SK181098A3 - Method for producing recombinant adenovirus - Google Patents

Description

Postup prípravy rekombinantných adenovírusov

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nového postupu na. prípravu rekombinantných ¹adenovírusov. Týka sa tiež purifikovaných vírusových prípravkov vytvorených podlá tejto metódy.

A » k ä Doterajší stav techniky

Adenovírusy majú isté vlastnosti výhodné predovšetkým na použitie ako vektory a na prenos génov v génovej terapii. Majú dosť široké hostiteľské spektrum, sú schopné infikovať príbuzné bunky, nie sú zahrnuté do genómu infikovanej bunky a nie sú spájané s významnými patológiami u ludi. Adenovírusy sa použili na prenos génov záujmu do svalu (Ragot a kol., Náture 361 (1993) 647), ďo pečene (Jaffe a kol., Náture Genetics 1 (1992) 372), nervového systému (Akli a kol., Náture Genetics 3 (1993) 224), atď. .

x Adenovírusy sú vírusy lineárnej dvojvláknovéj DNA s veľkosťou okolo 36 kb (kilobáz). Ich genóm obsahuje konkrétne sekvenciu obrátenej repeticie (ITR) na každom konci, sekvenciu enkapsidácie (Psi), rané a neskoré gény. Esenciálne rané gény sú známe v oblastiach El, E2, E3 a E4. Z týchto známych génov v oblasti El sú konkrétne gény nevyhnutné na propagáciu vírusu.

! Esenciálne neskoré gény sú známe v oblastiach L1 až L5. Genóm adenovírusu Ad5 sa úplne sekvenoval a je dostupný na základe· údajov (pozri konkrétne Genebank M73260) . Sekvenovali sa aj iné adenovirusové genómy (Ad2, Ad7, Adl2, atď.).

Na ich použitie v génovej terapii sa pripravili rôzne vektory odvodené z adenovírusov, ktoré majú začlenené rôzne terapeutické gény. V každej z týchto konštrukcii sa adenovírusy modifikovali tak, aby stratili neschopnosť replikácie v infikovanej bunke. Konštrukcie opísané vo vedľajších odboroch sú adenovírusy deletované v oblasti El, konkrétne dôležitej pre replikáciu vírusu, na úrovni, v ktorej sú vložené sekvencie heterologickej DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991); GoshChoudhury a kol., Gene 50 (1986) 161). Na zlepšenie vlastností vektora sa navrhlo vytvorenie ďalšej delécie alebo modifikácie v genóme adenovírusu. Bodová termosenzitívna mutácia sa vložila do mutanta ts 125, ktorá umožňuje inaktivovať väzbový proteín 72 kDa s DNA (DBP) (Van der Vliet' a kol., 1985). Iné vektory obsahujú deléciu inej oblasti, konkrétne oblasti E4 nevyhnutnej na aplikáciu alebo propagáciu vírusu. Oblasť E4 je zahrnutá do regulácie expresie neskorých génov, do stability neskorej RNA, do ukončenia expresie proteínov hostiteľskej bunky a do účinku replikácie vírusovej DNA. Adenovírusové vektory, v ktorých sú oblasti E1 a E4 deletované, majú teda veľmi zníženú schopnosť transkripcie a expresie vírusových génov. Takéto vektory sa opísali v prihláškach vynálezov WO94/28152, WO95/02697, PCT/FR96/00088). Okrem toho sa opísali vektory, ktoré majú modifikáciu na úrovni génu Iva2 (WO96/10088).

Rekombinantné adenovírusy opísané v literatúre sú produkty z rôznych adenovírusových sérotypov.^! Existujú rôzne sérotypy adenovírusov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu líšia, ale ktoré majú porovnateľnú genetickú organizáciu. Rekombinantné adenovírusy môžu byt ľudského alebo zvieracieho pôvodu. Čo sa týka adenovírusu ľudského pôvodu, môžu sa uviesť konkrétne tie, ktoré sú zaradené do skupiny C, konkrétne adenovírusy typu 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) alebo 12 (Adl2). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu sa môžu konkrétne uviesť adenovírusy psieho pôvodu a konkrétne kmene adenovírusov CAV2 (napríklad: souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800). Iné typy adenovírusov zvieracieho pôvodu sú uvedené konkrétne v prihláške vynálezu WO94/26914, ktorá je zahrnutá v odkazoch.

V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia vynálezu je rekombinantný adenovírus ľudského pôvodu skupiny C. Konkrétne ide o Ad2 alebo Ad5.

Rekombinantné adenovírusy sú produkované v enkapsidačnej línii, to znamená v línii buniek schopných doplniť v trans jednu alebo viac deficientných funkcií v rekombinantnom adenovírusovom ³ vektore. Jedna z týchto línií je napríklad línia 293, v ktorej bola zahrnutá časť genómu adenovírusu. Línia 293 je bunkovou ľudskou obličkovou embryonálnou líniou, ktorá obsahuje ľavý koniec (okolo 11-12%) genómu adenovírusu so sérotypom 4 (Ad5), ktorý obsahuje ľavú ITR, oblasť enkapsidácie, oblasť El, zahrňujúcu Ela a Elb, oblasť kódujúcu protein pIVa2. Táto línia je schopná transkomplementovať oblasť El defektného rekombinantného adenovírusu, to znamená adenovírusu bez celej alebo časti oblasti El a je so zvýšenou schopnosťou schopná produkovať vírus. Táto línia je tiež schopná produkovať pri teplote okolo 32 °C vírus obsahujúci okrem iného termosenzitivnu mutáciu E2. Opísali sa iné bunkové línie schopné doplniť oblasť El, založené konkrétne na rakovinových bunkách ľudských pľúc A549 (WO94/28152) alebo na ľudských retinoblastoch (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Opísali sa tiež línie schopné transkomplementovať viac funkcií adenovírusu. Môžu sa uviesť tiež línie komplementujúce oblasti El a E4 (Yeh a kol., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak a kol., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) a línie komplementujúce oblasti El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/2701) .

Rekombinantné adenovírusy sú ' zvyčajne tvorené vložením vírusovej DNA do enkapsidačnej línie, nasledujúcou lýzou buniek po dvoch alebo troch dňoch (kinetika adenovírusového cyklu je od 24 do 36 hodín). Po lýze buniek rekombinantné vírusové častice sa izolujú odstreďovaním v gradiente chloridu cézneho.

Na uvedenie postupu môže byť vírusová DNA úplný rekombinantný vírusový genóm, prípadne skonštruovaný v baktérii (WO96/25506) alebo v kvasinke (W095/03400), transfekovaný v bunkách. Môže ísť o rekombinantný vírus použitý na infikovanie enkapsidačnej línie. Vírusová DNA sa môže vložiť vo forme fragmentov nesúcich každú časť, vírusového rekombinantného genómu a oblast homológie, ktorá umožňuje po vložení do enkapsidačnej bunky znovu tvoriť rekombinantný vírusový genóm všeobecnou rekombináciou medzi rôznymi fragmentmi. Klasický postup tvorby adenovírusu zahrňuje nasledovné etapy: Bunky (napríklad bunky 293) sú infikované v kultivačnej miske vírusom s množstvom 3 až vírusových častíc na bunku (Multiplicity of Infection (MOI) = 3 až 5) , alebo transfekované s vírusovou DNA. DÍžka inkubácie sa pohybuje medzi 40 až 72 hodinami. Vírus sa potom uvoľní z jadra lýzou buniek, niekoľkými postupnými rozmrazovacími cyklami. Získaný bunkový lyzát sa potom odstredí pri rýchlosti- 2000 až 4000 rpm a supernatant (čistý bunkový lyzát) sa potom purifikuje odstreďovaním v prítomnosti chloridu cézneho v dvoch etapách:

- prvé odstreďovanie 1,5 hodiny v dvoch vrstvách chloridu cézneho s hustotou 1,25 a 1,4 ohraničujúcou denzitu vírusu (1,34) tak, aby oddelil vírusové proteíny prostredia;

- druhé odstreďovanie v ďalšom gradiente (od 10 do 40 hodín podľa použitého rotora), ktoré tvorí skutočnú a jedinú etapu purifikácie vírusu.

Po druhej etape odstreďovania je pás vírusu majoritný. Napriek tomu sú viditeľné dva pásy menej tmavé, tenké, ktorých pozorovanie v elektrónovom mikroskope ukázalo, že ide o prázdne vírusové častice s pruhom tmavším a o vírusové podjednotky (pentony, hexony) s pruhom menej tmavým. Po tejto etape sa vírus zozbieral punkciou pomocou ihly z centrifugačnej kyvety a cézium sa odstránilo dialýzou alebo odsolením.

Aj keď získaná úroveň purifikácie bola uspokojivá, má tento postup určité nevýhody. Konkrétne to, že je založený na použití chloridu cézneho, ktorý je neprijateľný na terapeutické použitie pre človeka. Je nutné vylúčiť chlorid cézny pochádzajúci z purifikácie. Táto metóda má okrem toho ešte ďalšie nevýhody, ktoré sú uvedené ďalej, a ktoré obmedzujú použitie .metódy v priemyselnom meradle.

Aby sa vylúčili tieto problémy, navrhla sa purifikácia vírusu získaného po lýze nie v gradiente chloridu cézneho, ale chromatograficky. Článok autorov Huyghe a kol., (Hum. Gen. Ther (1996) 1403) opisuje konkrétne štúdiu purifikácie rekombinantných adenovírusov, ktorá používa chromatografiu založenú na slabej výmene aniónov (DEAE). Publikovali sa práce odborníkov opisujúce použitie tohto typu chromatografie s týmto cieľom (Klemperer a kol., Virology 9 (1959) 536; Philipson L.,

Virology 10 (1960) 459; Haruna a kol., Virology 13 (1961) 264). Výsledky uverejnené v článku autorov Huyghe a kol. ukazujú dosť podpriemernú účinnosť odporúčanej ionomeničovej chromatografie. Získaný výsledok je podpriemerný, autori naznačujú, že vírusové častice sú prítomné vo viacerých chromatografických signáloch; výťažok je nízky ’ (výťažok vírusových častíc: 67%; výťažok infikovaných častíc 49%); a získaný vírusový preparát po týchto chromatografických etapách nie je čistý. Je nevyhnutné dopredu opracovať vírus s rôznymi enzýmami / proteinmi. Rovnaký článok opisuje štúdiu použitia chromatografie s gélovou filtráciou, ktorá má veľmi zlé delenie a veľmi nízke výťažky (15-20%).

Podstata vynálezu

Predložený vynález opisuje nový postup prípravy rekombinantných adenovírusov. Postup podľa vynálezu spočíva v modifikácii postupov odborníkov v úrovni fázy prípravy alebo v úrovni fázy purifikácie a umožňuje rýchlo získať vírus vo väčšom množstve a vyššej kvalite.

Postup podľa vynálezu sa týka konkrétne postupu prípravy rekombinantných adenovírusov, v ktorom sa vírusy získavajú zo supernatantu kultúry. Iné hľadisko vynálezu sa týka postupu prípravy zahrňujúce etapu ultrafiltrácie. Podľa ďalšieho hľadiska vynález sa týka tiež postupu zlepšenia purifikácie rekombinantných adenovírusov, ktorý zahrňuje anionomeničové chromatografie. Predložený vynález tiež opisuje postup zlepšenia purifikácie používajúci chromatografiu gélovou filtráciou, pripadne spojenú s anionomeničovou chromatografiou. Postup umožňuje získať vírus s lepšou kvalitou, čo sa týka čistoty, stability, morfológie a infekčnosti s vyšším výťažkom a v podmienkach prípravy úplne vyhovujúcich priemyselným požiadavkám a s ohľadom na riadenie, ktoré sa týka produkcie terapeutických molekúl.

V rámci industrializácie postup podľa vynálezu používa také metódy spracovania supernatantu kultúry osvedčené v širokom meradle pre rekombinantné proteíny, ako sú mikrofiltrácia alebo hĺbková filtrácia a tangenciálna ultrafiltrácia. Z dôvodu stability vírusu pri teplote 37 °C táto metóda umožňuje lepšie použitie v priemyselnom meradle, kde na rozdiel od metódy intracelulárny Čas zberu nemusí byť presný na poldeň. To zaisťuje získanie maximálneho množstva vírusu, čo je veľmi významné v prípade vírusov defektných vo viacerých oblastiach. Na druhej strane metóda podľa vynálezu umožňuje jednoduchšie a presnejšie sledovanie kinetiky tvorby vírusu priamo v homogénnej vzorke supernatantu bez predbežnej úpravy, čo umožňuje lepšiu reprodukovateľnosť prípravy. Postup podlá vynálezu umožňuje tiež vylúčiť etapu lýzy buniek. Lýza buniek predstavuje niekoľko nevýhod. Na priemyselnej úrovni sa môže ťažko pozorovať rozbitie buniek zmrazovacimi a rozmrazovacími cyklami. Alternatívna metóda lýzy (Dounce, X-press, sonifikácia, mechanické strihanie, atď.) má určité nevýhody: potenciálne tvorí aerosól ťažko konfinovaný pre vírus L2 alebo L3 (úroveň konfinácie vírusu závisí na ich patogenicite alebo ich spôsobe šírenia), tieto vírusy majú sklon spôsobovať infekcie vzduchom; vyvolávajú strihovú silu alebo uvoľnenie tepla ťažko kontrolovaného a zníženie aktivity preparátu. Použitý roztok detergentov na lýzu buniek bude vyžadovať validáciu a bude vyžadovať okrem iného potvrdenie odstránenia detergentu. Bunková lýza spôsobuje množstvo jemnejšiu vynálezu vedie k vírusovej maturácii zlomkov buniek v prostredí, ktoré potom vyžaduje purifikáciu. Čo sa týka kvality vírusu, postup podľa umožňuje prípadne zlepšiť dozrievanie vírusu, a to homogénnej populácii. V medziach, keď zabalenie DNA j e buniek nereplikatívne a sú umožňujú preparátu. ako pomer prípadne zlepšiť populácii. V medziach, posledná etapa vírusového cyklu, lýza po uvoľňuje prázdne častice, ktoré sú choroboplodné a majú toxický účinok vírusu a získaného pomeru špecifickej aktivity zvýšenie

Špecifická infekčná schopnosť preparátu je celkového počtu vírusových častíc, biochemickými metódami metóda, atď.) k počtu biologický efekt (tvorba pevnej pôde, definovaná je meraný imunoenzýmová ktorý (DO260nm, HPLC, PCR, vírusových častíc, ktoré vyvolávajú plakov lýzy pri kultivácii buniek na bunková translácia). Pre purifikovaný preparát je prakticky táto hodnota určená pomerom koncentrácie častíc meranou DO pri 260 nm ku koncentrácii jednotiek tvoriacich plak preparátu. Táto hodnota musí byť nižšia ako 100.

Získané výsledky ukazujú, že postup vynálezu umožňuje získať vírus s aspoň takou čistotou ako sa získa pomocou odstreďovania v gradiente chloridu cézneho v jednej etape a bez predbežného spracovania, ktorý pochádza z vírusového koncentrovaného supernatantu.

Prvý predmet vynálezu sa teda rekombinantných adenovírusov vyznačeného týka postupu prípravy tým, že vírusová DNA sa vložila do bunkovej enkapsidačnej bunky vylúčení postupov, buniek, do supernatantu v ktorých ktorá sa uskutoční sa zbiera po vedľajších narastených chemicky, v postupe pôsobením vonkajšieho podlá vynálezu nie pôsobenia.

a produkovaný vírus kultúry. Na rozdiel sa vírus získava po lýze mechanicky alebo sú bunky lyzované sledovaná dlhší čas

Kultúra je od a vírusy sa získavajú priamo zo supernatantu po samovoľnom uvoľnení enkapsidačnými bunkami. Vírus, podľa vynálezu sa potom získa z bunkového supernatantu tak, ako je vo vedľajších postupoch; ide o vírus intracelulárny, predovšetkým intra nukleárny.

Predkladáte! teraz ukázal, že napriek predĺženiu času kultivácie a napriek použitiu väčších objemov postup podľa vynálezu umožňuje vytvoriť vírusové častice vo zvýšenom množstve a zlepšiť ich kvalitu. Okrem toho, ako je už uvedené, tento postup umožňuje sa vyhnúť etapám lýzy, ktoré sú v priemyselnom meradle ťažko dosiahnuteľné a vytvárajú množstvo kontaminácií.

Princíp postupu sa teda týka získania voľných vírusov zo supernatantu. Tento postup môže zahrňovať čas kultivácie nižší ako je čas kultivácie vedľajších techník založených na bunkovej lýze. Ako sa už uviedlo, čas zberu nie je presný na poldeň. Je určený kinetikou uvoľňovania vírusu so supernatantu kultúry.

Kinetika uvoľňovania vírusu sa môže sledovať rôznymi spôsobmi. Môže sa použiť konkrétne metóda analýzy, ako je RPHPLC, IE-HPLC, semikvantitatívna PCR (príklad 4.3), farbenie mŕtvych buniek farbivom trypánovou modrou, meranie uvoľneného intracelulárneho enzýmu typu LDH, meranie častíc v supernatante prístroja typu Coulter alebo difrakciou svetla, imunologické metódy (ELISA, RIA, atď.) alebo nefelometria, titrácia agregátov v prítomnosti protilátky, atď..

Uprednostňovaný spôsob získavania je, že je zber uskutočnený ak aspoň 50% vírusu sa uvoľnilo do supernatantu.

Čas, keď 50% vírusu sa uvoľnilo, sa môže určiť pomocou merania kinetiky podľa ďalej opísaných metód. Ešte výhodnejšie sa zber uskutočni, keď aspoň 70% vírusu sa uvoľnilo do supernatantu.

Ešte výhodnejšie sa zber uskutoční, keď aspoň 90% vírusu sa uvoľnilo do supernatantu teda, keď kinetika dosiahne maximum. Kinetika uvoľňovania vírusu závisí predovšetkým na cykle replikácie adenovírusu a môže sa ovplyvniť s určitými faktormi. Konkrétne sa môže meniť podľa typu použitého vírusu a podľa typu delécie uskutočnenej na rekombinantnom vírusovom genóme. Konkrétne delécia v oblasti E3 vírus zdá, že brzdí uvoľňovanie vírusu. Za prítomnosti oblasti E3 vírus sa môže získať 24-48 hodín po infekcii. Naopak za neprítomnosti oblasti E3 je nevyhnutné čas kultivácie predĺžiť. Z tohto hľadiska predkladáte! uskutočnil kinetické pokusy uvoľňovania adenovírusu so zníženou schopnosťou v oblastiach E1 a E3 do bunkového supernatantu a ukázal, že uvoľnenie začína 4 až 5 dní po infekcii a že dĺžka kultivácie sa pohybuje až okolo 14 dní. Uvoľnenie dosahuje všeobecne maximum medzi 8 až 14 dňami a titer zostáva stabilný aspoň 20 dní po infekcii.

V postupe podľa vynálezu bunky sú prednostne kultivované počas periódy zahrňujúci 2 až 14 dní. Uvoľňovanie vírusu sa môže indukovať expresiou v enkapsidačnej bunke proteínu, napríklad vírusového, zahrnutého do uvoľňovania vírusu. ^! V prípade adenovírusu uvoľňovanie sa môže modulovať expresiou proteínu Death kódovaného oblasťou E3 adenovírusu (proteín E3-11, 6K) , prípadne expresiou riadenou indukovatelným promótorom. Môže sa znížiť čas uvoľňovania vírusu a získať zo supernatantu kultúry viac ako 50% vírusu 24-48 hodín po infekcii.

Na získanie vírusových častíc je výhodné supernatant kultúry dopredu prefiltrovať. Pre adenovírus, ktorý má veľkosť okolo 0,1 μιη (12 nm), sa filtrácia uskutočňuje pomocou membrán, ktoré majú veľkosť pórov dostatočnú na priechod vírusu, ale dostatočne jemnú na zachytenie kontaminácie. Filtrácia je prednostne uskutočnená pomocou membrán, ktoré majú veľkosť pórov väčšiu ako 0,2 gm. Podľa výhodného spôsobu uskutočnenia je konkrétne filtrácia vhodne uskutočnená cez membrány so znižujúcou sa pórovitosťou. Dobré výsledky sa získali konkrétne s použitím filtrácie cez hĺbkové filtre so znižujúcou sa veľkosťou pórov 10 gm, 1,0 gm potom 0,8-0,2 gm. Podľa iného uprednostňovaného variantu filtrácia je uskutočňovaná tangenciálnou mikrofiltráciou cez rovinné membrány firmy Millipore alebo vláknité hĺbkové filtre, ktoré majú veľkosť pórov medzi 0,2 gm až 0,6 gm. Výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že táto etapa filtrácie má výťažok 100% (žiadne straty vírusu zadržaním na filtri s najjemnejšími pórmi sa nepozorovali).

Podľa iného hľadiska vynálezu predkladatel ukázal postup umožňujúci zbierať a purifikovať vírus zo supernatantu. Z tohto hľadiska je takto filtrovaný (alebo čistený) supernatant pripravený na ultrafiltráciu. Ultrafiltrácia umožňuje (i) koncentrovať supernatant, predpokladané objemy sú značné, (ii) zlepšenie prvej puŕifikácie vírusu a (iii) upraviť prípravný pufor v neskorších etapách prípravy. Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia supernatant sa tangenciálne ultrafiltruje. Tangenciálna ultrafiltrácia spočíva v koncentrácii a frakcionácii roztoku na dva podiely, sediment a filtrát, ktoré sa separujú membránami s určitou veľkosťou s uskutočnením prietoku cé'z podiel sedimentu a pri aplikácii transmembránového tlaku medzi týmto podielom a podielom filtrátu. Prietok je všeobecne uskutočnený pomocou pumpy do podielu sedimentu a transmembránový tlak je riadený prostredníctvom ventilu na kvapalinovom prítoku obehu filtrátu alebo pumpou s premenlivým prietokom na kvapalinovom prietoku obehu filtrátu. Rýchlosť prietoku a transmembránový tlak sú zvolené tak, aby sa vytvorili malé strižné sily (počet jednotiek reynold nižší ako 5000 s^-1, prednostne nižší ako 3000 s“¹, tlak nižší ako 1,0 bar) aby sa vyhlo vyprázdňovaniu membrán. Na uskutočnenie ultrafiltrácie sa môžu použiť rôzne systémy, ako napríklad špirálové membrány alebo hĺbkové vláknité membrány (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Separcor). Pre adenovírusy, ktoré majú veľkosť asi 1000 kDA sa používajú výhodne v rámci vynálezu membrány, ktoré majú veľkosť pórov menšiu ako 1000 kDa, prednostne medzi 100 kDa až 1000 kDa. Použitie membrán, ktoré majú veľkosť 1000 kDa alebo vyššiu, stráca’ v tejto etape význam pre vírus. Prednostne sa používajú membrány, ktoré majú veľkosť medzi 200 až 600 kDa, konkrétne 300 až 500 kDa. Uvedené skúsenosti v príkladoch ukazujú, že použitie membrány, ktorá má veľkosť 300 kDa umožňuje zadržať viac ako 90% vírusových častíc., pričom sa eliminujú kontaminanty z kultivačnej pôdy (DNA, proteíny, kultivačné pôdy, bunkové proteíny, atď.). Použitie veľkosti 500 kDa poskytuje rovnaké výhody.

Výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že táto etapa umožňuje významne koncentrovať objemy supernatantu bez straty vírusu (výťažok je 90%) a že sa získa vírus s lepšou kvalitou. Ľahko sa môže dosiahnuť 20-100 násobná koncentrácia.

Táto etapa ultrafiltrácie spočíva teda v doplnkovej purifikácii na rozdiel od klasickej schémy, keď sa eliminujú aspoň čiastočne kontaminanty s veľkosťou menšou ako veľkosť membrány (300 až 500 kDa). Zvýšenie kvality vírusového preparátu je evidentné, ak sa porovná hľadisko separácie po prvej etape ultracentrifugácie podľa týchto dvoch postupov. V klasickom postupe, ktorý zahrňuje lýzu, skúmavka vírusového prostriedku má čiastočne problémy so zrazeninou (lipidy, proteíny), ktorá niekedy dosahuje pruh vírusu, zatiaľ čo v postupe podľa vynálezu prípravok po uvoľnení a ultrafiltrácii predstavuje pruh dobre oddelený od kontaminantov média, ktoré zostávajú vo vyššej fáze. Zvýšenie kvality je tiež ukázané, ak sa porovnajú profily na ionomeničovej kolóne vírusu získaného bunkovou lýzou oproti vírusu, ktorý sa získal ultrafiltráciou, ako je opísané v predloženom vynáleze. Kvalita sa tiež môže zvýšiť pri nasledovaní ultrafiltrácie diafiltráciou koncentrátu. Táto diafiltrácia sa uskutočňuje na rovnakom princípe ako tangenciálna ultrafiltrácia a umožňuje odstrániť kontaminanty s väčšou veľkosťou ako je veľkosť membrány s uskutočnením ekvilibrácie koncentrátu v purifikačnom pufri.

Predkladáte! tiež ukázal, že táto ultrafiltrácia umožňuje potom purifikáciu vírusu priamo chromatograficky na ionomeničovej kolóne alebo gélovou filtráciou, ktorá umožňuje získať dobré . rozdelenie signálov vírusových častíc bez ' potreby predbežnej chromatografie prípravku. Predovšetkým toto je neočakávané a výhodné. Ak je uvedené vo vyššie spomenutom článku autorov Huyghe a kol., purifikácia chromatografiou vírusového preparátu poskytuje slabé výsledky a ukazuje na nutnosť dopredu opracovať suspenziu vírusu Bensonázou a cyklodextrínom.

Postup podľa vynálezu sa teda vyznačuje tým, že vírus sa získa pomocou ultrafiltrácie.

Ak sa už uviedlo, výsledný koncentrát je použiteľný priamo na purifikáciu vírusu. Táto purifikácia sa môže uskutočniť s klasickými technikami, takými ako je odstreďovanie v gradiente chloridu cézneho alebo v inom prostredí ultracentrifugácie, ktorá umožňuje oddeliť častice podľa ich veľkosti, denzity alebo sedimentačného koeficientu. Výsledky uvedené v príklade 4 ukazujú, že vírus takto získaný má významné vlastnosti. Konkrétne podľa vynálezu je možné nahradiť chlorid cézny roztokom jodixanol,5,5'-[ (2-hydroxy-l,3propandiyl)-bis(acetylamino) ]bis(acetyamonobis [N,N'-bis(2,3dihyroxypropyl-2,4,6-triodo-1,3-benzenkarboxamid], v ktorom vírus sedimentuje v rovnováhe s denzitou medzi 1,16 až 1,24. Použitie tohto roztoku je výhodné, pretože na .rozdiel od chloridu cézneho nie je toxický. Predkladatel tiež dokázal, že takto výhodne získaný koncentrát umožňuje tiež purifikovať vírus priamo mechanizmom meniča iónov alebo gélovou filtráciou získať veľmi dobrý výsledok delenia chromatografických signálov vírusových častíc bez potreby predbežného spracovania.

Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vírus sa teda získa a purifikuje anionomeničovou chromatografiou.

Na anionomeničovú chromatografiu sa použili rôzne druhy nosiča, ako je napr. celulóza, agaróza (gély Sepharose), dextrán (gély Sephadex), akrylamid (gély Sephacryl, gély Trisacryl), silikagély (gély TSK-gél SW), poly[styrén/divinylbenzén] (gély Source alebo gély Poros), kopolymér etylénglykolmetakrylát (gély Toyopearl HW a TSK-gél PW) alebo zmesi (agaróza - dextrán: gél Superdex) . Na zvýšenie chromatografického delenia je výhodnejšie v rámci predloženého vynálezu použitie nosiča vo forme gulôčok, ktoré majú nasledujúce vlastnosti:

- čo najviac guľový tvar,

- kalibrovaný rozmer (všetky guľôčky by mali byť identické alebo čo najviac homogénne), bez nedokonalosti a bez rozbitia,

- s čo najmenším rozmerom: opísali sa guľôčky 10 μιη (napríklad Monobeads Pharmacia alebo TSK-gél TosoHaas). Zdá sa, že táto veľkosť je dolný limit pre rozmer gulôčok, ich pórovitosť musí byť veľmi vysoká, aby umožnila penetráciu predmetu chromatografie vo vnútra guľôčok (pozri ďalej).

- zachovať rigiditu na rezistenciu voči tlaku.

Na chromatografiu adenovírusov obsahujúcich predmet s veľmi významnou veľkosťou (rozmer > 100 nm) je dôležité použiť gély so zvýšeným horným limitom pórovitosti, dokonca čo najväčším, aby sa umožnil prístup vírusových častíc k funkčným skupinám, s ktorými by mali interagovať.

Výhodne sa nosič vyberá spomedzi agarózy, dextránu, akrylamidu, silíc, poly[styrén/divinylbenzénu], kopolyméru etylénglykolmetakrylátu, použité buď samotné alebo v zmesi.

Pre anionomeničové chromatografie sa použitý nosič musí funkcionalizovať štepením skupín schopných interagovať s aniónovými molekulami. Skupina je tvorená konkrétne amínom, ktorý môže byť terciárny alebo kvartérny. S použitím terciárneho amínu takého, ako je napríklad DEAE, sa získa slabý menič aniónov. S použitím kvartérneho amínu sa získa silný menič aniónov.

V rámci predloženého vynálezu je konkrétne výhodné použitie silného meniča aniónov. Podľa vynálezu sa prednostne používa taký chromatografický nosič, ako je uvedené ďalej, funkcionalizovaný s kvartérnymi amínmi. Z nosičov, ktoré sú funkcionalizované kvartérne amíny sa môžu uviesť ako príklady náplň Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ a Poros QE, náplň typu Fractogel TMAE a náplň Toyopearl Super Q.

Uprednostňované príklady náplni použiteľných v rámci vynálezu sú Source, konkrétne také Source Q, ako je 15 Q (Pharmacia), MonoBeads, ako je Q (Pharmacia), náplne typu Poros HQ a Poros QE. Nosič MonoBeads (rozmer guľôčok 10 ± 0,5 μπι) je komerčne dostupný už 10 rokov a náplne typu Source (15 μιη) alebo Poros (10 μιη alebo 20 μπι) už asi 5 rokov. Tieto dve náplne majú výhodu, že majú vnútorné rozdelenie pórov veľmi široké (od 20 nm po 1 μπι) umožňujúce tak prechod veľmi veľkého objemu cez guľôčky. Poskytujú veľmi malú rezistenciu pre cirkuláciu kvapaliny cez gél (teda veľmi malý tlak) a sú veľmi rigidne. Transport roztokov cez funkčné skupiny, s ktorými_ budú vstupovať do interakcie, ' je veľmi rýchly. Predkladáte! ukázal, že tieto parametre sú konkrétne dôležité v prípade adenovírusu, ktorého difúzia je pomalá vzhľadom na jeho veľkosť.

Výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že adenovírus sa koncentrátu v jednej etape anionomeničovej veľmi dobrý (140% autormi že výťažok purifikácie je hodnotou 49% publikovanou rozdelenie

Uvedené môže purifikovať z chromatografie tak, tdu, v porovnaní s kol.) a že okrem toho ukazujú, že schopnosť a má teda terapeutické použitie, získali so

Huyghe a výsledky infekčnú je tiež veľmi dobré.

získaný adenovírus má vlastnosti, ktoré . sú vyžadované na Tieto prednostne výhodné výsledky sa silným meničom meničom aniónov, konkrétne uprednostňovaná náplň Source zvýšenú aniónov, náplňou

Q15.

a to s

Source funcionalizovaným

Q. Konkrétne je

Z tohto hľadiska sa predmet rekombinantných adenovírusov z vyznačenou tým, že zahrňuje anionomeničovou chromatografiou.

vynálezu biologického etapu purifikácie týka .purifikácie prostredia so silnou

Podlá tohto variantu biologické prostredie môže byť supernatant enkapsidačných buniek, ktoré produkujú uvedený vírus, lyzát enkapsidačných buniek, ktoré produkujú vírus . alebo roztok uvedeného prepurifikovaného vírusu.

Chromatografia je prednostne uskutočnená na nosiči, ktorý je funkcionalizovaný s kvartérnym aminom. Podlá uprednostňovaného spôsobu nosič sa vždy vyberá spomedzi agarózy, dextránu, akrylamidu, silikagély, poly[styrén/divinylbenzénu] , kopolyméru etylénglykolmetakrylátu, buď samotnými alebo v zmesi.

Predovšetkým výhodný je spôsob uskutočnenia, ktorý sa vyznačuje tým, že chromatografia je uskutočnená na silikagéli

Source Q, konkrétne Source Q15.

Postup ďalej opísaný je výhodne uskutočnený so supernatantom buniek, ktoré produkujú vírus a zahrňuje etapu predbežnej ultrafiltrácie. Táto etapa je výhodne uskutočnená pri skôr opísaných, podmienkach, konkrétne ide o tangenciálnu ultrafiltráciu na membráne, ktorá má velkosť medzi 300 až 500 kDa.

Podľa iného spôsobu uskutočnenia vynálezu sú vírusy získané a purifikované chromatografiou gélovou filtráciou.

Gélová filtrácia sa môže uskutočniť priamo na supernatante, na koncentráte, alebo na víruse pochádzajúcom z anionomeničovej chromatografie. V tejto etape sa môžu použiť uvedené nosiče pre anionomeničovú chromatografiu, ale bez funkcionalizácie.

Z tohto hľadiska uprednostňované nosiče sú agaróza (gély Sepharose), dextrán (gély Sephacryl, gély Trisacryl), silikagély (gély TSK-gél SW) , kopolymér etylénglykolmetakrylát (gély Toyopearl HW a TSK-gél PW), alebo zmesi (agaróza-dextrán: gél Superdex). Konkrétne uprednostňované nosiče sú:

-Superdex 200HR (Pharmacia)

-Sephacryl S-500HR, S-1000HR alebo S-2000 (Pharmacia)

-TSK G6000 PW (TosoHaas).

Uprednostňovaný postup podľa vynálezu zahrňuje teda ultrafiltráciu nasledovanú s anionomeničovou chromatografiou.

Iný variant vynálezu sa týka postupu purifikácie adenovirusu z biologického prostredia, ktorý zahrňuje prvú etapu ultracentrifugácie, druhú etapu dilúcie alebo dialýzy, a tretiu etapu anionomeničovej chromatografie. Podľa tohto variantu je prednostne prvá etapa uskutočnená s rýchlou ultracentrifugáciou v gradiente chloridu cézneho. Termín rýchla znamená ultracentrifugáciu nie dlhšiu ako 0,5 až 4 hodiny. V priebehu druhej etapy je vírus diluovaný a dialyzovaný proti pufru, aby sa uľahčila jeho nanesenie na chromatografický gél, a aby sa vylúčila ultracentrifugácia.

Tretia etapa je uskutočnená s použitím anionomeničovej chromatografie tak, ako je už opísané prednostne, silných aniónov.

V typickom pokuse z vírusu získaného zo supernatantu ' (alebo prípadne intracelulárne) prvá rýchla ultracentrifugácia je uskutočnená s chloridom céznym (ako je v príklade 3). Po jednoduchej dilúcii vzorky (napríklad desať objemov pufru) alebo po jednoduchej dialýze pufru, je vzorka chromatografovaná ionomeničovou chromatografiou (ako v príklade 5.1). Výhoda tohto variantu postupu podľa vynálezu spočíva v tom, že obsahuje dve úplné rozdielne separácie vírusu (denzita a povrchový náboj), ktoré môžu upraviť prípadne vírus na úroveň kvality, ktorá doplňuje technické údaje týchto dvoch metód. Etapa chromatografie okrem toho umožňuje súčasne vylúčiť prostredie použité na ultracentrifugáciu (napríklad chlorid cézny alebo každé iné prostredie zodpovedajúce prostrediam, ktoré sú uvedené) .

Iný predmet vynálezu sa týka použitia jodixanol,5,5'-[2hydroxy-1,3propandiyl]-bis(acetylamino)]-bis(acetylamono)bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo-l,3-benzenkarboxamid] na purifikáciu adenovirusu.

Na uskutočnenie postupu podľa vynálezu sa môžu použiť rôzne enkapsidačné bunky adenovirusu. Enkapsidačné bunky môžu byť konkrétne pripravené z rôznych farmaceutický použiteľných buniek, teda buniek kultivovateľných v prijateľných priemyselných podmienkach, ktoré nemajú patogénny charakter. Môže ísť o divé alebo primárne bunkové línie kultúr, konkrétne ľudské retinoblasty, bunky ľudského karcinómu pľúc alebo embryonálne bunky obličiek. Môže ísť výhodne o bunky ľudského pôvodu, ktoré sú infikovateľné adenovírusom. Z tohto hľadiska sa môžu uviesť bunky KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, HER, A549, HER, atď.

Bunky línie KB pochádzajú ž karcinómu ľudskej epidermy. Sú prístupné v ATCC (ref. CCL17) rovnako aj s podmienkami, ktoré umožňujú ich kultiváciu. Línie ľudských buniek Hela pochádzajú z karcinómu ľudského epitelu. Je tiež prístupná v ATCC (ref. CCL2) rovnako v podmienkach, ktoré umožňujú ich kultiváciu. Bunky línie 293 sú bunky obličiek ľudského embrya (Graham a koľ., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Táto línia obsahuje konkrétne vo svojom genóme zahrnutú ľavú časť genómu ľudského adenovirusu Ad5 (12%). Bunková línia gm DBP6 (Brough a koľ., Virology 190 (1992 624) je tvorená bunkami Hela, ktoré nesú gén E2 adenovirusu riadený s LTR MMTV.

Môže tiež ísť o bunky psieho pôvodu (BHK, MDCK, atď.) . Z tohto ' hľadiska sú uprednostňované psie bunky línie MDCK. Podmienky kultivácie buniek MDCK sú opísané konkrétne autormi Macatney a kol., Science 44 (1988) 9.

V literatúre sú opísané rôzne línie enkapsidačných buniek a sú uvedené v príkladoch. Ide konkrétne o bunky, ktoré transkomplementujú funkcie E1 a E4 alebo E1 a E2 adenovirusu. Tieto bunky sú prednostne odvodené z ľudských embryonálnych buniek obličiek alebo sietnice alebo karcinómu ľudských pľúc.

Vynález sa tiež týka najmä výhodného postupu prípravy rekombinantného adenovirusu. Tento postup je prispôsobený produkcii defektného rekombinantného vírusu v jednej alebo viac oblastiach a konkrétne vírusu, ktorý je defektný v oblasti E1 alebo v oblasti E1 a E4. Inak je tento postup aplikovateľný na prípravu adenovírusov rôznych sérotypov takých, ako sú už naznačené.

Konkrétne podľa výhodného spôsobu uskutočnenia postup vynálezu je použitie na prípravu rekombinantného adenovirusu, v ktorom oblasť E1 je neaktívna deléciou fragmentu PvuII-BglII, ktorý sa nachádza od nukleotidu 454 po nukleotid 3328, na sekvencii adenovírusu Ad5. Táto sekvencia je uvedená v literatúre a tiež na základe dát (pozri konkrétne Genebank No. M73260) . V inom uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia je oblasť E1 inaktivovaná deléciou fragmentu HinfII-Sau3A, ktorý sa rozkladá od nukleotidu 382 po nukleotid 3446. V zvláštnom spôsobe postupu umožňuje prípravu vektorov, ktoré obsahujú úplnú deléciu oblasti E4. Toto sa môže uskutočniť odstránením fragmentu Maell-MscI, ktorý zodpovedá nukleotidom 35835-32720. V inom zvláštnom spôsobe postupu je deletovaná samotná funkčná časť E4. Táto časť obsahuje minimálne čítacie rámce ORF3 a ORF6. Tieto kódované fázy genómu napríklad sa môžu deletovať vo forme fragmentov PvuII-AluI a BglII-PvuII, ktoré zodpovedajú nukleotidom 34801-34329 a 34115-33126. V rámci predloženého vynálezu sa môžu tiež použiť také delécie oblasti E4 vírusu Ad2 dl808 alebo vírusu Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOll alebo Ad5 dll014. Z tohto hľadiska sú konkrétne výhodné bunky na prípravu vírusu, ktorý obsahuje neaktívnu oblasť E1 a deléciu v oblasti E4 tohto typu' prítomného v genóme Ad5 dl'1014, teda vírusu E4-, ktorý zachováva čítací rámec ORF4.

Ako sa už uviedlo, delécia v oblasti E1 zahrňuje výhodne celok alebo časť E1A a E1B. Táto delécia musí byť dostatočná na to, aby vírus nebol schopný autonómne sa replikovať v bunke. Časť oblasti E1 deletovaná v adenovíruse podlá vynálezu pokrýva výhodne nukleotidy 454-3328 alebo 382-3446.

Ďalej uvedené pozície odkazujú na sekvenciu divého adenovírusu Ad5 takého, aký je publikovaný a prijatý na danom základe. Aj keď menšie varianty musia existovať medzi rôznymi sérotypmi adenovírusu, tieto polohy sú všeobecne aplikovateľné na konštrukciu rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu od každého sérotypu a konkrétne adenovírusu Ad2 a Ad7.

Vytvorené adenovírusy môžu mať ďalšie alternatívy na úrovni ich genómu. Môžu sa deletovať ďalšie oblasti na zvýšenie schopnosti vírusu a zníženie vedľajších účinkov spojených s expresiou vírusových génov. Deletovať sa môže konkrétne celok alebo časť oblasti E3 alebo IVa2. Čo sa týka oblasti E3, môže sa konkrétne zachovať oblasť kódujúca proteín gol9K. Tento proteín umožňuje vyhnúť sa tomu, aby adenovírusový vektor bol predmetom imunitnej reakcie, ktorá (i) obmedzuje jeho účinok a (ii) by mohla mať nežiaduci sekundárny účinok. Podlá spôsobu uskutočnenia oblasť E3 je deletovaná a sekvencia kódujúca proteín gpl9k je znovu vložená pod kontrolu heterologického promótora.

Ako sa už uviedlo, adenovírusy obsahujú vektory prenosu génov velmi účinných na aplikácie v génovej a bunkovej terapii. Preto heterologické sekvencie nukleových kyselín, ktorých prenos alebo expresia v bunke, orgánu alebo organizmmu je skúmaná a môže sa vložiť do ich genómu. Táto sekvencia môže zahrňovať jednu alebo viac terapeutických génov takých, ako je gén, ktorého transkripcia a prípadne translácia v cieľovej bunke vytvárajú produkty, ktoré majú terapeutický účinok. Z terapeutických produktov sa môžu uviesť konkrétne enzýmy, krvné -deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF,

I atď. (FR 9203120), rastové faktory alebo ich prekurzory alebo enzýmy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGFG, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atď., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (FR 93 05125), dystrofín alebo minidystrofin (FR 91 11947), gény supresorov tumorov: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atď. (WO94/24297), gény kódujúce faktory zahrnuté do koagulácie: Faktor VII, VIII, IX, atď., sebevražedné gény: tymidínkináza, cytozíndeamináza, atď. alebo tiež celok alebo časť prirodzeného alebo umelého imunoglobulínu (Fab, ScFv, atď. WO94/29446) , atď. Terapeutický gén môže byť gén alebo antisense sekvencia, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo transkripciu bunkovej mRNA. Tieto sekvencie sa môžu napríklad transkribovať v cieľovej bunke v RNA komplementárnej mRNA bunkovej a blokovať tak ich transláciu v proteíne podľa technik opísaných v EP 140 308. Terapeutický gén môže byť tiež gén kódujúci antigénny peptid schopný tvoriť u ľudí imunitnú odpoveď z pohľadu vakcínovej realizácie. Môže ísť konkrétne o špecifické antigénne peptidy vírusu Epstein-Barrovej, vírusu

HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírus pseudobesnoty alebo tiež nádorový vírus (EP 259 212) .

Heterologické sekvencie nukleových kyselín obsahuje konkrétne oblasť promótora transkripcie funkčnú v infikovanej bunke, rovnako ako oblasť umiestnenú na 3' konci génu záujmu, ktorý špecifikuje signál terminácie transkripcie a miesto polyadenylácie. Tieto elementy spolu tvoria kazetu expresie. Čo sa týka oblasti promótora, môže ísť o oblasť promótora prirodzene zodpovedného za expresiu požadovaného génu, keď tento je schopný fungovať v infikovanej bunke. Môže ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo rovnakých syntetických. Konkrétne môže ísť o sekvencie promótorov eukaryotických alebo vírusových génov alebo o každú sekvenciu promótora alebo odvodenú, ktorá stimuluje alebo potláča transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, indukovatelne alebo neindukovateľne. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov získaných z genómu bunky, ktorá sa požaduje infikovať alebo genómu vírusu, konkrétne ide o promótory génov EA1, MLP adenovírusu, promótor CMV, LRT-RSV, atď. Z eukaryotických promótorov sa môžu použiť konkrétne ubikvitínové promótory (HPRT, vimentín, α-aktín, tubulín, atď.), promótory stredných filamentov (GFAP, desmín, neurofilament, keratín, atď.), promótory terapeutických génov (typ MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI, atď.), promótory špecifických tkanív (pyruvátkináza, vilín, väzbový črevný protein mastných kyselín, a-aktín hladkého svalstva, špecifický promótor pre pečeň; ApoAI, ApoAII, ľudský albumín, atď.) alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej, atď.). Okrem toho tieto sekvencie expresie sa môžu modifikovať adíciou aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií alebo sekvencií umožňujúcich expresiu tkanivovo špecifickú alebo majoritnú. Inak, ak vložená nukleová kyselina neobsahuje sekvencie expresie, môže sa vložiť do genómu defektného vírusu v smere takejto sekvencie.

Heterologické sekvencie nukleových kyselín môžu tiež zahrňovať konkrétne signálnu sekvenciu proti smeru terapeutického génu, ktorá riadi terapeutický produkt syntetizovaný v sekrečných dráhach cieľovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť prirodzená signálna sekvencia terapeutického produktu, ale môže ísť tiež o každú inú funkčnú signálnu sekvenciu alebo o umelú signálnu sekvenciu.

i

Expresná kazeta terapeutického génu môže byť vložená do rôznych miest genómu rekombinantného adenovírusu podľa technik opísaných vo vedľajších odboroch. Môže sa vložiť predovšetkým na úrovni delécie El. Môže sa tiež vložiť na úrovni oblasti E3 s pridaním alebo substitúciou sekvencii. Môže sa tiež umiestniť na úrovni deletovanej oblasti E4.

Predložený vynález sa tiež týka vírusových preparátov purifikovaných a získaných podľa postupu vynálezu, rovnako ako každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň jeden alebo viac defektných rekombinantných adenovirusov pripravených podlá tohto postupu. Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa môžu formulovať z pohľadu podávania a to orálne, parenterálne, i

intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné,· intraokulárne, atď. .

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu obsahuje vhodný farmaceutický nosič pre injikovatelnú formu. Môže ísť konkrétne o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď. alebo zmes týchto soli), sterilné, izotonické alebo kompozície suché konkrétne lyofilizované, ktoré po prídavku, podľa prípadu, sterilizovanej vody alebo fyziologického séra umožňujú injikovatelnú formu kompozície. Môžu sa tiež použiť ďalšie nosiče ako napríklad hydrogél. Tento hydrogél sa môže pripraviť z každého polyméru (homo alebo heteropolyméru) biokompatibilného a necytotoxického. Tieto polyméry boli napríklad opísané v patentovej prihláške WO93/08845. Niektoré z nich ako napríklad tie, ktoré sú získané z etylén oxidu alebo propylén oxidu sú komerčné. Dávka vektora použitá na injekciu sa môže prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne použitému spôsobu podávania, patológii, génu určeného na expresiu alebo tiež dĺžke liečenia. Všeobecne rekombinantné adenovirusy podľa vynálezu sú formulované a podávané vo forme dávok, ktoré obsahujú medzi 10⁴ až 10¹⁴ pfu/ml, konkrétne 10⁶ až 1O¹⁰ pfu/ml. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti roztoku adenovírusu a je určený infekciou určitej bunkovej kultúry a následným meraním po 15 dňoch počtom plakov infikovaných buniek. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú dobre opísané v odbornej literatúre.

Podľa terapeutického génu vírusy takto produkované sa môžu použiť na liečenie alebo prevenciu radu patológií, ktoré zahrňujú genetické ochorenia (dystrofia, cystická fibróza, atď.), neurodegeneratívne ochorenia (Alzheimer, Parkinson, ALS, atď.), rakoviny, patológie spojené s deorganizáciou koagulácie alebo s dyslipoproteinémiou, patológie spojené s vírusovou infekciou (hepatitída, AIDS, atď.), atď..

Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, pričom v žiadnom smere neobmedzujú jeho rozsah.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Štúdium stability adenovírusu purifikovaného podľa príkladu 4.

Obrázok 2: HPLC analýza (reverzná fáza) adenovírusu purifikovaného podľa príkladu 4. Porovnanie s adenovírusom podľa príkladu 3.

Obrázok 3: Kinetika uvoľňovania adenovírusu Ad-pGal do supernatantu buniek 293, meraná semikvantitatívnou PCR ' a s Plaque Assay.

Obrázok 4: Profil elúcie na Source Q15 supernatantu ultrafiltrovaného adenovírusu (príklad 5.1).

Obrázok 5: HPLC analýza na Resource Q signálu získaného vírusu chromatografiou na náplni Source Q15 supernatantu ultrafiltrovaného adenovírusu (príklad 5.1).

Obrázok 6: (A) Profil elúcie na náplni Source Q15 supernatantu adenovírusu Ad-APOAl ultrafiltrovaného (príklad

5.3) ; a (B) HPLC analýza (Resource Q) signálu získaného vírusu.

Obrázok 7: (A) Profil elúcie na náplni Source Q15 supernatantu adenovírusu Ad-TK ultrafiltrovaného (príklad 5.3). HPLC artalýza (Resource Q) z rôznych frakcií (začiatok a koniec signálu) získaných vírusov: (B) Frakcia F2, stred signálu; (C) frakcia F3, okraj signálu; (D) frakcia F4 koniec signálu.

Obrázok 8: Profil elúcie na náplni MonoQ koncentrátu supernatantu bunkovej kultúry produkujúcej adenovirus (príklad

5.4) . BG25F1: Infikovaný a koncentrovaný supernatant.

Obrázok 9: Profil elúcie na géli POROS HQ koncentrátu supernatantu bunkovej kultúry produkujúcej adenovirus (príklad

5.4). BG25F1: koncentrovaný supernatant vírusu a purifikovaný na céziu.

Obrázok 10: Profil purifikácie s gélovou filtráciou na Sephacryl SlOOOHR/Superdex 200 HR supernatantu ultrafiltrovaného adenovírusu (príklad 6).

Obrázok 11: Analýza elektrónovým mikroskopom adenovírusu purifikovaného podľa vynálezu.

Obrázok 12: Analýza elektrónovým mikroskopom vírusového pásu s denzitou 1,27.

Všeobecné techniky molekulovej biológie

Klasické metódy používané v molekulovej biológii, ako sú preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza v agarózových géloch alebo akrylamide, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo zmesou fenol/ chloroform, zrážanie DNA v prostredí slaného etanolu alebo izopropanolom, transformácia E. coli, atď., sú dobre známe odborníkom a sú opísané v odbornej literatúre (Maniatis a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982, Ausubel a kol. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 1987) .

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratories). Na ligáciu sa môžu fragmenty DNA rozdeliť na základe veľkosti elektroforézou v agarózových alebo akrylamidových géloch, extrahovať fenolom alebo zmesou fenol/chloroform, zrážať s etanolom a inkubovať v prítomnosti DNA ligázy fága T4 (Biolabs) podľa odporučenia dodávateľa. Doplnenie prečnievajúcich 5' koncov sa môže uskutočniť s Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I E. coli (Biolabs) podľa odporučenia dodávateľa. Odstránenie prečnievajúcich 3' koncov sa uskutočnilo v prítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Biolabs) použitej podľa odporučenia výrobcu. Odstránenie prečnievajúcich 5' koncov sa uskutočnilo opracovaním zmesi SI nukleázou.

Riadená mutagenéza in vitro syntetickými oligonukleotidmi sa môže uskutočniť podľa metódy vyvinutej Taylorom a kol. (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) s použitím súpravy firmy Amersham. Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. a Faallona F.

A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335-350 sa môže uskutočniť s použitím DNA termocyklera (Perkin Elmer Cetus) podľa odporučenia výrobcu. Overenie nukleotidových sekvencii sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Sangerom a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) s použitím súpravy firmy Amersham.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1:

Bunková enkapsidačná línia

Enkapsidačné bunky použité v rámci vynálezu môžu pochádzať z každej bunkovej línie infikovateľnej adenovírusom zlúčiteľným s použitím v terapeutickej oblasti. Ide konkrétne o bunky vybrané z nasledovných línii:

. - bunková línia 293:

Línia 293 je línia embryonálnych ľudských obličiek, obsahujúca ľavý koniec (asi 11-12%) genómu adenovírusu sérotyp 5 Ad5, obsahujúci ľavú ITR, oblasť enkapsidácie, oblasť El, obsahujúcu E1A, E1B, oblasť kódujúcu proteín pIX a časť oblasti kódujúcu proteín pIVa2 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Táto línia je schopná transkomplementovať defektný rekombinantný adenovírus v oblasti El, teda stratený celok alebo časť tejto oblasti El, a produkovať množstvo vírusu, ktorý má zvýšené hodnoty.

- bunková línia A549:

Bunky doplňujúce oblasť El adenovírusu sa skonštruovali z buniek A549 (Imler a kol., Gene Ther. (1996) 75). Tieto bunky obsahujú fragment zasahujúci oblasť El, ktorá má odstránenú ľavú ITR umiestnená pod kontrolou indukovateľného promótora.

- bunková línia HER

Embryonálne bunky ľudských obličiek (HER) sa môžu infikovať adenovírusom (Byrd a kol., Oncogene 2 (1988) 477). Enkapsidačné bunky adenovírusu pripravené z týchto buniek sú opísanénapríklad v prihláške vynálezu WO94/28153 alebo v článku autorov Fallaux a kol. (Hum. Gene Ther. (1996) 215). Môže sa uviesť konkrétne línia 911 obsahujúca oblasť El genómu adenovírusu AD5, od nukleotidu 70 po nukleotid 5789 nachádzajúci sa v genóme buniek HER. Táto bunková línia umožňuje produkciu vírusu defektného v oblasti El.

- bunky IGRP2

Bunky IGRP2 sú bunky získané z buniek 293 vložením funkčnej jednotky oblasti E4 pod kontrolou indukovatelného promótora. Tieto bunky umožňujú tvorbu defektných vírusov v oblasti El a E4 (Yeh a kol., J. Virol. (1996) 70).

- bunky VK

Bunky VK (VK2-20 a VK10-9) sú bunky získané z buniek 293 vložením celej oblasti E4 pod kontrolou indukovatelného promótora a oblasti kódujúcej protein pIX. Tieto bunky umožňujú tvorbu defektných vírusov v oblasti El a E4 (Krougliak a kol., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575).

- bunky 293E4

Bunky 293E4 sú bunky získané z buniek 293 včlenením celej oblasti E4. Tieto bunky umožňujú tvorbu ...defektných vírusov v oblasti El a E4 (WO94/02697; Cancer Gene Thér. (1995) 322).

Príklad 2:

Použité vírusy

Produkované vírusy v rámci príkladov, ktoré nasledujú, sú adenovírusy obsahujúce markerový gén LacZ E. coli (Ad-pGal), adenovírus obsahujúci gén kódujúci tymidínkinázu herpes vírusu typ I (Ad-TK), adenovírus kódujúci supresorový protein ľudského tumoru p53 a vírus kódujúci apolipoproteín Al (Ad-poAI). Tieto vírusy sú odvodené zo sérotypu Ad5 a majú nasledovnú štruktúru:

delécia v oblasti El, ktorá zahrňuje nukleotidy 382 (miesto Hinfl) až 3446 (miesto Sau3A).

- kazeta expresie génu pod kontrolou promótora RSV alebo CMV vloženou na úrovni vyššie uvedenej delécie.

delécia oblasti E3.

.

Konštrukcia týchto vírusov je opísaná v literatúre (WO94/25073, WO95/14102, FR 95.01632, Stratford-Pérricaudet a kol., J. Clin. Invest (1992) p626) . Očakáva sa, že sa môže pripraviť akákoľvek iná konštrukcia podľa postupu vynálezu, konkrétne vírus nesúci heterologické gény alebo ďalšie delécie (napríklad E1/E4 alebo EÍ/E2).

Príklad 3:

Produkcia vírusu lýzou buniek

Tento príklad opisuje staršiu techniku prípravy vírusu spočívajúcu v lýze enkapsidačných buniek na získanie produkovaného vírusu.

Bunky 293 sú infikované na 80-90% v kultivačnej miske so zásobou vírusu Ad-pGal alebo Ad-TK (príklad 2) v pomere 3 až 5 vírusov na bunku (Multiplicity of Infection MOI = 3 až 5) . Dĺžka inkubácie sa pohybuje od 40 do 72 hodín a čas¹ zberu je určený pozorovaním buniek v mikroskope, bunky ktoré zaguľatili, sa stanú lámavejšie a priliehajú slabšie a slabšie k nosiču. V literatúre kinetika cyklu vírusu trvá do 24 do 36 hodín.

Na laboratórnej úrovni prípravy je dôležité zbierať bunky skôr ako sa oddelia, aby sa vylúčila infekcia kultivačného prostredia v čase zberu bez straty buniek a potom ich vrátiť do minimálneho objemu (koncentračný faktor sa riadi podľa veľkosti kultúry, t. j. medzi 10 až 100 násobkom).

Vírus sa teda uvoľní z jadra tromi až šiestimi cyklami postupného rozmrazovania (etanol - suchý ľad až -70 °C, teplota kúpeľa 37 °C).

Získaný bunkový lyzát sa potom odstredí pri rýchlosti 2000 až 4000 rpm a supernatant (čistý bunkový lyzát) sa potom purifikuje ultracentrifugáciou v gradiente chloridu cézneho v dvoch etapách:

- prvá rýchla ultracentrifugácia 1,5 hodiny pri 35000 rpm, rotor SW 41, v dvoch vrstvách cézia 1,25 a 1,40 zaisťujúcich denzitu vírusu (1,34) tak, aby prebehla separácia proteínov vírusu z prostredia; rotory môžu byť rotory swinging (Sw28,

Sw41 Beckman) alebo s fixným uhlom (Ti45, Ti70, TÍ70.1 Beckman) podlá použitého objemu;

- druhá ultracentrifugácia v dlhšom gradiente (od 10 do 40 hodín podía použitého rotora) napríklad 18 hodin> pri 35000 rpm v rotore SW 41, ktorá spočíva v pravej a jedinečnej purifikácii vírusu. Vírus sa nachádza v lineárnom gradiente s rovnováhou k denzite 1,34.

V tejto etape je pruh vírusu majoritný. Napriek tomu sa pozorovali dva tenké pruhy s menšou denzitou, ktorých pozorovanie v elektrónovom mikroskope ukázalo, že ide o prázdny alebo rozbitý vírus a pruh s menšou denzitou je tvorený vírusovými podjednotkami (pentony, hexony).. Po tejto etape je vírus získaný z nádobky punkciou pomocou ihly a cézium sa odstráni dialýzou alebo odsolenim na géli.

Príklad 4:

Príprava vírusu zo supernatantu

Tento príklad opisuje pokus prípravy vírusu získaním po spontánnom uvoľnení. Vírus sa potom získa ultracentrifugáciou purifikáciou v chloride céznom.

4.1. Protokol

V tejto metóde, na rozdiel od príkladu 3, sa bunky nezbierajú po 40 až 72 hodinách, ale inkubácia sa predĺži na 8 až 12 dní, aby sa získala úplná lýza buniek, a aby sa vylúčili cykly zmrazovania a rozmrazovania. Vírus sa získa zo supernatantu.

Supernatant je teda čistený filtráciou na filtroch so znižujúcou sa veľkosťou pórov (10 μτη/ 1,0 μιη / 0,8-0,2 μτη) .

Vírus má veľkosť 0,1 gm a v tejto etape sa nepozoruje žiadna strata tohto vírus zadržaním na filtri s najmenšou pórovitosťou (0,22 gm) . Supernatant, ktorý sa raz čistí, sa potom koncentruje tangenciálnou ultrafiltráciou na špirálovej membráne Millipore, ktorá má veľkosť 300 kDa.

V príkladoch uvedených v predloženom vynáleze koncentračný faktor je daný mŕtvym objemom systému, ktorý je 100 ml. Objemy supernatantu od 4 do 20 litrov sa koncentrovali týmto systémom, ktorý umožňuje získať objemy koncentrátu od 100 do 200 ml bez väčších ťažkostí, čo zodpovedá koncentračnému faktoru od 20 do 100 násobku.

Koncentrát sa potom purifikuje odstreďovaním v chloride céznom, ako je opísané v príklade 3, a následnou etapou dialýzy.

4.2. Výsledky

Čistota

Zatiaľ čo skúmavka s intracelulárnym vírusom (príklad 3) predstavuje problém so zrazeninou (lipidy, proteíny), ktorá niekedy dosahuje pruh vírusu, vírusový prípravok získaný po prvej etape centrifugácie v chloride céznom, postupom podľa vynálezu, predstavuje pruh vírusu už dobre izolovaný od kontaminantov kultivačnej pôdy, ktoré ostávajú v hornej fáze. HPLC analýza na kolóne Resource Q (príklad 5) .ukazuje tiež tento stupeň čistoty produktu na začiatku získaného ultrafiltráciou

I infikovaného supernatantu so zníženým množstvom kontaminantov nukleových kyselín (pomer DO 260/280 väčší alebo rovný 1,8) a proteíny (pomer DO 260/280 nižší ako 1) .

Stabilita vírusu v supernatante pri teplote 37 °C:

Stabilita vírusu sa určila titračnou metódou plaque assay supernatantu bunkovej kultúry, ktorého časť sa odoberala v rôznych časových intervaloch inkubácie pri 37 °C po infekcii. Výsledky sú uvedené ďalej:

Vírus Ad-TK:

-titer 10 dni po infekcii = 3,5 x 10⁸ pfu/rnl

-titer 20 dní po infekcii = 3,3 x 10⁸ pfu/rnl

Vírus Ad-PGal:

-titer 8 dní po infekcii = 5,8 x 10⁸ pfu/ml

-titer 9 dní po infekcii = 3,6 x 10⁸ pfu/ml

-titer 10 dni po infekcii = 3,5 x 10⁸ pfu/ml

-titer 13 dní po infekcii = 4,1 x 10⁸ pfu/ml

-titer 16 dní po infekcii = 5,5 x 10⁸ pfu/ml

Získané výsledky ukazujú, že dokonca až 20 dni po infekcii je titer supernatantu stabilný v presných medziach dávky. Obrázok 1 ukazuje, že v elučnom pufri je vírus stabilný aspoň 8 mesiacov pri -80 °C rovnako ako pri -20 °C.

Špecifická infekcia preparátov

Parameter zodpovedajúci pomeru počtu vírusových častíc, meraných pomocou HPLC, k počtu pfu dáva infekčnú schopnosť vírusového prípravku. Podľa odporučenia FDA musí byť táto hodnota nižšia ako 100. Tento parameter sa meral nasledovne: Dve série nádobiek, ktoré obsahujú kultúru buniek 293 sa infikovali súčasne v rovnakom čase s rovnakým množstvom vírusu za rovnakých podmienok. Tento pokus sa uskutočnil pre rekombinantný adenovirus Ad-PGal, potom sa opakoval pre adenovírus Ad-TK. Pre každý adenovírus sa séria získala po 48 hodinách po infekcii a pozorovala sa ako produkt intracelulárneho vírusu purifikovaného v gradiente cézia po zmrazení a rozmrazení. Druhá séria sa inkubovala 10 dní po infekcii a vírus sa získal zo supernatantu. Získané purifikované prípravky sa titrovali plaque assay a kvantifikácia úplného počtu vírusových častíc sa určila meraním koncentrácie proteinu PVII HPLC analýzou na priamej fáze na kolóne C4 Vydac 4.6 x 50 mm po denaturácii vzorky v 6,4 M guanidíne. Množstvo proteínov PVII korelovalo s počtom vírusových častíc skúmaných 720 kópií PVII na vírus (Horwitz, Virology, second edition (1990)). Táto metóda je korelovaná s počtom vírusových častíc k prípravku, ktorý je purifikovaný denzitometricky pri 260 nm pre koeficient špecifickej extinkcie 1.0 jednotky absorbancie = 1,1 x 10¹² častíc na ml.

Získané výsledky ukazujú, že pre vírus Ad-pGal je tento pomer 16 pre vírus supernatantu a 45 pre intracelulárny vírus. Pre vírus Ad-TK je pomer 78 v prípade zberu metódou supernatantovou a 80 pre vírus získaný metódou intracelulárnou.

Analýza elektrónovým mikroskopom

Táto metóda umožňuje zistiť prítomnosť prázdnych častíc alebo voľných vírusových podjednotiek spoločne purifikovaných a tiež umožňuje posúdiť proteínovú kontamináciu purifikovaných vírusových prípravkov alebo prítomnosť nedisociovaných agregátov vírusových častíc.

Protokol: 20 μΐ vzorky sa uložilo na uhlíkovú misku, potom sa pridal uranylacetát na pozorovanie negatívneho sfarbenia do koncentrácie 1,5%. Na pozorovanie sa používa elektrónový mikroskop Jeol 1010 od 50 až 100 kV.

Výsledok: Analýza uskutočnená na víruse pozbieranom zo supernatantu ukazuje čistý preparát bez kontaminantov, bez agregátov a bez prázdnych vírusových častíc. Je možné rozlíšiť vlákna vírusov, rovnako ako ich správnu geometrickú štruktúru. Tieto výsledky potvrdzujú vysokú kvalitu, vírusových ,častíc podľa vynálezu.

Analýza proteínového profilu metódou HPLC a SDS PAGE:

Analýza SDS PAGE μΐ vzorky sa riedilo s pufrom Laemmli (Náture .227 (1970) 680-685), redukovalo 5 minút pri teplote 95 °C, potom sa nanieslo na gély Novex 1 mm x 10 jamiek s gradientom 4 - 20%. Po migrácii sa gély farbili s Coomasie Blue a analyzovali na pomocou Image Master VDS Pharmacia. Analýza dáva elektroforetický profil pre vírus zozbieraný zo supernatantu, ktorý je v zhode s údajmi z literatúry (Lennart Philipson, 1984

H. S. Ginsberg editors, Plénum Press, 310-338).

Analýza HPLC reverznou fázou

Obrázok 2 ukazuje superpoziciu 3 chromatogramov získaných z dvoch vzoriek vírusu zozbieraného intracelulárne a jedného zo vzorky vírusu purifikovaného metódou supernatantu. Podmienky pokusu sú nasledovné: kolóna Vydac ref 254 Tp 5405, RPC 4,6 x 50 mm, roztok A: H2O + 0,07% TFA; roztok B: CH3CN + 0,07% TFA, lineárny gradient: T = 0 min %B = 25; T = 25 min %B = 50; prietok 1 ml/min, detektor 215 nm. Chromatogramy ukazujú úplnú identitu medzi vzorkami bez rozdielu v relatívnej intenzite každého signálu. Povaha každého signálu sa určila sekvenovaním a dokázaním, že prítomné proteíny sú všetky vírusového pôvodu (pozri nasledujúcu tabuľku).

Peak (min)	Identifikácia
19-20	prekurzor PVII
21-22	prekurzor PVII; prekurzor XI a 12
27-28	prekurzor PVI; prekurzor PX
32-33	prekurzor PX
34
35-36	zrelý PVII
37	zrelý PVII; prekurzor PVIII
39-41	zrelý PVI
45	pX
46	pX

Analýza in vitro účinku translácie a cytotoxicity

Uskutočnila sa analýza cytotoxicity, keď sa infikovali bunky HCT116 na plaku s 24 jamkami pre rastúcu MOI a určilo sa percento živých buniek vzhľadom na neinfikovanú kontrolu 2 a 5 dní po infekcii pomocou techník farbenia kryštálovou fialovou.

Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

adenovírus	MOI=3,0	MOI=10,0	MOI=30,0	MOI=100,0
supernatant, J2	97%	96%	87%	89%
supernatant, J5	97%	90%	10%	<5%

Analýza účinku translácie

Pre adenovírus Ad-QGal účinok transdukcie prípravku sa určil pri infekcii buniek W162. neumožňujúcich replikáciu, kultivovaných na plaku s 24 jamkami s rastúcou koncentráciou vírusových častíc. Na rovnaké množstvo kontrolných vírusových častíc sa počítajú 48 hodín po infekcii bunky s βgalaktozidázovou aktivitou po inkubácii s X-gal ako substrátom. Každá modrá buka je počítaná ako jednotka transdukcie (TDU), výsledok sa násobí riedením roztoku, aby sa získala koncentrácia v jednotkách transdukcie vzorky. Účinnosť transdukcie sa potom vyjadrí, keď sa urobí pomer koncentrácie vírusových častíc ku koncentrácii v TDU. Získané výsledky ukazujú, že purifikovaný vírus má dobrý účinok transdukcie in vitro.

Analýza expresie intracerebrálne in vivo

Aby sa zvýšila účinnosť adenovírusu podľa vynálezu na prenos a expresiu génov in vivo, adenovírusy sa injikovali stereotakticky do časti mozgu imunokompetentných myší 0F1. Injikovali sa preto objemy 1 μΐ po 10‘ pfu vírusu so stereotaktickým označením nasledovne (pre rezný pruh 0 mm) : predozadný +0,5; strednopostranný: 2; hĺbka: -3,5.

Mozgy sa analyzovali 7 dní po injekcii. Získané výsledky ukazujú, že účinok transdukcie je vysoký: tisíce transdukovaných buniek, expresia v jadre velmi intenzívna, častá a intenzívna difúzia do cytoplazmy.

4.3. Kinetika uvoľňovania vírusu

Tento príklad opisuje štúdiu kinetiky uvoľnenia adenovírusu do supernatantu kultúry enkapsidačných buniek.

Táto štúdia sa uskutočnila semikvantitatívnou metódou PCR pomocou oligonukleotidov komplementárnej oblasti genómu adenovírusu. Z tohto hľadiska lineárna vírusová DNA (1-10 ng) sa inkubovala v prítomnosti dXTP (2 μΐ, lOmM), dvojice špecifických oligonukleotidov a Taq polymerázy (Cetus) v pufri lOxPXR počas 30 cyklov amplifikácie pri nasledovných podmienkach: 2 min pri 91 °C, 30 cyklov (1 min pri 91 °C, 2 min pri teplote okolia, 3 min pri 72 °C), 5 min pri 72 ^qC a 4 °C. Pokusy sa uskutočnili s nasledovnými dvojicami oligonukleotidov:

- dvojica 1:

TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT (6368) - SEQ ID NO: 1

ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA (6369) - SEQ ID NO: 2

- dvojica 2:

TTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGG (6362) - SEQ ID NO:3

CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA (6363) - SEQ ID NO:4

- dvojica 3:

TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGT (6364) - SEQ ID NO:5

AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA (6365) - SEQ ID NO:6

- dvojica 4:

GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG (6366) - SEQ ID NO: 7

AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT (6367) - SEQ ID NO: 8

Množstvo uvoľneného adenovírus do supernatantu sa určilo v supernatante buniek 293 infikovaných s Ad-PGal v rôznych časových intervaloch po infekcii. Získané výsledky sú uvedené na obrázku

3. Ukazujú, že uvoľňovanie buniek začína od 5. alebo 6. dňa po infekcii.

Očakáva sa, že každá ďalšia technika určenia množstva sa môže použiť s rovnakým cieľom na každej ďalšej enkapsidačnej línii a pre všetky typy adenovírusov.

Príklad 5:

Purifikácia vírusu ultrafiltráciou a ionomeničom

Tento príklad opisuje, ako adenovírus získaný z koncentrátu, sa môže purifikovať priamo a v jednej etape ionomeničovej chromatografie s veľmi dobrým výťažkom.

5.1. Protokol

V tomto príklade východiskový materiál je tvorený koncentrátom (alebo sedimentom ultrafiltrácie) a je opísaný v príklade 4. Sediment má úplný obsah proteínov medzi 5 až 50 mg/ml, predovšetkým medzi 10 až 30 mg/ml v pufri PBS (lOmM fosfátový pufor, pH 7,2, ktorý obsahuje 150mM NaCl).

Supernatant ultrafiltrácie získaný z vírusového prípravku je injikovaný na kolónu obsahujúcu Source Q 15 (Pharmacia) ekvilibrovanú v pufri 50mM Tris/HCl, pH 8,0 obsahujúcom 250mM NaCl, l,0mM MgC12 a 10% glycerol (pufor A). Po prepláchnutí s 10 objemami kolóny pufrom A sa adsorbované vzorky eluovali s lineárnym gradientom NaCl (od 250mM do IM) s 25 objemami kolóny pri lineárnom prietoku 60 až 300ml/h, konkrétne pri 12 ml/h. Profil typickej elúcie získaný pri 260 nm je uvedený na obrázku

4. Frakcie, ktoré obsahujú vírusové Zodpovedajú koncu symetrického signálu, súhlasí s retenčným časom získaným s častice sa spojili, ktorého retenčný čas preparátom vírusových častíc purifikovaných ultracentrifugáciou. Je možné injikovať pri podmienkach opísaných ďalej minimálne 30 mg úplných proteínov na ml náplne Source Q 15 pri zachovaní dobrého delenia signálov vírusových častíc.

V reprezentatívnom príklade uskutočnenom s prípravkom adenovírusu Ad-pGal (Príklad 2) sa 12,6 mg úplných proteínov injikovalo na kolónu Resource Q (1 ml), napríklad 5 x 1O¹⁰ PFU a 1,6 x 1O¹⁰ TDU. Signál vírusových častíc spojených po chromatografii (3,2 ml; Obrázok 5) obsahuje 173 gg proteínov a

3,2 x 1O¹⁰ PFU a 2,3 x 1O¹⁰ TDU. Vírusové častice sa teda purifikovali 70 krát (v množstve proteínov) a výťažok je 64% v PFU a 142% v TDU (pozri nasledovnú tabuľku).

etapy	koncentrácia vzorky	objemy	získané objemy	výťažky	faktor purifikácie
superna- tant		5000 ml	5000 ml	100%	-
ultra- filtrácia 300 kDa	proteíny: 6,3 mg/ml PFU: 2,5 x 1O10/ ml TDU: 8,1 x 109/ml častice 3,8 x 1011/ml podiel/pfu: 16,0 podiel/tdu: 47,0	5000mi	200ml 1	100%	5

purifiká-	PFU: 1,1	x	2,0 ml	3,0 ml	proteíny	70
cia	1010/ml		koncen-	eluátu	=85%
ionomeni-			trátu		PFU=64%
TDU: 7,2 109/ml	x
čová
TDU=140%
(jedna
etapa)	častice 2, 1011/ml	0 x			častice= 84%
	podiel/pfu:	20			HPLC
	podiel/tdu:	27			čistota^
					98,4%
gradient	PFU: 1,0	x	28,3 ml	QSP 4,1	PFU=66%	70
CsCl	lO^/ml		koncen-	ml	TDU=130%
	TDU: 7,5 1010/ml	x	trátu		častice= 84%
	častice 2,	2 x			HPLC
	1012/ml .				čistota=
	podiel/pfu:	22			98,4%
	podiel/tdu:	29

5.2. Čistota

Po tejto etape purifikácie zozbierané frakcie majú čistotu >98% vírusových častíc (UV detekcia pri 260 nm) pri analýze s vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na kolóne Resource Q (1 ml) v nasledujúcom chromatografickom systéme: 10 μΐ chromatograficky purifikovanej frakcie ako je opísané v Príklade

5.1 sa injikuje na kolónu Resource Q15 (A ml gélu; Pharmacia) ekvilibrovanú v pufri 50mM Tris/HCl pH 8,0 (pufor B). Po prepláchnuti s 5 ml pufru B sa adsorbovaná vzorka eluovala s lineárnym fragmentom 30 ml NaCl (0 až IM) v pufri B pri prietoku lml/min. Eluované vzorky sa detegovali pri vlnovej dĺžke 260 nm. HPLC analýza (Obrázok 5) ukazuje tiež, že zvyškový albumín hovädzieho séra prítomný v sedimente ultrafiltrácie sa úplne odstránil počas preparatívnej chromatografie. Jeho obsah v purifikovanej frakcii je stanovený ako <0,1%. Western blot analýza s polyklonálnou protilátkou anti-BSA (s pomerom ECL; Amersham) naznačuje, že obsah BSA po chromatografickej preparácii je vyšší ako 100 ng na mg vírusu.

Elektroforetická analýza adenovírusovej frakcie purifikovanej chromatograficky je uskutočnená v polyakrylamidovom géli (4-20%) pri denaturačných podmienkach (SDS). Pruhy proteínov sa potom detegujú dusičnanom strieborným. Táto analýza ukazuje, že adenovírusový prostriedok získaný chromatograficky má úroveň čistoty aspoň takú, ako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugáciou, pretože nemá pruh doplňovacích proteínov, ktorý naznačuje kontamináciu preparátu neadenovírusovými proteínmi.

Adenovírusový preparát získaný chromatograficky má pomer absorbancie A260nm/^A280nm = 1,30 ± 0,05. Táto hodnota, ktorá je identická s hodnotou získanou pre najlepšie preparáty získané ultrafiltráciou, naznačuje, že preparát je bez kontaminujúcich proteínov alebo kontaminujúcich nukleových kyselín.

Analýza v elektrónovom mikroskope uskutočnená pri podmienkach opísaných v príklade 4.2 na víruse Ad-pGal purifikovanom chromatograficky ukazuje čistý prípravok bez kontaminantov, bez agregátov a bez prázdnych vírusových častíc. Ultracentrifugácia v gradiente chloridu cézneho tohto prípravku zjavuje samotný pruh denzity 1,30, čo potvrdzuje neprítomnosť kontaminácie v chromatografickom prípravku možnými prázdnymi časticami alebo kapsidovými fragmentmi. Počas purifikácie chromatografický signál vírusu je nasledovaný inflexom (alebo sekundárnym signálom) v jeho oneskorenej časti, ktorý nie je spojený so základným signálom. Ultracentrifugácia tejto frakcie v gradiente chloridu cézneho odhaľuje pruh denzity 1,27 a analýza prípravku tejto frakcie ukazuje, že neobsahuje nukleové kyseliny. Analýza elektrónovým mikroskopom ukazuje, že táto frakcia obsahuje častice nepravidelné, ktoré majú na povrchu perforáciu (Obrázok 12) . Ide teda o prázdne (bez DNA) a nekompletné častice. To teda ukazuje, že purifikácia adenovirusu chromatografiou odstráni prázdne častice prítomné v malom množstve z preparátov pred purifikáciou.

5.3. Purifikácia adenovirusu, ktorý obsahuje terapeutický gén taký, ako sú gény kódujúce proteíny ApoAI alebo tymidínkinázu

Tento príklad ukazuje, ako sa môžu adenovírusy obsahujúce vo svojich genómoch sekvencie heterologických nukleových kyselín, ktoré kódujú terapeutické proteíny purifikovať priamo a v jednej samostatnej etape ionomeničovej chromatografie. Ukazuje tiež, že chromatografické vlastnosti adenovirusu sú nezávislé na sekvencií heterologických nukleových kyselín, ktoré adenovírus nesie, čo umožňuje použiť rovnaký postup purifikácie pre rôzne adenovírusy nesúce sekvencie rôznych heterologických nukleových kyselín.

V tomto experimente purifikácie adenovírus obsahujúci vo svojom genóme sekvenciu heterologických nukleových kyselín kódujúcich protein ApoAI (Príklad 2, WO94/25073) je purifikovaný chromatograficky v systéme opísanom v príklade 5.1; 18 ml (72 mg proteínov; 1,08 x 10¹³ častíc) koncentrovaného supernatantu bunkovej kultúry získaného 10 dní po infekcii (Obrázok 6A) . Signál vírusových častíc získaných po chromatografii (14 ml; 1,4 mg proteínov) obsahuje 9,98 x 1012 častíc, čo naznačuje 92% výťažok častíc a faktor purifikácie 51. Po tejto etape purifikácie získané frakcie (Obrázok 6B) majú čistotu vyššiu ako 98% vírusových častíc počas chromatografickej analýzy pri podmienkach opísaných v príklade 5.2. Elektroforetická analýza adenovírusových frakcií purifikovaných chromatografiou uskutočnenou pri podmienkach opísaných v príklade 5.2 ukázala, že preparát má úroveň čistoty minimálne rovnaký ako je čistota preparátu získaného klasickou ultracentrifugáciou, a že je bez kontaminujúcich proteínov alebo bez kontaminujúcich nukleových kyselín.

V inom typickom experimente purifikácie adenovírus obsahujúci v svojom genóme sekvenciu heterologických nukleových .

kyselín kódujúcich proteín tymidínkinázu vírusu herpes simplex typ 1 (Príklad 2, WO95/14102) je purifikovaný chromatograficky v systéme opísanom v príklade 5.1; 36 ml (180 mg proteínov; 4,69 x 10¹³ častíc) koncentrovaného supernatantu bunkovej kultúry (Obrázok 7A) . Signál vírusových častíc získaných po chromatografii (20 ml; 5,6 mg proteínov) obsahuje 4,28 x 1012 častíc, čo naznačuje výťažok častíc 99% a faktor purifikácie 32. Po tejto etape purifikácie získané frakcie (Obrázok 7B-D) majú čistotu vyššiu ako 99% vírusových častíc počas chromatografickej analýzy pri podmienkach opísaných v príklade 5.2 a pomer absorbancie 1,29. Elektroforetická analýza adenovírusových frakcií purifikovaných chromatografiou uskutočnenou pri podmienkach opísaných v príklade 5.3 ukázala, že preparát má úroveň čistoty minimálne rovnaký ako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugáciou, a že je bez kontaminujúcich proteínov alebo kontaminujúcich nukleových kyselín.

5.4. Purifikácia intracelulárneho adenovírusu silnou výmenou aniónov

Tento príklad ukazuje, ako sa môže adenovírus obsahujúci v svojom · genóme sekvenciu heterologickej nukleovej kyseliny purifikovať priamo a v jednej samotnej etape ionomeničovej chromatografie z lyzátu enkapsidačných buniek produkujúcich uvedený vírus.

V typickom experimente purifikácie adenovírus obsahujúci v svojom genóme sekvenciu heterologických nukleových kyselín kódujúcich proteín β-Gal sa purifikuje chromatocjraf icky v systéme opísanom v príklade 5.1 (kolóna FineLine Pilot 35, Pharmacia, 100 m náplne Source 15Q) ; 450 ml (napríklad 2,5 x 10¹⁴ častíc) koncentrovaného lyzátu bunkové kultúry získaného 3 dni po infekcii chemickou lýzou (1% Tween-20). Signál vírusových častíc získaných po chromatografii (110 ml) obsahuje 2,15 x 10¹⁴ častíc, čo naznačuje výťažok 86% častíc. Po tejto etape purifikácie získané frakcie vykazujú čistotu vyššiu ako 98% vírusových častíc počas chromatografickej analýzy pri podmienkach opísaných v príklade 5.2. Elektroforetická analýza adenovírusových frakcii purifikovaných chromatografiou uskutočnenou pri podmienkach opísaných v príklade 5.2 ukázala, že preparát má úroveň čistoty minimálne rovnakú ako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugáciou, a že je bez kontaminujúcich proteínov alebo bez kontaminujúcich nukleových kyselín.

5.5. Purifikácia vírusu ultrafiltráciou a ionomeničovou chromatografiou na rôznych kolónach

Tento príklad ukazuje, ako adenovirus obsahujúci v svojom genóme heterologické nukleové kyseliny sa môže purifikovať priamo a v jednej samotnej etape ionomeničovej chromatografie s použitím rôznych gélov nosiča Source 15Q založenej na rovnakom princípe separácie. Výmena aniónov interakciou s kvartérnymi skupinami matrice.

V typickom experimente purifikácie adenovírusu sa rôzne rekombinantné adenovírusy (kódujúce β-Gal, apolipoproteín AI a TK) purifikovali chromatograficky na kolóne gélu Source Q30 v opísanom protokole v príklade 5.1. Získané výsledky ukazujú, že gél Source Q30 umožňuje získať vírusový preparát s čistotou 85% s výťažkom medzi 70 až 100%. Získané výsledky ukazujú, že Q30 má na purifikáciu adenovírusu účinok (vyjadrený počtom teoretických poschodí) 1000 a 0,5 až 1 x 10¹² pv na ml (maximálne množstvo vírusu, ktoré sa môže chromatografovať bez toho, aby sa signály menili) . Tieto výsledky ukazujú, že gél Source Q30 môže teda vyhovovať purifikácii rekombinantných adenovírusov, aj keby jeho vlastnosti boli horšie ako vlastnosti Source Q15. (čistota 99%, účinok 8000 a schopnosť 2,5 až 5 x 10¹² pv na ml).

V inom typickom experimente purifikácie sa adenovirus β-Gal purifikuje chromatograficky na kolóne MonoQ HR 5/5 v opísanom protokole príkladu 5.1. Chromatografický obraz zodpovedajúci sedimentu ultrafiltrácie a takto získanému purifikovanému vírusovému preparátu je uvedený na Obrázku 8.

V inom typickom experimente sa adenovírus Ad β-Gal purifikuje chromatograficky na kolóne Poros HQ/M v opísanom protokole príkladu 5.1. Chromatograficky obraz zodpovedajúci sedimentu ultrafiltrácie a takto získanému purifikovanému vírusovému preparátu je uvedený na Obrázku 9.

Príklad 6:

Purifikácia vírusu ultrafiltráciou a gélovou filtráciou

Tento príklad naznačuje, ako sa môže adenovírus získaný v koncentráte (sediment ultracentrifugácie) purifikovať priamo chromatograficky s gélovou filtráciou s veľmi dobrým výťažkom.

6.1. Protokol

200 μΐ sedimentu ultrafiltrácie získaného v príklade 4 (napríklad 1,3 mg proteínov) sa injikovalo na kolónu HR 10/30 (Pharmacia) naplnenou so Sephacryl S-1000SF (Pharmacia) ekvilibrovanou napríklad v pufri PBS, pH 7,2 obsahujúcom 150 mM NaCl (Pufor C). Vzorky sú frakcionované^: a eluované pufrom C s prietokom 0,5 ml/min a detegovali na konci kolónu pomocou UV pri 260 nm. Prípadne sa môžu použiť rovnaké podmienky pre kolónu naplnenú so Sephacryl S-1000HR pre častice medzi 100 nm až 1000 nm.

Delenie dvoch chromatografických systémov gólovej filtrácie ďalej opísané sa môže výhodne zvýšiť pri chromatografii supernatantu ultrafiltrácie (200 μΐ) na systéme 2 kolón HR 10/30 (Pharmacia) spojených do série (kolóna Sephacryl S-1000HR alebo S-2000 nasledovaná kolónou Superdex 200 HR) ekvilibrovaných v pufri C. Vzorky sú eluované pufrom C s prietokom 0,5 ml/min a detegovali pomocou UV pri 260 nm. V tomto systéme signál vírusových častíc je velmi zreteľne separovaný od vzorky s menšou molekulovou hmotnosťou ako v systéme zahrňujúcom kolónu Sephacryl S-1000 HR alebo Sephacryl S-2000.

V reprezentatívnom príklade sa sediment ultrafiltrácie (200 μΐ, 1,3 mg proteínov) chromatografoval na systéme dvoch kolón Sephacryl S-1000HR - Superdex 200 HR 10/30 (Obrázok 10). Spojil sa chromatografický signál obsahujúci vírusové častice. Jeho retenčný čas je v zhode s retenčným časom získaným s preparátom vírusových častíc purifikovaných ultracentrifugáciou. Signál vírusových častíc spojený po chromatografii (7 ml) obsahuje 28 μg proteinov a 3,5 x 10⁹ PFU. Jeho analýza analytickou ionomeničovou chromatografiou pri podmienkach opísaných v príklade 5.2 ukazuje na prítomnosť silnejšieho signálu kontaminantov sedimentu na analytickej kolóne, ktorého plocha je asi 25% plochy vírusového signálu. Pomer absorbancie 260nm/280nm, ktorá má hodnotu 1,86 naznačuje, že signál kontaminantov zodpovedá nukleovým kyselinám. Vírusové častice sa teda purifikovali 50 krát (v množstve proteinov) a výťažok purifikácie je 85% PFU.

Prípadne je možné chromatografovať preparáty vírusových častíc (ultrafiltrát alebo frakcie na konci kolóny anionomeničovej chromatografie) na kolóne TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm; TosoHaas) ekvilibrované v pufri 0,5/ml a detegovať pomocou UV pri 260 nm. Rovnako sa môže výhodne zvýšiť rozlíšenie chromatografického systému, konkrétne zvýšiť separáciu signálov vírusových častíc vzorky s menšou molekulovou hmotnosťou pri chromatografii supernatantu ultrafiltrácie (50 až 200 μΐ) na systéme dvoch spojených kolón v sérii (kolóna TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm) nasledovaná kolónou Superdex 200 HR ekvilibrovaných v pufri C. Vzorky sa eluovali pufrom C pri prietoku 0,5 ml/min a detegovali pomocou UV pri 260 nm.

Príklad 7:

Purifikácia vírusu ultrafiltráciou; meničom iónov a gélovou filtráciou

Frakcie vírusových častíc pochádzajúce z anionomeniČovej chromatografie (Príklad 5) sa môžu výhodne chromatografovať v už opísanom chromatografickom systéme gélovej filtrácie, napríklad

s cieľom	zvýšiť úroveň čistoty vírusových častíc, ale tiež
hlavne s	cieľom upraviť vírusové častice do kompatibilného

prostredia alebo prispôsobeného ďalšiemu použitiu vírusového preparátu (injekcie, ...).

Zoznam sekvencii (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:

TAATTACCTG GGCGGCGAGC ACGAT 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:

ACCTTGGATG GGACCGTGG GAACA 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotíd (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly; DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:

TTTTTGATGC GTTTCTTACC TCTGG 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotíd (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 4:

CAGACAGCGA TGCGGAAGAG AGTGA 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotíd (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 5:

TGTTCCCAGC GGTCCATCC AAGGT 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 6:

AAGGACAAGC AGCCGAAGTA GAAGA 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:

GGATATATG GTTGGACGCT GGAAG 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 8:

AGGGCGGATG CGACGACACT GACTT

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Postup prípravy rekombinantného adenovirusu,. vyznačujúci s a t ý m, že vírusová DNA je vložená do enkapsidačnéj bunkovej kultúry a produkované vírusy sú získané po uvoľnení do supernatantu.

   2. Postup podľa nároku že zber je uskutočnený, supernatantu. 1, v keď yznačujúc i sa sa tým, aspoň 50% vírusu uvoľnilo do 3. Postup podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zber je uskutočnený, keď aspoň 70% vírusu sa uvoľnilo do supernatantu. 4. Postup podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zber je uskutočnený, keď aspoň 90% vírusu sa uvoľnilo do supernatantu.
2. 5. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vírus sa získa ultrafiltráciou.
3. 6. Postup podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ultrafiltrácia je tangenciálna ultrafiltrácia.
4. 7. Postup podía nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že ultrafiltrácia je uskutočnená na membráne, ktorá má veľkosť menšiu ako 1000 kDa.
5. 8. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vírus je získaný anionomeničovou chromatografiou.
6. 9. Postup podľa nároku 8, vyznačujúci satým, že anionomeničová chromatografia je silná anionomeničová chromatografia.
7. 10. Postup podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že silná anionomeničová chromatografia je uskutočnená na nosiči vybranom z náplní Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ a

   Poros QE, náplňami typu TMAE a Toyopearl Super Q.
8. 11. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vírus je získaný chromatograficky gélovou filtráciou.
9. 12. Postup podľa nároku 11, vyznačujúci sa' tým, že chromatografia gélovou filtráciou je uskutočnená na nosiči vybranom medzi gélmi Sephacryl S-500 HR, Sephacryl S-1000 SF, Sephacryl S-1000 HR, Sephacryl S-2000, Superdex 200 HR, Sepharose 2B, 4B alebo 6B a TSK G6000 PW.
10. 13. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vírus je získaný ultrafiltráciou nasledovanou anionomeničovou chromatografiou.
11. 14. Postup podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že vírus je získaný ultrafiltráciou nasledovanou anionomeničovou chromatografiou a potom chromatografiou gélovou filtráciou.
12. 15. Postup podlá jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že enkapsidačná bunka je bunka transkomplementujúca oblasť E1 adenovirusu.
13. 16. ’ Postup podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že enkapsidačná bunka je bunka transkomplementujúca oblasť E1 a E4 adenovirusu.
14. 17. Postup podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že enkapsidačná bunka je bunka transkomplementujúca oblasť E1 a E2a adenovirusu.
15. 18. Postup podlá jedného z nárokov 15 až 17, vyznačujúci sa tým, že bunka je ludská embryonálna obličková bunka, ľudský retinoblast alebo bunka ľudského karcinómu.
16. 19. Postup purifikácie rekombinantných adenovirusov z biologického prostredia, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje etapu purifikácie silnou anionomeničovou chromatografiou.
17. 20. Postup podľa nároku 19, vyznačujúci tým, že biologické prostredie je supernatant enkapsidačných buniek produkujúcich uvedený virús.
18. 21. Postup podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že biologické prostredie je lyzát enkapsidačných buniek produkujúcich uvedený vírus.
19. 22. Postup podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že biologické prostredie prepurifikovaný roztok uvedeného vírusu.
20. 23. Postup podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že chromatografia je uskutočnená na nosiči, ktorý je funkcionalizovaný kvartérnym aminorn.
21. 24. Postup podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že nosič je vybraný z agarózy, dextránu, akrylamidu, silikagélu poly[styrén/divinylbenzén], kopolyméru etylénglykolmetakrylát, samotnými alebo ich zmesmi.
22. 25. Postup podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že chromatografia je uskutočnená na náplni Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ a Poros QE, Fractogel TMAE alebo Toyopearl Super Q.

    26. Postup podľa nároku 25, v y z n a č u j ú c i s a . tým, že chromatografia je uskutočnená na náplni Source Q, najmä * Source Q15. 27. Postup podľa nároku 19, v y z n a č u j ú c i s a tým,

    že zahrňuje etapu predbežnej ultrafiltrácie.
23. 28. Postup podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že ultrafiltrácia je tangenciálna ultrafiltrácia na membráne, ktorá má veľkosť medzi 300 až 500 kDa.
24. 29. Purifikovaný vírusový prostriedok získaný podľa postupu nárokov 1 alebo 19.
25. 30. Farmaceutická kompozícia obsahujúca vírusový prostriedok podľa nároku 29 a vhodný farmaceutický nosič.
26. 31. Použitie jodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-l,3propandiyl)-bis(acetylamino)]bis[N, N'-bis(2,3dihyroxypropyl-2, 4,6-triodo-l, 3-benzenkarboxamid] na purifikáciu adenovirusu.
27. 32. Postup purifikácie adenovirusu z biologického prostredia zahrňujúci prvú etapu ultracentrifugácie, druhú etapu dilúcie alebo dialýzy a tretiu etapu anionomeničovej chromatografie.