JP7178344B2 - 三量体安定化hivエンベロープタンパク質変異 - Google Patents
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Description
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも2つで指定アミノ酸残基を有するHIV Envタンパク質のアミノ酸配列を含み、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。ある種の好ましい実施形態では、651位の指定アミノ酸残基がPheであり;655位の指定アミノ酸残基がIleであり;535位の指定アミノ酸残基がAsnであり;かつ/または573位の指定アミノ酸残基がPheである。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み、
HIV Envタンパク質は、
(1)例えば、クレードC(例えば、配列番号2もしくは3のアミノ酸配列を含む)由来、またはクレードB(例えば、
配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を含む)由来のHIV Envコンセンサスアミノ酸配列;
(2)例えば、(a):配列番号6のアミノ酸配列、または(b):166位でGluからArgへの変異を有する配列番号6、または(c):501位および605位でCys残基へのアミノ酸の変異を有し、かつ559位でPro残基へのアミノ酸の変異を有する(a)もしくは(b)、または(d):さらなるフューリン切断部位変異、例えば、508~511位でのRRRRRR(配列番号10)によるアミノ酸の置換を有する(a)、(b)もしくは(c)、または(e)配列番号7、または(f)配列番号8もしくは9のアミノ酸配列を含むEnvなどのモザイクEnv配列を含む合成HIV Envタンパク質;ならびに
(3)少なくとも100、好ましくは少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置において見出されるアミノ酸残基で少なくとも1つの矯正変異を含む、好ましくはクレードCの、好ましくは野生型HIV Envタンパク質である親HIV Envタンパク質であって、矯正変異が、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に見出されるアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に見出されるアミノ酸残基による置換である、親HIV Envタンパク質;からなる群から選択され、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。ある種の好ましい実施形態では、651位の指定アミノ酸残基がPheであり;655位の指定アミノ酸残基がIleであり;535位の指定アミノ酸残基がAsnであり;かつ/または573位の指定アミノ酸残基がPheである。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み、
HIV Envタンパク質は、
(a)501位と605位におけるCys;
(b)559位におけるPro;ならびに
(c)501位と605位におけるCysおよび559位のPro
からなる群から選択される指定位置で指定アミノ酸残基をもたらす少なくとも1つの変異を含む、SOSIP変異体HIV Envタンパク質であり、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。ある種の好ましい実施形態では、651位の指定アミノ酸残基がPheであり;655位の指定アミノ酸残基がIleであり;535位の指定アミノ酸残基がAsnであり;かつ573位の指定アミノ酸残基がPheである。
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、TrpもしくはPhe、好ましくはGlnもしくはGlu;
(ix)64位におけるLys、もしくは66位におけるArg、もしくは64位におけるLysおよび66位におけるArg;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位および433位の両方におけるCys;
(xii)556位におけるPro、もしくは558位におけるPro、もしくは556位および558位におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、もしくは569位におけるGly、もしくは636位におけるGly、もしくは568位および636位の両方におけるGly、もしくは569位および636位の両方におけるGly;ならびに/または
(xv)302位におけるTyr、もしくは519位におけるArg、もしくは520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位と520位の両方におけるArg
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つで指定アミノ酸残基を含む。
別の一般的態様では、本発明は、配列番号4と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%または100%同一なアミノ酸配列を含む組換え体HIV Envタンパク質に関し、%同一性を決定する際に、好ましくは、204位、535位、573位、589位、647位、651位および655位、ならびに、好ましくはさらに、64位、66位、201位、316位、433位、501位、508~511位、556位、558位、559位、588位、548~568位および605位が考慮されず、また、ナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。それについてのある種の実施形態では、組換え体HIV Envタンパク質は、配列番号5と少なくとも98%、99%または100%同一なアミノ酸配列を含み、%同一性を決定する際に、好ましくは、204位、535位、573位、589位、647位、651位および655位、ならびに、好ましくはさらに、64位、66位、201位、316位、433位、508~511位、556位、558位、588位および548~568位が考慮されず、また、ナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
これらの態様および実施形態では、%同一性の決定のために考慮されない指定位置のアミノ酸の1つ以上は、例えば、204位におけるIle;651位におけるPhe、Ala、LeuまたはTrpなど(下の表1および2を参照のこと)の本明細書で好ましいものとして指定されるアミノ酸から選択されることが好ましい。
204I、647F、589I;651F、655I、573F;651F、204I、573F;651F、647F、573F;655I、204I、573F;655I、647F、573F;204I、647F、573F;651F、655I、204I;651F、647F、204I;655I、647F、204I;651F、655I、647F;655I、651F、647F;655I、651F、535N;655I、589V、573F;655I、589V、204Iである。少なくとも3つの本発明による位置で好ましいアミノ酸を有する特に好ましいEnvタンパク質としては:651F、655I、535N;655I、589V、535N;655I、573F、589V;655I、204I、589V;651F、655I、647Fが挙げられる。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも2つでの指定アミノ酸残基を有するHIV Envタンパク質のアミノ酸配列を含む。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含む。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp;
(iii)535位におけるAsnまたはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla;
(v)573位におけるPheまたはTrp;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み、
HIV Envタンパク質は、
(1)例えば、配列番号2、3、4、もしくは5のアミノ酸配列を含むクレードCまたはクレードBコンセンサス配列などの、HIV Envコンセンサス配列;
(2)例えば、(a)配列番号6;(b)166位でGluからArgへの変異を有する配列番号6;(c)配列番号7;(d)配列番号8または9、任意選択によりさらに上記のようなSOSIPおよび/もしくはフューリン切断部位変異を有する(a)、(b)または(d)のアミノ酸配列を含む、合成HIV Envタンパク質
からなる群から選択される。
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体HIV Envタンパク質をコードする核酸分子、およびその核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、もしくは合成的に生成されるRNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは、二重鎖または単鎖であり得る。DNAは、例えば、cDNA、ゲノムDNA、またはその組み合わせを含むことができる。核酸分子およびベクターは、組換え体タンパク質の生成、宿主細胞におけるタンパク質の発現、またはウイルス粒子の生成のために使用され得る。
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体HIV Envタンパク質のうち3つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換え体HIV Envタンパク質のいずれかを含むことができる。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換え体HIV Envタンパク質の3つの同一の単量体(またはgp140が切断される場合は同一のヘテロ二量体)を含む。三量体複合体は、単量体形態などのHIVエンベロープタンパク質の他の形態から分離され得るか、または三量体複合体は、単量体形態などのHIVエンベロープタンパク質の他の形態とともに存在し得る。
別の一般的態様では、本発明は、組換え体HIV Envタンパク質、三量体複合体、単離核酸、ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載の組換え体HIV Envタンパク質、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター、または宿主細胞のいずれかを含むことができる。
実施形態1は、
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnまたはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla、好ましくはValまたはIle;
(v)573位におけるPheまたはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle、好ましくはPhe
からなる群から選択される指定位置の少なくとも2つで指定アミノ酸残基を有するHIV Envタンパク質のアミノ酸配列を含む、組換え体HIV Envタンパク質であり、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnまたはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla、好ましくはValまたはIle;
(v)573位におけるPheまたはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle、好ましくはPhe
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つでの指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含む、組換え体HIV Envタンパク質であり、
HIV Envタンパク質が、
(1)例えば、(配列番号2、3、4、もしくは5)のアミノ酸配列を含む、例えば、クレードCまたはクレードB由来のコンセンサス配列を有するHIV Envタンパク質;または
(2)例えば、(a)配列番号6;(b)166位でGluからArgへの変異を有する配列番号6;(c)配列番号7;または(d)配列番号8もしくは配列番号9)のアミノ酸配列を含み、(a)、(b)または(d)が任意選択によりさらに、SOSIP(501位および605位のCys、ならびに559位のPro)、ならびに/またはフューリン切断部位の変異(例えば、アミノ酸508~511を置換する配列番号10)を有し得る、合成HIV Envタンパク質;または
(3)少なくとも100、好ましくは少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基で少なくとも1つの矯正変異を含む、好ましくはクレードCの、野生型HIV Envタンパク質であって、矯正変異が、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、野生型HIV Envタンパク質;からなる群から選択され;かつ
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、またはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、またはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnまたはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、またはAla、好ましくはValまたはIle;
(v)573位におけるPheまたはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および
(vii)647位におけるPhe、Met、またはIle、好ましくはPhe
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つでの指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含む、組換え体HIV Envタンパク質であり、
HIV Envタンパク質が、
(a)501位と605位におけるCys;
(b)559位におけるPro;
(c)501位と605位におけるCysおよび559位におけるPro
からなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、SOSIP変異体HIV Envタンパク質であり;かつ
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、TrpもしくはPhe、好ましくはGlnもしくはGlu;
(ix)64位におけるLys、もしくは66位におけるArg、もしくは64位におけるLysおよび66位におけるArgの両方;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位および433位の両方におけるCys;
(xii)556位もしくは558位におけるPro、もしくは556位および558位の両方におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、もしくは569位におけるGly、もしくは636位におけるGly、もしくは568位および636位の両方におけるGly、もしくは569位および636位の両方におけるGly;ならびに/または
(xv)302位におけるTyr、もしくは519位におけるArg、もしくは520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位と520位の両方におけるArg
からなる群から選択される指定位置の少なくとも1つでの指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換をさらに含む、実施形態1~16のいずれかの組換え体HIV Envタンパク質であり、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
(a)655I、589V、573F、651F、588E、535N、204I;
(b)556P、655I、535N、573F、589V、204I、588Q;
(c)204I、535N、556P、588E、589V、651F、655I;
(d)535N、556P、589V、651F、655I;および
(e)535N、556P、588E、589V、651F、655I
からなる群から選択されるアミノ酸の組み合わせを含む、実施形態1~23のいずれかの組換え体HIV Envタンパク質である。
(b)アミノ酸508~511を置換する配列番号10を有し、ならびに/または
(c)少なくとも100、好ましくは少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基での少なくとも1つの矯正変異であって、矯正変異が、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、少なくとも1つの矯正変異をもたらす変異を有する野生型HIV Envタンパク質からなる群から選択される、実施形態34または35の方法である。
(a)501位と506位におけるCys、および559位におけるPro;
(b)例えば、アミノ酸508~511を置換する配列番号10を有する、HIV Envタンパク質のフューリン切断配列における変異;
(c)651位におけるPhe;
(d)655位におけるIle;
(e)535位におけるAsn;
(f)589位におけるVal;
(g)573位におけるPhe;
(h)204位におけるIle;
(i)647位におけるPhe;
(j)658位におけるVal;
(k)588位におけるGlnもしくはGlu;ならびに/または
(l)556位、558位、もしくは556位および558位におけるPro
の1つ以上を含む。
HIVエンベロープクレードCコンセンサス配列
HIVクレードCエンベロープ(Env)タンパク質コンセンサス配列は、HIV Envタンパク質の三量体形成における様々な変異の影響を調査するためのバックボーン配列として開発された。既知のHIVウイルス単離株由来の3,434個のエンベロープタンパク質配列の配列アラインメントを、Los Alamosデータベース(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)からダウンロードした。3,434個の配列から、クレードCのみの1,252個の配列を選択して、HIVクレードC Envタンパク質コンセンサス配列を生成した。アラインメントに基づいてコンセンサス残基を明確に同定することができた位置で、コンセンサス配列を使用して、BLAST検索によって最も近い野生型配列を同定した。続いて、これらの位置のコンセンサス残基を、BLAST検索から同定された最も近い野生型配列におけるアミノ酸として選択した。HIV EnvクレードCコンセンサス配列を配列番号2に示す。BLASTを使用して配列番号2に対して最も高い相同性を有する2つの配列は、Genbank番号ADM30337.1およびADM30340.1を有する配列であり、両方ともに、配列番号2と90%の配列同一性を有した。
HIV EnvクレードBコンセンサス配列は、HIV EnvクレードCコンセンサス配列を生成するための上記のものと同様の手順を用いて生成された。クレードBコンセンサス配列は、既知のクレードBウイルス単離株由来の1,708個のクレードBエンベロープタンパク質配列を用いて生成された。HIV EnvクレードBコンセンサス配列を配列番号4に示す。
組換え体HIV Envタンパク質は可溶性gp140タンパク質として発現され、かつ精製された。単一変異(アミノ酸置換)ならびにその組み合わせ(例えば、二重および三重変異)をConC_SOSIPバックボーンコンセンサス配列に導入して、一連の組換え体HIV Envタンパク質バリアントを生成した。
配列番号3に示されるHIVクレードC Envコンセンサス配列ConC_SOSIPをコードするDNAを合成し、GenScript(Piscataway、NJ 08854)またはGene Art(Life Technologies、Carlsbad、CA)でコドン最適化した。続いて、コドン最適化された配列をベクターpcDNA2004にクローン化して、さらなる変異を導入するためのバックボーンHIVエンベロープ配列として使用されたHIVクレードC gp140 Envコンストラクトを生成した。pcDNA2004 HIVクレードC gp140 Envコンストラクト上で実施される部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、ConC_SOSIPバックボーン配列に変異を導入した。HEK-Expi293F細胞またはHEK293F細胞を、ConC_SOSIP配列またはそのバリアントをコードする90%のpcDNA2004ベクターおよびフューリンプロテアーゼをコードする10%のpcDNA2004ベクター(フューリン-pcDNA2004)により、製造業者の指示書に従って一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を37℃および10%CO2で5日間培養した。培養上清を1250×gで10分間回転させた。その後、0.22μmの真空フィルターを使用して遠心上清を滅菌濾過し、さらなる使用まで4℃で保存した。
96ウェル形式における発現のために、細胞を37℃および10%CO2で3日間培養した。4μLのOptimem(培養培地)を、添加された4μLの100ng/uL DNAおよび8uLのExpi293Fミックス(54uL/mL Optimem)と混合し、20分間インキュベートした。その後、200uL/ウェルのExpi293F細胞を2.5×10E6細胞/mLで添加した。培養上清を回収し、300gで5分間遠心して、細胞および細胞片を除去した。その後、0.22μmの真空フィルターを使用して、遠心上清を滅菌濾過し、さらなる使用まで4℃で保存した。
pcDNA2004ベクターから発現されるHIV gp140 Envタンパク質を、初回の精製についてはスノードロップ(Galantus nivalis)-レクチンカラム(Vectorlabs、AL-1243)、次の工程についてはSuperdex200 Increaseカラム(GE)を使用する2段階の精製プロトコルに従って精製して、残留している夾雑物を除去した。スノードロップ(Galantus nivalis)-レクチンカラムを使用する初回の工程のために、培養上清を緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl pH7.5)で希釈し、4mL CVのTricorn 10-50レクチンアガロースカラムに毎分4mLの速度で通過させた。その後、カラムを4カラム容量の緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl pH7.5)で洗浄し、4カラム容量の40mM Tris、500mM NaClおよび1Mマンノピラノシド pH7.5を用いて1.6mL/分の上向きの流れにより溶出したが、これは、流れの方向を下向きから上向きに変えて、エンベロープタンパク質の溶出の速度を増大させ、かつ溶出容量を減少させたことを意味している。溶出液をスピンコンセントレータ(50K、Amicon Ultra、Millipore)を使用して濃縮した。
発現されたHIV gp140 Envタンパク質を含有する細胞培養上清および精製したHIV gp140 Envタンパク質試料を、4~12%(w/v)Bis-Tris NuPAGEゲル、1×MOPS(Life Technologies)で、還元条件下または非還元条件下にて分析し、iBlot技術(Life Technologies)を使用してブロットした。すべての手順を、製造業者の指示書に従って実施した。純度分析のために、ゲルをKrypton Infrared Protein Stain(Thermo Scientific)またはSYPRO Rubiタンパク質染料(Bio-Rad)で染色した。ウエスタンブロッティング分析のために、メンブレンを抗6×ヒスチジンタグ抗体(抗His-HRP)で探索した。ゲルおよびブロットメンブレンをOdyssey装置(Li-Cor)でスキャンし、画像をOdyssey 3.0ソフトウェア(Li-Cor)を使用して分析した。
スノードロップ(Galanthus nivalis)レクチン、その後サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製されたConC_SOSIPバックボーン配列を有するエンベロープタンパク質の三量体を、ネガティブ染色電子顕微鏡法(NS-EM)を使用して画像化したが、これはJulien et al.2015(Proc.Natl.Acad.Sci.(2015)112(38)11947-52)に記載のとおりに実施された。使用直前に三量体試料をTris緩衝生理食塩水(TBS)、pH7.4中において0.01~0.5mg/mLに希釈し、2×10-1mbarの空気中において25mAで30秒間グロー放電されたカーボン被膜200 Cuメッシュグリッド(EMS CF200-Cu)上に付着させた。その後、3μL液滴の希釈された三量体試料をグリッドに1分間アプライし、続いて濾紙(Whatman、no.1または4)でブロッティングした。グリッドを1分間乾燥させ、次に、3μLの2.3%酢酸ウラニル(UAc)で60秒間染色した。試料面で4.68Åのピクセルサイズを得た25,000×の倍率により120keVで動作するFEI Tecnai F20電子顕微鏡を使用してデータを収集した。画像をGatan BM ultrascanにより得た。
画像(三量体が濃縮された材料の)中のほぼすべての粒子が、適切に形成された閉じた三量体であった(データは示さず)。
実施例2で生成される組換え体HIV Envタンパク質バリアントを三量体形成について選別して、ConC_SOSIPバックボーン配列と比較して、形成される三量体の割合を向上させ、かつ/または三量体の収量を向上させたそれらの変異を同定した。三量体の割合および三量体の収量のハイスループットなスクリーニングを、AlphaLISAアッセイを使用して行って、組換え体HIV Envタンパク質に対する一群の広域中和HIV抗体(bNAb)および非bNAbの結合を評価した。AlphaLISAアッセイの結果を、サイズ排除クロマトグラフィーおよび多角度光散乱(SEC-MALS)によって確認した。
HIV gp140 Envタンパク質の総発現量および実施例2に記載のように生成されたConC_SOSIP配列に導入された単一アミノ酸置換を有する200を超えるHIV gp140バリアントの適切にフォールディングされた天然の三量体の総量を、細胞培養上清においてAlphaLISAアッセイによって測定した。二重変異および三重変異を含有するHIV gp140バリアントもまた試験された。いずれの追加の変異も有しないConC_SOSIP配列を有するHIV Envタンパク質を、比較のために試験した。
ConC_SOSIPバックボーン配列における上の表1の(i)~(vii)のリスト由来のいくつかの単一、二重および三重アミノ酸置換についてのAlphaLISAアッセイによって決定された三量体形成の割合を図2Aに示す。試験された単一アミノ酸置換を含有する約200個のHIV gp140 Envバリアントの中で、任意の追加のアミノ酸置換を有しないConC_SOSIPバックボーン配列に対して形成された三量体の割合と比較して、形成された三量体の割合を少なくとも25%増加させた7つの置換位置が同定された。
SEC-MALS分析も使用して、AlphaLISAアッセイを使用して選別されたHIV gp140バリアントに関する三量体の収量および三量体形成の割合を確かめた。HIV gp140バリアントを30mL規模の培養液中で発現させ、Polyprep自然落下カラム(Biorad カタログ番号731-1550)中の200μlのスノードロップ(Galanthus nivalis)レクチンビーズ(Vectorlab カタログ番号AL-1243)上に無細胞上清をアプライすることによって精製した。ビーズを2mlの結合緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl、pH7.4)で洗浄した。250~500μlの40mM Tris、500mM NaCl、1Mマンノピラノシド pH7.4を使用して、タンパク質を溶出した。SEC-MALS実験を実施するために、高速液体クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies)およびOptilab T-rEX屈折率検出器(Wyatt)と連結したMiniDAWN TREOS装置(Wyatt)を使用した。全体で100μlのレクチン溶出または約30μgのタンパク質のいずれかを、ランニング緩衝液(150mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH7.0)中で1mL/分にて平衡化したTSK-Gel G3000SWxlカラム(Tosoh Bioscience)にアプライした。データをAstra 6ソフトウェアパッケージを使用して分析し、分子量計算値を屈折率シグナルから導出した。
本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質の熱安定性を、AlphaLISAおよび示差走査熱量測定(DSC)によって試験した。
三量体に特異的なmAb PGT145に対する結合に基づいて、熱処理後の完全な三量体の消失を測定することによって、熱安定性を試験した。未精製の上清(20μl)を60℃で1時間加熱した。次に、試料を最大速度で5分間遠心分離して、凝集体を除去した。AlphaLISAアッセイを、実施例3において上述のように実施した。
HIV gp140 Envバリアントの融解温度(Tm)を、MicroCalキャピラリーDSCシステムを使用するDSCによって決定した。各測定をスキャン速度100℃/時間で開始温度20℃および最終温度110℃を用いて実施した。0.5mg/mLの濃度を有するタンパク質試料(400μL)を各測定のために使用した。データをOrigin J.ソフトウェア(MicroCal VP分析ツール)を使用して分析した。
クレードBコンセンサス配列ConB_SOSIP(配列番号5)に導入される単一アミノ酸置換(I535N、D589V、N651FまたはK655I)を含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載のように生成され、精製された。三量体の収量および三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
配列番号7に示される配列を有する合成HIVエンベロープタンパク質(「DS_sC4_SOSIP_E166R」と命名される)に導入されるアミノ酸置換を含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載のように作製され、精製された。合成HIVエンベロープタンパク質DS_sC4_SOSIP_E166Rは、いわゆるSOSIP変異(残基501および605におけるCys、残基559におけるPro)、ジスルフィド(DS)結合の導入をもたらす残基201および433におけるCys、ならびに尖部を安定化する166位におけるArgを有する。加えて、このタンパク質は655位でトランケートされる。三量体形成の割合および三量体の収量を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
ConC_SOSIP(配列番号3に示される配列を有する)に導入されるアミノ酸置換を含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載のように作製され、精製された。三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。その後、組み合わせのうちより少数の選択物(斜体で下に表されるもの、および加えてK655I;I535N、D589V;I535N、K655I;D589V、K655I)を、実施例3に記載のようにスノードロップ(Galanthus nivalis)レクチンを使用して精製し、三量体含量をSEC-MALSを使用して分析した。実施例4に記載のように安定性を測定した。
K655I、N651F;
K655I、N651F、E647F;
K655I、N651F、E647F、I535N;
K655I、N651F、I535N;
K655I、I573F;
K655I、D589V、I573F;
K655I、D589V、I573F、N651F;
K655I、D589V、I573F、K588E;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、I535N;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、I535N、A204I;
K655I、D589V、I535N、L556P;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、L556P;
K655I、D589V、A204I;
L556P、N651F;
L556P、N651F、K655I;
L556P、N651F、K655I、I535N;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、N651F、I535N;
L556P、N651F、I535N、I573F;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、K655I、I535N;
L556P、K655I、I535N、I573F;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q。
(He et al、2016)の記載と同様にして安定化されたEnvタンパク質をディスプレイするフェリチンおよびDPS自己組織化粒子を作製した。これを行うために、gp140タンパク質は、短いアミノ酸リンカー(例えば、GSGまたはAAAGSであるが、他のリンカーも使用することができ、例えば、He et al、2016を参照のこと)を介してDNAレベルで粒子のN末端に融合され、Expi293F細胞において融合タンパク質を発現した。このようにして作製された粒子の一例は、ConC_SOSIP(配列番号3)HIV Envタンパク質に融合したフェリチンに基づき、次の変異を有した:I535N、A558P、D589V、K655I。三量体形成を向上させると報告された(Kesavardhana et al、2014)追加のV570D変異を有するこのEnvタンパク質を伴うフェリチン粒子も作製したが、この変異は、不所望である非中和抗体(17b)の結合の著しい増加をもたらすことが観察された。これらの5つの変異を有するEnvはまた、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびマイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)に由来する2種類のDPS粒子に融合された(DPS粒子の作製については、例えば、国際公開第2011/082087号パンフレットを参照のこと)。これらの5つの変異および加えてジスルフィド架橋を導入する二重変異I201C-A433Cを有するEnvもフェリチンに融合された。
単一アミノ酸置換(I535N、D589V、N651F、K655I、I573F、A204IまたはE647F)を含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質を、実施例2に記載のようにSOSIP改変(「BG505_SOSIP」と命名される)を有する野生型クレードAのHIVエンベロープタンパク質に導入した。HIVエンベロープタンパク質BG505_SOSIPは、いわゆるSOSIP変異(残基501および605におけるCys、および残基559におけるPro)ならびにジスルフィド(DS)結合の導入をもたらす残基201および433におけるさらなるCys、ならびに332位における潜在的なN-グリコシル化部位(T332N変異)を有する。このタンパク質は664位でトランケートされる。BG505_SOSIPの配列を配列番号21に示す。
単一アミノ酸置換T651F、追加の置換L556P(C97ZA_SOSIP_L556P)を伴うWT C97ZA_SOSIP Env配列(配列番号23)に導入される二重アミノ酸置換T651F、M535Nを含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載のように生成され、発現された。三量体の収量および三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
クレードC株Du422由来のEnvタンパク質において、SOSIP変異を導入し、かつ2つのグリカンホールを295位および386位におけるK295NおよびD386N変異によってふさいだ。加えて、いくつかの残基を実施例12および図12に記載の概念的なフレームワークに従って矯正し(V272I、W456R、G466EおよびF643Y)、安定化置換L556P、I535N、N651FおよびD589Vを導入した。全ての追加の置換により、より高い三量体の収量および三量体の割合を得た(例えば、図11)。
感染した患者から単離されたウイルス由来のwt配列は、適切なフォールディングを阻害する不安定化変異を獲得した可能性があるため、クレードC C97ZA、DU422およびモザイクsC4のwt Env配列を最初に矯正した。
前の実施例において示すように、7つの変異(A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651FおよびK655I)は、ConC_SOSIPにおける三量体の収量および割合を向上させた(「ConC_base」または「安定化されたConC_SOSIP」または「ConC_SOSIP 7mut」をもたらす)(例えば、図13および15)。
実施例2に記載の変異にさらにつけ加えて、ConC_SOSIP(配列番号3)バックボーンにおいて、589位、647位、651位および655位をMet残基によって個別に置換し、三量体形成の割合および収量について上記のような方法を使用して試験した。実施例2に記載の変異のように、647位、651位または655位におけるMetは、図16で見ることができるように、三量体の品質を向上させた(より高い三量体の割合および収量、bNAb結合の増加)。
658位(HIV-1単離株HXB2のgp160に従うナンバリング)で置換変異を有する組換え体HIV Envタンパク質をConC_SOSIP(配列番号3)バックボーンにおいて作製した。K658をVal、Ile、Phe、Leu、Met、またはAlaに変異させた。加えて、いくつかの二重変異がなされ、これらの変異は、上記の安定化変異の1つであるK655Iと組み合わされた。三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって決定した。
ウサギの免疫化試験を可溶性Envタンパク質およびリポソームと結合したEnvタンパク質を用いて行った。初回抗原刺激を安定化されたConC_SOSIP.v3(配列番号28)で実施し、その後4回の追加免疫をそれぞれ別のタンパク質、すなわち、1)矯正および安定化されたsC4_SOSIP.v4(配列番号32);2)矯正および安定化されたC97ZA_SOSIP.v2(配列番号30);3)矯正および安定化されたDu422_SOSIP.v1(配列番号31);ならびに4)安定化されたBG505_SOSIP.v2(配列番号29)で実施した。
RRRRRR
MRVRGILRNWQQWWIWGILGFWMLMICNVVG(注記:最後のVGは、成熟タンパク質の開始、またはシグナル配列の終端になり得る)
NPDWLPDM
GSGSGSGS
DDVHPDWD
RDTFALMM
DEEKVMDF
DEDPHWDP
MRVKGIRKNYQHLWRWGTMLLGMLMICSA
AAALPETGGGSDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHHHHHH
MRVRGMLRNWQQWWIWSSLGFWMLMIYSV
MRVMGIQRNCQHLFRWGTMILGMIIICSA
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Claims (24)
- 組換え体ヒト免疫不全ウイルス(HIV)エンベロープ(Env)タンパク質であって、以下のアミノ酸残基:
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe
の2つ以上を含み、
前記位置のナンバリングが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス(HIV)エンベロープ(Env)タンパク質。 - 組換え体HIV Envタンパク質であって、以下のアミノ酸残基:
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe
の1つ以上を含み、
前記HIV Envタンパク質が:
(1)例えば、配列番号2もしくは3のアミノ酸配列を含むクレードC由来の、または例えば、配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を含むクレードB由来のHIV Envコンセンサス配列;
(2)例えば、(a):配列番号6;または(b):166位でGluからArgへの変異を有する配列番号6;または(c):501位および605位でCys残基へのアミノ酸の変異を有し、かつ559位でPro残基へのアミノ酸の変異を有する(a)もしくは(b);または(d):さらなるフューリン切断部位変異、例えば、508~511位でのRRRRRR(配列番号10)によるアミノ酸の置換を有する(a)、(b)もしくは(c);または(e)配列番号7;または(f)配列番号8もしくは9のアミノ酸配列を含む合成HIV Envタンパク質;ならびに
(3)少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基で少なくとも1つの矯正変異を含む、好ましくはクレードCの、好ましくは野生型HIV Envタンパク質である親HIV Envタンパク質であって、前記矯正変異が、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、前記矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在する前記アミノ酸残基による置換である、親HIV Envタンパク質;からなる群から選択され、
かつ
前記位置のナンバリングが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、組換え体HIV Envタンパク質。 - 組換え体HIV Envタンパク質であって、以下のアミノ酸残基:
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe
の1つ以上を含み、
前記HIV Envタンパク質が、以下:
(a)501位および605位におけるCys;
(b)559位におけるPro;ならびに
(c)501位および605位におけるCysならびに559位のPro
の少なくとも1つを含むHIV Envタンパク質であり;かつ
位置のナンバリングが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、組換え体HIV Envタンパク質。 - (i)~(vii)において示される前記アミノ酸残基の2つ以上を含む、請求項2または3に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 501位と605位においてCysまたは559位においてPro、好ましくは、501位と605位においてCysおよび559位においてProを含む、請求項1、2または4のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- (i)~(vii)において示される前記アミノ酸残基の3つ以上を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- (i)~(vii)において示される前記アミノ酸残基の4つ以上を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 651位においてPhe、655位においてIle、535位においてAsn、および589位においてValを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- (i)~(vii)において示される前記アミノ酸残基の5つ以上を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 以下:
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、TrpもしくはPhe、好ましくはGlnもしくはGlu;
(ix)64位におけるLys、もしくは66位におけるArg、もしくは64位におけるLysおよび66位におけるArg;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位および433位の両方におけるCys;
(xii)556位もしくは558位におけるPro、もしくは556位および558位の両方におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、もしくは569位におけるGly、もしくは636位におけるGly、もしくは568位および636位の両方におけるGly、もしくは569位および636位の両方におけるGly;ならびに/または
(xv)302位におけるTyr、もしくは519位におけるArg、もしくは520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび520位におけるArg、もしくは302位におけるTyrおよび519位と520位の両方におけるArg
の1つ以上をさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。 - 前記HIV Envタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、508位~511位でのRRRRRR(配列番号10)による置換をさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 配列番号3、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31、または32のいずれか1つと少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- (xvi)658位においてVal、Ile、Phe、Met、Ala、またはLeu、好ましくはValまたはIle、最も好ましくはValから選択されるアミノ酸残基をさらに含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- gp140またはgp160タンパク質である、請求項1~13のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- クレードCまたはクレードA、好ましくはクレードC由来の請求項1~14のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の前記組換え体HIV Envタンパク質のうち3つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質もしくは請求項16に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソームまたはナノ粒子。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質をコードする単離核酸分子。
- プロモーターに作動可能に連結された請求項18に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項19に記載のベクター。
- 請求項18に記載の単離核酸分子または請求項19もしくは20に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記組換え体HIV Envタンパク質の産生に好適な条件下で請求項21に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、組換え体HIV Envタンパク質を作製する方法。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質、請求項16に記載の三量体複合体、請求項17に記載の粒子、請求項18に記載の単離核酸分子、または請求項19もしくは20に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- HIV Envタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法が、親HIV Envタンパク質における1つ以上のアミノ酸残基を置換することを含み、1つ以上の前記置換が、以下のアミノ酸:
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe
の1つ以上をもたらし、
前記位置のナンバリングが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、方法。
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