽)的多聚核苷酸或目标RNA可操作地连接适当的调节序列，例如本文所述调节序列。任选地，将一个以上异源编码序列并入单个载体或病毒中。例如，除了编码治疗或预防活性的HA和/或NA多肽的多聚核苷酸或RNA以外，载体还包括另外的治疗或预防性多肽(例如，抗原、协同刺激分子、细胞因子、抗体等)和/或标记物等。
尽管为个体接种特定亚群的特定菌株的减毒流感病毒可诱导对不同菌株和/或亚群的流感病毒的交叉保护，但是，若需要，可通过为个体接种来自至少2种、至少3种或至少4种流感病毒株或次代株的减毒流感病毒来增强交叉保护，例如至少其中2种流感病毒株代表不同亚群。例如，为个体接种至少4种减毒流感病毒株或次代株可包括为个体接种至少2种A型流感病毒株或次代株和至少2种B型流感病毒株或次代株。为个体接种至少4种减毒流感病毒株或次代株可包括为个体接种至少3种A型流感病毒株或次代株和至少1种B型流感病毒株或次代株。为个体接种至少4种减毒流感病毒株或次代株可能需要施用单个四价疫苗，所述四价疫苗包含全部所述至少4种减毒流感病毒株或次代株。接种疫苗可能选择性需要施用多种疫苗，每种疫苗包含1种、2种或3种减毒流感病毒株或次代株。另外，疫苗组合可任选地包括大流行疫苗和非大流行菌株的混合物。疫苗混合物(或多次接种疫苗)可包含来自人菌株和/或非人流感株(例如，鸟类和人等)的组分。相似地，本发明的减毒流感疫苗可任选地与诱导对其它感染物起保护性免疫应答的疫苗组合。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包含3个重配流感病毒的三价疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包含2个重配A型流感病毒和1个重配B型流感病毒的三价疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包含1个H1型重配A型流感病毒、1个H3型重配A型流感病毒和1个重配B型流感病毒的三价疫苗。在另一实施方案中，本发明的疫苗为包含4个重配流感病毒的四价疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包含2个重配A型流感病毒和2个重配B型流感病毒的四价疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包含1个H1型重配A型流感病毒、1个H3型重配A型流感病毒、1个Victoria谱系重配B型流感病毒和1个Yamagata谱系重配B型流感病毒的四价疫苗。
重组病毒的生产
使用重组反向遗传方法可基因工程化和回收负链RNA病毒(USPN 5,166,057，Palese等)。最初将这种方法应用于工程流感病毒基因组(Luytjes等(1989)Cell 59：1107-1113；Enami等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11563-11567)，并且已成功应用于各种分段和非分段负链RNA病毒，例如狂犬病(Schnell等(1994)EMBO J.13：4195-4203)、VSV(Lawson等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481)、麻疹病毒(Radecke等(1995)EMBO J.14：5773-5784)、牛瘟病毒(Baron & Barrett(1997)J.Virol.71：1265-1271)、人副流感病毒(Hoffman & Banerjee(1997)J.Virol.71：3272-3277；Dubin等(1997)Virology 235：323-332)、SV5(He等(1997)Virology 237：249-260)、犬瘟热病毒(Gassen等(2000)J.Virol.74：10737-44)和仙台病毒(Park等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5537-5541；Kato等(1996)Genesto Cells 1：569-579)。本领域的技术人员熟悉这些和相似技术，以生产包含本发明的HA和NA序列的流感病毒。正如包含一种或多种本发明的核酸和/或多肽的重组流感病毒，根据这些方法生产的重组流感病毒也是本发明的特征。当然，正如本领域的技术人员所了解，通常流感病毒(和本发明的流感病毒)为负链RNA病毒。因此，当本发明描述转录包含例如图1的序列等的流感病毒时，应理解为通常指所述序列的相应负链RNA形式。图1中的核苷酸序列包含基因的DNA形式(例如，编码正义)(连同核苷酸序列中的一些未翻译区域)。本领域的技术人员可容易地进行RNA和DNA序列之间的转变(例如，将U变为T等)和互补核苷酸序列(RNA或DNA)之间的转变等。因此，例如，本领域的技术人员可容易地从核苷酸序列转变为相应氨基酸序列或相应互补序列(DNA或RNA)等。同样，明显的是，当这种HA和/或NA序列描述为在DNA载体内(例如质粒等)内时，则通常可理解所述序列的相应DNA形式。并且，本发明的核酸包括本文序列表中的显式序列以及该序列的互补序列(RNA和DNA)、序列表中的序列的双链形式、序列表中的序列的相应RNA形式(如序列表中与显式序列互补的RNA或序列表中的序列的RNA形式，例如有相同意义，但由RNA组成，用U代替T等)。
细胞培养和表达宿主
本发明还涉及引入(转导、转化或转染)本发明的载体的宿主细胞和通过重组技术生产本发明的多肽。用载体，例如本发明的表达载体基因工程化(即，转导、转化或转染)宿主细胞。如上所述，载体可呈质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。适当表达宿主的实例包括：细菌细胞(例如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、真菌细胞(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa))或昆虫细胞(例如果蝇(Drosophila)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))。
最常见的是，将哺乳动物细胞用于培养本发明的HA和NA分子。适于流感病毒复制的宿主细胞(例如，具有本文的HA和/或NA序列)包括(例如)Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞(包括293T细胞、COS7细胞等)。一般地，按例如1∶1的比例采用包括以上两种细胞系(例如MDCK细胞和293T或COS细胞)的共同培养物以提高复制效率。通常，在适于维持中性缓冲pH(例如，pH为7.0至7.2)的受控湿度和CO2浓度下，在标准商用培养基(例如补充血清(例如，10％胎牛血清)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium))或无血清的培养基中培养细胞。任选地，培养基含有防止细菌生长的抗生素(例如，青霉素、链霉素等)和/或另外的营养素(例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸)、促进有利生长特征的另外的添加物(例如，胰岛素、β-巯基乙醇)等。
可在(例如)通过病毒的产生而改良为适于活化启动子、选择转化体或扩增所插入的多聚核苷酸序列的常规营养培养基中培养工程化宿主细胞。培养条件，例如温度、pH等通常为先前用于选择进行表达的特定宿主细胞的培养条件，并且对于本领域的技术人员而言显而易见并且本文引用的参考包括(例如)Freshney(1994)Culture ofAnimal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，NewYork以及其中引用的参考。其它有用参考包括(例如)Paul(1975)Celland Tissue Culture，第5版，Livingston，Edinburgh；Adams(1980)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-CellCulture for Biochemists，Work和Burdon(编)Elsevier，Amsterdam。有关体外生产流感病毒过程中特别感兴趣的组织培养方法的另外的详情包括(例如)Cohen和Shafferman(编)Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines中的Merten等(1996)Production of influenzavirus in cell cultures for vaccine preparation.，出于各种目的将其整体并入本文。另外，易于通过常规实验确定该方法中适于本发明的变化并且为本领域的技术人员所熟悉。
可在含血清或无血清的培养基中培养用于生产流感病毒的细胞(例如，具有本文的HA和/或NA序列)。在一些情况下，例如为了制备纯化病毒，通常需要宿主细胞在无血清条件下生长。可小规模培养细胞，例如在少于25ml的培养基、培养管或烧瓶中或在搅拌下的大烧瓶中，在烧瓶、瓶子或反应器培养物中的微载体珠上(例如，DEAE-Dextran微载体珠(例如Dormacell、Pfeifer & Langen)、微珠、流动型实验室、苯乙烯共聚物-三-甲胺珠(例如Hillex、SoloHill、AnnArbor))。微载体珠是为每体积细胞培养物的粘附细胞提供较大表面积的小球(直径为100-200μm)。例如，lL培养基可包括20,000,000个以上的微载体珠，提供了超过8000cm2的生长表面。对于病毒的商业生产，例如对于疫苗生产，常常需要在生物反应器或发酵罐中培养细胞。生物反应器在lL以下至100L以上的体积均可用，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)、NBS生物反应器(NewBrunswick Scientific，Edison，NJ)、来自B.Braun Biotech International(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)的实验室和商业规模的生物反应器。
不管培养体积的大小，在本发明的许多预期方面，重要的是使用温度依赖型多质粒系统(参见，例如，2002年10月23日提交的美国申请第60/420,708号、2003年4月25日提交的美国申请第10/423,828号和2004年5月24日提交的美国申请第60/574,117号，全部所述申请的标题均为“Multi-Plasmid System for the Production of InfluenzaVirus(用于生产流感病毒的多质粒系统)”)，加热病毒溶液以便过滤等将培养物保持在适当温度下，以确保有效回收重组和/或重配流感病毒。通常，采用调节器(例如，恒温器)或用于感知和保持细胞培养系统和/或其它溶液的温度的其它装置，以确保在适当时期(例如，病毒复制等)温度处于恰当水平。
在本文的一些实施方案中(例如，其中由载体上的片段生成重配病毒)，根据本领域熟知的用于将异源核酸引入真核细胞的方法将包含流感基因组片段的载体引入(例如，转染)宿主细胞中，所述方法包括(例如)磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染和采用聚胺转染试剂转染。例如，可根据厂商说明使用聚胺转染试剂TransIT-LT1(Mirus)将载体(例如，质粒)转染至宿主细胞中，例如COS细胞、293T细胞或COS或293T细胞与MDCK细胞的组合，以生成重配病毒等。因此，在一个实例中，用约2μl稀释于160μl培养基(优选为无血清培养基)中的TransIT-LT1将约1μg每种载体引入宿主细胞群中，总体积为200μl。在室温下孵育DNA：转染试剂混合物45min，然后加入800μl培养基。将转染混合物加入宿主细胞，并且通过本领域技术人员熟知的其它方法如上所述培养细胞。因此，为了在细胞培养物中生产重组或重配病毒，将并入所述8个基因组片段(例如，本发明的PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)的每一个的载体与约20μl的TransIT-LT1混合并转染至宿主细胞中。任选地，在用无血清培养基(例如，Opti-MEM I)转染之前更换含血清培养基并孵育4-6h。
可选地，可采用电穿孔将并入流感基因组片段的载体引入宿主细胞。例如，根据以下方法使用电穿孔利于将并入A型或B型流感病毒的质粒载体引入Vero细胞。简言之，约5x106个Vero细胞，例如在补充10％胎牛血清(FBS)的改良伊格尔培养基(MEM)中生长的Vero细胞重新悬浮于0.4ml OptiMEM中并置于电穿孔试管中。向试管中的细胞加入20μg体积达25μl的DNA，然后轻拍轻轻混合。根据厂商说明(例如，连有Capacitance Extender Plus的BioRad Gene Pulser)在300V、950mF及28-33ms的时间常数下进行电穿孔。通过轻拍再次混合细胞，并且电穿孔后约1-2min，将0.7ml含有10％FBS的MEM直接加入试管。然后将细胞转染至含2ml MEM、10％FBS的标准6孔组织培养皿的两个孔中。冲洗试管以回收全部剩余细胞，并且将洗涤悬浮液分为两孔。最终体积约为3.5mL。然后在允许病毒生长的条件下孵育细胞，例如对于冷适应株而言在约33下℃孵育。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多表达系统，例如基于病毒的系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，编码序列任选地连至由晚期启动子和三联体前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。插入病毒基因组的非必需E1或E3区域将产生能够在感染宿主细胞中表达目标多肽的存活病毒(Logan和Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci81：3655-3659)。另外，转录增强子，例如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子可用于增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。
任选地选择宿主细胞株能够以所需的方式调节插入序列的表达或加工表达的蛋白。这种蛋白质的修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。将蛋白质的前体形式裂解为成熟形式的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或功能很重要。另外，宿主细胞内的恰当定位(即，在细胞表面)也很重要。不同的宿主细胞，例如COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等具有特异性细胞结构和这种翻译后修饰活性的特征机制，并且可选择以确保正确修饰和处理当前引入的外源蛋白。
为了长期高产量生产本发明的多聚核苷酸编码的重组蛋白或具有本发明的多聚核苷酸编码的子序列的重组蛋白，可任选地使用稳定的表达系统。例如，使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选标记基因的表达载体来转染稳定表达本发明多肽的细胞系。例如，在引入载体后，在细胞转移到选择培养基之前使细胞在富集培养基中生长1-2天。可选标记的目的是为了赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和回收。因此，可使用适于所述细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化细胞(例如，源自单一细胞类型)的抗性细胞团。
用编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞任选地在适于表达编码蛋白并从细胞培养物中回收编码蛋白的条件下培养。可将表达所述蛋白的细胞进行分类、分离和/或纯化。依据序列(例如，根据编码膜滞留信号等的融合蛋白)和/或所用载体，由重组细胞生成的蛋白质或其片段可分泌或与膜结合或细胞内滞留。
在非动物细胞，例如植物、酵母、真菌、细菌等中也可生成与本发明的核酸相对应的表达产物。除了Sambrook、Berger和Ausubel(全部参见下文)以外，还在Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；FundamentalMethods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)与Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL中发现关于细胞培养的详情。
在细菌系统中，可根据表达产物的预期的用途选择多种表达载体。例如，当生产抗体需要大量多肽或其片段时，利于采用指导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。这种载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中目标编码序列(例如包含本文发现的序列等)可连至用于氨基末端翻译的序列的框内的载体、pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem264：5503-5509)、pET载体(Novagen，Madison WI)等中，所述氨基末端翻译启动生成具催化活性的β-半乳糖苷酶融合蛋白的β-半乳糖苷酶的甲硫氨酸和随后7个残基。相似地，在酵母(酿酒酵母)中，多种含组成型或诱导型启动子的载体，例如α因子、醇氧化酶和PGH可用于生产所需表达产物。对于综述，参见下文Ausubel和Grant等，(1987)；Methods in Enzymology 153：516-544。
目标生物分子的克隆、诱变和表达
描述适于本发明的分子生物学技术(例如克隆、突变、细胞培养等)的一般文本包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual(第3版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，2000(“Sambrook”)和Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，a joint venture betweenGreene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(补充到2002年)(“Ausubel”))。这些文本描述了诱变、载体的用途、启动子和与(例如)HA和/或NA分子产生等有关的许多其它相关主题。
各种类型的诱变任选地用于本发明，(例如)以生成和/或分离(例如)新型或新分离的HA和/或NA分子和/或进一步修饰/突变本发明的多肽(例如，HA和NA分子)。诱变包括但不限于定点诱变、任意点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含模板的尿嘧啶诱变、寡聚核苷酸定向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双螺旋DNA诱变等。另外的适合方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、由全部基因合成诱变、双链断裂修复等。本发明还包括(例如)涉及嵌合构造的诱变。在一个实施方案中，天然存在的分子或改变或突变的天然分子的已知信息，例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等可指导诱变。
以上文本和本文中的实例描述了这些方法以及以下出版物(及其中的参考)：Sieber等，Nature Biotechnology，19：456-460(2001)；Ling等，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，Anal Biochem 254(2)：157-178(1997)；Dale等，Oligonucleotide-directed random mutagenesisusing the phosphorothioate method，Methods Mol Biol 57：369-374(1996)；I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res 23，3067-8(1995)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；Arnold，Proteinengineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology4：450-455(1993)；Bass等，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities，Science 242：240-245(1988)；Fritz等，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplexDNA procedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl Acids Res 16：6987-6999(1988)；Kramer等，Improved enzymatic in vitro reactions inthe gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，Nucl Acids Res 16：7207(1988)；Sakamar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl Acids Res 14：6361-6372(1988)；Sayers等，Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis，Nucl Acids Res 16：791-802(1988)；Sayers等，Strandspecific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，(1988)Nucl Acids Res 16：803-814；Carter，Improved oligonucleotide-directedmutagenesis using M13 vectors，Methods in Enzymol 154：382-403(1987)；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA，Methods in Enzymol 154：350-367(1987)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，inNucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))(1987)；Kunkel等，Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods inEnzymol 154，367-382(1987)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template，Methods in Enzymol 154：329-350(1987)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem J 237：1-7(1986)；Eghtedarzadeh & Henikoff，Use of oligonucleotides to generate largedeletions，Nucl Acids Res 14：5115(1986)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc Natl AcadSci USA，83：7177-7181(1986)；Nakamaye & Eckstein，Inhibition ofrestriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups andits application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl Acids Res14：9679-9698(1986)；Wells等，Importance of hydrogen-bond formationin stabilizing the transition state of subtilisin，Phil Trans R Soc Lond A317：415-423(1986)；Botstein & Shortle，Strategies and applications ofin vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter等，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl AcidsRes 13：4431-4443(1985)；
Figure BDA0000123166940000471
等，Oligonucleotide-directedmutagenesis by microscale ′shot-gun′gene synthesis，Nucl Acids Res 13：3305-3316(1985)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection，Proc Natl Acad Sci USA 82：488-492(1985)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann Rev Genet 19：423-462(1985)；Taylor等，The use of phosphorothioate-modified DNA in restrictionenzyme reactions to prepare nicked DNA，Nucl Acids Res 13：8749-8764(1985)；Taylor等，The rapid generation of oligonucleotide-directedmutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，NuclAcids Res 13：8765-8787(1985)；Wells等，Cassette mutagenesis：anefficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Kramer等，The gapped duplex DNA approachto oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl Acids Res 12：9441-9456(1984)；Kramer等，Point Mismatch Repair，Cell 38：879-887(1984)；Nambiar等，Total synthesis and cloning of a gene coding for theribonuclease S protein，Science 223：1299-1301(1984)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors，Methods in Enzymol 100：468-500(1983)；和Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：anefficient and general procedure for the production of point mutations inany DNA fragment，Nucl Acids Res 10：6487-6500(1982)。在Methods inEnzymol第154卷中有另外关于以上多种方法的详情，其还描述了用于各种诱变、基因分离、表达和其它方法的故障分析问题的有用控件。
通常根据Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts22(20)：1859-1862，(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用如Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res，12：6159-6168(1984)描述的自动化合成器化学合成例如用于本发明诱变(例如使本发明的HA和/或NA分子的文库突变，或使本发明的HA和/或NA分子的文库改变)的寡聚核苷酸。
另外，基本上任何核酸必需从任何商业来源定制或标准定购。相似地，肽和抗体可从任一多种来源定制。
本发明还涉及包含HA和/或NA分子或本发明的其它多肽和/或核酸或各种载体(例如6:2重配流感病毒、质粒救援系统中的质粒等)中的这种HA和/或NA或其它序列的宿主细胞和生物体。用本发明的载体基因工程化(例如，转化、转导或转染)宿主细胞，所述载体可为(例如)克隆载体或表达载体。例如，载体可呈质粒、细菌、病毒、裸露多聚核苷酸或结合多聚核苷酸形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述标准方法包括电穿孔(参见，From等，Proc NatlAcad Sci USA 82，5824(1985)、病毒载体感染、用在小珠或小颗粒基质内或在表面上有核酸的小颗粒进行高速弹道穿透(Klein等，Nature327，70-73(1987))。Berger、Sambrook和Ausubel提供了各种适当的转化方法。参见上文。
若干将靶核酸引入细菌细胞的熟知方法是可用的，其中任何方法均可用于本发明。这些方法包括：使受体细胞和含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、粒子轰击和感染病毒载体等。细菌细胞可用于扩增许多含本发明的DNA构造的质粒。使细菌生长至对数期，并且可通过本领域已知的各种方法分离细菌内的质粒(例如，参见Sambrook)。另外，用于从细菌中纯化质粒的大量试剂盒可商购(参见，例如，来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；和来自Qiagen的QIAprepTM)。然后进一步利用分离并纯化的质粒以生成其它质粒，用于转染细胞或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有用于调节特定靶核酸表达的转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列和启动子。载体任选地包含基因表达盒，所述基因表达盒含有至少一个独立终止子序列、允许所述盒在真核生物或原核生物或其二者中复制的序列(例如，穿梭载体)和原核和真核系统的选择标记。载体适于在原核生物、原核生物中或优选在其二者中复制和整合。参见，Giliman & Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等，Nature，328：731(1987)；Schneider，B.等，Protein Expr Purif6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(全部见上文)。例如，由ATCC提供了用于克隆的细菌和噬菌体目录，例如由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等(编)。Watson等(1992)Recombinant DNA Second Edition ScientificAmerican Books，NY中也发现序列测定、克隆和分子生物学其它方面的另外的基本方法和基础理论研究。参见上文。
多肽生产和回收
在一些实施方案中，在转导适合宿主细胞系或细胞株并使宿主细胞生长至适当细胞密度之后，通过适当方式(例如，温度变化或化学诱导)诱导所选启动子并且另外培养细胞一段时间。在一些实施方案中，然后从培养基回收分泌的多肽产物，例如如同呈分泌的融合蛋白形式的HA和/或NA多肽。在其它实施方案中，由细胞生产含有本发明的一种或多种HA和/或NA多肽的病毒颗粒。可选地，可通过离心收获细胞，通过物理或化学方式破坏细胞，并且保留所得到的粗提物进行进一步纯化。可通过任何简便方法破坏蛋白质表达中采用的真核或微生物细胞，所述方法包括冻融循环、声波处理、机械破坏或使用细胞溶解剂或本领域技术人员熟知的其它方法。另外，可利用表达本发明的HA和/或NA多肽产物的细胞，而无需从细胞分离多肽。在这种情况下，任选地在细胞表面表达本发明的多肽，并且因此在细胞表面结合抗体等的上面检验到所述多肽(例如，通过具有HA和/或NA分子或其片段，例如包含融合蛋白等)。这种细胞也是本发明的特征。
可通过本领域熟知的许多方法的任一种从重组细胞培养物中回收并纯化表达的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲合色谱法(例如，使用本领域技术人员已知的任何标记系统)、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。如需要，在完成成熟蛋白质构型中可使用蛋白质再折叠步骤。同样，在最后纯化步骤可采用高效液相色谱法(HPLC)。除了本文提到的参考以外，本领域还熟知各种纯化方法，包括例如Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；和Bollag等(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ，Harris and Angal(1990)Protein Purification Applications：A PracticalApproach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris and AngalProtein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)Protein Purification：Principles andPractice，第3版Springer Verlag，NY；Janson and Ryden(1998)ProteinPurification：Principles，High Resolution Methods and Applications，第2版Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ中阐述的方法。
当病毒内生成本发明的表达多肽时，通常从生长有感染(转染)细胞的培养基中回收病毒。通常，在浓缩流感病毒之前澄清粗培养基。常见方法包括超滤法、硫酸钡吸附并洗脱和离心法。例如，首先可通过以足以去除细胞碎片和其它大颗粒物质的时间(例如10至30min)离心(例如在1000-2000xg下)来澄清来自感染培养物的粗培养基。任选地，然后将澄清的培养基上清液离心(例如在15,000xg下)约3-5h以粒化流感病毒。在pH为7.4下将病毒颗粒再悬浮于适当缓冲液中之后，例如STE(0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.0001M EDTA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通过浓度梯度离心用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)浓缩病毒。连续梯度或步长梯度是适合的，例如蔗糖梯度在12％至60％之间，分为4个12％步长。按足以将病毒浓缩至供回收的可见带的速度和时间离心所述梯度。可选地，并且对于大规模商业应用而言，使用在连续模式下运转的区带离心转子从密度梯度净化病毒。例如，在Furminger.Vaccine Production，Nicholson等(编)的Textbook of Influenza pp.324-332；Merten等(1996)Production ofinfluenza virus in cell cultures for vaccine preparation，Cohen &Shafferman(编)Novel Strategies in Design and Production of Vaccines第141-151页和美国专利第5,690,937号中提供了足以指导技术人员由组织培养物制备流感病毒的另外的详情。若需要，可在存在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)的情况下将回收的病毒贮存于-80℃。
修饰氨基酸
本发明的表达多肽可含有一种或多种修饰氨基酸。修饰氨基酸的存在可利于(例如)：(a)延长多肽血清半衰期；(b)降低/增强多肽抗原性；(c)增强多肽贮存稳定性等。例如，在重组体生产期间共翻译或后翻译地修饰氨基酸(例如，在哺乳动物细胞内表达期间在N-X-S/T基序处进行N连接糖基化)或通过合成方式(例如，通过聚乙二醇化)修饰氨基酸。
修饰氨基酸的非限制性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊二烯基化(例如，法呢基化、香叶基香叶基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酰基化氨基酸等)以及通过与例如脂质部分或其它有机衍生化试剂结合而修饰的氨基酸。整篇文献中充满适于指导技术人员修饰氨基酸的参考。Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Human Press，Towata，NJ中有示例性方案。
融合蛋白
本发明还提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明的序列(例如，编码HA和/或NA多肽的序列)或其片段与例如免疫球蛋白(或其部分)、编码(例如)GFP(绿色荧光蛋白)或其它相似标记的序列等的融合。编码这种融合蛋白的核苷酸序列为本发明的另一方面。本发明的融合蛋白任选地用于(例如)与本发明的非融合蛋白相似的应用(包括，例如，本文所述的治疗、预防、诊断、实验等应用)。除了与免疫球蛋白序列和标记序列融合以外，本发明的蛋白质还任选地与(例如)为融合蛋白分类和/或将融合蛋白靶向特异性细胞类型、区域等的序列融合。
抗体
本发明的多肽可用于生成对本文给定的多肽和/或由本发明的多聚核苷酸编码的多肽有特异性的抗体，例如本文所示抗体，及其保守变异体。对以上提及的多肽有特异性的抗体用于(例如)诊断和治疗用途，例如与靶多肽的活性、分布和表达有关的用途。例如，可任选地利用这种抗体来定义与本文HA/NA序列相同的菌株内的其它病毒。
可通过本领域熟知的方法生成对本发明的多肽有特异性的抗体。这种抗体可包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab片段和由Fab表达文库生成的片段。
多肽不需要用于抗体生产的生物活性(例如，不需要全长功能性血凝素或神经氨酸酶)。然而，多肽或寡肽必须具抗原性。用于诱导特异性抗体的肽通常具有至少约4个氨基酸和通常至少5个或10个氨基酸的氨基酸序列。短距多肽可与另一蛋白质(例如钥孔血蓝素、生成的抗嵌合分子抗体)融合。
本领域技术人员已知多种生产多克隆和单克隆抗体的方法，并且可适于生产对本发明的多肽有特异性的抗体和/或由本发明的多聚核苷酸序列编码的抗体等。参见，例如，Coligan(1991)Current Protocolsin Immunology Wiley/Greene，NY；Paul(编)(1998)FundamentalImmunology，Fourth Edition，Lippincott-Raven，Lippincott Williams &Wilkins；Harlow and Lane(1989)Antibodies：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Press，NY；Stites等(编)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA及其中的参考；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed.)Academic Press，New York，NY；和Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497。适于抗体制备的其它技术包括选择噬菌体和相似载体中重组抗体库。参见，Huse等(1989)Science 246：1275-1281；和Ward等(1989)Nature 341：544-546。特异性单克隆和多克隆抗体和抗血清通常以(例如)至少约0.1μM、至少约0.01μM或更高的KD结合，并且通常以至少约0.001μM或更高的KD结合。
对于某些治疗应用，需要人源化抗体。美国专利5,482,856号中可发现制备嵌合(人源化)抗体的详细方法。Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering，第2版Freeman and Company，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)Antibody Engineering，A PracticalApproach IRL at Oxford Press，Oxford，England(McCafferty)，和Paul(1995)Antibody Engineering Protocols Humana Press，Towata，NJ(Paul)中可发现关于人源化和其它抗体生产与工程技术的另外的详情。例如，在Ostberg等(1983)，Hybridoma 2：361-367、Ostberg，美国专利第4,634,664号和Engelman等，美国专利第4,634,666号中有关于具体步骤的另外的详情。
核酸和多肽序列变异体
如本文所述，本发明提供了核酸多聚核苷酸序列和多肽氨基酸序列，例如血凝素和神经氨酸酶序列，和(例如)包含所述序列的组合物和方法。本文公开了所述序列的实例。然而，本领域技术人员将了解本发明未必限制于本文公开的那些序列，并且本发明还提供了许多具有本文所述功能的相关和无关序列，例如编码HA和/或NA分子的序列。
技术人员将了解公开序列的许多变异体包括在本发明内。例如，产生功能相同的序列的公开序列的保守改变包括在本发明内。核酸多聚核苷酸序列的变异体(其中变异体杂交至少一个公开序列)被视为包括在本发明内。例如，通过标准序列比较技术确定的本文公开序列的唯一子序列也包括在本发明内。
沉默变异
由于遗传密码的简并性，任选地生成编码本发明的多肽和/或病毒的任一核酸序列，一些序列与本文的HA和NA核酸和多肽的序列同一性水平较低。以下提供了指定在生物和生化文本中存在的遗传密码的典型密码子表。
表1
密码子表
Figure BDA0000123166940000541
密码子表显示许多氨基酸由一个以上密码子所编码。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均编码精氨酸。因此，在由一个密码子指定精氨酸的本发明核酸的每个位置上，可将密码子改为上述任一相应密码子，而不改变编码的多肽。应了解RNA序列中U与DNA序列中的T相对应。
这种“沉默变异”是一种以下所述的“保守修饰变异”。技术人员认为可通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(除一般为甲硫氨酸唯一密码子的ATG、一般为色氨酸唯一密码子的TTG)以编码功能相同的多肽。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含于任一所述序列中。因此，本发明明确提供了编码本发明多肽的核酸序列的每种可能变异，通过根据可能的密码子选择选择组合可产生所述变异。适用于编码本发明的血凝素或神经氨酸酶多肽的核酸序列时，根据标准三联体基因密码(例如，如表1所述或如本领域一般可用的三联体基因密码)产生这些组合。通过结合基因密码考虑序列而明确地提供并描述了本文每种氨基酸的所有变化。技术人员完全能够使用本文的方法进行这些沉默取代。
保守变异
由于基因密码的简并性，“沉默取代”(即，不会引起编码多肽改变的核酸序列取代)是本发明编码氨基酸的每种氨基酸序列的隐含特征。相似地，氨基酸序列中一个或一些氨基酸的“保守氨基酸取代”被性质非常相似的不同氨基酸取代，由于与公开的构造(例如本文的构造)非常相似，也易于鉴定。每个公开的序列的这种保守变异是本发明的特征。
特定氨基酸序列的“保守变异”指编码相同或大致相同氨基酸序列的那些核酸，可选地，其中氨基酸不编码氨基酸序列和大致相同序列，参见，下表2。技术人员将认识到编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分氨基酸(通常少于5％、更常见的是少于4％、3％、2％或1％)的单个取代、缺失或添加为“保守性修饰变异”，其中所述改变引起氨基酸缺失、氨基酸添加或用化学性质相似的氨基酸取代氨基酸。因此，本发明所列多肽序列的“保守变异”包括小部分多肽序列的氨基酸被相同保守取代组的保守性选择氨基酸取代，通常少于5％，更常见的是少于4％、3％、2％或1％。最后，添加不改变核酸分子的编码活性的序列，例如添加非功能序列为碱性氨基酸的保守变异。
表2--保守取代组
  1   丙氨酸(A)   丝氨酸(S)   苏氨酸(T)
  2   天冬氨酸(D)   谷氨酸(E)
  3   天冬酰胺(N)   谷氨酰胺(Q)
  4   精氨酸(R)   赖氨酸(K)
  5   异亮氨酸(I)   亮氨酸(L)   甲硫氨酸(M)   缬氨酸(V)
  6   苯丙氨酸(F)   酪氨酸(Y)   色氨酸(W)
序列比较、同一性和同源性
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性”或百分比“同一性”指如用一种以下所述序列比较算法(或技术人员可用的其它算法)或通过肉眼检查测定，比较和比对最大一致性时两个或更多个序列或子序列相同或有指定百分比的氨基酸残基或相同的核苷酸。
在两种核酸或多肽(例如，编码HA或NA分子的DNA和/或RNA，或HA或NA分子的氨基酸序列)的情况下，短语“大致相同”指如使用序列比较算法或通过肉眼检查测定，比较和比对最大一致性时，两个或或更多个序列或子序列具有至少约90％、优选91％、最优选92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高核苷酸或氨基酸残基同一性。这种“大致相同”序列通常被视为“同源”，而与实际祖系无关。优选地，当氨基酸为血凝素或血凝素片段时，在长度为至少约200个残基的氨基酸序列区域，更优选在长度为至少约250个残基的氨基酸序列区域存在“大致同一性”，并且最优选地，在至少约300个残基、350个残基、400个残基、425个残基、450个残基、475个残基、480个残基、490个残基、495个残基、499个残基、500个残基、502个残基、559个残基、565个残基或566个残基或在待比较的两条序列的全长上序列大致相同，或者当氨基酸为神经氨酸酶活神经氨酸酶片段时，在至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约436个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约451个氨基酸、至少约465个氨基酸、至少约466个氨基酸、至少约469个氨基酸、至少约470个氨基酸或至少约566个邻接氨基酸上序列大致相同。
对于序列比较和同源性确定，通常一个序列用作与检测序列比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后根据指定程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
例如，可通过以下方法进行最佳序列比对而进行比较：Smith &Waterman，Adv Appl Math 2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman& Wunsch，J Mol Biol 48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson &Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 85：2444(1988)对相似方法的探索、Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中算法的计算机化实现，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA或通过肉眼观察(通常参见，Ausubel等，同上)。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例为Altschul等的J Mol Biol 215：403-410(1990)中描述的BLAST算法。通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公用进行BLAST分析的软件。这种算法包括首先通过识别查询序列中长度为W的短字而识别高分序列对(HSP)，用数据库序列中长度相同的字比对时，所述高分序列对匹配或满足正值阈值分数T。T称为邻近字评分阈值(参见，Altschul等，同上)。这些初始邻近字命中作为发起寻找含有其的较长HSP的种子。然后字命中沿每个序列双向延伸，直到累计比对分数增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励分数，总是＞0)和N(失配残基的惩罚分数，总是＜0)计算累计分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累计分数。当累计比对分数从达到的最高值下降数量X时，字命中停止向每个方向延伸；由于一次或多次负分残基比对的累计，累计分数为0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认字长(W)为11，期望值(E)为10，截止值为100，M＝5、N＝-4，并且默认双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认字长(W)为3，期望值(E)为10并且默认BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff & Henikoff(1989)Proc Natl Acad Sci USA89：10915)。
除计算序列同一性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc Natl Acad SciUSA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一种量度为最低总概率(P(N))，这表示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率。例如，如果比较检测核酸和参考核酸时最低总概率低于约0.1，优选低于约0.01和最优选低于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
有用序列比对算法的另一实例是PILEUP。PILEUP使用渐进成对比对由一组相关序列建立多序列比对。也可绘制显示用于建立比对的聚类关系的树状图。PILEUP使用简化的Feng & Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-360的渐进比对方法。所用方法与Higgins & Sharp(1989)CABIOS5：151-153描述的方法相似。所述程序可比对(例如)多达300个最长5,000个字母的序列。多比对法从成对比对两个最相似的序列开始，生成两比对序列的聚类。然后可与第二最相关序列或比对序列聚类比对该聚类。通过简单延伸成对比较的两个单独序列比对两序列聚类。通过一系列渐进成对比对实现最终比对。所述程序也可用于绘制聚类关系的树状图或树状表达式。通过为序列比较区域指定特异序列及其氨基酸或核苷酸坐标运行程序。
另外适于多核酸或氨基酸的算法的实例，序列比对为CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等(1994)Nucl.Acids.Res.22：4673-4680)。CLUSTALW在序列组之间进行多成对比较并且基于同源性将其集成多比对比较。缺口开口和缺口延伸罚分可分别为(例如)10和0.05。对于氨基酸比对，BLOSUM算法可用作蛋白质权值矩阵。参见，例如，Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919。
数字系统
本发明提供了包含与本文的核酸和分离或重组多肽(包括，例如，本文所示序列)及其各种沉默取代和保守取代的序列信息相对应的字符串的数字系统，例如计算机、计算机可读介质和集成系统。集成系统还可包括(例如)生成与字符串相对应的基因的基因合成设备。
本领域已知的各种方法可用于检测不同字符串之间的同源性和相似性，或者可用于进行其他所需功能，例如控制输出文件，提供呈现包括序列等的信息的依据。实例包括以上讨论的BLAST。本发明的计算机系统可包括这种程序，例如连同一种或多种包含本文指出的序列的数据文件或数据库。
因此，在本文的集成系统中可检测和识别各种HA或NA序列或片段等之间不同类型的各种严格性和长度的同源性和相似性。例如，已经设计了许多同源性确定方法进行生物聚合物的序列比较分析，在字处理中进行拼写检查和由各种数据库进行数据检索。了解天然多聚核苷酸中4个主要核苷碱基之间的双螺旋成对补体相互作用，刺激互补同源多聚核苷酸串退火的模型也可用作通常对与本文序列相对应的字符串进行的序列比对或其它操作的基础(例如，字处理操作、构造包含序列或子序列字符串的图、输出表等)。
因此，可通过输入与本发明的一种或多种多聚核苷酸和多肽(核酸或蛋白质或二者)相对应的字符串使标准桌面应用适用于本发明，所述标准桌面应用例如字处理软件(例如，Microsoft WordTM或CorelWordPerfectTM)和数据库软件(例如，电子表格软件(例如MicrosoftExcelTM、Corel Quattro ProTM)或数据库程序(例如Microsoft AccessTM、ParadoxTM、GeneWorksTM或MacVectorTM)或其它相似程序)。例如，本发明的系统可包括前述具有适当字符串信息的软件，例如与用户界面(例如，在Windows、Macintosh或LINUX系统等标准操作系统中的GUI)一起使用以操作与本文序列相对应的字符串的软件。如上所述，专业比对程序(例如BLAST)也可并入本发明的系统进行核酸或蛋白质(或相应字符串)的比对。
本发明中的系统通常包括具有进入软件系统的数据集的数字计算机，所述软件系统包含本文的任何序列。计算机可为(例如)PC(Intelx86或奔腾芯片兼容DOSTM、OS2TM WINDOWSTM WINDOWSNTTM、WINDOWS95TM、WINDOWS2000TM、WINDOWS98TM、基于LINUX的机器、MACINTOSHTM、Power PC或基于UNIX(例如，SUNTM工作站)机器)或本领域技术人员已知的商购的其它计算机。比对或以其它方式操作序列的软件可用，或者技术人员可易于使用标准程序设计语言(例如，Visualbasic、PERL、Fortran、Basic、Java等)构建所述软件。
任一种控制器或计算机任选地包括监控器，所述监控器通常为阴极射线管(“CRT”)显示器、平板显示器(例如，动态矩阵液晶显示器、液晶显示器)等。计算机电路常置于包括许多集成电路芯片(例如微处理器、存储器、接口电路等)的箱中。所述箱还任选地包括硬盘驱动器、软盘驱动器、大容量可移动驱动器(例如可写入CD-ROM)和其它常见外围元件。输入设备，例如键盘或鼠标，在相关计算机系统中任选地提供用户输入和待比较或以其它方式操作的序列的用户选择。
计算机通常包括以用户输入设定参数区(例如，GUI)形式或以预编程指令(例如，为各种不同具体操作预编程)形式接收用户指令的适当软件。然后，软件将这些指令转换为用于指示(例如，适当机制或输送控制器的)操作的适当语言以进行所需操作。软件还包括用于控制核酸合成(例如，基于本文的序列或序列比对)、比较样品的差异基因表达或其它操作的输出元件。
试剂盒和试剂
本发明任选地作为试剂盒提供给用户。例如，本发明的试剂盒含有一种或多种本文所述的核酸、多肽、抗体或细胞系(例如，包含或具有本发明的HA和/或NA分子)。试剂盒可含有(例如)作为封装于适当容器内的cDNA微阵列的诊断核酸或多肽(例如，抗体、探针组)或其它核酸(例如一种或多种表达载体)。试剂盒通常还包含一种或多种用于标记表达产物的另外的试剂(例如，基质、标记物、引物)、管和/或其它附件、收集样品的试剂、缓冲液、杂交盒、盖玻片等。试剂盒任选地还包含说明书或用户手册，所述说明书或用户手册详述了将试剂盒组分用于诊断集的发现或应用的优选方法。
根据说明书使用时，试剂盒可(例如)用于评估疾病状态或状况，用于评估药剂或其它治疗干预对细胞或生物体疾病状态或状况发展的影响或用作疫苗等。
在另外的方面，本发明提供了具体化本文的方法、组合物、系统和装置的系统试剂盒。本发明的系统试剂盒任选地包括以下的一种或多种：(1)装置、系统、系统组件或装置组件；(2)实践本文所述方法，和/或操作本文装置或装置组件和/或使用本文组合物的说明书。在又一方面，本发明提供本文任何装置、装置组件、组合物或试剂盒的用途，本文任何方法或检测的实践和/或实践本文任何检测或方法的任何装置或试剂盒的用途。
另外，试剂盒可包括以上提及的一个或多个翻译系统(例如，细胞)以及适当包装材料、保存试剂盒组分的容器、实践本文方法的教学材料等。相似地，(例如)可与保存试剂盒组分的容器、实践本文方法的教学材料等一起以试剂盒形式提供翻译系统产物(例如，蛋白质(例如HA和/或NA分子))。而且，试剂盒可包含各种疫苗(例如，通过质粒救援法生产的疫苗)，例如包含本文的HA和/或NA序列的减毒活疫苗(例如，FluMist)。
为便于使用本发明的方法和组合物，可将任何疫苗组分和/或组合物(例如，尿囊液中的重配病毒等)和用于包装和感染作实验或治疗疫苗目的的流感病毒的另外的组分(例如，缓冲液、细胞、培养基)包装成试剂盒形式。通常，除了以上组分之外，试剂盒还含有另外的材料，可包括(例如)执行本发明方法的说明书、包装材料和容器。
实施例
现参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了举例说明，并且决不应将本发明理解为限于这些实施例，而应理解为涵盖由于本文提供的教导而变得很明显的全部变化。
材料和方法
重组病毒的生成：从疾病控制预防中心(CDC)收到的野生型(wt)A型流感H1N1病毒、从MDCK细胞分离的A/CA/4/09和从卵中分离的A/CA/7/09。A/CA/4/09卵适应的病毒RNA由食品与药物管理局(FDA)的叶子平博士提供。使用对HA和NA基因末端序列通用的引物通过RT-PCR扩增A/CA/4/09和A/CA/7/09的HA和NA基因片段，并克隆至质粒载体pAD3000中(Hoffman(2000)PNAS 97：6108-6113)。使用
Figure BDA0000123166940000621
定点诱变试剂盒(Stratagene)进行定点诱变向HA基因引入特异性变化，并通过序列分析确认HA序列。通过将8个编码H1N1病毒的HA和NA的cDNA质粒和冷适应(ca)A/AnnArbor/6/60(MDV-A，A型流感病毒的主供体病毒)的6个内部基因片段共转染至共培养的293T和MDCK细胞中生成6:2重配疫苗株。通过电穿孔在无血清Vero/CEK细胞中生成用于生产的疫苗株。在10至11日龄的鸡含胚卵的尿囊腔中繁殖病毒。通过测定由vRNA扩增的RT-PCR cDNA的序列检验救援病毒的HA和NA序列。
病毒滴定：通过荧光灶检测测定病毒滴度并用log10FFU(荧光灶单位)/ml表示(Forrest等(2008)Clin Vaccine Immunol 15：1042-1053)。通过先前所述空斑检测检查病毒空斑形态(Jin等，(2003)Virology 306，18-24)。
受体结合检测：如先前所述将鸡红细胞(cRBC)(HEMA Resourceand Supply，Inc.)去唾液酸化和再唾液酸化。将100μl的10％cRBC在37℃下用50mU霍乱弧菌神经氨酸酶孵育1h以去除唾液酸。用1mlPBS清洗3次后，将细胞重新悬浮于1ml含1％牛血清蛋白(BSA)的PBS中，在用37℃下用2.5mU的α2，3(N)-唾液酸转移酶(Calbiochem，La Jolla，CA)或2mU的α2，6(N)-唾液酸转移酶(Calbiochem，La Jolla，CA)孵育1.5h，加上1.5mM CMP-SA(Sigma，St.Louis，MO)。用PBS清洗3次后，将再唾液酸化cRBC重新悬浮于PBS中成0.5％(v/v)。在V形底的96孔微量滴定板中进行血凝集检测(HA)，检验结合活性。在室温下用50μl、0.5％的cRBC、α2，3或α2，6再唾液酸化cRBC孵育50μl连续稀释2倍的病毒60min。HA滴度解释为使RBC血细胞凝集的最高稀释度。
雪貂研究：用来自Simonson的8-10周龄雌雄雪貂(3只一组)评定呼吸道内的病毒复制和疫苗免疫原性。雪貂单独居住并且经鼻内接种7.0log10FFU病毒/0.2ml剂量。感染3天后，对雪貂进行安乐死，并收获肺部和鼻甲骨(NT)。通过EID50检测确定肺部和NT的病毒滴度并表示为50％卵感染剂量/g组织(log10EID50/g)。在感染后第14天、第21天和第28天对指定进行免疫原性研究的雪貂放血，并通过HAI测定血清的抗体滴度。
通过HAI检测进行血清抗体检测：通过HAI检测确定感染后雪貂血清中抗同源和异源病毒的的H1N1特异性抗体水平。血清学分析之前，用配制成10mL、0.9％NaCl/瓶的受体破坏酶(RDE)(DenkaSeiken，Tokyo，Japan)处理雪貂血清。将0.1mL血清与0.15mL RDE混合，并在37℃下孵育18h，并在56℃下孵育45min后加入0.15mL、0.9％柠檬酸钠调至最终稀释度1∶4。使用0.5％tRBC确定菌株特异性血清HAI滴度，并且将HAI滴度表示为抑制血细胞凝集的最高血清稀释度的倒数值。
结果
重配候选疫苗株的生成
RT-PCR扩增之后由感染MDCK细胞RNA克隆来自wtA/CA/4/09的HA和NA基因片段。通过核苷酸序列分析发现来自每个HA或NA的总计12个cDNA克隆相同。和表示MDV-A的6个内部蛋白质基因片段的质粒一起，将表示wt A/CA/4/09的HA序列和NA序列的质粒转染至293/MDCK细胞中，然而在MDCK细胞或卵上均不能回收可存活的重配子代。由wt A/CA/4/09卵分离物克隆的HA cDNA有两个氨基酸位置异源(表3)。由12个分析的克隆，观察到以下变化：42％L191I、50％Q223R，(8％)有L191I和Q223R。将表示这些不同HA序列的质粒组合并转染至具有MDV-A内部蛋白基因的293/MDCK细胞中，并且易于救援重配病毒。
可救援由在残基222或223处没有氨基酸改变的A/CA/7/09克隆的HA质粒以生成子代病毒。这表明CA/7/09中T197A变化是有效救援A/CA/7/09的原因。其它A/CA/7/09克隆具有D222G或Q223R变化，还救援了HA中含有D222G或Q223R的病毒。由于A/CA/4/09和A/CA/7/09的HA之间的高度相似性，并且由于这两个菌株之间NA序列相同，所以进一步研发了源自A/CA/7/09的变异体。
表3新型H1N1变异体的HA序列和病毒滴度
*病毒滴度为至少3种病毒保存株的平均滴度；NA：不适用
选择鸡含胚卵中生长较好的疫苗株
如表3所示，A/CA/4/09和A/CA/7/09救援重配疫苗株在鸡含胚卵中复制，滴度为7.4-7.8log10FFU/ml，这比季节性H1N1疫苗株低至少10倍。而且，回收的A/CA/7/09重配候选疫苗在MDCK细胞中形成很小的空斑。为了改善MDCK细胞和卵中的疫苗病毒生长，在MDCK细胞中使A/CA/7/09候选株(V5和V6)传代两次，感染复数(moi)为4.0、0.4和0.04，然后通过空斑检测检查上清液中存在的病毒。全部MDCK传代病毒含有比亲本病毒大很多(2-4mm)的空斑(图1)。测定来自MDCK传代V5和V6候选疫苗的12个空斑的HA基因片段的序列。每种较大空斑形态分离物的HA在以下位置之一具有单个氨基酸改变：源自V5的K119N或K119E、K153E、K154E和来自V6的A186D。
A/CA/7/09的HA序列还与来源于猪的两种早期H1N1病毒A/Swine/Iowa/1/1976和A/swine/1931以及近期人H1N1病毒A/SouthDakota/6/07(A/SD/07)相比较。如图2所示，在猪H1N1病毒中K119、K153和K154高度保守。A/SD/6/07也含有K119和K154残基。图2所示4种病毒中，186处的氨基酸更加多样化。先前的研究(Both等(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：6996-7000)显示G155E变化是造成卵中病毒快速生长的原因。这些数据表明153-155区域中带负电的残基E优选用于MDCK细胞和卵中的病毒复制。为检查先前报道的A/NJ/76病毒的G155E变化是否也能提高卵中A/CA/7/09病毒复制，将G155E引入V5和V6。另外，为确认大空斑中鉴定的氨基酸赋予卵中病毒生长优势，将每个鉴定突变引入HA中，救援重配疫苗候选株。而且，还将V6中鉴定的A186D变化引入V5和V5-119E。相似地，还将V5中发现的119N突变引入V6和V6-186D以评估单个和两个氨基酸改变对卵中病毒复制的影响。相似地，还将V5中发现的119N突变引入V6和V6-186D以评估单个和两个氨基酸改变对卵中病毒复制的影响。HA序列分析还显示A/CA/09菌株在残基278处含有唯一糖基化位点(图2)。为评估这个另外的糖基化位点是否影响病毒生长，将T278K变化分别引入V5和V6。
检查救援病毒在卵中的生长。如表4所示，大部分含引入HA突变的变异体明显比V5和V6生长得更好。V5-278K和V6-278K的滴度为7.6和7.7Log10FFU/ml，与V5和V6相似。因此，去除278糖基化位点对卵中病毒滴度的影响极小。位点119、186、153、154、155和186处的变化使病毒滴度升高0.2-1.2log10FFU/ml。V5中119E和186D组合变化导致其自身的滴度比119E或186D稍高。
表4从MDCK细胞鉴定并通过反向遗传学引入的A/CA/07/09HA变异体。第2行示出了H1 HA的氨基酸残基数量；第3行示出了H3 HA中的相应氨基酸残基数量。
Figure BDA0000123166940000661
Figure BDA0000123166940000671
*病毒滴度为至少3种病毒保存株的平均滴度
疫苗变异体的抗原性评估
为了确定引入H1 HA的任一氨基酸改变是否影响病毒抗原性，使用HAI检测评估A/CA/7/09变异体与不同感染后的雪貂血清的反应性(表5)。冷适应病毒，具有223R残基的A/CA/4/07(V3)、具有222G残基的A/CA/7/09(V5)和具有223R残基的A/CA/7/09(V6)与来自接种了wt A/CA/4/09、ca A/CA/4/09(V3)、ca A/CA/7/09(V5)和caA/CA/07/09(V6)的雪貂的4种参考血清起相似反应。在位置119和186处向V5引入了氨基酸改变的变异体对V5有相似抗原性。然而，在位置153、154和155处有变化的病毒与这些血清的反应性低很多检测到滴度降低4倍以上。因此，这些数据证明疫苗株中不应存在残基153-154处的突变。可将位置119和186处的变化引入疫苗株，而不会影响病毒抗原性。
表5A/CA/7/09HA变异体的抗原性。用火鸡RBC进行HAI检测。
Figure BDA0000123166940000681
A/CA/7/09疫苗候选株减毒，但在雪貂中有免疫原性。
为评估A/CA/7/09疫苗变异体的减毒表现型和它们诱导抗体反应的能力，经鼻内给雪貂接种0.2ml剂量体积的7.0log10FFU病毒，并通过EID50检测确定雪貂上呼吸道和下呼吸道中的病毒复制。如表6所示，所有A/CA/7/09变异体在NT组织中均有效复制，但在肺部未检测到病毒。这些数据证实雪貂中这些病毒是减毒的，MDV-A的6个内部蛋白质基因片段赋予了特征表现型。
在鼻内接种后第14天采集雪貂感染后血清并通过HAI检测评估抗体滴度(表6)。所有V5变异体均极具免疫原性并且诱导H1N1特异性抗体应答，HAI滴度为256至1024。还评估了若干V6变异体的免疫原性并且发现其免疫原性比V5低(数据未示出)。在残基119和186处有突变的变异体保持了与wt病毒相似的抗原性，并且与154E和155E变异体反应不佳。用来自154E和155E变异体感染的雪貂的血清，感染的雪貂血清与wt病毒、V5和具有119E和186D变化的V5变异体的反应也不佳；其滴度差异在2倍以内。V5-154E和155E感染后雪貂血清的同源HAI滴度比其它变异体高4倍以上。有趣的是，186D处的突变导致与154E和155E变异体的反应性降低更多。这些数据证明A/CA/07/09(H1N1)的119和186HA变异体赋予了在卵中的快速生长性，而不改变病毒抗原性或免疫原性，使其成为猪源性H1N1病毒的可能候选疫苗。
表6A/CA/7/09HA变异体在雪貂呼吸道内的复制及其免疫原性。在感染后的第14天采集雪貂血清并用火鸡RBC进行HAI检测。
Figure BDA0000123166940000691
A/CA/7/09变异体的受体结合特异性
野生型A/CA/4/09和A/CA/7/09病毒在卵中生长引起HA受体结合位点上的氨基酸改变D222G和Q223R。先前在卵传代之后已鉴定了其它H1N1菌株中的这些位置，并且这些位置是引起HA受体结合特异性的原因。为了确定疫苗病毒变异体是否具有不同的受体结合特异性，通过RBC结合检测评估V5、V6、V5-119和V5-186的受体结合特异性(表7)。V4(无222和223变化)优选结合α2-6SA，而非α2-3SA。V5(D222G)同样结合α2-3和α2-6SA再唾液酸化RBC。然而，V6(Q223R)仅可结合α2-3SA再唾液酸化RBC，确认这两个残基影响病毒受体结合特异性。V5-119E/N和V5-186D病毒的结合特异性与V5相似。HA双重突变体V5-119E/186D优选结合α2-6SA比α2-3SA多。引入V6的119E和186D残基不能恢复其与α2-6SA的结合(数据未示出)。因此，119和186残基的变化并未明显影响病毒受体结合特异性。
表7A/CA/07/09疫苗变异体的受体结合特异性
A/CA/7/09重配体的蛋白质组成
在25k rpm下通过2ml、30％蔗糖垫将13ml从感染卵收获的尿囊液粒化1h。将病毒颗粒重新悬浮于0.2ml PBS中。将5ul病毒悬浮液装在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上并用考马斯蓝染色。样品顺序如下：
图3A
泳道1.重组HAA/NC/20/99 0.5μg
泳道2.重组HAA/NC/20/99 2μg
泳道3.MDVA-V5-119E/186D(FFA 8.6)
泳道4.MDVA-V6(FFA 7.9)
泳道5.MDVA-V6-186D(FFA 8.1)
泳道6.PR8-V5-119E/186D(FFA 8.2)
泳道7.PR8-V6(FFA 7.8)
泳道8.PR8-V6-186D(FFA 8.5)
泳道9.NYMC X-179A(FFA 8.5)
泳道10.PR8 South Dakota(FFA 8.7)
图3B
泳道1.NYMC X-179A(FFA 8.5)
泳道2.MDVA-V5-119E/186D(FFA 8.6)
泳道3.MDVA-V5-119E/186D/PA-S395N(FFA8.9)
泳道4.South Dakota(FFA 8.7)
使用标准方法确定FFA和最高滴度值。其名称内有“MDVA”的重配病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段。其名称内有“PR8”的重配病毒包含PR8的6个内部基因组片段。
A/California/7/09变异体HA蛋白质产量的比较
生成了包含来自PR8的6个内部基因组片段和来自A/CA/7/09的HA和NA基因组片段的6:2重配流感病毒。生成了包含来自PR8的6个内部基因组片段、来自A/CA/7/09的NA基因组片段和编码本文所述H1 HA变异体多肽的HA基因组片段的另外的6:2重配流感病毒。使包含不同A/CA/7/09 HA变异体以及A/Texas/5/2009 RG15(A/TX/7/09 RG15)和A/California/07/09NYMC X179A的6:2重配病毒在鸡含胚卵中展开，并通过FFA确定其最高滴度。检测病毒株示于表8中。6:2 PR8-South Dakota是包含来自PR8的6个内部基因组片段和来自A/South Dakota/6/07的HA和NA基因组片段的6:2重配病毒。6:2AA-V5-119E/186D是包含来自A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因组片段、来自A/CA/7/09的NA基因组片段和V5-119E/186D变异体HA基因组片段的6:2重配病毒。包含本文所述H1 HA变异体基因组片段的PR8重配病毒的滴度可比得上X179A，最高产量株可用于TIV生产。
表8 6:2重配H1N1病毒在含胚卵中的最高滴度
Figure BDA0000123166940000721
除了测定最高滴度以外，我们还确定了表8所列的一些重配病毒的HA蛋白质产量。通过感染50个卵，MOI为103FFU/个卵，进行所选病毒的扩增。在33℃下孵育62h后收获病毒。然后按蔗糖梯度纯化等量尿囊液(250ml)。通过SDS PAGE分析病毒蛋白质，然后进行考马斯蓝染色。
结果的代表性样本示于图4。如图4A所示，X179A、6:2PR8-V6-186D和6:2AA-V5-119E/186D的蛋白质总产量分别为460、300和350μg。虽然6:2 AA-V5-119E/186D的蛋白质总产量比A/CA/7/09X179A低，但6:2AA-V5-119E/186D的HA蛋白质产量最高。该实验中观察到6:2AA-V5-119E/186D的蛋白质总产量较低很可能是因为分析差异。如图4B所示，6:2PR8-V5-119E/186D和X179A的蛋白质总产量分别为780和720μg。6:2PR8-V5-119E/186D的HA蛋白质产量也比A/CA/7/09 X179A高。
包含PR8骨架和变异体A/California/7/09H1多肽的重配病毒
生成了包含来自PR8的6个内部基因组片段、A/CA/7/09H1 HA基因组片段的变异体和A/CA/7/09 NA基因组片段的另外的6:2重配流感病毒。表9中总结了H1 HA氨基酸变异。
表9包含变异体A/CA/7/09H1 HA和PR8骨架的重配病毒
Figure BDA0000123166940000731
在所测试的变异体HA中，仅V5-119E/186D/190R中的变化降低抗原性(表9)。使包含不同A/CA/7/09HA变异体的6:2重配病毒在鸡在含胚卵中展开以确定HA蛋白质产量。在33℃下孵育48h之后收获病毒。然后通过蔗糖梯度沉降纯化病毒。通过SDS-PAGE分析纯化病毒的蛋白质组成，然后进行考马斯蓝染色。单独泳道装载包含等量纯化病毒(图5A)或从等体积的收获尿囊液纯化的病毒(图5B)的样品。还包括由AA-V5-ED(包含V5-119E/186D变异体HA和A/AnnArbor/6/60骨架)和X179A病毒制备的样品作为对照。PR8-C病毒生成的HA多肽的产量比X179A高。
通过SDS-PAGE进一步测定PR8-C和AA-V5-ED相对于X179A的HA产量，然后进行考马斯蓝染色。通过SDS-PAGE分析各种体积(10、7.5、5和2.5μl)的PR8-C和AA-V5-ED样品和10μl的X179A样品。使用图象分析软件测量每种样品中的HA1蛋白质相对含量。测量结果示于图6中。AA-V5-ED和PR8-C病毒生成的HA蛋白质比X179A多1-1.5倍。
虽然为了清楚和理解已相当详细地描述了上述发明，但是通过阅读本公开内容，本领域技术人员将清楚在不背离本发明精确范围的前提下可在形式和细节上进行各种变化。例如，可按各种组合使用上述全部技术和装置。该申请中引用的全部出版物、专利、专利申请或其它文件为了所有目的通过引用整体并入，如同单独地指出每篇出版物、专利、专利申请或其它文件为了所有目的通过引用并入。尤其，以下专利申请为了所有目的通过引用整体并入：2009年6月25日提交的美国临时申请第61/220,426号、2009年7月23日提交的第61/227,986号和2009年8月14日提交的第61/234,021号。
Figure IDA0000123166990000011
Figure IDA0000123166990000021
Figure IDA0000123166990000031
Figure IDA0000123166990000041
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Figure IDA0000123166990000091
Figure IDA0000123166990000101
Figure IDA0000123166990000111

Claims (341)

1.一种分离或重组多肽，所述多肽选自以下：
a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
b)包含含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
c)包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
d)包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
e)包含含D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
f)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
g)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含K119E和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
h)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
i)包含SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
j)包含含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
k)包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
l)包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
m)包含含D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
n)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
o)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含至少一个选自K119E和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
p)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)进一步含至少一个选自K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
q)包含含SEQ ID NO：6氨基酸序列的多肽；
r)包含含SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列的多肽；
s)包含与(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
t)包含(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列的多肽，所述多肽中少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸残基被取代、缺失或插入；
u)包含(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列和还包含H273Y取代的多肽；和
v)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1所述的分离或重组多肽，其中所述多肽为免疫原性的。
3.一种无菌组合物，包含权利要求1所述的分离或重组多肽。
4.一种抗体，其对权利要求1所述的分离或重组多肽有特异性。
5.一种免疫原性组合物，包含免疫有效量的权利要求1所述的分离或重组多肽。
6.一种重配流感病毒，包含编码权利要求1所述的分离或重组多肽的核酸。
7.一种分离或重组核酸，包含编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的分离或重组核酸，包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的分离或重组核酸，其中所述核酸为DNA。
10.根据权利要求7所述的分离或重组核酸，其中所述核酸为RNA。
11.根据权利要求7所述的分离或重组核酸，其中所述多聚核苷酸编码免疫原性多肽。
12.一种组合物，包含权利要求7所述的分离或重组核酸。
13.一种免疫原性组合物，包含免疫有效量的权利要求7所述的分离或重组核酸。
14.一种重配流感病毒，包含权利要求7所述的核酸。
15.一种重配流感病毒，包含权利要求8所述的核酸。
16.一种重配流感病毒，其中所述重配流感病毒为6:2重配病毒，所述重配病毒包含6个来自一个或多个供体病毒的内部基因组片段、编码权利要求1所述的多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
17.一种重配流感病毒，其中所述重配流感病毒为7:1重配病毒，所述重配病毒包含编码权利要求1所述的多肽的第一基因组片段，并且还包含6个内部基因组片段和编码来自一个或多个供体病毒的神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
18.根据权利要求16或17所述的重配流感病毒，其中所述供体病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的重配流感病毒，其中所述供体病毒选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的重配流感病毒，其中所述病毒为活病毒。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的重配流感病毒，其中所述第一基因组片段编码包含具有至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的重配流感病毒，其中所述第一基因组片段编码包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽。
23.根据权利要求16至20中任一项所述的重配流感病毒，其中所述第一基因组片段编码包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的重配流感病毒，其中所述第一基因组片段编码的多肽的氨基酸序列还包含D222G和/或Q223R取代。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
26.根据权利要求16至24中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
28.一种在细胞培养物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的6个内部基因组片段、编码权利要求1所述的多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述细胞群能支持流感病毒的复制；
b)培养所述宿主细胞群；和
c)回收多种重配流感病毒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含具有至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一基因组片段编码的多肽的氨基酸序列还包含D222G和/或Q223R取代。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述第二基因组片段为猪流感病毒基因组片段。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
37.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述第一流感株选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒适合以鼻内疫苗制剂施用。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述包含流感病毒基因组的多种载体包含A型流感病毒基因组。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述多种载体为多种质粒载体。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中所述宿主群包括以下的一种或多种：Vero细胞、PerC6细胞、MDCK细胞、293T细胞或COS细胞。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述方法不包括辅助病毒的使用。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述多种载体由8种载体组成。
44.一种免疫原性组合物，包含权利要求1所述的分离或重组多肽。
45.一种免疫原性组合物，包含权利要求7所述的分离或重组核酸。
46.根据权利要求44或45所述的组合物，还包含赋形剂。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述赋形剂为药学上可接受的赋形剂。
48.一种免疫原性组合物，包含权利要求14至27中任一项所述的重配流感病毒。
49.根据权利要求48所述的组合物，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
50.根据权利要求48或49所述的组合物，其中所述组合物为流感减毒活疫苗。
51.一种生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的至少6个内部基因组片段、编码权利要求1所述的多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述细胞群能支持流感病毒复制；
b)培养所述宿主细胞群；
c)回收多种重配流感病毒；和
d)提供一种或多种药学上可接受的赋形剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含含至少一个选自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一基因组片段编码包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一基因组片段编码的多肽的氨基酸序列还包含D222G和/或Q223R取代。
56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述第二基因组片段为猪流感病毒基因组片段。
57.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
60.根据权利要求51至59中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒适合以鼻内疫苗制剂施用。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中所述包含流感病毒基因组的多种载体包含A型流感病毒基因组。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的方法，其中所述第一流感株选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
63.根据权利要求51至62中任一项所述的方法，其中所述重组病毒适合以鼻内疫苗制剂施用。
64.一种重配流感病毒，包含在受治疗者中对病毒感染产生免疫原应答以预防或治疗所述病毒感染的有效量的权利要求1所述的多肽。
65.根据权利要求64所述的重配流感病毒，其中所述受治疗者为哺乳动物。
66.根据权利要求65所述的重配流感病毒，其中所述哺乳动物为人类。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的重配流感病毒，其中所述病毒感染为流感病毒感染。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒将在体内施用给所述受治疗者或在体外或离体施用给所述受治疗者的一个或多个细胞。
69.根据权利要求64-68中任一项所述的重配流感病毒，其中向所述受治疗者施用预防性或治疗性治疗所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
70.一种提高重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度的方法，包括改变在与SEQ ID NO：1的位置119或186的氨基酸残基相对应的位置上的血凝素多肽氨基酸残基，从而提高所述流感病毒在含胚卵中的最高滴度。
71.根据权利要求70所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改变。
72.根据权利要求71所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为谷氨酸(E)。
73.根据权利要求71所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬酰胺(N)。
74.根据权利要求70所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置186的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改变。
75.根据权利要求74所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置186的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
76.根据权利要求70所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119和186的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改变。
77.根据权利要求76所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为谷氨酸(E)，并且与SEQ ID NO：1的位置186的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
78.根据权利要求76所述的方法，其中与SEQ ID NO：1的位置119的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬酰胺(N)，并且与SEQ ID NO：1的位置186的所述氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中所述血凝素多肽为H1血凝素多肽。
80.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中所述血凝素多肽为猪流感病毒血凝素多肽。
81.根据权利要求70至80中任一项所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
82.根据权利要求811所述的方法，其中所述血凝素多肽还包含D222G和/或Q223R取代。
83.根据权利要求70至82中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的至少6个内部基因组片段。
84.根据权利要求70至82中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的7个基因组片段。
85.根据权利要求70至83中任一项所述的方法，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述重配流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66的至少6个内部基因组片段。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述重配流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66的7个内部基因组片段。
88.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍。
89.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
90.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
91.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
92.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
93.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
94.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
95.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
96.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
97.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中相对于不含氨基酸改变的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
98.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
99.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
100.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
101.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
102.一种免疫原性组合物，包含权利要求70至101中任一项所述的重配或重组流感病毒。
103.一种流感疫苗，包含权利要求70至101中任一项所述的重配或重组流感病毒。
104.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求70至101中任一项所述的重配或重组流感病毒。
105.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在与SEQ ID NO：1的位置119或186的所述氨基酸残基相对应的位置上的改变的氨基酸残基。
106.根据权利要求105所述的重配或重组流感病毒，其中所述改变的氨基酸残基与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应。
107.根据权利要求106所述的重配或重组流感病毒，其中与SEQID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为谷氨酸(E)。
108.根据权利要求106所述的重配或重组流感病毒，其中与SEQID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬酰胺(N)。
109.根据权利要求105所述的重配或重组流感病毒，其中所述改变的氨基酸残基与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应。
110.根据权利要求109所述的重配或重组流感病毒，其中与SEQID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的所述氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
111.根据权利要求105所述的重配或重组流感病毒，其包含在与SEQ ID NO：1的位置119和186的氨基酸残基相对应的位置上的改变的氨基酸残基。
112.根据权利要求111所述的重配或重组流感病毒，其中与SEQID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的所述改变的氨基酸残基被改为谷氨酸(E)，并且与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的所述改变的氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
113.根据权利要求111所述的重配或重组流感病毒，其中与SEQID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的所述改变的氨基酸残基被改为天冬酰胺(N)，并且与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的所述改变的氨基酸残基被改为天冬氨酸(D)。
114.根据权利要求105至113中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽为H1血凝素多肽。
115.根据权利要求105至113中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽为猪流感病毒血凝素多肽。
116.根据权利要求105至115中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：1的所述氨基酸序列。
117.根据权利要求116所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽还包含D222G和/或Q223R取代。
118.根据权利要求105至117中任一项所述的重配流感病毒，还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的至少6个内部基因组片段。
119.根据权利要求105至117中任一项所述的重配流感病毒，还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的7个基因组片段。
120.根据权利要求105至119中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
121.根据权利要求120所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的至少6个内部基因组片段。
122.根据权利要求120所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的7个基因组片段。
123.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍。
124.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
125.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
126.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
127.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
128.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
129.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
130.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
131.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
132.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含所述改变的氨基酸残基的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
133.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
134.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
135.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
136.根据权利要求105至122中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
137.一种免疫原性组合物，包含权利要求105至136中任一项所述的重配或重组流感病毒。
138.一种流感疫苗，包含权利要求105至136中任一项所述的重配或重组流感病毒。
139.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求105至136中任一项所述的重配或重组流感病毒。
140.一种包含基因组片段的重配流感病毒，所述基因组片段编码包含除在位置119上的氨基酸E或N和在位置186上的氨基酸D外的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
141.一种包含HA基因组片段的重配流感病毒，所述HA基因组片段编码包含除在位置119上的氨基酸E或N和在位置186上的氨基酸D外的H1N1猪流感病毒氨基酸序列的多肽。
142.一种包含HA基因组片段的重配流感病毒，所述HA基因组片段编码包含除在位置119和位置186上的非天然存在的氨基酸外的H1N1猪流感病毒氨基酸序列的多肽。
143.一种免疫原性组合物，包含通过权利要求28至43中任一项所述的方法生成的所述重配流感病毒。
144.根据权利要求143所述的组合物，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
145.根据权利要求143或144所述的组合物，其中所述组合物为减毒流感活疫苗。
146.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置119相对应的位置上或在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置186相对应的位置上包含非天然存在的氨基酸。
147.根据权利要求146所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置119相对应的位置上或在与SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置186相对应的位置上包含非天然存在的氨基酸。
148.根据权利要求146所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含至少一个选自以下的非天然存在的氨基酸：在与SEQID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的谷氨酸(E)，在与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的天冬酰胺(N)和在与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的天冬氨酸(D)。
149.根据权利要求148所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的谷氨酸(E)和在与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的天冬氨酸(D)。
150.根据权利要求148所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在与SEQ ID NO：1的位置119的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的天冬酰胺(N)和在与SEQ ID NO：1的位置186的氨基酸残基相对应的氨基酸残基处的天冬氨酸(D)。
151.根据权利要求146至150中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽为H1血凝素多肽。
152.根据权利要求146至150中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽为猪流感病毒血凝素多肽。
153.根据权利要求146至152中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在位置119和/或186上有氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
154.根据权利要求153所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽还包含D222G和/或Q223R取代。
155.根据权利要求146至154中任一项所述的重配流感病毒，其还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的至少6个内部基因组片段。
156.根据权利要求146至154中任一项所述的重配流感病毒，其还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的7个基因组片段。
157.根据权利要求146至156中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
158.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍。
159.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
160.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
161.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
162.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
163.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
164.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
165.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
166.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
167.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中相对于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重组流感病毒，所述重配或重组流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
168.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
169.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
170.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
171.根据权利要求146至157中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
172.一种免疫原性组合物，包含权利要求146至171中任一项所述的重配或重组流感病毒。
173.一种流感疫苗，包含权利要求146至171中任一项所述的重配或重组流感病毒。
174.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求146至171中任一项所述的重配或重组流感病毒。
175.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
176.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
177.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
178.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
179.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
180.一种包含血凝素多肽的重配或重组流感病毒，所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
181.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的至少6个内部基因组片段。
182.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含A/Ann Arbor/6/60的至少6个内部基因组片段。
183.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含A/Puerto Rico/8/34的至少6个内部基因组片段。
184.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的病毒的7个基因组片段。
185.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含A/Ann Arbor/6/60的7个基因组片段。
186.根据权利要求175至180中任一项所述的重配或重组流感病毒，其还包含A/Puerto Rico/8/34的7个基因组片段。
187.根据权利要求175至186中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
188.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
189.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
190.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
191.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
192.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9.5log10PFU/ml的滴度。
193.根据权利要求175至187中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约10log10PFU/ml的滴度。
194.一种免疫原性组合物，包含权利要求175至193中任一项所述的重配或重组流感病毒。
195.一种流感疫苗，包含权利要求175至193中任一项所述的重配或重组流感病毒。
196.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求175至193中任一项所述的重配或重组流感病毒。
197.根据权利要求105至196中任一项所述重配重组流感病毒，其还包含神经氨酸酶多肽。
198.根据权利要求197所述的重配重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
199.根据权利要求197所述的重配重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
200.根据权利要求197所述的重配重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
201.一种重配或重组流感病毒，包含供体病毒的6个内部基因组片段、编码血凝素多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
202.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
203.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
204.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
205.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
206.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
207.根据权利要求201所述的重配或重组流感病毒，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO：6的残基1-327的氨基酸序列。
208.根据权利要求201至207中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
209.根据权利要求201至207中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
210.根据权利要求201至207中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
211.根据权利要求201至210中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
212.根据权利要求201至210中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒为A/Ann Arbor/6/60。
213.根据权利要求201至210中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒为A/Puerto Rico/8/34。
214.根据权利要求201至213中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
215.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
216.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
217.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
218.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
219.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9.5log10PFU/ml的滴度。
220.根据权利要求201至214中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约10log10PFU/ml的滴度。
221.一种免疫原性组合物，包含权利要求201至220中任一项所述的重配或重组流感病毒。
222.一种流感疫苗，包含权利要求201至220中任一项的所述重配或重组流感病毒。
223.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求201至220中任一项所述的重配或重组流感病毒。
224.一种重配或重组流感病毒，包含供体病毒的6个内部基因组片段、编码血凝素多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
225.根据权利要求224所述的重配或重组流感病毒，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
226.根据权利要求224所述的重配或重组流感病毒，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的84至1064的核苷酸序列。
227.根据权利要求224至226中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
228.根据权利要求224至226中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
229.根据权利要求224至226中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
230.根据权利要求224至226中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
231.根据权利要求224至230中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
232.根据权利要求224至230中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒为A/Ann Arbor/6/60。
233.根据权利要求224至230中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述供体病毒为A/Puerto Rico/8/34。
234.根据权利要求224至233中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
235.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约7.5log10PFU/ml的滴度。
236.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8log10PFU/ml的滴度。
237.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约8.5log10PFU/ml的滴度。
238.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9log10PFU/ml的滴度。
239.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约9.5log10PFU/ml的滴度。
240.根据权利要求224至234中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配或重组流感病毒生长到在含胚卵中至少约10log10PFU/ml的滴度。
241.一种免疫原性组合物，包含权利要求224至240中任一项所述的重配或重组流感病毒。
242.一种流感疫苗，包含权利要求224至240中任一项所述的重配或重组流感病毒。
243.一种冷适应、温度敏感、减毒流感活疫苗，包含权利要求224至240中任一项所述的重配或重组流感病毒。
244.一种在受治疗者中对病毒感染产生免疫原应答以预防或治疗所述病毒感染的有效量的权利要求14-27或140-142中任一项所述的重配流感病毒。
245.根据权利要求244所述的重配流感病毒，其中所述受治疗者为哺乳动物。
246.根据权利要求245所述的重配流感病毒，其中所述哺乳动物为人类。
247.根据权利要求244-246中任一项所述的重配流感病毒，其中所述病毒感染为流感病毒感染。
248.根据权利要求244-247中任一项所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒将在体内施用给所述受治疗者或在体外或离体施用给所述受治疗者的一个或多个细胞。
249.根据权利要求244-248中任一项所述的重配流感病毒，其中向所述受治疗者施用预防性或治疗性治疗所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
250.一种在受治疗者中对病毒感染产生免疫原应答以预防或治疗所述病毒感染的有效量的权利要求105-136、146-171、175-193、197-220或224-240中任一项所述的重配或重组流感病毒。
251.根据权利要求250所述的重配或重组流感病毒，其中所述受治疗者为哺乳动物。
252.根据权利要求251所述的重配或重组流感病毒，其中所述哺乳动物为人类。
253.根据权利要求250-252中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述病毒感染为流感病毒感染。
254.根据权利要求250-253中任一项所述的重配或重组流感病毒，其中所述重配流感病毒将在体内施用给所述受治疗者或在体外或离体施用给所述受治疗者的一个或多个细胞。
255.根据权利要求250-254中任一项所述的重配流感病毒，其中向所述受治疗者施用预防性或治疗性治疗所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
256.一种预防或治疗受治疗者病毒感染的方法，所述方法包括：向所述受治疗者施用对病毒感染产生免疫原应答的有效量的权利要求14-27或140-142中任一项所述的重配流感病毒。
257.根据权利要求256所述的方法，其中所述受治疗者为哺乳动物。
258.根据权利要求257所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
259.根据权利要求256-258中任一项所述的方法，其中所述病毒感染为流感病毒感染。
260.根据权利要求256-259中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒将在体内施用给所述受治疗者或在体外或离体施用给所述受治疗者的一个或多个细胞。
261.根据权利要求256-260中任一项所述的方法，其中向所述受治疗者施用预防性或治疗性治疗所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
262.一种预防或治疗受治疗者病毒感染的方法，所述方法包括：向受治疗者施用对所述病毒感染产生免疫原应答的有效量的权利要求105-136、146-171、175-193、197-220或224-240中任一项所述的重配流感病毒。
263.根据权利要求262所述的方法，其中所述受治疗者为哺乳动物。
264.根据权利要求263所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
265.根据权利要求262-264中任一项所述的方法，其中所述病毒感染为流感病毒感染。
266.根据权利要求262-265中任一项所述的方法，其中将所述重配流感病毒在体内施用给所述受治疗者或在体外或离体施用给所述受治疗者的一个或多个细胞。
267.根据权利要求262-266中任一项所述的方法，其中向所述受治疗者施用预防性或治疗性治疗所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
268.一种在细胞培养物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的6个内部基因组片段、编码血凝素多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述细胞群能支持流感病毒复制；
b)培养所述宿主细胞群；和
c)回收多种重配流感病毒。
269.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
270.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
271.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
272.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
273.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
274.根据权利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
275.根据权利要求268所述的方法，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
276.根据权利要求268所述的方法，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的84至1064的核苷酸序列。
277.根据权利要求268-276中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
278.根据权利要求268-276中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
279.根据权利要求268-276中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
280.根据权利要求268-276中任一项所述的方法，其中所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
281.根据权利要求268-280中任一项所述的方法，其中所述第一流感病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
282.根据权利要求268至281中任一项所述的方法，其中所述第一流感株选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
283.根据权利要求268至281中任一项所述的方法，其中所述第一流感株为A/Ann Arbor/6/60。
284.根据权利要求268至281中任一项所述的方法，其中所述第一流感株为A/Puerto Rico/8/34。
285.根据权利要求268至284中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒适合以鼻内疫苗制剂施用。
286.根据权利要求268至285中任一项所述的方法，其中所述包含流感病毒基因组的多种载体包含A型流感病毒基因组。
287.根据权利要求268至286中任一项所述的方法，其中所述多种载体为多种质粒载体。
288.根据权利要求268至287中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞群包含以下的一种或多种：Vero细胞、PerC6细胞、MDCK细胞、293T细胞或COS细胞。
289.根据权利要求268至288中任一项所述的方法，其中所述方法不包括辅助病毒的使用。
290.根据权利要求268至289中任一项所述的方法，其中所述多种载体由8种载体组成。
291.一种生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的至少6个内部基因组片段、编码血凝素多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述宿主细胞群能支持流感病毒复制；
b)培养所述宿主细胞群；
c)回收多种重配流感病毒；和
d)提供一种或多种药学上可接受的赋形剂。
292.根据权利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
293.根据权利要求291所述的方法，所述血凝素多肽包含与SEQID NO：6的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
294.根据权利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
295.根据权利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
296.根据权利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含与SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
297.根据权利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6的残基1-327的氨基酸序列。
298.根据权利要求291所述的方法，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
299.根据权利要求291所述的方法，其中所述第一基因组片段包含SEQ ID NO：7的84至1064的核苷酸序列。
300.根据权利要求291-299中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
301.根据权利要求291-299中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
302.根据权利要求291-299中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
303.根据权利要求291-299中任一项所述的方法，其中所述第二基因组片段包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
304.根据权利要求291至303中任一项所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
305.根据权利要求291至304中任一项所述的方法，其中所述第一流感株选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
306.根据权利要求291至304中任一项所述的方法，其中所述第一流感株为A/Ann Arbor/6/60。
307.根据权利要求291至304中任一项所述的方法，其中所述第一流感株为A/Puerto Rico/8/34。
308.根据权利要求291至307中任一项所述的方法，其中所述重配流感病毒适合以鼻内疫苗制剂施用。
309.根据权利要求291至308中任一项所述的方法，其中所述包含流感病毒基因组的多种载体包含A型流感病毒基因组。
310.根据权利要求291至309中任一项所述的方法，其中所述多种载体为多种质粒载体。
311.根据权利要求291至310中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞群包含以下的一种或多种：Vero细胞、PerC6细胞、MDCK细胞、293T细胞或COS细胞。
312.根据权利要求291至311中任一项所述的方法，其中所述方法不包括辅助病毒的使用。
313.根据权利要求291至312中任一项所述的方法，其中所述多种载体由8种载体组成。
314.一种分离或重组多肽，其中所述多肽选自：
a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
b)包含含H273Y氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
c)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽；
d)包含与(a)至(c)任一多肽的氨基酸序列有至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.4％、至少99.6％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
e)包含(a)至(c)任一多肽的氨基酸序列的多肽，所述多肽中少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个氨基酸残基被取代、缺失或插入；
315.根据权利要求314所述的分离或重组多肽，其中所述多肽为免疫原性的。
316.一种无菌组合物，包含权利要求314所述的分离或重组多肽。
317.一种抗体，对权利要求314所述的分离或重组多肽有特异性。
318.一种免疫原性组合物，包含免疫有效量的权利要求314所述的分离或重组多肽。
319.一种重配流感病毒，包含编码权利要求314所述的分离或重组多肽的核酸。
320.一种分离或重组核酸。包含编码权利要求314所述的多肽的核苷酸序列。
321.根据权利要求320所述的分离或重组核酸，其中所述核酸为DNA。
322.根据权利要求320所述的分离或重组核酸，其中所述核酸为RNA。
323.根据权利要求320所述的分离或重组核酸，其中所述多聚核苷酸编码免疫原性多肽。
324.一种组合物，包含权利要求320所述的分离或重组核酸。
325.一种免疫原性组合物，包含免疫有效量的权利要求320所述的分离或重组核酸。
326.一种重配流感病毒，包含权利要求320所述的核酸。
327.一种重配流感病毒，包含权利要求321所述的核酸。
328.一种重配流感病毒，其中所述重配流感病毒为6:2重配病毒，所述重配病毒包含6个来自一个或多个供体病毒的内部基因组片段、编码权利要求314的所述多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
329.一种重配流感病毒，其中所述重配流感病毒为7:1重配病毒，所述重配病毒包含编码权利要求314的所述多肽的第一基因组片段，并且还包含6个内部基因组片段和编码来自一个或多个供体病毒的神经氨酸酶多肽的第二基因组片段。
330.根据权利要求3146或17所述的重配流感病毒，其中所述供体病毒包含一种或多种选自减毒、冷适应和温度敏感的表型属性。
331.根据权利要求328至330中任一项所述的重配流感病毒，其中所述供体病毒选自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17。
332.根据权利要求328至331中任一项所述的重配流感病毒，其中所述病毒为活病毒。
333.根据权利要求328至332中任一项所述的重配流感病毒，其中所述第一基因组片段编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽。
334.根据权利要求328至333中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为猪流感病毒神经氨酸酶。
335.根据权利要求328至333中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽为N1神经氨酸酶。
336.根据权利要求328至333中任一项所述的重配流感病毒，其中所述神经氨酸酶多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
337.一种用于在细胞培养物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的6个内部基因组片段、编码权利要求314所述多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述细胞群能支持流感病毒复制；
b)培养所述宿主细胞群；和
c)回收多种重配流感病毒。
338.一种免疫原性组合物，包含权利要求314所述的分离或重组多肽。
339.一种免疫原性组合物，包含权利要求328至336中任一项所述的重配流感病毒。
340.一种生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：
a)将多种包含流感病毒基因组的载体引入宿主细胞群中，其中多种载体包含第一流感株的至少6个内部基因组片段、编码权利要求314的所述多肽的第一基因组片段和编码神经氨酸酶多肽的第二基因组片段，并且其中所述细胞群能支持流感病毒复制；
b)培养所述宿主细胞群；
c)回收多种重配流感病毒；和
d)提供一种或多种药学上可接受的赋形剂。
341.一种重配流感病毒，包含在受治疗者中对病毒感染产生免疫原应答以预防或治疗所述病毒感染的有效量的权利要求314所述的多肽。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ617191A (en) 2009-06-25 2015-06-26 Medimmune Llc Swine influenza hemagglutinin variants
CA2850962A1 (en) * 2011-10-07 2013-09-06 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin variants
KR101315273B1 (ko) * 2012-10-29 2013-10-08 대한민국 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주
AU2013354219A1 (en) 2012-12-03 2015-07-02 Novartis Ag Reassortant influenza a viren
DK3142750T3 (da) * 2014-05-13 2020-09-14 Univ Pennsylvania Sammensætninger omfattende aav, som udtrykker dobbelt-antistofkonstrukter og anvendelser deraf
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3307310A2 (en) 2015-05-13 2018-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
SG10201912976WA (en) 2017-02-28 2020-02-27 Univ Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
SG10201913833PA (en) 2017-02-28 2020-03-30 Univ Pennsylvania Influenza vaccines based on aav vectors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080069821A1 (en) * 2006-08-09 2008-03-20 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza Hemagglutinin And Neuraminidase Variants
US20080299151A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Statens Serum Institut Influenza vaccines

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5382425A (en) * 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US7871626B2 (en) * 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
CA2626266C (en) * 2005-10-17 2015-09-08 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
NZ617191A (en) 2009-06-25 2015-06-26 Medimmune Llc Swine influenza hemagglutinin variants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080069821A1 (en) * 2006-08-09 2008-03-20 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza Hemagglutinin And Neuraminidase Variants
US20080299151A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Statens Serum Institut Influenza vaccines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARTEN: "Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans.", 《SCINECE》, vol. 325, no. 5937, 22 May 2009 (2009-05-22), pages 197 - 201 *

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EP2448598A1 (en) 2012-05-09
SG176178A1 (en) 2011-12-29
NZ596823A (en) 2013-11-29
EP2448598A4 (en) 2013-10-23
AU2010266078B2 (en) 2014-08-14

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