HU224558B1 - Eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására - Google Patents
Eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU224558B1 HU224558B1 HU0001271A HUP0001271A HU224558B1 HU 224558 B1 HU224558 B1 HU 224558B1 HU 0001271 A HU0001271 A HU 0001271A HU P0001271 A HUP0001271 A HU P0001271A HU 224558 B1 HU224558 B1 HU 224558B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- adenovirus
- cells
- chromatography
- supernatant
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 76
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 54
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 38
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 17
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 9
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 183
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 126
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 44
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 41
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 35
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 29
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 13
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 12
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 12
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 8
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- -1 2-hydroxy-1,3-propanediyl Chemical group 0.000 description 7
- 101100294463 Human adenovirus E serotype 4 L2 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 6
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 6
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000017610 release of virus from host Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 2
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100039886 DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC4 Human genes 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669237 Homo sapiens DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC4 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101100450591 Human adenovirus B serotype 3 PVIII gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N merck compound 25 Chemical compound C1C[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)CN1C(C1=C(F)C=CC=C11)=NN1C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1C1CC1 IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004271 weak anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Description
A találmány tárgya egy új eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására. A találmány tárgyát képezik az eljárással előállított tisztított víruskészítmények is.
Az adenovírusok rendelkeznek néhány különösen előnyös tulajdonsággal géntranszfer vektorként a génterápiában történő alkalmazásuk szempontjából. Nevezetesen széles gazdaspektrumúak, képesek nyugalomban lévő sejteket fertőzni, nem integrálódnak a fertőzött sejt genomjába, és a mai napig nem kapcsolható hozzájuk jelentős emberi megbetegedés. Az adenovírusokat így alkalmazták már gének átvitelére az izomba [Ragot et al., Natúré 361, 647 (1993)], a májba [Jaffe et al., Natúré genetics 1, 372 (1992)], az idegrendszerbe [Akii et al., Natúré genetics 3, 224 (1993)] stb.
Az adenovírusok kettős szálú DNS-vírusok körülbelül 36 kb (kilobázis) mérettel. Genomjuk többek között mindkét végén egy inverz ismétlődő szekvenciát (ITR), egy részecskeképzésért felelős szekvenciát (Psi), korai és késői géneket tartalmaz. A legfontosabb korai géneket az E1, E2, E3 és E4 területek tartalmazzák. Ezek közül az E1 régióban lévő gének például a virális terjedéshez szükségesek. A fő késői géneket az L1-L5 régiók tartalmazzák. Az Ad5 adenovírusgenomját teljes egészében szekvenálták, és adatbázisokban hozzáférhető (lásd például Genebank M73260). Más adenovírusgenomok (Ad2, Ad7, Ad 12 stb.) részeit, egyes esetekben az egész genomot szintén szekvenálták.
Génterápiás alkalmazásukhoz különböző adenovíruseredetű vektorokat állítottak elő, melyek különböző terápiás géneket tartalmaztak. A konstrukciók mindegyikében az adenovírust úgy változtatták meg, hogy képtelenné tegyék a fertőzött sejtben való replikációra. (gy a szakirodalomban leírt konstrukciókban az adenovírusoknak a virális replikációhoz elengedhetetlen E1 régiója deletált, melynek területére a heterológ DNS-szekvenciákat építették be [Levrero et al., Gene 101, 195(1991); Gosh-Choudhury etal., Gene 50,161 (1986)]. Másrészt a vektorok tulajdonságainak javítására javasolták, hogy más deléciókat vagy módosításokat végezzenek az adenovírusok genomjában. így a ts125 mutánsba egy hőmérséklet-érzékeny pontmutációt vezettek be, amely lehetővé teszi, hogy a 72 kD DNS-kötő proteint (DBP) inaktiváljuk [Van dér Vliet et al. (1975)]. Más vektorok másik, a replikációhoz és/vagy a virális terjedéshez elengedhetetlen területen, az E4 régióban tartalmaznak deléciót. Az E4 régió a késői gének szabályozásában, a késői nukleáris RNS stabilitásában, a gazdasejtfehérjék kifejeződésének leállításában és a virális DNS replikációjának hatékonyságában játszik szerepet. Azok az adenovírusvektorok, melyekben az E1 és az E4 régió deletált, nagyon alacsony transzkripciós alapzajjal és a virális gének kifejeződésének igen alacsony szintjével rendelkeznek. Ilyen vektorokat írtak le például a WO 94/28152, WO 95/02697, PCT/FR96/00088 számú szabadalmi iratokban. Ezenkívül leírtak a IVa2 gén területén módosítást hordozó vektorokat is (WO 96/10088).
Az irodalomban leírt adenovírusokat különböző szerotípusú adenovírusokból kiindulva állítják elő. Különböző szerotípusú adenovírusok léteznek, melyeknek szerkezete és tulajdonságai kissé eltérnek, de genetikai szerveződésük összehasonlítható. Részletesebben: a rekombináns adenovírusok lehetnek humán vagy állati eredetűek. Ami a humán eredetű adenovírusokat illeti, előnyösen a C csoportba tartozókat említhetjük meg, különösen a 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) vagy 12 (Ad12) típusú adenovírusokat. A különböző állati eredetű adenovírus közül előnyösen a kutyaeredetűeket említhetjük meg, többek között a CAV2 adenovírus bármely törzsét (például a manhattan vagy A26/61 törzs) (ATCC VR-800). Más állati eredetű adenovírusokat említenek többek között a jelen bejelentésbe referenciaként beépített WO 94/26914 számon közzétett bejelentésben.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a rekombináns adenovírus egy C csoportba tartozó humán adenovírus. Még előnyösebb módon az Ad2 vagy az Ad5 adenovírusról van szó.
A rekombináns adenovírusokat egy részecskeképző sejtvonalban állítjuk elő, azaz egy olyan sejtvonalban, amely képes transz-helyzetben komplementálni egy vagy több, a rekombináns adenovírusgenomjából hiányzó funkciót. Egy ilyen sejtvonal például a 293 sejtvonal, amelybe az adenovírusgenomjának egy része be van építve. Pontosabban a 293 sejtvonal egy humán embrionális vesesejtvonal, amely az 5 szerotípusú (Ad5) adenovírusgenomjának bal szélét (körülbelül 11-12%) tartalmazza, amely rész a bal ITR-eket, a részecskeképzésért felelős területet, az E1a és E1b régiókat magában foglaló E1 területet, a pIX fehérjét kódoló régiót és a plVa2 fehérjét kódoló terület egy részét tartalmazza. Ez a sejtvonal képes transzkomplementálni az E1 régiójában hiányos rekombináns adenovírusokat, azaz azokat, melyekből az E1 régió vagy annak egy része hiányzik, és képes magas titerű vírussarzsok termelésére. A sejtvonal képes permisszív hőmérsékleten (32 °C) termelni a többek között a hőmérséklet-érzékeny E2 mutációt hordozó vírussarzsokat is. Más az E1 régió komplementálására képes sejtvonalakat is leírtak, melyek többek között az A549 humán tüdő-karcinómasejteken (WO 94/28152) vagy humán retinoblasztokon [Hűm. Gén. Ther. 215 (1996)] alapulnak. Másrészt leírtak olyan sejtvonalakat is, melyek több adenovírusfunkciót képesek transzkomplementálni. Részletesebben: az E1 és E4 régiókat komplementáló sejtvonalakat [Yeh et al., J. Virol. 70, 559 (1996); Cancer Gén. Ther. 2, 322 (1995); Krougliak et al., Hűm. Gén. Ther. 6, 1575 (1995)] és az E1 és E2 régiókat komplementáló sejtvonalakat (WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071) említhetjük meg.
A rekombináns adenovírusokat szokásosan a vírus-DNS-nek a részecskeképző sejtvonalba történő bevezetésével termelik, melyet a sejteknek körülbelül 2 vagy 3 nap múlva történő iízise követ (az adenovírusok ciklusának kinetikája 24-36 órás). A sejtek Iízise után a rekombináns vírusrészecskéket cézium-kloridgradienscentrifugálással különítik el.
Az eljárás megvalósításához a bevezetett vírusDNS lehet az adott esetben egy baktériumban (WO 96/25506) vagy élesztőben (WO 95/03400) előállított, a
HU 224 558 Β1 sejtekbe transzfektált teljes rekombináns vírusgenom. Szó lehet a részecskeképző sejtvonal fertőzésére használt rekombináns vírusról is. A vírus-DNS-t fragmentumok formájában is bevezethetjük, melyek mindegyike a rekombináns vírusgenom egy részét és egy homológ területet hordoz, amely a részecskeképző sejtbe való bevezetés után lehetővé teszi a rekombináns vírusgenom rekonstrukcióját a különböző fragmentumok közötti homológ rekombinációval. Az adenovírusok előállítására egy klasszikus eljárás tehát a következő lépésekből áll: a sejteket (például 293 sejtek) tenyésztőpalackban egy vírussarzssal fertőzzük 3-5 vírusrészecske/sejt arányban (fertőzési multiplicitás, MOI=3-5), vagy vírus-DNS-sel transzfektáljuk. Ezután az inkubálás 40-72 óráig tart. Ezután a vírust felszabadítjuk a sejtmagból a sejtek lízisével, általában több egymást követő fagyasztást ciklussal. A kapott sejtlizátumot ezután alacsony sebességgel (2000—4000 rpm) centrifugáljuk, és a felülúszót (tisztított sejtlizátum) cézium-klorid jelenlétében végzett centrifugálással két lépésben tisztítjuk:
- egy első gyorscentrifugálás 1,5 órán át két, a vírus sűrűségét (1,34) közrefogó 1,25 és 1,40 sűrűségű cézium-klorid-rétegen, a vírusnak a közeg fehérjéitől való elválasztására;
- egy második hosszabb (10-40 óra az alkalmazott rotortól függően) gradienscentrifugálás, ami a valódi, egyedüli vírustisztítási lépés.
Általában a második centrifugálási lépés után a vírust tartalmazó sáv a fősáv. Két kevésbé erős, finom sávot is megfigyelhetünk, melyek elektronmikroszkópos vizsgálata azt mutatta, hogy üres vagy összetört vírusrészecskékről van szó az erősebb sáv esetében, és vírusalegységekről (pentonok, hexonok) a kevésbé erős sáv esetében. Ez után a lépés után a vírust a centrifugacső tűvel végzett megcsapolásával összegyűjtjük, és a céziumot dialízissel vagy sómentesítéssel távolítjuk el.
A kapott tisztasági szint ugyan megfelelő, de ez az eljárástípus mégis rendelkezik néhány hátránnyal. Részletesebben: cézium-klorid alkalmazásán alapul, ami az emberi terápiás alkalmazással összeférhetetlen. Ezért szükségszerű a cézium-kloridot eltávolítani a tisztítás végén. Ez az eljárás ezenkívül más, később említett hátrányokkal is rendelkezik, melyek az ipari méretű alkalmazását korlátozzák.
A problémák megszüntetésére javasolták, hogy a lízis után kapott vírust ne cézium-klorid-gradienssel, hanem kromatográfiával tisztítsák. Így Huyghe és munkatársai cikke [Hűm. Gén. Ther. 6, 1403 (1996)] különböző típusú kromatográfiák rekombináns adenovírusok tisztítására történő alkalmazásának vizsgálatát ismerteti. A cikk ismertet többek között egy rekombinánsadenovírus-tisztítási vizsgálatot, amely gyenge anioncserélő kromatográfiát (DEAE) alkalmaz. Ezt megelőző munkák leírták már ennek a típusú kromatográfiának az alkalmazását ebből a célból [Klemperer et al., Virology 9, 536 (1959); Philipson L„ Virology 10, 459 (1960); Haruna et al., Virology 13, 264 (1961)]. A Huyghe és munkatársai cikkében bemutatott eredmények a javasolt ioncserélő kromatográfiás eljárással közepes hatékonyságot mutatnak. így a kapott felbontás átlagos, a szerzők megjegyzik, hogy a vírusrészecskék több kromatográfiás csúcsban is jelen vannak; a hozam alacsony (vírusrészecskék hozama: 67%; fertőző részecskék hozama: 49%); a kromatográfiás lépés után kapott víruskészítmény szennyezett. Ezenkívül a vírus különböző enzimekkel/fehérjékkel történő előkezelése szükséges. Ugyanebben a cikkben másrészt ismertetnek egy vizsgálatot a gélpermeációs kromatográfia alkalmazására, ami nagyon rossz felbontást és nagyon alacsony hozamot (15-20%) eredményezett.
A találmány egy új eljárást ismertet rekombináns adenovírusok tisztítására egy biológiai közegből. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy nagyon gyors és iparilag alkalmazható módon kapjunk igen nagy mennyiségű és igen jó minőségű vírussarzsokat.
A találmány szerinti eljáráshoz előnyösen a rekombináns adenovírusokat a tenyészet felülúszójából nyerjük ki. A találmány tárgya tehát egy eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására, amely egy egyetlen erős anioncserélő kromatográfiás lépést tartalmaz. A találmány egy javított tisztítási eljárást is ismertet, amely gélpermeációs kromatográfiát alkalmaz, adott esetben anioncserélő kromatográfiával kapcsoltan. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a tisztaság, a stabilitás, a morfológia és a fertőzőképesség tekintetében javított minőségű vírusokat kapjunk megnövekedett hozammal, és az ipari követelményeknek és a terápiás molekulákra vonatkozó szabályozásnak teljes egészében megfelelő termelési körülmények között.
Részletesebben: az ipari méretűvé alakítás tekintetében a találmány szerinti eljárás rekombináns proteinek esetében nagy méretekben kipróbált tenyészet-felülúszó kezelési eljárásokat alkalmaz, amilyenek a mikroszűrés vagy tömörített szűrés és a tangenciális ultraszűrés. Másrészt a vírus 37 °C-on mutatott stabilitása miatt az eljárás ipari fázisban jobb szervezést tesz lehetővé abban a tekintetben, hogy az intracelluláris eljárással szemben nem szükséges, hogy a learatás ideje pontos legyen, a fél napot leszámítva. Ezenfelül maximális víruslearatást garantál, ami különösen fontos a több területen hiányos vírusok esetében. Másrészt a találmány szerinti eljárás a termelés kinetikájának könnyebb és pontosabb követését teszi lehetővé közvetlenül a homogén felülúszómintákon, előkezelés nélkül, ami a termelés jobb reprodukálhatóságát teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi azt is, hogy ne legyen szükség a sejtlízis lépésére. A sejtlízisnek több hátránya van. így nehezen képzelhető el a sejtek elroncsolása fagyasztási-olvasztási ciklusok segítségével ipari méretekben. Másrészt a lízis alternatív eljárásai (Dounce, X-press, ultrahang, mechanikai nyírás stb.) is hátrányokkal rendelkeznek: potenciálisan olyan aeroszolokat hoznak létre, melyek az L2 vagy L3 vírusok esetében térben nehezen izolálhatok (a vírusok izolálása szintjén, patogenitásuktól vagy terjedési módjuktól függően), ezek a vírusok pedig hajlamosak arra, hogy légiúton fertőzzenek; nehezen szabályozható és a készítmény aktivitását csökkentő nyíróerőt és/vagy
HU 224 558 Β1 hőfelszabadulást vonnak maguk után. Annak a megoldásnak az értékét, hogy a sejtlízishez detergenseket alkalmazunk, fel kell mérni, és másrészt fel kell becsülni a detergens eltávolításának lehetőségét is. Végül a sejtlízis a közegben számos sejttörmelék jelenlétéhez vezet, ami a tisztítást kényesebbé teszi. A vírus minősége tekintetében a találmány szerinti eljárás potenciálisan a vírus jobb érését teszi lehetővé, ami homogénebb populációhoz vezet. Részletesebben ott, ahol a vírus-DNS csomagolása a vírusciklus utolsó lépése, az érés előtti sejtlízis potenciálisan üres részecskéket szabadít fel, melyek ugyan nem replikatívak, a priori fertőzőek, és ugyanakkor a vírus saját toxikus hatásában részt vesznek, és megnövelik a kapott készítmény specifikus aktivitási arányát. Egy készítmény specifikus fertőzési arányát úgy definiáljuk, mint a biokémiai módszerekkel (OD260 nm, HPLC, PCR, immunoenzimatikus módszerek stb.) mért összes vírusrészecskék számának aránya a biológiai hatást (plakkok képződése szilárd közegű sejttenyészeten, sejtek transzdukciója) kiváltó vírusrészecskék számához. A gyakorlatban egy tisztított készítmény esetében az arányt úgy határozzák meg, hogy a 260 nm-nél mért OD alapján meghatározott részecskekoncentrációnak és a készítmény plakk-képző egység koncentrációjának arányát képezik. Az arány kisebb kell legyen száznál.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy legalább a cézium-klorid-gradiensen centrifugálással tisztítottal azonos tisztaságú vírust kapjunk egyetlen lépésben, előzetes kezelés nélkül, koncentrált vírusfelülúszóból kiindulva.
A találmány egyik tárgya tehát egy eljárás rekombináns adenovírusok előállítására, azzal jellemezve, hogy a vírus-DNS-t egy részecskeképző sejttenyészetbe vezetjük be, és a termelt vírusokat a tenyészet felülúszójába történt felszabadulásuk után aratjuk le. A korábbi eljárásokkal ellentétben, amelyekben a vírusokat egy érés előtti, mechanikai vagy kémiai módon végzett sejtlízist követően aratták le, a találmány szerinti eljárásban a sejteket nem lizáljuk külső tényező közbeiktatásával. A tenyészetet hosszabb ideig tartjuk fenn, és a vírusokat közvetlenül a felülúszóban aratjuk le, miután azok a részecskeképző sejtekből spontán felszabadultak. A vírust tehát a sejtfelülúszóban gyűjtjük össze a találmány szerint, míg a megelőző eljárásokban egy intracelluláris, pontosabban intranukleáris vírusról van szó.
A bejelentés kimutatta, hogy a tenyésztés idejének meghosszabbítása és a nagyobb alkalmazott térfogat ellenére a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy megnövekedett mennyiségben és jobb minőségben állítsunk elő vírusrészecskéket. Ezenkívül, amint a korábbiakban jeleztük, az eljárás azt is lehetővé teszi, hogy a lízis lépését, ami ipari méretekben nehéz, és számos szennyeződést okoz, elkerüljük.
Az eljárás tehát a felülúszóba felszabadult vírusok learatásán alapul. Az eljárás hosszabb tenyésztési időt alkalmazhat, mint a megelőző, sejtlízisen alapuló módszerek. Amint a korábbiakban jeleztük, a learatás idejének nem kell pontosnak lenni, a fél napot leszámítva.
Azt alapvetően a vírus tenyészet-felülúszóba való felszabadulásának kinetikája határozza meg.
A vírus felszabadulásának kinetikáját többféle módon követhetjük. Részletesen: alkalmazhatunk analitikai módszereket, mint az RP-HPLC, az IE-HPLC, a szemikvantitatív PCR (4.3. példa), az elpusztult sejtek festése tripánkékkel, az intracelluláris LDH típusú enzimek felszabadulásának mérése, a felülúszóba felszabadult részecskék mérése Coulter típusú készülékkel vagy fénydiffrakcióval, immunológiai (ELISA, RIA stb.) vagy nefelometriás eljárások, aggregációs titrálás antitest jelenlétében stb.
Előnyös módon a learatást akkor végezzük, amikor legalább a vírusok 50%-a felszabadult a felülúszóba. Azt az időt, amikor a vírusok 50%-a felszabadult, könnyedén meghatározhatjuk egy, a fentebb leírt kinetikai vizsgálattal. Még előnyösebben az aratást akkor végezzük, amikor a vírusoknak legalább a 70%-a felszabadult a felülúszóba. Különösen előnyös, ha az aratást akkor végezzük, amikor legalább a vírusok 90%-a felszabadult a felülúszóba, azaz amikor a kinetika elér egy platót. A vírusfelszabadulás kinetikája alapvetően az adenovírus replikációs ciklusán alapul, és bizonyos faktorokkal befolyásolható. Részletesen: az alkalmazott vírus, különösen a rekombináns vírusgenomjában végzett deléció típusának függvényében változhat. Részletesen: az E3 régió deléciója, úgy tűnik, késlelteti a vírus felszabadulását. így az E3 régió jelenlétében a vírus 24-48 órával a fertőzés után aratható. Ezzel ellentétben az E3 régió hiányában hosszabb tenyésztési idő látszik szükségesnek. Ebben a tekintetben a bejelentés vizsgálatokat végzett E1 és E3 régióban hiányos adenovírusok sejtfelülúszóba történő felszabadulásának kinetikájára vonatkozóan, és kimutatta, hogy a felszabadulás körülbelül 4-5 nappal a fertőzés után indul meg, és körülbelül a 14. napig tart. A felszabadulás általában a 8. és a 14. nap között éri el a platót, és a titer stabil marad legalább a fertőzés utáni 20. napig.
Előnyösen a találmány szerinti eljárásban a sejteket 2-14 napos időtartamig tenyésztjük. Másrészt a vírusfelszabadulás indukálható a részecskeképző sejtben egy olyan fehérje, például vírusprotein expressziójával, amelynek a vírusfelszabadulásban szerepe van. így adenovírus esetében a felszabadulás szabályozható az adenovírus E3 régiója által kódolt Death-protein (E3-11.6K protein) expressziójával, adott esetben egy indukálható promoter irányítása alól expresszálva. Ezáltal a vírusfelszabadulás idejét csökkenthetjük, és a tenyészet-felülúszóban a vírusok több mint 50%-át tudjuk learatni 24-48 órával a fertőzés után.
A vírusrészecskék begyűjtéséhez a tenyészet-felülúszót előnyösen előzőleg szűrjük. Mivel az adenovírus mérete körülbelül 0,1 pm (120 nm), a szűrést a vírus áthaladásához elég nagy porozitású, de a szennyeződések visszatartásához elég finom membrán segítségével végezzük. Előnyösen a szűrést 0,2 pm-nél nagyobb porozitású szűrőn végezzük. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a szűrést csökkenő porozitású membránok sorozatán végzett egymás utáni szűrésekkel végezzük. Különösen jó eredményeket
HU 224 558 Β1 kaptunk, amikor a szűrést csökkenő, 10 gm, 1,0 gm, majd 0,8-0,2 gm porozitású tömörített szűrőn végezzük. Egy másik előnyös változat szerint a szűrést tangenciális mikroszűréssel végezzük sima membránon vagy tömörített rostokon. Részletesebben sima Millipore membránokat, vagy 0,2 és 0,6 gm közötti porozitással rendelkező tömörített rostokat alkalmazhatunk. A példákban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a szűrési lépés hozama 100% (nem figyeltünk meg a leggyengébb prorozitással rendelkező szűrőn való visszatartásnak tulajdonítható vírusveszteséget).
A találmány egy másik megközelítésében a bejelentés egy eljárást dolgozott ki, amely vírusok felülúszóból történő learatását és tisztítását teszi lehetővé. Ehhez az így szűrt (vagy tisztított) felülúszót egy ultraszűrésnek vetjük alá. Az ultraszűrés lehetővé teszi, hogy (i) a felülúszót koncentráljuk, mivel az érintett térfogat jelentős lehet, (ii) a vírus egy első tisztítását végezzük el, és (iii) a készítmény pufferét a későbbi eljárási lépésekhez beállítsuk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a felülúszót egy tangenciális ultraszűrésnek vetjük alá. A tangenciális ultraszűrés abból áll, hogy egy oldatot koncentrálunk és frakcionálunk, két, egymástól meghatározott vágási küszöbű membránokkal elválasztott rész, a szűrlet és a szűrési maradék között úgy, hogy áramlást létesítünk a berendezés szűrésimaradék-részében, és transzmembrán nyomást alkalmazunk e rész és a szűrletrész között. Az áramlást általában a berendezés szűrésimaradék-részében lévő pumpa segítségével hozzuk létre, és a transzmembránnyomást a szűrésimaradék-rész körforgásának a folyadékot szállító vékony cső részén lévő szelep segítségével szabályozzuk. Az áramlás sebességét és a transzmembránnyomást úgy választjuk meg, hogy kis nyírási erőt hozzunk létre (Reynolds-szám kisebb 5000 s-1-nél, előnyösen kisebb 3000 s_1-nél, nyomás kisebb 1,0 bar-nál), elkerülve a membránok eltömődését. Az ultraszűrés megvalósításához különböző rendszereket alkalmazhatunk, például a spirális membránok (Millipore, Amicon), sík membránok vagy tömörített rostok (Amicon, Millipore, Sartorius, Pali, GF, Sepracor). Mivel az adenovírusok tömege körülbelül 1000 kD, előnyösen a találmány keretein belül 1000 kD-nál kisebb, előnyösen 100 kD és 1000 kD közötti vágási küszöbű membránokat alkalmazunk. 1000 kD vagy annál nagyobb vágási küszöbű membránok alkalmazása jelentős vírusveszteséget von maga után ebben a lépésben. Előnyösen 200 és 600 kD közötti, még előnyösebben 300 és 500 kD közötti vágási küszöbű membránokat alkalmazunk. A példákban bemutatott kísérletek azt mutatják, hogy 300 kD-os vágási küszöbű membrán alkalmazása a vírusrészecskék több mint 90%-ának visszatartását teszi lehetővé, miközben a közeg szennyeződéseit eltávolítja (DNS, a közeg fehérjéi, sejtfehérjék stb.). 500 kD-os vágási küszöbű membránok alkalmazása ugyanezeket az előnyöket kínálja.
A példákban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy ez a lépés lehetővé teszi jelentős térfogatú felülúszó koncentrálását, vírusveszteség nélkül (90%-os hozam), és jobb minőségű vírust állít elő. Részletesen:
könnyedén kaphatunk 20-100-szoros koncentrálást is.
Ez az ultraszűrési lépés tehát egy kiegészítőtisztítást képez a klasszikus sémához képest abban a tekintetben, hogy a vágási küszöbnél (300 vagy 500 kD) kisebb tömegű szennyeződéseket legalább részben eltávolítja. A víruskészítmény minőségének javulása nyilvánvaló, ha a két eljárás szerint összehasonlítjuk az elválasztás utáni látványt az első ultracentrifugálási lépés után. A lízist alkalmazó klasszikus eljárásban a víruskészítményt tartalmazó cső zavaros kinézetű, csapadékkal (lipidek, fehérjék), amely néha a vírus sávját is érinti, míg a találmány szerinti eljárásban a felszabadulás és az ultraszűrés után a készítmény egy, a közeg szennyeződéseitől jól elkülönülő sávot alkot, amely a felső fázisban marad. A minőség javulását az is mutatja, ha összehasonlítjuk a sejtlízissel kapott vírus ioncserélő kromatográfiás profilját a találmányban leírt ultraszűréssel kapott víruséval. Másrészt a minőséget tovább javíthatjuk, ha az ultraszűrést a koncentrátum diafiltrációja követi. A diafiltrációt ugyanazon az elven végezzük, mint a tangenciális ultraszűrést, és ez lehetővé teszi, hogy teljesebben távolítsuk el a membrán vágási küszöbénél nagyobb méretű szennyeződéseket, miközben a koncentrátum kiegyensúlyozását is elvégezzük a tisztítási pufferben.
Másrészt a bejelentés azt is kimutatta, hogy az ultraszűrés lehetővé teszi a vírus közvetlen ioncserélő oszlopkromatográfiás vagy gélpermeációs kromatográfiás tisztítását, lehetővé téve, hogy a vírusrészecskék kitűnő csúcsfelbontását kapjuk anélkül, hogy szükséges lenne a készítmény kromatográfiát megelőző kezelése. Ez különösen váratlan és előnyös. Amint Huyghe és munkatársai idézett cikkében jelezték, a víruskészítmények kromatográfiás tisztítása közepes eredményeket ad, és ráadásul a vírusszuszpenzió előzetes kezelését teszi szükségessé benzonázzal és ciklodextrinekkel.
Részletesebben: a találmány szerinti eljárást tehát az jellemzi, hogy a vírusokat ultraszűréssel aratjuk le.
Amint az előzőekben jeleztük, a kapott koncentrátum közvetlenül alkalmazható a vírus tisztítására. A tisztítást a korábbi klasszikus eljárásokkal végezhetjük, például cézium-klorid-gradiensen vagy más ultracentrifugáló közegen végzett centrifugálással, ami lehetővé teszi a részecskék mérete, sűrűsége vagy szedimentációs állandója szerinti elválasztást. A 4. példában bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az így kapott vírus figyelemre méltó tulajdonságokkal rendelkezik. Részletesen: a találmány szerint lehetséges, hogy a cézium-kloridot jodixanol, azaz 5,5’-[(2-hidroxi-1,3-propándiil)-bisz(acetil-amino)]-bisz[N,N’-bisz(2,3-dihidroxi-propil-2,4,6-trijód-1,3-benzén-karboxamid)]-oldattal helyettesítsük, amelyben 1,16-1,24 közötti relatív sűrűségnél a vírus egyensúlyban ülepedik. Az oldat alkalmazása előnyös, mivel a cézium-kloriddal ellentétben nem toxikus. Másrészt a bejelentés azt is kimutatta, hogy előnyös módon a kapott koncentrátum lehetővé teszi azt is, hogy a vírust közvetlenül ioncserélő mechanizmussal vagy gélpermeációval tisztítsuk,
HU 224 558 Β1 és a vírusrészecskék kitűnő kromatográfiás csúcsfelbontását kapjuk anélkül, hogy megelőző kezelés lenne szükséges.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a vírusokat tehát anioncserélő kromatográfiával aratjuk le és tisztítjuk.
Anioncserélő kromatográfia esetén különböző hordozókat alkalmazhatunk, például cellulózt, agarózt (Sepharose gélek), dextránt (Sephadex gélek), akrilamidot (Sephacryl gélek, Trisacryl gélek), szilikát (TSK-gel SW gélek), poli(sztirol-divinil-benzol)-t (Source vagy Poros gélek), etilénglikol-metakrilát kopolimereket (Toyopearl HW és TSK-gel PW gélek) vagy keverékeket (agaróz-dextrán: Superdex gél). Másrészt a kromatográfiás felbontás javítására a találmány keretein belül előnyös, ha a hordozót a következő jellemzőkkel rendelkező gyöngyök formájában alkalmazzuk:
- a lehető legjobban gömb alakú,
- kalibrált átmérő (teljesen azonos gyöngyök vagy a lehető leghomogénebbek), hiba vagy törés nélkül,
- a lehető legkisebb átmérő: 10 pm-es gyöngyöket leírtak (például a Pharmacia MonoBeadse, vagy a TosoHaas TSK-gelre). Ez az érték, úgy tűnik, az alsó korlát gyöngyök esetében, melyek porozitása másrészt igen nagy kell legyen, hogy lehetővé tegye a kromatografálandó anyagok behatolását a gyöngyök belsejébe,
- mindamellett merevek, hogy ellenálljanak a nyomásnak.
Másrészt adenovírusok kromatográfiája esetén, melyek jelentős méretű részecskék (átmérőjük >100 nm), fontos, hogy olyan gélt alkalmazzunk, amely porozitásának felső korlátja megnövekedett, sőt a lehető legnagyobb, hogy lehetővé tegye a vírusrészecskék bejutását a funkciós csoportokhoz, amelyekkel kölcsönhatásba kell lépniük.
Előnyösen a hordozót az agaróz, a dextrán, az akrilamid, a szilika, a poli(sztirén-divinil-benzén), az etilénglikol-metakrilát kopolimer közül választjuk, egyedül vagy keverékben.
Az anioncserélő kromatográfia esetében az alkalmazott hordozónak funkciós csoportokkal kell rendelkeznie, egy olyan csoport kapcsolásával, amelyről feltételezhető, hogy kölcsönhatásba lép egy anionos molekulával. A legáltalánosabban a csoport egy aminból áll, ami lehet tercier vagy kvaterner. Ha tercier amint alkalmazunk, amilyen például a DEAE, gyenge anioncserélőt kapunk. Kvaterner amint alkalmazva erős anioncserélőt kapunk.
A találmány keretein belül különösen előnyös, ha erős anioncserélőt alkalmazunk. így előnyösen a találmány szerint egy olyan, a fentiekben leírt kromatográfiás hordozót alkalmazunk, mely kvaterner amin funkciós csoportokkal rendelkezik. A kvaterner aminokkal rendelkező hordozók közül példaképpen említhetjük a Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ és Poros QE gyantákat, a Fractogel TMAE típusú gyantákat és a Toyopearl Super Q gyantákat.
A találmány keretein belül alkalmazható gyantákra előnyös példák a Source, többek között a Source Q gyanták, amilyen a 15Q (Pharmacia), a MonoBeads gyanták, amilyen a Q (Pharmacia), a Poros HQ és Poros QE típusú gyanták. A MonoBeads hordozó (gyöngyátmérő 10±0,5 pm) több mint tíz éve kapható kereskedelmi forgalomban, a Source típusú (15 pm) vagy a Poros típusú (10 pm vagy 20 pm) hordozók körülbelül 5 éve. E két utóbbi hordozó azzal az előnnyel rendelkezik, hogy igen nagy a belső póruseloszlás (20 nm-1 pm), ami lehetővé teszi az igen nagy részecskék áthatolását a gyöngyökön. Ezenfelül alacsony ellenállást mutatnak a gélen keresztül történő folyadékáramlással szemben (tehát kicsi a nyomás), és igen merevek. Az oldatok azon funkciós csoportok felé szállítása tehát, melyekkel kölcsönhatásba kell lépniük, igen gyors. A bejelentés kimutatta, hogy ezek a paraméterek különösen jelentősek adenovírusok esetében, melyeknek diffúziója lassú méretükhöz képest.
A példákban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az adenovírusokat a koncentrátumból egyetlen anioncserélő kromatográfiás lépéssel tisztíthatjuk, a tisztítás hozama (140% tdu-ban kifejezve, a Huyghe és munkatársai által közölt 49%-os értékkel összehasonlítva) és a felbontás kiváló. Ezenkívül a bemutatott eredmények azt is mutatják, hogy a kapott adenovírus megnövekedett fertőzőképességű, tehát a terápiás alkalmazáshoz megkívánt jellemzőkkel rendelkezik. Különösen előnyös eredményeket kaptunk erős, azaz kvaterner ammóniumcsoportokkal rendelkező anioncserélővei, például Source Q gyantával. A Source Q15 gyanta különösen előnyös.
Ebben a tekintetben a találmány tárgya egy eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására biológiai közegből, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy erős anioncserélő kromatográfiás tisztítási lépést.
E változat szerint a biológiai közeg lehet az említett vírust termelő részecskeképző sejtek felülúszója, az említett vírust termelő részecskeképző sejtek lizátuma vagy az említett vírus előzetesen tisztított oldata.
Előnyösen a kromatográfiát egy kvaterner amin funkciós csoportokkal ellátott hordozón végezzük. A hordozót az agaróz, a dextrán, az akrilamid, a szilikagél, a poli(sztirol-divinil-benzol), az etilénglikol-metakrilát kopolimer közül választjuk, egymagában vagy kévédén.
Egy különösen előnyös megvalósítási mód azzal jellemezhető, hogy a kromatográfiát Source Q, előnyösen Q15 gyantán végezzük.
Másrészt a fentebb leírt eljárást előnyösen termelősejtek felülúszójából kiindulva végezzük, és az eljárás tartalmaz egy előzetes ultraszürési lépést. Ezt a lépést előnyösen a korábbiakban meghatározott körülmények között végezzük, nevezetesen tangenciális ultraszűrésről van szó egy 300 és 500 kD közötti nyírási küszöbű membránon.
A találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint a vírusokat gélpermeációs kromatográfiával aratjuk le és tisztítjuk.
A gélpermeációt közvetlenül a felülúszóval, koncentrátummal vagy anioncserélő kromatográfiából származó vírusokkal végezhetjük. Az anioncserélő kro6
HU 224 558 Β1 matográfia esetében említett hordozókat használhatjuk ehhez a lépéshez is, de funkciós csoportok nélkül.
Ebben a tekintetben az előnyös hordozók az agaróz (Sepharose gélek), a dextrán (Sephadex gélek), az akrilamid (Sephacryl gélek, Trisacryl gélek), a szilikagél (TSK-gel SW gélek), az etilénglikol-metakrilát kopolimer (Toyopearl HW és TSK-gel PW gélek) vagy keverékek (agaróz-dextrán: Superdex gél). A különösen előnyös hordozók a következők:
- Superdex 200HR (Pharmacia)
- Sephacryl S-500HR, S-1000HR vagy S-2000 (Pharmacia)
- TSK G6000 PW (TosoHaas)
Egy találmány szerinti előnyös eljárás tartalmaz tehát egy ultraszűrést, melyet egy anioncserélő kromatográfia követ.
Egy másik előnyös eljárás tartalmaz egy ultraszűrést, melyet anioncserélő kromatográfia, majd egy gélpermeációs kromatográfia követ.
A találmány egy másik változata egy eljárás adenovírusok tisztítására biológiai közegből, amely tartalmaz egy első ultracentrifugálási lépést, egy második hígítási vagy dializálólépést és egy harmadik anioncserélő kromatográfiás lépést. Ebben a variánsban az első lépést előnyösen cézium-klorid-gradiensen végzett gyors ultracentrifugálással végezzük. A gyors kifejezés 0,5—4 óráig tartó ultracentrifugálást jelent. A második lépés során a vírust hígítjuk, vagy egy pufferrel szemben dializáljuk, hogy megkönnyítsük a kromatográfiás gélre való injektálását és az ultracentrifugáló-közeg eltávolítását. A harmadik lépést a korábban leírt anioncserélő, előnyösen erős anioncserélő kromatográfiát használva végezzük. Egy jellemző kísérletben a felülúszóban (vagy adott esetben intracellulárisan) learatott vírusból kiindulva végzünk egy első gyors ultracentrifugálást cézium-kloriddal (mint a 3. példában). Ezután a minta egyszerű hígítása után a mintát ioncserélő kromatográfiának vetjük alá (mint az 5.1. példában). A találmány szerinti eljárás ezen variánsának előnye abból származik, hogy a vírus elválasztásának két teljesen különböző módját alkalmazza (sűrűség és felületi töltés), és így a vírust adott esetben a két módszer hatékonyságát ötvöző minőségi szintre hozhatja. Ezenfelül a kromatográfia lépése egyidejűleg azt is lehetővé teszi, hogy az ultracentrifugáláshoz használt közeget eltávolítsuk (például cézium-klorid vagy bármely más, fentebb említett ekvivalens közeg).
A találmány egy másik tárgya a jodixanol, azaz 5,5'-[(2-hidroxi-1,3-propándiil)-bisz(acetil-amino)]-bisz[N,N’-bisz(2,3-dihidroxi-propil-2,4,6-trijód-1,3-benzénkarboxamid)] alkalmazása adenovírusok tisztítására.
A találmány szerinti eljárás véghezviteléhez különböző adenovírus részecskeképző sejteket alkalmazhatunk. Részletesen a részecskeképző sejteket különböző gyógyszerészetileg alkalmazható, azaz iparilag elfogadható körülmények között tenyészthető és ismert patogén jellemzővel nem rendelkező sejtekből kiindulva állíthatjuk elő. Beállt sejtvonalakról vagy primer tenyészetekről lehet szó, többek között humán retinoblasztokról, humán tüdő-karcinómasejtekről vagy vese-embrionálissejtekről. Előnyösen humán eredetű sejtekről van szó, melyek fertőzhetek adenovírussal. Ebben a tekintetben a KB, HeLa, 293, Verő, gmDBP6, HER, A549, HER stb. sejteket említhetjük meg.
A KB-vonal sejtjei humán epidermális karcinómából származnak. A sejtek és a tenyésztésüket lehetővé tevő körülmények az ATCC-nél hozzáférhetők (CCL17 számon). A humán HeLa-sejtvonal humán epitheliumkarcinómából származik. Ez is, és a tenyésztést lehetővé tevő körülmények az ATCC-nél férhető hozzá (CCL2 számon). A 293 vonal sejtjei humán embrionális vesesejtek [Grahan et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]. A sejtvonal genomjába integrált módon tartalmazza többek között a humán Ad5 adenovírusgenomjának bal részét (12%). A gmDP6 sejtvonal [Brough et al., Virology 190, 624 (1992)] az adenovírus E2 génjét az MMTV LTR promoterének irányítása alatt tartalmazó HeLa-sejtekből áll.
Kutyaeredetű sejtekről (BHK, MDCK stb.) is szó lehet. Ebben a tekintetben a kutya MDCK-sejtvonal-sejtjei az előnyösek. Az MDCK sejtek tenyésztési körülményeit például Macatney és munkatársai írták le [Science 44, 9 (1988)].
Különböző részecskeképző sejtvonalakat írtak le az irodalomban, és említenek a példák. Előnyösen az adenovírus E1 funkcióját transzkomplementáló sejtekről van szó. Még előnyösebben az adenovírus E1 és E4, vagy E1 és E2a funkcióit transzkomplementáló sejtekről van szó. Ezek a sejtek előnyösen humán embrionális veséből vagy retinából, vagy humán tüdőkarcinómából származnak.
A találmány így egy különösen előnyös eljárást nyújt rekombináns adenovírusok termelésére. Az eljárás alkalmas egy vagy több területében hiányos rekombináns vírusok termelésére, különösen az E1 régióban, vagy az E1 és E4 régiókban hiányos vírusok termelésére. Másrészt különböző, például a korábban említettek szerinti szerotípusú adenovírusok termelésére alkalmas.
Egy különösen előnyös módon a találmány szerinti eljárást olyan rekombináns adenovírusok termelésére alkalmazzuk, melyekben az E1 régió egy, az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 454. nukleotidtól a 3328. nukleotidig tartó Pvull-Bglll fragmentum deléciójával van inaktiválva. Ez a szekvencia az irodalomban és adatbázisokban hozzáférhető (lásd többek között Genebank no M73260). Egy másik előnyös megvalósítási módban az E1 régió egy, a 382. nukleotidtól a 3446. nukleotidig tartó Hinfll-Sau3A fragmentum deléciójával van inaktiválva. Egy különös megvalósítási módban az eljárás lehetővé teszi olyan vektorok termelését, melyek a teljes E4 régió delécióját hordozzák. Ezt egy, a 35 835-32 720. nukleotidoknak megfelelő Maell-Mscl fragmentum kivágásával lehet megvalósítani. Egy másik különleges módban csak az E4 egy funkcionális része deletált. Ez a rész legalább az ORF3 és ORF6 leolvasási kereteket tartalmazza. Példaképpen ezeket a kódoló leolvasási kereteket a genomból egy Pvull-Alul és egy Bglll-Pvull fragmentum formájában deletálhatjuk, melyek a 34 801-34 329. és a 34 115-33 126. nukleotidoknak fe7
HU 224 558 Β1 lelnek meg. Az Ad2 dl808 vírus vagy az Ad5 dl1004, Ad5 dl1007, Ad5 dl1011 vagy Ad5 dl1014 vírusok E4 régiójának delécióját is alkalmazhatjuk a találmány keretein belül. Ebben a tekintetben a találmány szerinti sejtek különösen előnyösek inaktív E1 régiót, és E4 régiójában egy, az Ad5 dl1014 genomjában lévővel azonos típusú deléciót tartalmazó vírusok, azaz ORF4 leolvasási keretüket megőrző E4 vírusok termelésére.
Amint a korábbiakban jeleztük, az E1 régióban lévő deléció előnyösen az E1A és E1B régiót vagy azok egy részét érinti. Ez a deléció elegendő kell legyen ahhoz, hogy a vírus ne legyen képes az autonóm replikációra egy sejtben. Az E1 régió találmány szerinti adenovírusban deletált része előnyösen a 454-3328. vagy a 382-3446. nukleotidokat tartalmazza.
A fentebb megadott helyzetek a vad Ad5 adenovírus publikált, adatbázisokban hozzáférhető szekvenciájára hivatkoznak. Kismértékű eltérések ugyan létezhetnek az adenovírusok különböző szerotípusai között, ezek a helyek azonban általában alkalmazhatók a találmány szerinti rekombináns adenovírusok kialakításához bármely szerotípusból, többek között az Ad2 és Ad7 adenovírusokból kiindulva.
Másrészt a termelt adenovírusok más változásokat is tartalmazhatnak genomjukban. Részletesen más régiók is deletáltak lehetnek, hogy megnöveljük a vírus kapacitását, és lecsökkentsük a virális gének expressziójával kapcsolatos másodlagos hatásokat. így többek között az E3 vagy IVa2 régiókat, vagy azok egy részét deletálhatjuk. Ami az E3 régiót illeti, különösen előnyös lehet, ha a gp19K fehérjét kódoló részt megőrizzük. Ez a fehérje teszi lehetővé, hogy az adenovírusvektor ne váltson ki immunválaszt, amely (i) hatását korlátozná, és (ii) nemkívánatos másodlagos hatásokat válthatna ki. Egy különleges mód szerint az E3 régió deletált, és a gp19K fehérjét kódoló szekvenciát egy heterológ promoter irányítása alatt újból bevezettük.
Mint a korábbiakban jeleztük, az adenovírusok nagyon hatékony génátviteli vektorok gén- és sejtterápiás felhasználások esetén. Ehhez genomjukban egy olyan heterológ nukleinsavszekvenciát lehet beépíteni, amelynek átvitele és/vagy expressziója egy sejtben, szervben vagy szervezetben kívánatos. Ez a szekvencia egy vagy több terápiás gént tartalmazhat, amilyenek például azok a gének, melyek transzkripciója és adott esetben transzlációja a célsejtben terápiás hatással rendelkező termékeket hoz létre. A terápiás termékek között különösen az enzimeket, vérszármazékokat, hormonokat, limfokineket: interleukinek, interferonok, TNF stb. (FR 9203120), növekedési faktorokat, neurotranszmittereket vagy ezek prekurzorait vagy szintézisük enzimjeit, trofikus faktorokat: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 stb., az apolipoproteineket: ApoAI, ApoAlV, ApoE stb. (WO 94/25073), a disztrofint vagy egy minidisztrofint (WO 93/06223), a tumorszuppresszor géneket: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev stb. (WO 94/24297), a véralvadásban szerepet játszó faktorokat kódoló géneket: VII, Vili, IX stb. faktorok, az öngyilkos (suicid) géneket: timidin-kináz, citozin-dezamináz stb., vagy egy természetes vagy mesterséges immunglobulint, vagy annak egy részét (Fab, ScFv stb.) (WO 94/29446) stb. említhetjük meg. A terápiás gén egy antiszensz gén vagy szekvencia is lehet, melynek expressziója a célsejtben lehetővé teszi, hogy a génexpressziót vagy az mRNS transzkripcióját szabályozzuk a sejtben. Az ilyen szekvenciák a célsejtben például az mRNS-sel komplementer RNS-sé íródnak át, és így gátolják annak fehérjévé való transzlációját, az EP 140 308 számú szabadalomban leírtak szerint. A terápiás gén egy antigénpeptidet kódoló gén is lehet, amely képes az embernél immunválaszt kiváltani, vakcinák előállítása céljából. Például az Epstein-Barr-vírusra, a HIV-vírusra, a hepatitis B vírusára (EP 185 573), az Aujeszky-betegség vírusára vagy tumorokra (EP 259 212) specifikus antigénpeptidekről lehet szó.
A heterológ nukleinsavszekvencia általában tartalmaz egy, a fertőzött sejtben működőképes transzkripciós promoterrégiót is, valamint egy, a kérdéses géntől 3’-irányban elhelyezkedő régiót, amely egy transzkripciós terminációs szignált határoz meg, és egy poliadenilációs helyet. Ezen elemek összessége képezi az expressziós kazettát. Ami a promoterrégiót illeti, szó lehet a kérdéses gén kifejeződéséért természetes módon felelős promoterrégióról, amennyiben valószínűsíthető, hogy ez működni fog a fertőzött sejtben. Szó lehet azonban eltérő eredetű (más fehérjék expressziójáért felelős vagy szintetikus) régiókról is. Többek között eukarióta vagy virális gének promoterszekvenciáiról, vagy bármely olyan promoterszekvenciáról vagy annak származékáról lehet szó, amely egy gén transzkripcióját specifikusan vagy nem specifikusan, indukálhatóan vagy nem indukálhatóan stimulálja vagy gátolja. Példaképpen a fertőzni kívánt sejt genomjából származó vagy egy vírusgenomjából származó promoterszekvenciákról lehet szó, például az adenovírus E1A, MLP génjeinek promotereiről, a CMV, LTR-RSV stb. promoterekről. Az eukarióta promoterek közül a mindenütt jelen levő promotereket (HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin stb.), az intermedier filamentumok promotereit (dezmin, neurofilamentumok, keratin, GFAP stb.), terápiás gének promotereit (MDR, CFTR, Vili faktor stb. típusúak), a szövetspecifikus promotereket (piruvát-kináz, viliin, a zsírsavak kötődéséért felelős bélfehérje promotere, a simaizomsejtek α-aktinjának promotere, májspecifikus promoterek, ApoAI, ApoAII, humán albumin stb.) vagy egy ingerre válaszoló promotereket (szteroidhormonok receptorai, retinsavreceptor stb.) említhetjük meg. Ezenkívül ezeket az expressziós szekvenciákat aktivációs vagy regulációs, vagy szövetspecifikus, vagy nagymértékű expressziót lehetővé tevő szekvenciák hozzáadásával módosíthatjuk is. Másrészt amennyiben a beépített nukleinsav nem tartalmaz expressziós szekvenciákat, azt a hiányos vírusba ilyen szekvenciák alá építhetjük be.
Másrészt a heterológ nukleinsav tartalmazhat, különösen a terápiás gén felett, egy szignálszekvenciát, amely a szintetizált terápiás terméket a célsejt szekréciós útvonalára irányítja. Ez a szignálszekvencia lehet a terápiás termék természetes szignálszekvenciája, de
HU 224 558 Β1 bármely más működőképes szignálszekvenciáról vagy mesterséges szignálszekvenciáról is szó lehet.
A terápiás gén expressziós kazettáját a rekombináns adenovírusgenomjának különböző helyeire építhetjük be, az irodalomban leírt módszerek szerint. Például az E1 deléció helyére építhető be. De beépíthető az E3 régió területére, a szekvencia fölé, vagy azt helyettesítve. A deletált E4 régió területére is helyezhetjük az expressziós kazettát.
A találmány tárgyát képezik még a találmány szerinti eljárással kapott tisztított víruskészítmények, valamint bármely gyógyszerkészítmény is, amely egy vagy több ezen eljárás szerint előállított hiányos rekombináns adenovírust tartalmaz. A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket helyi, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris, transzdermikus stb. beadás céljából formulázhatjuk.
Előnyösen a gyógyszerkészítmény gyógyászatilag elfogadható hordozókat tartalmaz az injektálható formulázáshoz. Különösen steril, izotóniás sóoldatokról (mononátrium-foszfát, dinátrium-foszfát, nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-klorid stb., vagy ilyen sók keveréke) vagy szárított, többek között liofilizált készítményekről lehet szó, melyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával lehetővé teszik injektálható oldatok előállítását. Más kötőanyagokat is használhatunk, mint például egy hidrogélt. E hidrogélt bármely biokompatibilis és nem citotoxikus polimerből (homo vagy hetero) előállíthatjuk. Ilyen polimereket Ir le például a WO 93/08845 számon közzétett bejelentés. Ezek közül egyesek, többek között az etilén-oxidból és/vagy a propilén-oxidból előállítottak, kereskedelmi forgalomban vannak. Az injekcióhoz alkalmazott vírusok dózisát különböző paraméterek, például az alkalmazott beadási mód, az illető betegség, a kifejezni kívánt gén vagy a kezelés kívánt időtartama függvényében választhatjuk meg. Általában a találmány szerinti rekombináns adenovírusokat 104 és 1014 pfu, előnyösen 106-101° pfu közötti dózisban formulázzuk és adjuk be. A pfu („plaque forming unit”) kifejezés egy adenovírusoldat fertőzőképességét fejezi ki, és egy megfelelő sejtkultúra fertőzésével, és általában 15 nap elteltével a fertőzött sejtplakkok számának mérésével határozzuk meg. Egy vírusoldat pfu-titere meghatározásának technikáit az irodalom bőségesen ismerteti.
A terápiás gén függvényében az így termelt vírusokat számos betegség kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatjuk, beleértve a genetikai betegségeket (disztrófia, cisztikus fibrózis stb.), a neurodegeneratív betegségeket (Alzheimer, Parkinson, ALS stb.), a rákokat, a véralvadás zavaraival vagy diszlipoproteinémiával társult betegségeket, a vírusfertőzéssel társult betegségeket (hepatitis, AIDS stb.) stb.
A találmányt részletesebben a következő példák segítségével írjuk le, melyek azonban csak illusztrációnak tekintendők, és nem korlátozzák az oltalmi kört.
Az ábrák leírása
1. ábra: A 4. példa szerint tisztított adenovírus stabilitásának vizsgálata.
2. ábra: A 4. példa szerint tisztított adenovírus
HPLC- (inverz fázis) analízise. Összehasonlítás a 3. példa szerinti adenovírussal.
3. ábra: Az ad-pGal adenovírus 293 sejtek felülúszójába történő felszabadulásának kinetikája, szemikvantitatív PCR-rel és plakk-assay-vel mérve.
4. ábra: Ultraszűrt adenovírus-felülúszó (5.1. példa) elúciós profilja Source Q15-ön.
5. ábra: Ultraszűrt adenovírus-felülúszóból (5.1.
példa) Source Q15 gyantán kromatográfiával összegyűjtött vírusok csúcsának HPLC Ressource Q analízise.
6. ábra: (A) Ultraszűrt Ad-APOA1 adenovírus-felülúszó (5.3. példa) elúciós profilja Source Q15 gyantán; és (B) a begyűjtött víruscsúcs analízise HPLC-n (Ressource Q).
7. ábra: (A) Ultraszűrt Ad-TK adenovírus-felülúszó (5.3. példa) elúciós profilja Source Q15-ön. A begyűjtött vírus különböző frakcióinak (a csúcs kezdete és vége) HPLC- (Ressource Q) analízise: (B) F2 frakció, a csúcs középső része; (C) F3 frakció, a csúcs kezdete; (D) F4 frakció, a csúcs vége.
8. ábra: Adenovírustermelő sejttenyészet felülúszó-koncentrátumának (5.4. példa) elúciós profilja Mono Q gyantán. BG25F1: Céziumon koncentrált és tisztított vírusfelülúszó. BG25C: Fertőzött, koncentrált felülúszó.
9. ábra: Adenovírustermelő sejttenyészet felülúszó-koncentrátumának (5.4. példa) elúciós profilja POROS HQ gyantán. BG25F1: Céziumon koncentrált és tisztított vírus felülúszó. BG25C: Fertőzött, koncentrált felülúszó.
10. ábra: Ultraszűrt adenovírus-felülúszó Sephacryl S1000HR/Superdex 200HR-en végzett gélpermeációs tisztításának profilja.
11. ábra: Egy, a találmány szerint tisztított vírussarzs elektronmikroszkópos vizsgálata.
12. ábra: Az 1,27 sűrűségű vírussáv elektronmikroszkópos vizsgálata.
A molekuláris biológia általános módszerei A molekuláris biológiában klasszikusan alkalmazott módszerek, mint a plazmid DNS preparatív extrakciója, a plazmid DNS cézium-klorid-gradiens centrifugálása, az agaróz- vagy akrilamid-gélelektroforézis, a DNSfragmentumok tisztítása elektroelúcióval, a fehérjék extrakciója fenollal vagy fenol/kloroformmal, a DNS sós közegbe való kicsapása etanollal vagy izopropil-alkohollal, az Escherichia coliban való transzformáció stb. jól ismertek a szakember számára, és az irodalom részletesen ismerteti azokat [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York (1987)].
HU 224 558 Β1
A pBR322, pUC típusú plazmidok és az M13 sorozat tágjai kereskedelmi eredetűek (Bethesda Research Laboratories). A ligálásokhoz a DNS-fragmentumokat méretük szerint elválaszthatjuk agaróz- vagy akrilamid-gélelektroforézissel, fenollal vagy fenol/kloroform elegyével extrahálhatjuk, etanollal kicsaphatjuk, majd T4 fág DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében inkubálhatjuk a forgalmazó előírásai szerint. A túllógó 5’-végek betöltését E. coli DNS-polimeráz I. Klenow fragmentumával (Biolabs) végezhetjük a forgalmazó előírásai szerint. A 3’ túllógó végek leemésztését T4 fág DNS-polimeráz (Biolabs) jelenlétében végezzük, az enzimet a gyártó előírásai szerint alkalmazva. A túllógó 5’-végeket S1 nukleázzal végzett kezeléssel távolítjuk el.
A szintetikus oligonukleotidok által irányított in vitro mutagenezist a Taylor és munkatársai által kifejlesztett eljárás szerint végezhetjük [Nucleic Acids Rés. 13, 8749-8764 (1985)], az Amersham által forgalmazott kitet alkalmazva. A DNS-fragmentumok úgynevezett PCR-technikával (Polimerase-catalyzed Chain Reaction, polimerázkatalizált láncreakció) [Saiki R. K. et al., Science 230, 1350-1354 (1985), Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth Enzym. 155, 335-350 (1987)] végzett enzimatikus amplifikációját egy „DNA-thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) alkalmazásával végeztük, a gyártó előírásai szerint. A nukleotidszekvenciák igazolását a Sanger és munkatársai által kidolgozott eljárás szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, (1977)], az Amersham által forgalmazott kitet használva.
Példák
1. példa
Részecskeképző sejtvonalak
A találmány keretein belül alkalmazott részecskeképző sejtvonalak bármely adenovírussal fertőzhető sejtvonalból származhatnak, amely terápiás célú felhasználással kompatibilis. Előnyösen a következő sejtvonalak közül választott sejtről van szó:
- A 293 sejtvonal sejtjei
A 293 sejtvonal egy humán embrionális vesesejtvonal, amely az 5 szerotípusú adenovírusgenomjának a bal ITR-t, a részecskeképződésért felelős területet, az E1a és E1b részt tartalmazó E1 területet, a pIX fehérjét kódoló területet és a plVa2 fehérjét kódoló terület egy részét magában foglaló bal szélét (körülbelül 11-12%) tartalmazza [Graham et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]. A sejtvonal képes transzkomplementálni az E1 régióban hiányos rekombináns adenovírusokat, azaz amelyekből az E1 régió vagy annak egy része hiányzik, és így képes magas titerű vírussarzsokat termelni.
- Az A549 sejtvonal sejtjei
Az adenovírus E1 régióját komplementáló sejteket hoztunk létre az A549 sejtekből [Imler et al., Gene Ther., 75 (1996)]. Ezek a sejtek egy indukálható promoter irányítása alatt tartalmazzák az E1 régió egy kisebb fragmentumát, amelyből hiányzik a bal ITR.
- A HER-sejtvonal sejtjei
A humán embrionális retina (HER)-sejtek fertőzhetők adenovírussal [Byrd et al., Oncogene 2, 477 (1988)]. Az ezekből a sejtekből előállított adenovírus részecskeképző sejteket például a WO 94/28152 számon közzétett bejelentésben írták le, vagy Fallaux és munkatársai cikkében [Hűm. Gene Ther., 215 (1996)]. Különösen a 911 sejtvonalat említhetjük meg, amely az Ad5 adenovírusgenomjának E1 régióját tartalmazza a 79. nukleotidtól az 5789. nukleotidig, a HER-sejtek genomjába beépülve. Ez a sejtvonal lehetővé teszi E1 régióban hiányos vírusok termelését.
- IGPR2 sejtek
Az IGPR2 sejtek a 293 sejtekből az E4 régió egy indukálható promoter szabályozása alatt álló funkcionális egységének beépítésével kapott sejtek. A sejtek lehetővé teszik E1 és E4 régiójában hiányos vírusok termelését [Yeh et al., J. Virol., 70 (1996)].
- VK-sejtek
A VK-sejtek (VK2-20 és VK10-9) a 293 sejtekből az egy indukálható promoter szabályozása alatt álló E4 régió egészének és a pIX fehérjét kódoló területnek a beépítésével kapott sejtek. A sejtek E1 és E4 régiójukban hiányos vírusok termelését teszik lehetővé [Krougliak et al., Hűm. Gene Ther. 6, 1575 (1995)].
- 293E4 sejtek
A 293E4 sejtek a 293 sejtekből a teljes E4 régió beépítésével kapott sejtek. Ezek E1 és E4 régiójukban hiányos vírusok termelését teszik lehetővé [WO 95/02697; Cancer Gene Ther., 322 (1995)].
2. példa
Az alkalmazott vírusok
A következő példák keretein belül előállított vírusok az E. coli LacZ génjét tartalmazó adenovírus (Ad-pGal), az I. típusú herpes simplex vírus timidin-kinázát kódoló gént tartalmazó adenovírus (Ad-TK), a humán p53 tumorszuppresszor fehérjét kódoló gént tartalmazó adenovírus és az A1 apolipoproteint kódoló vírus (Ad-ApoAI). A vírusok az Ad5 szerotípusból származnak, és a következő szerkezettel rendelkeznek:
- deléció az E1 régióban, amely például a 382. nukleotidtól (Hinfl hely) a 3446. nukleotidig (Sau3a hely) terjedő részt foglalja magában,
- az RSV vagy a CMV promoter irányítása alatt álló génexpressziós kazetta a deléció helyére beépítve,
- az E3 régió deléciója.
A vírusok előállítását az irodalom ismerteti [WO 94/25073, WO 95/14102, FR 95/01632, Stradford-Perrcicaud et al., J. Clin. Invest., 626 (1992)]. Természetesen bármely más konstrukciót termelhetünk a találmány szerinti eljárással, többek között más heterológ géneket hordozó és/vagy más deléciókkal rendelkező (E1/E4 vagy E1/E2 például) vírusokat.
3. példa
Vírustermelés sejtlízissel
A példa az eddigi vírustermelési eljárást ismétli meg, amely abból áll, hogy a részecskeképző sejteket lizálják a termelt vírusok kinyeréséhez.
HU 224 558 Β1
293 sejteket 80-90% összefolyásnál tenyésztőpalackban fertőztünk Ad-pGal vagy Ad-TK vírusok oltósarzsával (2. példa) 3-5 vírus/sejt arányban (Multiplicity of Infection, MOI=3-5). Az inkubáció 40-72 órán át tartott, az aratás idejét a sejtek mikroszkópos megfigyelésével döntöttük el, melyek egyre kerekebbé, fénytörőbbé és a tenyészedényhez egyre kevésbé tapadóvá válnak. Az irodalomban a vírusciklus 24-36 órán át tart.
Laboratóriumi termelés szintjén fontos, hogy a sejteket még leválásuk előtt learassuk, hogy sejtveszteség nélkül távolítsuk el a fertőzési közeget az aratás pillanatában, majd a sejteket újból felvegyük minimális térfogatban (a koncentráció változása a tenyészet méretétől függően 10-100-szoros).
A vírust ezután 3-6 egymás utáni fagyasztási-olvasztási ciklussal (etanol-szárazjég -70 °C, vízfürdő 37 °C) felszabadítjuk a magból.
A kapott sejtlizátumot azután alapsebességgel (2000-4000 rpm) centrifugáljuk, és a felülúszót (tisztított sejtlizátum) azután cézium-klorid-gradiensen végzett ultracentrifugálással két lépésben tisztítjuk:
egy első gyors ultracentrifugálás (lépés) 1,5 órán át 35 000 rpm-mel, Sw41 rotor, két, 1,25 és 1,40 sűrűségű céziumrétegen, ami közrefogja a vírus sűrűségét (1,34), hogy a vírust elválasszuk a közeg proteinjeitől; a rotorok lehetnek „swinging” rotorok (Sw28, Sw41 Beckman) vagy fix szögű rotorok (Ti 45, Ti 70, Ti 70.1 Beckman), a kezelendő térfogattól függően;
egy második hosszabb gradienscentrifugálás (10-40 óra, az alkalmazott rotortól függően), például 18 óra 35 000 rpm-mel Sw41 rotorral, ami az igazi és egyedi vírustisztítási lépést képezi. A vírus lineáris gradiensben egyensúlyban van 1,34 sűrűségnél.
Általában ebben a lépésben a vírussáv a legnagyobb. Néha megfigyelhetünk két kisebb sűrűségű, vékony sávot, melyek elektronmikroszkópos vizsgálata azt mutatta, hogy üres vagy roncsolt vírusokról van szó, és a legkisebb sűrűségű sáv esetében vírusalegységekről (pentonok, hexonok). Ez után a lépés után a vírust a csőbe gyűjtöttük össze a cső tűvel végzett lecsapolásával, és a céziumot dialízissel vagy kisózással G25-ön eltávolítjuk.
4. példa
Felülúszóban lévő vírusok tisztítása
A példa egy kísérletet ír le vírusok termelésére spontán felszabadulás után. A vírust azután ultraszűréssel aratjuk le, majd cézium-kloridon tisztítjuk.
4.1. Eljárás
Az eljárásban a 3. példával ellentétben a sejteket nem 40-72 órával a fertőzés után aratjuk le, hanem az inkubációt meghosszabbítjuk 8-12 nap közötti ideig, hogy a sejtek teljes lízisét érjük el anélkül, hogy szükségünk lenne a fagyasztás-felolvasztás ciklusok véghezvitelére. A vírusok a felülúszóban találhatók.
A felülúszót csökkenő porozitású (10 μπι/1,0 μΓη/0,8—0,2 μιτι) tömörített szűrőkön szűréssel tisztítottuk.
A vírusok mérete 0,1 μηι, és ebben a lépésben nem figyeltünk meg a legkisebb porozitású szűrőn való fennmaradásnak köszönhető vírusveszteséget.
A felülúszót a tisztítás után tangenciális ultraszűréssel koncentráltuk Millipore spirális membránon, melynek vágási küszöbe 300 kD.
A találmányban ismertetett kísérletekben a koncentrálás mértékét a rendszer holt térfogata határozta meg, ami 100 ml. 4-20 liter felülúszó térfogatokat koncentráltunk ezzel a rendszerrel, ami nehézség nélkül lehetővé tette 100-200 ml koncentrátum-térfogatok nyerését, ami 20-100-szoros koncentrációváltozásnak felel meg.
A koncentrátumot azután 0,22 pm-en szűrtük, majd cézium-kloridon centrifugálva tisztítottuk, amint azt a 3. példában leírtuk, amit egy dialízislépés követett.
4.2. Eredmények
Tisztaság
Míg az intracelluláris vírusokat tartalmazó cső látványa zavaros, csapadékkal (lipidek, fehérjék), ami néha a vírussávot is érinti, a találmány szerinti eljárás első cézium-kloridon végzett centrifugálási lépése után kapott víruskészítmény egy, a közeg szennyező anyagaitól jól elkülönült vírussávot mutat, ami a felső fázisban marad. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat Resource Q oszlopon (vö. 5. példa) szintén kimutatta a kiindulási anyag tisztaságának a fertőzött felülúszó ultraszűrésével kapott, a nukleinsav (OD 260/280 arány 1,8 vagy nagyobb) és fehérje (OD 260/280 arány kisebb 1-nél) szennyeződések csökkenésével járó növekedését.
A vírus stabilitása felülúszóban 37 °C-on
A vírus stabilitását titrálással, plakk-assay-módszerrel határoztuk meg fertőző tenyészet-felülúszóból, melynek aliquotjait a 37 °C-on történt inkubációfertőzés utáni különböző időpontjaiban levettük. Az eredményeket itt adjuk meg.
Ad-TK vírus:
- titer 10 nappal a fertőzés után=3,5*108 pfu/ml
- titer 20 nappal a fertőzés után=3,3*108 pfu/ml
Ad-pGal vírus:
- titer 8 nappal a fertőzés után=5,8*108 pfu/ml
- titer 9 nappal a fertőzés után=3,6*10® pfu/ml
- titer 10 nappal a fertőzés után=3,5*10® pfu/ml
- titer 13 nappal a fertőzés után=4,1 *10® pfu/ml
- titer 16 nappal a fertőzés után=5,5*108 pfu/ml
A kapott eredmények azt mutatják, hogy legalább 20 nappal a fertőzés utánig a felülúszó titere stabil a mérés pontosságának határain belül. Másrészt az 1. ábra azt mutatja, hogy az elúciós pufferben a vírus legalább nyolc hónapig stabil -80 °C-on ugyanúgy, mint -20 °C-on.
A készítmény specifikus fertőzőképessége
Ez az érték, ami a HPLC-vel mért vírusrészecskék számának a pfu-számhoz viszonyított arányának felel meg, a víruskészítmények fertőzőképességéről tájékoztat. Az FDA előírásai szerint 100-nál kisebb kell legyen. Az értéket a következőképpen mértük.
Két sorozat 293 sejteket tartalmazó tenyésztőpalackot párhuzamosan fertőztünk ugyanabban a pillanatban ugyanazzal a vírusinokulummal ugyanolyan kö11
HU 224 558 Β1 rülmények között. A kísérletet Ad-pGal rekombináns adenovírus esetében végeztük el, majd megismételtük az Ad-TK adenovírus esetében is. Minden adenovírus esetében az egyik sorozat palackot 48 órával a fertőzés után arattuk le, és ezt úgy tekintettük, mint intracel- 5 luláris vírusok termelése, melyet céziumgradiensen tisztítottunk a fagyasztás-felolvasztás után. A másik sorozatot 10 napig tenyésztettük a fertőzés után, és a vírust a felülúszóból arattuk le. A kapott tisztított készítményeket plakk-assay-vel titráltuk, és az összes vírus- 10 részecske számának meghatározását a PVII protein koncentrációjának reverz fázisú HPLC-vel végzett mérésével végeztük C4 Vydac 4,6x50 mm oszlopon a minták 6,4 M guanidin denaturálása után. A PVII fehérje mennyisége korrelációban van a vírusrészecskék 15 számával, 720 PVII kópiát számolva vírusonként [Horwitz, Virology, 2. kiadás (1990)]. Ez az eljárás összhangban van a vírusrészecskék tisztított készítményből denzitometriás eljárással történő meghatározásával, amit 260 nm-en végeznek, specifikus extinkciós 20 koefficiens 1,0, abszorbanciaegység=1,1x1012 részecske/ml.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy az Ad-pGal vírus esetében az arány 16 a felülúszóból származó vírus esetében, és 45 az intracelluláris vírus 25 esetében. Az Ad-TK vírus esetében az arány 78 abban az esetben, amikor a vírus aratását a felülúszóból végeztük, és 80, amikor az aratást intracelluláris eljárással végeztük.
Elektronmikroszkópos vizsgálat 30
Az eljárás lehetővé teszi, hogy felfedjük az együtt kinyert üres részecskék vagy szabad vírusalegységek jelenlétét, valamint, hogy becsüljük a tisztított víruskészítmény fehérjeszennyeződését vagy a vírusrészecskék nem disszociábilis aggregátumainak jelenlétét. 35
Módszer: 20 μΙ mintát helyeztünk egy szénnel bevont gridre, majd a negatív festéssel való megfigyeléshez 1,5%-os uranil-acetáttal kezeltük. A megfigyeléshez Jeol 1010 mikroszkópot alkalmaztunk 50-100 kV-tal. 40
Eredmény: A felülúszóból aratott víruson végzett vizsgálat tiszta készítményt mutat, szennyeződés nélkül, aggregátumok nélkül és üres vírusrészecskék nélkül. Ráadásul a vírus rostjait, valamint szokásos geometriai szerkezetét meg lehet különböztetni. Az ered- 45 mények alátámasztják a találmány szerint kapott vírusrészecskék jó minőségét.
A fehérjeprofil vizsgálata HPLC-vel és
SDS-PAGE-vel
SDS-PAGE vizsgálat 50 μΙ mintát Laemmli-pufferben oldottunk fel [Natúré 227, 680-685 (1970)], 5 percig 95 °C-on redukáltuk, majd Novex 1 mmx10 lyuk, 4-20% gradiens gélre töltöttük. A futtatás után a géleket Coomassie kékkel festettük, és Image master VDS Pharmacia készüléken analizáltuk. Az analízis a felülúszóból learatott vírusok esetében az irodalomban [Lennart Philipson, H.
S. Ginsberg eds., Plenum press, 310-338 (1984)] található adatokkal egyező elektroforetikus profilt mutatott.
Reverz fázisú HPLC vizsgálat A 2. ábra a három egymásra vetített kromatogramot mutatja, melyeket a két intracellulárisan learatott és az egyetlen, a felülúszóból kiinduló eljárással tisztított mintából kaptunk. A kísérleti körülmények a következők voltak: Vydac 254. ref. számú Tp 5405, RPC4 4,6x50 mm, A oldószer: H20+0,07% TFA, B oldószer: CH3CN+0,07% TFA, lineáris gradiens: T=0 perc B%=25, T=50 perc B%=50%, átfolyást ml/perc, detektort 15 nm. A kromatogramok azt mutatják, hogy a minták teljesen azonosak, a csúcsok relatív intenzitásában nincs különbség. A csúcsok természetét szekvenálással határoztuk meg, és kimutattuk, hogy a jelen lévő fehérjék mind virális eredetűek (lásd az itt következő táblázatot).
Csúcs (perc) | Azonosítás |
19-20 | PVII prekurzor |
21-22 | PVII prekurzor, PX1a12 prekurzor |
27-28 | PVI prekurzor, PX prekurzor |
32-22 | PX prekurzor |
34 | |
35-36 | érett PVII |
37 | érett PVII, PVIII prekurzor |
39=11 | érett PVI |
45 | PX |
46 | PIX |
A transzdukciós hatékonyság és a citotoxicitás in vitro vizsgálata
A citotoxicitás vizsgálatát úgy végeztük, hogy HCT116 sejteket fertőztünk 24 lyukas lemezen növekvő MOl-val, és meghatároztuk az élő sejteknek nem fertőzött kontrolihoz viszonyított arányát 2 és 5 nappal a fertőzés után, kristályibolya festési módszer segítségével.
Az eredményeket az itt található táblázatban mutatjuk be.
Adenovírus | MOI=3,0 | MOI=10,0 | MOI=30,0 | MOI=100,0 |
Felülúszó, 2 nap | 91% | 96% | 87% | 89% |
Felülúszó, 5 nap | 97% | 90% | 10% | <5% |
HU 224 558 Β1
A transzdukció hatékonyságának vizsgálata
Az Ad-pGal adenovírus esetében egy készítmény transzdukciós hatékonyságát úgy határoztuk meg, hogy 24 lyukas lemezen tenyésztett replikációra nem permisszív W162 sejteket fertőztünk vírusrészecskék növekvő koncentrációival. Egy adott azonos vírusmennyiség esetében megszámoljuk 48 órával a fertőzés után a béta-galaktozidáz-aktivitást kifejező sejteket X-gal-lal, mint szubsztráttal való inkubálás után. Minden kék sejtet úgy számítunk, mint egy transzdukciós egység (TDU), az eredményt megszorozzuk a minta hígításának mértékével, hogy megkapjuk a minta transzdukciós egységben kifejezett koncentrációját. A transzdukciós hatékonyságot ezután a vírusrészecskék koncentrációjának a TDU-koncentrációhoz viszonyított arányával fejezzük ki. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a tisztított vírusok jó in vitro transzdukciós hatékonysággal rendelkeznek.
Az intracerebrális expresszié vizsgálata in vivő
A találmány szerinti vírusok az in vivő génátvitel és génexpresszió terén mutatott hatékonyságának becslésére az adenovírusokat sztereotaxikus úton injektáltuk immunkompetens OF1 egerek striatumába. Ehhez a vírus 1 μΙ 107 pfu titerű térfogatát a következő sztereotaxikus helyekre injektáljuk (0 mm-nél metsző sáv esetében): anteroposterior: +0,5; mediolaterális: 2; mélység: -3,5.
Az agyakat 7 nappal az injektálás után vizsgáltuk. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a transzdukció hatásfoka nagy: sejtek milliói vannak transzdukálva, az expresszió nagyon intenzív a magban, és a diffúzió gyakori és intenzív a citoplazmába.
4.3. A vírusfelszabadulás kinetikája
A példa az adenovírusok részecskeképző sejttenyészetek felülúszójába való felszabadulásának kinetikai vizsgálatát írja le.
A vizsgálatot szemikvantitatív PCR-rel végeztük az adenovírusgenomjának területeivel komplementer oligonukleotidok segítségével. Ehhez a linearizált vírus-DNS-t (1-10 ng) dXTP (2 μΙ, 10 mM), egy specifikus oligonukleotidpár és Taq Polimeráz (Cetus) jelenlétében inkubáltuk 10XPCR pufferben, és 30 amplifikációs ciklusnak vetettük alá a következő körülmények között: 2 perc 91 °C, 30 ciklus (1 perc 91 °C, 2 perc anneáló-hőmérséklet, 3 perc 72 °C), 5 perc 72 °C, majd 4 °C. A PCR-kísérleteket a következő szekvenciájú oligonukleotidpárokkal végeztük:
- 1. pár:
TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT (6368), 1. számú szekvencia
ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA (6369), 2. számú szekvencia
- 2. pár:
TTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGG (6362), 3. számú szekvencia
CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA (6363),
4. számú szekvencia
- 3. pár:
TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAGGT (6364), 5. számú szekvencia
AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA (6365),
6. számú szekvencia
- 4. pár:
GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG (6366), 7. számú szekvencia
AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT (6367), 8. számú szekvencia
A felülúszóba felszabadult adenovírusok mennyiségét Ad-pGal-lal fertőzött 293 sejtek felülúszójában mértük, a fertőzés után különböző időpontokban. A kapott eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Azt mutatják, hogy a sejtből való felszabadulás a fertőzés utáni 5. vagy a 6. napon kezdődik.
Természetesen bármely másik vírusmeghatározási módszert alkalmazhatjuk ugyanebből a célból, bármely másik részecskeképző sejtvonallal és bármely adenovírus esetében.
5. példa
A vírus tisztítása ultraszűréssel és ioncserével
A példa azt mutatja be, hogyan tisztítható a koncentrátumban lévő adenovírus közvetlenül és egyetlen anioncserélő kromatográfiás lépésben nagyon magas hozammal.
5.1. Módszer
A kísérletben a kiindulási anyagot tehát a 4. példában leírt koncentrátum (vagy ultraszűrési maradék) képezi. A szűrési maradék teljes proteintartalma 5 és 50 mg/ml közötti, előnyösen 10 és 30 mg/ml közötti, PBS pufferben (10 mM foszfát, pH 7,2, ami 150 mM NaCI-ot tartalmaz).
A víruskészitményböl kapott ultraszűrési felülúszót egy Source Q15 (Pharmacia) gyantát tartalmazó oszlopra injektáljuk, melyet 250 mM NaCI-ot, 1,0 mM MgCI2-ot és 10% glicerint tartalmazó 50 mM Tris/HCI (pH 8,0) pufferrel (A puffer) egyensúlyoztunk ki. 10 oszloptérfogat A pufferrel történő mosás után az adszorbeálódott anyagokat NaCI 25 oszloptérfogatnyi lineáris gradiensével eluáljuk (250 mM-1 M) 60-300 cm/óra, előnyösen 12 cm/óra lineáris átfolyással. A tipikus 260 nm-nél kapott elúciós profilt a
4. ábrán mutatjuk be. A vírusrészecskéket tartalmazó frakciókat gyűjtjük. Ez egy vékony szimmetrikus csúcsnak felel meg, melynek retenciós ideje egybevág az ultracentrifugálással tisztított vírusrészecske-készítmény kapott retenciós idejével. A fent leírt körülmények között minimálisan 30 mg összfehérjét lehet injektálni Source Q15 gyanta ml-enként, miközben a vírusrészecskecsúcs kiváló felbontása megmarad.
Egy reprezentatív kísérletben, melyet pGal adenovíruskészítménnyel (2. példa) végeztünk, 12,6 mg összfehérjét, vagy 5*1O10 pfu-t és 1,6*101° TDU-t injektáltunk Resource Q oszlopra (1 ml). A kromatográfia (3,2 ml, 5. ábra) után gyűjtött vírusrészecskecsúcs 173 pg fehérjét, és 3,2*101° pfu-t és 2,3*101° TDU-t tartalmazott. A vírusrészecskéket tehát 70-szeresre tisztítottuk (proteinmennyiségre vonatkoztatva), és a tisztítás hozama 64% pfu-ban és 142% TDU-ban (lásd az alábbi táblázatot).
HU 224 558 Β1
Lépés | Mintakoncentráció | Kiindulási térfogat | Kapott térfogat | Hozam | Tisztítási faktor |
Felülúszó | 5000 ml | 5000 ml | 100% | ||
Ultraszűrés 300 kD | fehérje: 6,3 mg/ml PFU: 2,5*1010/ml TDU: 8,1*109/ml részecske: 3,8*1011/ml rész./pfu arány: 16,0 rész./tdu arány: 47,0 | 5000 ml | 200 ml | 100% | 5 |
Ioncserélő tisztítás (egyetlen lépés) | PFU: 1,0*1010/ml TDU: 7,2*109/ml részecske: 2,0*101/ml rész./pfu arány: 20 rész./tdu arány: 27 | 2,0 ml koncentrátum | 3,1 ml eluátum | protein: 85% | 70 |
CsCI-gradiens | PFU: 1,1*1011/ml TDU: 7,5*1010/ml részecske: 2,2*1012/ml rész./pfu arány: 22 rész./tdu arány: 29 | 28,3 ml koncentrátum | QSP4.1 ml | PFU: 66% TDU: 130% részecske: 84% HPLC-tisztaság 98,4% | 70 |
5.2. Tisztaság
Ez után a tisztítási lépés után a gyűjtött frakció 98%-nál nagyobb tisztaságot mutat a vírusrészecskék tekintetében (UV-detektálás 260 nm-nél), nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) vizsgálva Resource Q oszlopon (1 ml) a következő kromatográfiás rendszerben: 10 μΙ az 5.1. példában leírt módon tisztított frakciót injektáltunk egy 50 mM Tris/HCI (pH 8,0) pufferrel (B puffer) kiegyensúlyozott Resource Q15 oszlopra (1 ml gél, Pharmacia). 5 ml B pufferrel való öblítés után az adszorbeálódott anyagokat NaCI 30 ml B pufferben készült lineáris gradiensével (0-1 M) eluáltuk 1 ml/perc átfolyással. Az eluált anyagokat 260 nm-en detektáltuk. A HPLC analízis azt mutatja (5. ábra), hogy az ultraszűrési maradékban jelen levő maradvány borjúszérum-albumin a preparatív kromatográfia során teljesen eltávolítódik. A tisztított frakcióban mennyiségét kevesebb mint 0,1%-ra becsültük. A Westernblot-vizsgálat anti-BSA poliklonális antitesttel (ECL előhívással, Amersham) azt jelzi, hogy a BSA-tartalom a kromatográfiás készítményben kevesebb 100 ng/vírus mg értéknél.
A kromatográfiával tisztított adenovírusfrakció elektroforetikus vizsgálatát poliakrilamid-gélen (4-20%) végeztük denaturáló körülmények között (SDS). A fehérjesávokat azután ezüst-nitrát-festéssel mutattuk ki. A vizsgálat azt mutatja, hogy a kromatográfiával kapott adenovíruskészítmény tisztasága legalább azonos a klasszikus úton, ultracentrifugálással kapott értékkel, mivel nincs kiegészítő fehérjesáv, ami a készítmény szennyeződését mutatná nem adenovírusfehérjékkel.
A kromatográfiával kapott adenovíruskészítmény a260 nrr/A280 nm abszorbanciaaránya 1,30±0,05. Ez az érték, ami azonos az ultracentrifugálással kapott legjobb készítményekével, azt jelzi, hogy a készítményben nincsenek szennyező fehérjék vagy szennyező nukleinsavak.
A kromatográfiával tisztított Ad-pGal vírus 4.2. példában leírt módon végzett elektronmikroszkópos vizsgálata tiszta, szennyeződéstől, aggregátumtól és üres vírusrészecskéktől mentes készítményt mutat (11. ábra).
Ezenfelül a készítmény cézium-klorid-gradiens-ultracentrifugálása egyetlen 1,30 sűrűségű sávot mutat, ami alátámasztja a kromatográfiás készítményben az esetleges üres vírusrészecskék vagy kapszidfragmentumok által történt szennyeződések hiányát. A tisztítás során a vírus kromatográfiás csúcsot egy váll (vagy másodlagos csúcs) követi annak hátsó részén, amelyet nem a főcsúccsal együtt gyűjtöttünk. A frakció cézium-klorid-gradiens-ultracentrifugálása egy 1,27 sűrűségű sávot mutat, és a frakció összetételének vizsgálata azt mutatja, hogy nem tartalmaz nukleinsavat. Az elektronmikroszkópos vizsgálat azt mutatja, hogy a frakció szabálytalan formájú részecskéket tartalmaz, melyek felületükön perforáltak (12. ábra). Tehát üres (DNS-t nem tartalmazó), és nem teljes részecskékről van szó. Ez tehát azt mutatja, hogy az adenovírus kromatográfiás tisztítása eltávolítja a tisztítás előtt kis mennyiségben jelen levő üres részecskéket.
5.3. Egy terápiás gént, például az ApoAI vagy a timidin-kináz-fehérjéket kódoló géneket tartalmazó adenovírus tisztítása
A példa azt mutatja be, hogy a genomjukban terápiás fehérjéket kódoló heterológ nukleinsavszekvenciákat hordozó adenovírusok közvetlenül és egyetlen ioncserélő kromatográfiás lépésben tisztíthatok. Azt is bemutatja, hogy az adenovírus kromatográfiás viselkedése független a hordozott heterológ nukleinsavszekvenciától, ami lehetővé teszi, hogy ugyanazt a tisztítási eljárást alkalmazzuk különböző heterológ nukleinsavszekvenciákat hordozó különböző adenovírusok esetében.
Egy tipikus tisztítási kísérletben egy genomjában az ApoAI fehérjét kódoló heterológ nukleinsavszekvenciát hordozó adenovírust (2. példa) (WO 84/25073) tisztítottunk az 5.1. példában leírt rendszerben, egy sejttenyészet 10 nappal a fertőzés után learatott koncentrált felülúszójának 18 ml-ét (72 mg fehérje, 1,08*1013 részecske) kromatografálva. A kromatográfia után gyűjtött vírusrészecskéket tartalmazó csúcs (14 ml; 1,4 mg fehérje) 9,98* 1012 részecskét tartalmazott, ami részecskékben számolva 92%-os hozamnak
HU 224 558 Β1 és 51-szeres tisztításnak felel meg. Ez után a tisztítási lépés után a gyűjtött frakció 98%-nál nagyobb tisztaságot mutatott vírusrészecskékre nézve az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiás vizsgálat során (6B. ábra). Az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiával tisztított adenovírusfrakció elektroforézises vizsgálata azt mutatta, hogy a készítmény tisztasága legalább azonos a klasszikus úton ultracentrifugálással kapott készítményével, és hogy mentes a szennyező fehérjéktől vagy nukleinsavaktól.
Egy másik tipikus tisztítási kísérletben egy genomjában az 1. típusú herpes simplex timidin-kináz-fehérjéjét kódoló heterológ nukleinsavszekvenciát hordozó adenovírust (2. példa) (WO 95/14102) tisztítottunk az
5.1. példában leírt rendszerben kromatografálva egy sejttenyészet koncentrált felülúszójának 36 ml-ét (180 mg fehérje; 4,69*1013 részecske) (7A. ábra). A kromatográfia után gyűjtött vírusrészecskéket tartalmazó csúcs (20 ml; 5,6 mg fehérje) 4,28*1013 részecskét tartalmazott, ami részecskékre nézve 91 %-os hozamnak és 32-szeres tisztításnak felel meg. Ez után a tisztítási lépés után a gyűjtött frakció (7B-D. ábrák) 99%-nál nagyobb tisztaságot mutatott vírusrészecskékre nézve az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiás vizsgálat során, és abszorbanciaaránya 1,29 volt. Az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiával tisztított adenovírusfrakció elektroforézises vizsgálata azt mutatta, hogy a készítmény tisztasága legalább azonos a klasszikus úton ultracentrifugálással kapott készítményével, és hogy mentes a szennyező fehérjéktől vagy nukleinsavaktól.
5.4. Intracelluláris adenovírus tisztítása erős anioncserélővei
A példa azt mutatja be, hogy a genomjában egy heterológ nukleinsavat tartalmazó adenovírus hogyan tisztítható közvetlenül egyetlen ioncserélő lépésben egy, az említett vírust termelő részecskeképző sejtlizátumból.
Egy tipikus tisztítási kísérletben egy genomjában a β-gal fehérjét kódoló heterológ nukleinsavszekvenciát hordozó adenovírust tisztítottunk, az 5.1. példában leírt rendszerben kromatografálva egy 3 nappal a fertőzés után kémiai lízissel (1% Tween 20) learatott sejttenyészet koncentrált lizátumát (FineLine Pilot 35 oszlop, Pharmacia, 100 ml Source Q15 gyanta). A kromatográfia után gyűjtött vírusrészecskéket tartalmazó csúcs (110 ml) 2,15*1014 részecskét tartalmazott, ami 85%-os hozamnak felel meg részecskékre nézve. Ez után a tisztítási lépés után a gyűjtött frakció 98%-nál nagyobb tisztaságot mutatott vírusrészecskékre nézve az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiás vizsgálat során. Az 5.2. példában leírt körülmények között végzett kromatográfiával tisztított adenovírusfrakció elektroforézises vizsgálata azt mutatta, hogy a készítmény tisztasága legalább azonos a klasszikus úton ultracentrifugálással kapott készítményével, és hogy mentes a szennyező fehérjéktől vagy nukleinsavaktól.
5.5. A vírus tisztítása ultraszűréssel és ioncserélő kromatográfiával különböző oszlopokon
A példa azt mutatja be, hogy a koncentrátumban lévő adenovirusok hogyan tisztíthatok közvetlenül és egyetlen ioncserélő kromatográfiás lépésben a Source Q15 hordozótól eltérő gélt használva, ahol az anioncserélés ugyanazon az elválasztási elven, azaz a hordozó kvaterner amincsoportjaival létrejövő kölcsönhatás elvén működik.
Egy tipikus adenovírustisztítási kísérletben különböző (a βΘθΙ, az Al apolipoproteint és a TK-t kódoló) rekombináns adenovírusokat tisztítottunk Source Q30 gél oszlopon kromatografálva, az 5.1. példában leírt módszert követve. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a Source Q30 gél lehetővé teszi, hogy 85%-os tisztaságú víruskészítményt kapjunk 70-100% közötti hozammal. Ezenfelül a kapott eredmények azt mutatják, hogy a Q30 hatékonysága az adenovirusok tisztítása esetében 1000 (az elméleti tányérszámban kifejezve), és terhelhetősége (az a maximális vírusmennyiség, amely a csúcsok megváltozása nélkül kromatografálható) 0,5-1 *1012 vírusrészecske/ml. Az eredmények azt mutatják, hogy a Source Q30 gél megfelel rekombináns adenovirusok tisztítására, még akkor is, ha tulajdonságai kevésbé kedvezőek a Source Q15 tulajdonságainál (tisztaság 99%-os, hatékonyság 8000, és kapacitása 2,5-5*1012 részecske/ml).
Egy másik tipikus adenovírustisztítási kísérletben βββΙ adenovírust tisztítottunk Mono Q HR 5/5 oszlopon az 5.1. példában leírt módszert követve. Az így kapott, az ultraszűrési maradéknak és a tisztított víruskészítménynek megfelelő kromatográfiás képet a 8. ábrán mutatjuk be.
Egy másik tipikus adenovírustisztítási kísérletben βΘθΙ adenovírust tisztítottunk Poros HQ/M oszlopon az
5.1. példában leírt módszert követve. Az így kapott, az ultraszűrési maradéknak és a tisztított víruskészítménynek megfelelő kromatográfiás képet a 9. ábrán mutatjuk be.
6. példa
A vírus tisztítása ultraszűréssel és gélpermeációval
A példa azt mutatja be, hogy a koncentrátumban lévő adenovírust (ultraszűrési maradék) hogyan lehet közvetlenül gélpermeációs kromatográfiával tisztítani igen magas hozammal.
6.1. Módszer
200 μΙ a 4. példában kapott ultraszűrési maradékot (vagy 1,3 mg fehérjét) injektáltunk egy Sephacryl S-1000SF-fel (Pharmacia) töltött HR 10/30 oszlopra (Pharmacia), melyet például 150 mM NaCI-ot tartalmazó PBS-pufferben (pH 7,2) (C puffer) egyensúlyoztunk ki. Az anyagokat C pufferrel frakcionáltuk és eluáltuk, 0,5 ml/perc átfolyással, és az oszlop kimeneténél 260 nm UV fénnyel detektáltuk. Egy másik változat szerint ugyanilyen munkakörülmények között alkalmazhatunk egy Sephacryl S-2000-rel töltött oszlopot, ami a 100 nm-1000 nm nagyságú részecskék esetében jobb felbontást tesz lehetővé, mint a Sephacryl S-1000HR oszlop.
HU 224 558 Β1
A fentebb leírt két gélpermeációs kromatográfiás rendszer felbontása előnyösen javítható úgy, hogy az ultraszűrési felülúszót (200 gl) egy C pufferben kiegyensúlyozott sorosan kapcsolt (Sephacryl S-100HR vagy S-2000, melyet egy Superdex 200HR követ) HR 10/30 oszlopot tartalmazó kétoszlopos rendszeren kromatografáljuk. Az anyagokat C pufferrel eluáltuk 0,5 ml/perc átfolyással, és 260 nm UV fénnyel detektáltuk. Ebben a rendszerben a vírusrészecskéket tartalmazó csúcs sokkal jobban elvált az alacsonyabb molekulatömegű anyagoktól, mint az egyetlen Sephacryl S-1000HR vagy Sephacryl S-2000 oszlopot tartalmazóban.
Egy kísérletben az ultraszűrési maradékot (200 μΙ, 1,3 mg fehérje) egy kétoszlopos Sephacryl S-1000HR-Superdex 200HR 10/30 rendszerben kromatografáltuk (10. ábra). A vírusrészecskéket tartalmazó csúcsot összegyűjtöttük. Retenciós ideje összhangban van az ultracentrifugálással tisztított vírusrészecske-készítmény esetében kapott retenciós idővel. A kromatográfia után összegyűjtött vírusrészecskéket tartalmazó csúcs (7 ml) 28 gg fehérjét és 3,5* 109 pfu-t tartalmazott. Az 5.2. példában leírt körülmények között végzett analitikus ioncserélő kromatográfiás vizsgálat azt mutatta, hogy egy, az analitikai oszlopon jobban visszatartott szennyező csúcs van jelen, melynek felülete a víruscsúcs felületének körülbelül 25%-a. A 260 nm/280 nm abszorbancia aránya, melynek értéke 1,86, azt jelzi, hogy a szennyező csúcs nukleinsavaknak felel meg. A vírusrészecskék tehát körülbelül 50-szeresre lettek tisztítva (fehérjemennyiségben kifejezve), és a tisztítás hozama 85% pfu-ban.
Egy másik változat szerint a vírusrészecske-készítményt (ultraszűrlet vagy anioncserélő kromatográfiás kimeneti frakciók) kromatografálhatjuk egy TSK G6000 PW oszlopon is (7,5*300 mm; TosoHaas), melyet C pufferrel egyensúlyoztunk ki. Az anyagokat C pufferrel eluáltuk 0,5 ml/perc átfolyással, és 260 nm UV fénnyel detektáltuk. Ráadásul előnyös lehet, ha a kromatográfiás rendszer felbontását, részletesen a vírusrészecskéket tartalmazó csúcsnak a kisebb molekulatömegű anyagoktól való elválasztását megnöveljük, az ultraszűrési felülúszót (50-200 gl) egy sorosan kapcsolt, C pufferrel kiegyensúlyozott kétoszlopos rendszeren [TSK G6000 PW oszlop (7,5*300 mm), melyet egy Superdex 200HR oszlop követ] kromatografálva. Az anyagokat C pufferrel eluáltuk 0,5 ml/perc átfolyással, és 260 nm UV fénnyel detektáltuk.
7. példa
A vírus tisztítása ultraszűréssel, ioncserével és gélpermeációval
Az ioncseréből származó vírusrészecskéket tartalmazó frakciót (5. példa) előnyösen kromatografálhatjuk egy, a fentebb leírt gélpermeációs kromatográfiás rendszeren, például abból a célból, hogy a vírusrészecskék tisztaságát még jobban javítsuk, a víruskészítmény későbbi felhasználásához (például injekció) megfelelő vagy azzal összeférhető közegben.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás rekombináns adenovírus tisztítására egy biológiai közegből, azzal jellemezve, hogy egyetlen erős anioncserélő kromatográfiás lépést végzünk, amelyben a gyanta részecskemérete 10 gm-20 gm.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai közeg az adenovírust termelő részecskeképző sejtek felülúszója.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai közeg az adenovírust termelő részecskeképző sejtek lizátuma.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai közeg az adenovírus egy előzetesen tisztított oldata.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiát kvaterner ammónium funkciós csoporttal ellátott hordozón végezzük.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozó agaróz, dextrán, akrilamid, szilikagél, poli(sztirol-divinil-benzol), etilénglikol-metakrilát kopolimer vagy ezek keveréke.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiát Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ, Poros QE, Fractogel TMAE vagy Toyopearl Super Q gyantán végezzük.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiát Source Q, előnyösen Source Q15 gyantán végezzük.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megelőzően egy ultraszűrési lépést végzünk.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ultraszűrés tangenciális ultraszűrés egy 300-500 kD vágási küszöbbel rendelkező membránon.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9608164A FR2750433B1 (fr) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | Procede de production d'adenovirus recombinants |
US2666796P | 1996-09-25 | 1996-09-25 | |
PCT/FR1997/001107 WO1998000524A1 (fr) | 1996-07-01 | 1997-06-20 | Procede de production d'adenovirus recombinants |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0001271A1 HUP0001271A1 (hu) | 2000-08-28 |
HUP0001271A3 HUP0001271A3 (en) | 2002-01-28 |
HU224558B1 true HU224558B1 (hu) | 2005-10-28 |
Family
ID=26232805
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0001271A HU224558B1 (hu) | 1996-07-01 | 1997-06-20 | Eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6485958B2 (hu) |
EP (1) | EP0944717A1 (hu) |
JP (1) | JP2000514290A (hu) |
KR (1) | KR20050043996A (hu) |
AU (1) | AU3447097A (hu) |
BR (1) | BR9710030A (hu) |
CA (1) | CA2258158A1 (hu) |
CZ (1) | CZ438398A3 (hu) |
HU (1) | HU224558B1 (hu) |
IL (1) | IL127692A0 (hu) |
NO (1) | NO986202L (hu) |
SK (1) | SK181098A3 (hu) |
WO (1) | WO1998000524A1 (hu) |
Families Citing this family (97)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2625279A1 (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-06 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adenovirus and aav |
US6485958B2 (en) * | 1996-07-01 | 2002-11-26 | Gencell Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
EP0968284B1 (en) | 1996-11-20 | 2006-12-13 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
US7732129B1 (en) * | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
AU5370598A (en) | 1996-12-13 | 1998-07-03 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
US20080261289A1 (en) * | 1996-12-13 | 2008-10-23 | Schering-Plough Corporation | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
US6544769B1 (en) * | 1996-12-13 | 2003-04-08 | Schering Corporation | Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
US6995006B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-02-07 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
MXPA00010338A (es) * | 1998-04-22 | 2005-06-17 | Genvec Inc | Purificacion eficiente de adenovirus. |
AU770672B2 (en) * | 1998-05-27 | 2004-02-26 | University Of Florida | Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixananol gradient |
US6146874A (en) * | 1998-05-27 | 2000-11-14 | University Of Florida | Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions |
US6689600B1 (en) | 1998-11-16 | 2004-02-10 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
AU779267B2 (en) * | 1998-12-31 | 2005-01-13 | Centelion S.A.S. | Method for separating viral particles |
FR2788064B1 (fr) * | 1998-12-31 | 2003-01-31 | Aventis Pharma Sa | Methode de separation de particules virales |
EP1155120B1 (fr) | 1999-02-22 | 2006-07-05 | Transgene S.A. | Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee |
US6783939B2 (en) * | 2000-07-07 | 2004-08-31 | Alphavax, Inc. | Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines |
JP2004538005A (ja) * | 2001-08-08 | 2004-12-24 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | シアル酸に結合するタンパク質を有するウイルスベクターの精製法 |
DE60233061D1 (de) * | 2001-09-06 | 2009-09-03 | Alphavax Inc | Alphavirus replikon-vektorsysteme |
JP2005517394A (ja) | 2001-12-12 | 2005-06-16 | エフ エイチ フォールディング アンド カンパニー リミテッド | ウイルス保存のための組成物 |
CA2469721A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-31 | Schering Aktiengesellschaft | Stabilized formulations of adenovirus |
US20030224354A1 (en) * | 2002-05-30 | 2003-12-04 | Introgen Therapeutics Inc. | Quantifying viral particles with intrinsic fluorescence |
EP1371723A1 (en) * | 2002-06-12 | 2003-12-17 | Procorde GmbH | Process for preparing an adenovirus-containing preparation |
US20040106184A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-06-03 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
NZ540657A (en) * | 2002-12-13 | 2006-09-29 | Alphavax Inc | High-yielding, GMP-compatible, commercially feasible process for producing highly purified alphavirus replicon particle (ARP) preparations for use in human and veterinary medicine |
ES2618309T3 (es) * | 2002-12-13 | 2017-06-21 | Alphavax, Inc. | Partículas de replicón de alfavirus multi-antigénico y métodos |
KR101454842B1 (ko) * | 2003-03-20 | 2014-11-04 | 알파벡스, 인크. | 개선된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 구축물 |
US20040229335A1 (en) | 2003-05-15 | 2004-11-18 | Introgen Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the production of adenoviral vectors |
CA2529053A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-29 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Method for purifying virus |
AU2004257214B2 (en) * | 2003-07-11 | 2010-04-22 | Alphavax, Inc. | Alphavirus-based cytomegalovirus vaccines |
ES2359473T3 (es) | 2003-07-21 | 2011-05-23 | Transgene S.A. | Citoquinas multifuncionales. |
DK1780269T3 (da) * | 2004-02-23 | 2009-10-12 | Crucell Holland Bv | Virusrensningsmetoder |
US20050266550A1 (en) * | 2004-05-18 | 2005-12-01 | Alphavax, Inc. | TC-83-derived alphavirus vectors, particles and methods |
WO2006052302A2 (en) | 2004-11-03 | 2006-05-18 | Introgen Therapeutics Inc. | Method of producing and purifying adenoviral vectors |
US8900804B2 (en) * | 2004-11-22 | 2014-12-02 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and solutions for tissue preservation |
MX2007011617A (es) | 2005-03-21 | 2008-03-13 | Applera Corp | Compuestos de alfa-cetoamida como inhibidores de la cisteina proteasa. |
DE602006003420D1 (de) * | 2005-04-11 | 2008-12-11 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
WO2008089448A2 (en) | 2007-01-19 | 2008-07-24 | Cornell Presearch Foundation, Inc. | Methods and compositions for promoting survival & proliferation of endothelial cells & stimulating angiogenesis |
EP2390340A3 (en) | 2007-01-30 | 2012-02-22 | Transgene SA | vector encoding Papillomavirus E1 and E2 polypeptides with reduced percentage of identity |
WO2008156829A2 (en) * | 2007-06-21 | 2008-12-24 | Alphavax, Inc. | Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins |
KR101504392B1 (ko) * | 2008-11-03 | 2015-03-19 | 크루셀 홀란드 비.브이. | 아데노바이러스 벡터의 제조방법 |
KR20120052352A (ko) | 2009-08-07 | 2012-05-23 | 트랜스진 에스.에이. | Hbv 감염을 치료하는 조성물 |
EP2488635B1 (en) | 2009-10-15 | 2013-11-20 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
CN102791852B (zh) | 2009-10-15 | 2014-05-07 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 纯化腺病毒颗粒的方法 |
AU2011214262B2 (en) | 2010-02-15 | 2015-05-21 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of Ad26 adenoviral vectors |
CN102985536B (zh) * | 2010-04-14 | 2017-12-05 | Emd密理博公司 | 生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法 |
EP3202897B1 (en) | 2010-12-09 | 2020-04-15 | Institut Pasteur | Diagnostic use of a fusion polypeptide comprising a viral protein and a mgmt enzyme |
TWI623618B (zh) | 2011-07-12 | 2018-05-11 | 傳斯堅公司 | Hbv聚合酶突變體 |
WO2013045658A1 (en) | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Transgene Sa | Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection |
TW201321016A (zh) | 2011-09-29 | 2013-06-01 | Transgene Sa | 免疫療法組成物及用於治療c型肝炎病毒感染之療程(二) |
DK2825640T3 (en) | 2012-03-12 | 2016-08-01 | Crucell Holland Bv | BATCHES OF RECOMBINANT ADENOVIRUS WITH CHANGED TERMINAL END |
US9125870B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-08 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
AP2014007993A0 (en) | 2012-03-22 | 2014-10-31 | Crucell Holland Bv | Vaccine against RSV |
AU2013271338B2 (en) | 2012-06-05 | 2018-05-24 | The Australian National University | Vaccination with interleukin-4 antagonists |
EP2912069B1 (en) | 2012-10-23 | 2019-07-31 | Emory University | Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
BR112015021297A2 (pt) * | 2013-02-28 | 2017-10-10 | Psioxus Therapeutics Ltd | um processo para a produção de adenovírus. |
KR102089121B1 (ko) | 2013-03-14 | 2020-03-13 | 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 | 종양살상형 아데노바이러스 조성물 |
CN105188745B (zh) | 2013-04-25 | 2019-10-18 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
EP3010931B1 (en) | 2013-06-17 | 2018-06-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
GB201415579D0 (en) * | 2014-09-03 | 2014-10-15 | Psioxus Therapeutics Ltd | A process |
RU2745300C2 (ru) * | 2014-06-27 | 2021-03-23 | Анджиокрин Биосайенс, Инк. | Клетки нервной системы, экспрессирующие e4orf1 аденовируса, и способы их получения и применения |
JP2017529070A (ja) * | 2014-08-27 | 2017-10-05 | サイオクサス セラピューティクス リミテッド | アデノウイルスの製造方法 |
CN107428799A (zh) | 2015-01-13 | 2017-12-01 | 阿尔法韦士曼公司 | 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液 |
WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
AU2016249798B2 (en) | 2015-04-14 | 2022-05-26 | Janssen Vaccines And Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
PL3319633T3 (pl) | 2015-07-07 | 2021-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Szczepionka przeciwko rsv |
CN108699566B (zh) | 2016-02-23 | 2023-06-30 | 萨克生物研究学院 | 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达 |
CA3013637A1 (en) * | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
WO2017174564A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-10-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
AU2017248021B2 (en) | 2016-04-05 | 2021-08-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F proteins |
CA3023022A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
AU2017264562B2 (en) | 2016-05-12 | 2023-03-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
JP2019523644A (ja) | 2016-05-30 | 2019-08-29 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | 安定化された融合前rsv fタンパク質 |
EP3472327B1 (en) | 2016-06-20 | 2020-08-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
JP7229151B2 (ja) | 2016-07-14 | 2023-02-27 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Hpvワクチン |
US20190328869A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-10-31 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
EP3541420A2 (en) | 2016-11-16 | 2019-09-25 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Nucleic acids for treatment of allergies |
CA3045892A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
JP6721797B2 (ja) | 2017-02-09 | 2020-07-15 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | 異種遺伝子発現のための強力で短いプロモーター |
KR102637960B1 (ko) | 2017-04-22 | 2024-02-21 | 이뮤노믹 쎄라퓨틱스, 인크. | 개선된 lamp 구축물 |
EP3618854A1 (en) | 2017-05-02 | 2020-03-11 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Lamp (lysosomal associated membrane protein) constructs comprising cancer antigens |
CA3061278A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
WO2019053109A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHOD FOR SAFE INDUCTION OF IMMUNITY AGAINST RSV |
US20210261647A1 (en) | 2018-05-15 | 2021-08-26 | Immunomic Therapeutics, Inc | Lamp constructs comprising allergens |
TW202043256A (zh) | 2019-01-10 | 2020-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
EP3927833A4 (en) | 2019-02-21 | 2022-11-30 | Unleash Immuno Oncolytics, Inc. | ONCOLYTIC ADENOVIRAL VECTOR AND METHODS OF USE |
AU2020366515A1 (en) | 2019-10-18 | 2022-04-21 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Improved lamp constructs comprising cancer antigens |
AU2020385683A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-06-30 | Janssen Biotech, Inc. | Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses |
TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
WO2021209897A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
WO2022009052A2 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
EP4176087A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
WO2022009049A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
WO2023201201A1 (en) | 2022-04-10 | 2023-10-19 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5173418A (en) * | 1985-05-10 | 1992-12-22 | Benzon Pharma, A/S | Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases |
FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
JPH09508017A (ja) * | 1994-01-12 | 1997-08-19 | ジェネティック セラピー,インコーポレイテッド | レトロウイルスベクターの精製 |
FR2716893B1 (fr) | 1994-03-03 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique. |
ATE189697T1 (de) | 1994-03-22 | 2000-02-15 | Immune Response Corp Inc | Die hocheffiziente herstellung und isolierung von viruspartikeln |
US5837520A (en) * | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
US6485958B2 (en) * | 1996-07-01 | 2002-11-26 | Gencell Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
EP0968284B1 (en) | 1996-11-20 | 2006-12-13 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
US6261823B1 (en) * | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
AU779267B2 (en) * | 1998-12-31 | 2005-01-13 | Centelion S.A.S. | Method for separating viral particles |
-
1997
- 1997-06-20 US US09/202,545 patent/US6485958B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 IL IL12769297A patent/IL127692A0/xx unknown
- 1997-06-20 JP JP10503872A patent/JP2000514290A/ja not_active Ceased
- 1997-06-20 CA CA002258158A patent/CA2258158A1/fr not_active Abandoned
- 1997-06-20 EP EP97930560A patent/EP0944717A1/fr not_active Ceased
- 1997-06-20 SK SK1810-98A patent/SK181098A3/sk unknown
- 1997-06-20 CZ CZ984383A patent/CZ438398A3/cs unknown
- 1997-06-20 AU AU34470/97A patent/AU3447097A/en not_active Abandoned
- 1997-06-20 KR KR1020057007148A patent/KR20050043996A/ko active IP Right Grant
- 1997-06-20 HU HU0001271A patent/HU224558B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 BR BR9710030A patent/BR9710030A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-20 WO PCT/FR1997/001107 patent/WO1998000524A1/fr not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-12-30 NO NO986202A patent/NO986202L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-10-10 US US10/267,865 patent/US6905862B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-23 US US11/086,678 patent/US20050287657A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0944717A1 (fr) | 1999-09-29 |
NO986202L (no) | 1999-02-15 |
JP2000514290A (ja) | 2000-10-31 |
US6905862B2 (en) | 2005-06-14 |
BR9710030A (pt) | 1999-08-10 |
US20030143730A1 (en) | 2003-07-31 |
KR20050043996A (ko) | 2005-05-11 |
HUP0001271A3 (en) | 2002-01-28 |
CA2258158A1 (fr) | 1998-01-08 |
US20020028497A1 (en) | 2002-03-07 |
NO986202D0 (no) | 1998-12-30 |
US20050287657A1 (en) | 2005-12-29 |
US6485958B2 (en) | 2002-11-26 |
WO1998000524A1 (fr) | 1998-01-08 |
HUP0001271A1 (hu) | 2000-08-28 |
AU3447097A (en) | 1998-01-21 |
IL127692A0 (en) | 1999-10-28 |
CZ438398A3 (cs) | 1999-03-17 |
SK181098A3 (en) | 1999-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU224558B1 (hu) | Eljárás rekombináns adenovírusok tisztítására | |
US6537793B2 (en) | Method of separating viral particles | |
WO1998000524A9 (fr) | Procede de production d'adenovirus recombinants | |
US7326555B2 (en) | Methods of adenovirus purification | |
Carina Silva et al. | Adenovirus vector production and purification | |
Sviben et al. | Recovery of infective virus particles in ion-exchange and hydrophobic interaction monolith chromatography is influenced by particle charge and total-to-infective particle ratio | |
JP2007522814A (ja) | ウイルスの精製方法 | |
JP2003510089A (ja) | 複製能力のあるアデノウイルスのないe1欠失アデノウイルスの製造に有用な細胞系及び構築物 | |
EP1585964A2 (en) | Chromatographic methods for adenovirus purification | |
Segura et al. | Chromatography purification of canine adenoviral vectors | |
AU2004249199A1 (en) | Method for purifying virus | |
AU778287B2 (en) | Method for producing recombinant adenovirus | |
AU2004201075B2 (en) | Method for producing recombinant adenovirus | |
EP1363997B1 (en) | Concentration and lysis of adenovirus-infected cells in a single unit operation | |
KR100514589B1 (ko) | 재조합아데노바이러스의제조방법 | |
FR2750433A1 (fr) | Procede de production d'adenovirus recombinants | |
MXPA99000230A (en) | Procedure of production of adenovirus recombinan | |
MXPA01006607A (es) | Método de separacion de particulas virales |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050915 |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |