CN112226418B - 重组腺相关病毒纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组腺相关病毒纯化方法。其主要包括第Ⅰ轮高pH（7.3～8.3）下的除杂纯化和第Ⅱ轮低pH（4.0～4.5）下的病毒吸附及严格密集梯度洗脱的进一步纯化。SDS‑PAGE结果表明病毒纯化效果显著，第Ⅰ轮纯化除去了大量的蛋白杂质，第Ⅱ轮纯化也明显除去部分杂质；WB和电镜结果证明，纯化产物实为rAAV病毒且滴度满足需要，而且镜检表明包含基因的实心颗粒占比可达99%。本发明纯化方法简单方便、能有效去除空壳病毒，提高包含基因的实心病毒占比，且易于实现rAAV的大规模纯化，为rAAV相关的临床研究和药物开发奠定了基础。

Description

重组腺相关病毒纯化方法

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒纯化方法。

背景技术

近几十年来，随着基因治疗的有关研究不断升温，各种基因表达载体相继被开发和应用，主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体主要包括裸质粒和脂质体DNA复合物等。虽然非病毒载体安全性高，但是它们转染效率低，介导基因表达的时间短，无法满足临床基因治疗的要求，所以现已基本被遗弃。常用的病毒载体包括：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）和逆转录病毒。但是慢病毒会整合至宿主染色体进而带来可能的安全隐患，腺病毒自身免疫原性较强，容易引发机体的免疫反应，一定程度上阻碍了其临床应用，逆转录病毒因为随机整合至宿主基因组的隐患和只能感染分裂细胞的限制，目前主要应用于体外实验研究。

而AAV载体相比于其它病毒载体具有以下优势：①安全性好，迄今尚未在人和动物中发现与AAV相关的疾病，85%以上的人群血清为AAV衣壳蛋白抗体阳性；②AAV是以位点特异性的方式整合在宿主基因组的病毒，避免了随机整合导致宿主细胞基因突变的问题；③AAV的宿主范围广，不仅可以感染分裂细胞，还可以感染静止期细胞；④rAAV携带的外源基因可以在宿主细胞长期稳定表达；⑤免疫原性低，重组腺相关病毒载体（Recombinantadeno-associated virus，rAAV）去除了野生型AAV自身的Rep和Cap基因，并不编码会引起免疫反应的病毒蛋白；⑥不同类型的AAV具有不同的组织嗜性，针对特定的组织可以选择更具组织特异性的AAV类型作为基因载体；⑦AAV还具有较好的热稳定性和抗酸、碱及有机溶剂的特性，有利于AAV的纯化。以上的这些优点，使AAV载体成为最有前景且最受欢迎的基因表达载体，在基因治疗和药物开发中备受关注。

随着AAV生产和纯化方法的不断改进以及rAAV相关的动物实验、临床试验的不断开展，多种rAAV药物已被广泛应用于多种疾病的基因治疗。rAAV的基因治疗已经在很多疾病动物模型上获得成功，如Leber先天性黑死病、Duchenne肌营养不良症、血友病B和帕金森病等。随着人们对rAAV载体的深入研究，将来可能发现更多、更安全、特异性更强、表达效率更高的rAAV载体。无论是开展动物实验，还是临床试验，均需要大量符合生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）要求的高纯度、高滴度的rAAV病毒载体。而rAAV的规模化包装和纯化是制约rAAV载体药物研究快速发展的关键问题。

总体上，rAAV的包装技术目前已比较成熟，而当前限制rAAV基因治疗研究快速发展的主要问题在于rAAV的纯化。所以，rAAV的基因治疗亟需一种简单高效、节约成本、可规模化的rAAV制备和纯化方法，来推进rAAV载体药物的研究进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组腺相关病毒纯化方法，以解决腺相关病毒纯化工艺复杂、纯化效果难以满足需要，且制备成本居高不下的技术难题。

在纯化方法的选择上，由于目前发展成熟且使用广泛的密度梯度离心法不适合规模化生产，且操作要求高不易掌握；基于此，本发明研究路线选择了更适合规模化生产且操作相对简单的离子交换层析法进行rAAV的后期纯化，但是将常规的离子交换层析法直接应用于rAAV的纯化，则难以做到病毒空颗粒的分离以及病毒产量和纯度之间的平衡。

为此，本发明技术方案基于病毒粗样所含杂质过多而在纯化前期设计了第Ⅰ轮的除杂纯化，设置高pH(7.3～8.3)的上样液，使病毒不带正电而不与阳离子树脂结合，过柱之后流穿，而在该pH下带正电荷的杂质将会与树脂结合，从而被高盐洗脱液洗脱清除。

另基于包装有基因的rAAV实心颗粒和空颗粒的pI值的差异性，本发明在第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中，设置低pH（4.0～4.5）的上样液，使rAAV颗粒带正电而吸附于阳离子交换树脂，再设置密集的洗脱（pH）梯度，将重组病毒颗粒、病毒空颗粒以及杂质蛋白分批从树脂中解离和洗脱，选定病毒滴度高且纯度高的洗脱峰进行浓缩和Buffer置换后，作为最终的rAAV纯化成品。

对所有特征AAV血清型1-12的衣壳的等电点平均值的分析表明，其呈微酸性(pI=6.3)，而柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系的工作pH范围为3.0～6.2，pKA = 6.4，适于作为AAV纯化的缓冲液。

基于此，在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液可优选为pH7.8的柠檬酸钠缓冲液。在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液优选为pH4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的pH梯度洗脱可采用pH5.31、pH5.48、pH5.72、pH5.86、pH6.02、pH6.17的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化过程中选择HiTrap SP HP或者分辨率较低的层析柱，如HiTrap SP FF 或HiTrap Capto S等；在第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化选择HiTrapSP HP 或者分辨率更高的层析柱（如RSOURCE 15 S或RSOURCE 30 S等），以进一步保证rAAV的纯度。

对所述洗脱峰液进行浓缩和Buffer置换的方法如下：

1）取100kDa截留分子量的超滤离心管，加入一定体积的PBS缓冲液后冰浴预冷5min，然后4℃、2000 g条件下离心10 min，弃去离下液；

2）然后将对应的梯度洗脱峰液取一定体积加入超滤离心管，于4℃、2000 g条件下离心10 min，离心后弃去离下液；

3）重复步骤2）直至该洗脱峰所有液体全部加入超滤离心管离心通过滤膜；

4）然后向超滤离心管再加入一定体积（≥10ml）的PBS缓冲液，于4℃、2000 g条件下离心10 min，至终体积1 ml，弃去离下液；

5）重复步骤4）两次，最后一次离心，需要调整离心时间，浓缩至需要的终体积。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1. 本发明方法的多轮纯化相辅相成：①第Ⅰ轮纯化可使层析柱与大量的蛋白杂质结合，从而使病毒流穿进入第Ⅱ轮纯化，避免了在第Ⅱ轮纯化的上样过程中，大量杂质与病毒竞争层析柱的结合位点，造成部分病毒未与柱结合而流失；②由于第Ⅱ轮设置了较精细洗脱条件，如果大量的杂质蛋白未经过第Ⅰ轮纯化清除，也会结合于柱而被梯度洗脱，将会给洗脱带来极大的压力，这些杂质蛋白很可能影响到最终的病毒纯度；③分两轮进行纯化，非常有利于大规模的纯化；第Ⅰ轮纯化因为需要结合大量的杂质蛋白，对层析柱的载量要求更大，而洗脱条件较为宽松，所以对层析柱的分辨率要求不高，可以选择载量大、分辨率稍差的层析柱来节省成本；而进入第Ⅱ轮纯化的病毒液仅含少量杂质，所以对高分辨率层析柱的载量要求较小，又可以节省成本。

2. 本发明通过对收集的病毒悬液运用多轮阳离子交换层析法进行纯化，第Ⅰ轮纯化设置较高pH值的上样液以吸附并去除病毒液中杂质蛋白；第Ⅱ轮纯化设置低pH上样液以吸附rAAV病毒再通过密集的pH梯度洗脱，最终分离到纯度较高（含基因的实心颗粒占比可达99%）、滴度达标且空壳含量极低的病毒颗粒。

3. 本发明方法整个操作流程简单，生产成本较低，操作环境密闭安全，符合生产质量管理规范，而且本发明纯化方法易于实现rAAV的大规模纯化，为rAAV相关的临床研究和药物开发奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例中纯化样品的SDS-PAGE蛋白分析照片，图中“Ⅰ- load”、“Ⅰ-peak”为第Ⅰ轮纯化的上样液和洗脱峰；“Ⅱ- load”、“Ⅱ- FT”即第Ⅱ轮纯化的上样液和流穿液；“45%”、“55%”、“65%”、“75%”、“85%” 为d液的混合占比，分别对应于经过Buffer置换和浓缩后的第Ⅱ轮纯化的各pH梯度（pH5.48、pH5.72、pH 5.86、pH 6.02、pH6.17）洗脱峰。

图2为本发明实施例中所得纯化样品的Western blot分析照片，图中“blank”指未转染质粒的293T细胞裂解液的空白对照；“Ⅰ- load”即第Ⅰ轮纯化的上样液；“45%”、“55%”、“65%”、“75%”、“85%”、“95%”为d液的混合占比，分别对应于经过Buffer置换和浓缩后的第Ⅱ轮纯化的各pH梯度洗脱峰。

图3为本发明实施例中病毒滴度测量所建立的rAAV基因组拷贝数绝对定量的标准曲线图。

图4为本发明实施例所得纯化rAAV病毒颗粒的电镜照片，其中，图b是图a里白色虚线方框区域的放大图，黑色箭头所示为没有包装入基因的AAV病毒空颗粒；白色箭头所示为包装有基因的rAAV病毒实心颗粒。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

1. 实施例中所涉及的仪器设备及试验材料：

无内毒素质粒中提试剂盒（美国Omega公司），pAAV-cTnT-eGFP质粒（山东维真生物科技有限公司），pAAV-R₂C₉和pHelper质粒（武汉淼灵质粒平台），TG1感受态细胞，PEI MAX4000转染试剂（美国Polysciences公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清FBS（上海生工生物工程股份有限公司），HEK 293T细胞系（郑州大学生命科学院张守涛课题组惠赠），Millex-HV针头式过滤器0.22μm PVDF膜（美国Millipore公司），PEG-8000、柠檬酸颗粒、柠檬酸三钠颗粒、氯化钠颗粒（上海索莱宝生物科技有限公司），阳离子交换层析柱HiTrap HP SP 5ml（美国GE公司），100kDa截留分子量的15ml超滤离心管（美国Millipore公司），AAV抗体（德国PROGEN公司），全能核酸酶（上海翊圣生物科技有限公司），蛋白酶K（日本TaKaRa公司），ChamQ^TM SYBR® qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

2. 实施例中所涉及缓冲液的配制：

配置100 mM的柠檬酸钠和100 mM的柠檬酸溶液作为母液配置以下纯化缓冲液：

a液：25 mM的柠檬酸钠水溶液，pH：7.8；

b液：25 mM的柠檬酸钠+1 M的NaCl水溶液，pH：7.2；

c液：22：28比例混合100 mM的柠檬酸钠和100 mM的柠檬酸水溶液，然后稀释4倍，pH：4.4；

d液：42.8：7.2比例混合100 mM的柠檬酸钠和100 mM的柠檬酸水溶液，然后稀释2倍，pH：6.2；

除上述a、b、c、d缓冲液外，另准备20%的乙醇和超纯水，纯化前均使用0.22 µm的滤膜过滤备用。然后通过AKTA纯化系统（GE公司），利用阳离子交换层析法进行rAAV的纯化。

实施例一：病毒的获取

（一）载体质粒的构建及rAAV9病毒包装

通过PEI转染试剂将pAAV-cTnT-eGFP，pAAV-R₂C₉和pHelper三种质粒共转染293T细胞进行rAAV病毒的包装（本例使用6个15cm的培养皿，铺板时每个皿的293T细胞数约为1.0×10⁷，待细胞汇合度达到70%左右开始进行转染）。

（二）rAAV的收获与纯化前处理：

1. 转染72 h后，将细胞刮离板底，用培养基上清分两次吹打重悬后，室温离心1200 rpm，8 min将细胞沉淀与培养基上清分离；

2. 细胞沉淀加适量的25 mM柠檬酸钠溶液重悬，吹匀后冻于-80℃冰箱；

3. 收集的细胞培养基以1：4的比例加入含40% PEG8000的2.5 M NaCl溶液，于4℃过夜静置以沉降病毒。

4. 对于步骤2）收集的细胞沉淀重悬液，在-80℃/37℃反复冻融3次后，4℃离心4500 rpm，15 min，收集上清；

5. 对于步骤3）收集的过夜沉降的细胞培养基，4℃离心4000rpm，30min后，弃上清，病毒沉淀加适量的25mM的柠檬酸钠重悬；

6. 将步骤4、5两步所得的病毒悬液混合，用0.22 um的针头滤器过滤后作为后续阳离子交换层析的病毒上样液。

实施例二：rAAV纯化

应用阳离子交换层析法对收获处理后的病毒液进行纯化，包括第Ⅰ轮较高pH下的除杂纯化和第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化。

（一）第Ⅰ轮较高pH下的rAAV初步除杂纯化

1. 打开AKTA纯化系统（GE公司），整个纯化过程使用A、B两管道输液。调节系统“50%B，5 ml/min，过柱”，以20%的乙醇冲洗整个系统，期间将阳离子交换柱HiTrap SP HP5ml（美国GE公司）装入系统相应位置，过柱冲洗至UV和Cond值降至基线水平，再换超纯水冲洗至基线。

2. 调节系统为“100%B，5 ml/min，不过柱”，将b液预充B管；

3. 柱平衡：调节系统为“0%B，5 ml/min，过柱”，走a液冲洗A管和纯化柱，待UV和Cond值稳定后准备上样；

4. Ⅰ-上样：调节系统为“0%B，2.5 ml/min，过柱”，将病毒上样液置于冰上，走A管上样；同时注意关注UV值变化，待UV值开始上升时收集流穿的目的病毒液，置于冰上备用；上样完毕后，继续A管走a液，至UV和Cond值稳定；

5. Ⅰ-洗脱：调节系统为“100%B，5 ml/min，过柱”，走b液进行洗脱，收集洗脱峰，注意洗脱一定要充分，直至UV值降回基线，洗脱所有结合在层析柱的蛋白。

6. 冲洗系统：调节系统为“50%B，5 ml/min，过柱”，A、B管均走超纯水冲洗至UV和Cond值降至基线。

（二）第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化

1. 调节系统为“100%B，5 ml/min，不过柱”，将d液预充B管；

2. 柱平衡：调节系统为“0%B，5 ml/min，过柱”，走c液冲洗A管和纯化柱，待UV和Cond值稳定后准备上样；

3. 将第Ⅰ轮纯化收集的流穿液（目的病毒液）按22：28的比例加入25 mM柠檬酸酸化，作为第Ⅱ轮纯化的上样液；

4. Ⅱ-上样：调节系统为“0%B，2.5 ml/min，过柱”，将酸化后上样液置于冰上走A管上样，使病毒蛋白结合于柱。待UV值开始上升时，收集流穿液以备检测，上样完毕后，A管继续走c液，至UV和Cond值稳定；

5. Ⅱ-洗脱：A管走c液，B管走d液，通过AKTA系统依次调节d液的混合比例（35% d液、45%d液、55% d液、65% d液、75% d液、85% d液、95% d液）来调节病毒蛋白洗脱的pH梯度（分别对应于pH5.31、pH5.48、pH5.72、pH5.86、pH6.02、pH6.17）和离子强度，“5 ml/min，过柱”，冰上收集各个梯度的洗脱峰。

6. 最后调节系统为“100%B，5 ml/min，过柱”，进行高盐冲洗柱再生，再依次换超纯水和20%的乙醇冲洗后，拆下纯化柱，关闭系统。

（三）纯化后rAAV的浓缩和Buffer置换

将各个梯度的洗脱峰用截流分子量100kDa的超滤离心管进行浓缩和Buffer置换，方法如下：

1. 取6个15 ml 100kDa截留分子量的超滤离心管（Millipore），加10 ml的PBS缓冲液，冰浴5 min，使超滤离心管预冷；

2. 将各个梯度洗脱峰分别取10 ml加入各超滤离心管中，做好标记，用天平配平后放入离心机，4℃离心，2000 g，10 min，注意按照超滤离心管说明放好位置；

3. 离心完毕后，弃去离下液，重复步骤2）直至各个梯度的洗脱峰全部加入超滤离心管离心，最后将洗脱峰浓缩至终体积1 ml左右；（可酌情调整离心时间以满足终体积约1ml）

4. 然后向各管再加入10 ml PBS缓冲液，4℃离心，2000 g，10 min，至终体积1 ml左右；

5. 重复步骤4）两次，最后一次离心，需要调整离心时间，浓缩至需要的终体积（一般0.5～1ml左右）。

通过SDS-PAGE和Western blot对收集的纯化样品进行蛋白分析，结果参见图1、图2。SDS-PAGE（图1）结果表明，对比第Ⅰ轮纯化的三个样品“Ⅰ- load”、“Ⅰ- peak”、“Ⅱ- load”（等同于被酸化的“Ⅰ- FT”），观察到纯化效果非常明显，“Ⅰ- load”里的大量的杂质蛋白条带被第Ⅰ轮纯化清除，“Ⅰ- peak”（UV值极高）带走了极大多数的杂质蛋白，使溶液“Ⅱ-load”里蛋白含量明显下降以致蛋白条带显示不清；经过第Ⅱ轮纯化的严格梯度洗脱后在洗脱峰45%d可以观察到白色虚线框内明显的AAV9外壳蛋白典型三条带VP1 (87kDa)，VP2(73kDa)，VP3 (62kDa)，而且杂带较少，洗脱峰55%d、65%d的相应位置也有相应条带但是明显较弱，洗脱峰75%d还可以观察到在大约50kDa和45kDa位置有不同于其它洗脱峰的2条明显杂带。WB结果（图2）也进一步证实了纯化到的蛋白是rAAV病毒，45%d洗脱峰条带最亮，提示病毒含量最高。综合分析SDS-PAGE（图1）和WB结果（图2），WB图上的洗脱峰45%d除了AAV典型三条带以外，在VP3条带下方还存在数条显影条带，应该是病毒蛋白分解所致，可以解释SDS-PAGE图中洗脱峰45%d出现的部分杂带；而洗脱峰75%d在50kDa和45kDa位置的杂带仅出现在SDS-PAGE，WB并无相应条带，证明是杂质蛋白。经过两轮纯化，“Ⅰ- peak”去除了大量的杂质蛋白，75%d洗脱峰也去除了50kDa和45kDa大小的明显杂质蛋白，初步选定洗脱峰45%d为rAAV纯化终成品，其rAAV9含量最多且纯度尚可。

（四）病毒滴度检测与电镜分析

1.Q-PCR法测定病毒滴度

建立Q-PCR绝对定量的标准曲线：设计一对引物，

eGFP-F:AGCACGACTTCTTCAAGTC，

eGFP-R：ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAG，

选取某一已知浓度的pAAV-cTnT-eGFP质粒，倍比稀释10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍，将稀释后的各质粒作为模版。使用ChamQTM SYBR® qPCR Master Mix进行荧光定量PCR，然后以模版质粒换算后的基因拷贝数GC（Genome Copy）的lg（GC）值为横坐标，CT（Cycle Threshold）值为纵坐标，建立标准曲线（见图3）。将待测的各个梯度的病毒成品适当稀释后，加全能核酸酶消化，37℃水浴30min，去除可能存在的核酸杂质，再加入蛋白酶K裂解病毒外壳，56℃水浴，20min，释放病毒DNA，然后95℃，15min灭活蛋白酶，最后以处理后的各个样品为模版进行荧光定量PCR。将各个样品的CT值代入标准曲线的线性回归方程，再乘以稀释倍数得最终的rAAV滴度（GC/mL），结果见表1。其中45%洗脱峰滴度明显最高，被选为rAAV纯化终成品，其滴度达到2.15×10¹² GC/mL，满足小动物注射所需病毒滴度。

表1 纯化浓缩后rAAV的滴度测定

注：“45%”、“55%”、“65%”、“75%”、“85%”、“95%”即经过Buffer置换和浓缩后的第Ⅱ轮纯化的各梯度洗脱峰。

2.rAAV病毒成品的电镜分析

将20 μl纯化的rAAV终成品（对应于45% b洗脱峰）滴到200网格的电子显微镜上，并用formvar膜和薄碳膜进行两次涂覆。15分钟后，依次用5 mM Tris-HCl（pH 7.5）和蒸馏水洗涤网格3分钟，然后用1％乙酸铀酰染色30秒钟，用滤纸将过量的染色溶液吸干，并将网格风干5分钟。用配备有MegaView II高分辨率TEM照相机的Jeol 1200-Ex电子显微镜在80kV的工作电压下对网格进行检查，检查了大量区域后，以15万至25万的放大倍数拍摄最具代表性的图像进行最终分析（见图4）。从中可以看出，直径约20nm的病毒颗粒在电镜下清晰可见，而且背景干净，几乎没有杂质粒子（图4a）；空壳病毒也非常少，约100个颗粒中仅发现1个空壳颗粒，包含有基因的病毒实心颗粒占比可达99%（图4b）。电镜结果表明，rAAV终成品的病毒纯度很高且空颗粒含量极少，纯化效果十分理想。

综合纯度和得率来看，洗脱峰45% b作为最终的rAAV成品最为合适，同时为了提高得率，还可以保留洗脱峰55% B和65% B，它们的病毒滴度仍然有10¹¹GC/ml左右，而且纯度更高。

上面结合实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者进行相关方法或步骤的等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，不再赘述。

Claims (6)

1.一种重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，对收集的病毒悬液进行至少两轮阳离子交换层析纯化，其中，在第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化中设置pH为7.3～8.3的上样液以吸附并去除病毒液中杂质蛋白；在第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中，设置pH为4.0～4.5的上样液以吸附rAAV病毒，再通过一定间隔的多pH梯度洗脱rAAV病毒，进行浓缩和Buffer置换后，收集滴度和纯度满足需要的梯度洗脱峰液，得纯化的腺相关病毒；在第Ⅱ轮纯化后，选定对应于pH5.48、pH5.72和/或pH5.86的洗脱峰液进行浓缩和Buffer置换，得rAAV纯品。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液为pH7.8的柠檬酸钠缓冲液。

3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液为pH4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的pH梯度洗脱依次采用pH5.31、pH5.48、pH5.72、pH5.86、pH 6.02、pH6.17的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

5.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化过程中，其离子交换柱选择HiTrap SP HP或者分辨率较低的层析柱HiTrapSP FF 或HiTrap Capto S；第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化的离子交换柱选择HiTrap SP HP或者分辨率更高的层析柱RSOURCE 15 S或RSOURCE 30 S，以进一步保证rAAV的纯度。

6.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，对所述洗脱峰液进行浓缩和Buffer置换的方法如下：

1）取100kDa截留分子量的超滤离心管，加入一定体积的PBS缓冲液后冰浴预冷5 min，然后4℃、2000 g条件下离心10 min，弃去离下液；

2）然后将对应的梯度洗脱峰液取一定体积加入超滤离心管，于4℃、2000 g条件下离心10 min，离心后弃去离下液；

3）重复步骤2）直至该洗脱峰所有液体全部加入超滤离心管离心通过滤膜；

4）然后向超滤离心管再加入一定体积的PBS缓冲液，于4℃、2000 g条件下离心10 min，至终体积1 ml，弃去离下液；

5）重复步骤4）两次，最后一次离心，需要调整离心时间，浓缩至需要的终体积。

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