JP7253529B2 - 三量体安定化hivエンベロープタンパク質変異 - Google Patents
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Description
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、若しくはTrp;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、若しくはTrp;
(iii)535位におけるAsn若しくはGln;
(iv)589位におけるVal、Ile、若しくはAla;
(v)573位におけるPhe若しくはTrp;
(vi)204位におけるIle;及び/又は
(vii)647位におけるPhe、Met、若しくはIleのアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含み、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。特定の好ましい実施形態では、651位の指定アミノ酸残基がPheであり;655位の指定アミノ酸残基がIleであり;535位の指定アミノ酸残基がAsnであり;且つ/又は573位の指定アミノ酸残基がPheである。
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、Trp若しくはPhe、好ましくはGln若しくはGlu;
(ix)64位におけるLys、若しくは66位におけるArg、若しくは64位におけるLys並びに及び66位におけるArg;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位及び433位の両方におけるCys;
(xii)556位におけるPro、若しくは558位におけるPro、若しくは556位及び558位におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の、7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、若しくは569位におけるGly、若しくは636位におけるGly、若しくは568位及び636位の両方におけるGly、若しくは569位及び636位の両方におけるGly;並びに/又は
(xv)302位におけるTyr、若しくは519位におけるArg、若しくは520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位及び520位の両方におけるArg;
のアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含む。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、又はTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、又はTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn又はGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、又はAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPhe又はTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;及び
(vii)647位におけるPhe、Met、又はIle、好ましくはPhe;
からなる群から選択される指定位置のうち少なくとも1つに指定アミノ酸残基を含む。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、若しくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、若しくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn若しくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、若しくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPhe若しくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;及び
(vii)647位におけるPhe、Met、若しくはIle、好ましくはPheからなる群から選択される指定アミノ酸残基による1つ以上の更なるアミノ酸置換と、を含む。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、若しくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、若しくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn若しくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、若しくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPhe若しくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;及び
(vii)647位におけるPhe、Met、若しくはIle、好ましくはPheからなる群から選択される指定アミノ酸残基による1つ以上の更なるアミノ酸置換と、を含み、
ここでHIV Envタンパク質は、
(1)例えば、配列番号2、3、4、又は5のアミノ酸配列を含む、クレードC又はクレードBコンセンサス配列などの、HIV Envコンセンサス配列;
(2)合成HIV Envタンパク質からなる群から選択される。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換え体HIV Envタンパク質をコードする核酸分子、及びその核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は合成的に生成されるRNAの形態又はDNAの形態であり得る。DNAは、二本鎖又は一本鎖であり得る。DNAは、例えば、cDNA、ゲノムDNA、又はその組み合わせを含むことができる。核酸分子及びベクターは、組換え体タンパク質の生成、宿主細胞におけるタンパク質の発現、又はウイルス粒子の生成のために使用され得る。
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体HIV Envタンパク質のうち3つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換え体HIV Envタンパク質のいずれかを含むことができる。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換え体HIV Envタンパク質の3つの同一の単量体(又はgp140が切断される場合は同一のヘテロ二量体)を含む。三量体複合体は、単量体形態などのHIVエンベロープタンパク質の他の形態から分離され得るか、又は三量体複合体は、単量体形態などのHIVエンベロープタンパク質の他の形態とともに存在し得る。
別の一般的態様では、本発明は、組換え体HIV Envタンパク質、三量体複合体、単離核酸、ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載の組換え体HIV Envタンパク質、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター、又は宿主細胞のいずれかを含むことができる。
実施形態1は、658位にVal、Ile、Phe、Met、Ala、及びLeuからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、又はTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、又はTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn又はGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、又はAla、好ましくはVal又はIle;
(v)573位におけるPhe又はTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;及び
(vii)647位におけるPhe、Met、又はIle、好ましくはPhe;
のアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含み、
位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、実施形態1~7のいずれか1つに記載の組換え体HIV Envタンパク質である。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、又はTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、又はTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn又はGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、又はAla、好ましくはVal又はIle;
(vi)204位におけるIle;及び
(vii)647位におけるPhe、Met、又はIle、好ましくはPhe;
のアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含む、実施形態8に記載の組換え体HIV Envタンパク質である。
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、Trp若しくはPhe、好ましくはGln若しくはGlu;
(ix)64位におけるLys、若しくは66位におけるArg、若しくは64位におけるLys及び66位におけるArgの両方;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位及び433位の両方におけるCys;
(xii)556位若しくは558位におけるPro、若しくは556位及び558位の両方におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の、7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、若しくは569位におけるGly、若しくは636位におけるGly、若しくは568位及び636位の両方におけるGly、若しくは569位及び636位の両方におけるGly;並びに/又は
(xv)302位におけるTyr、若しくは519位におけるArg、若しくは520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位及び520位の両方におけるArg;
のアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含む、実施形態1~38のいずれか1つに記載の組換え体HIV Envタンパク質である。
(a)655I、589V、573F、651F、588E、535N、204I;
(b)556P、655I、535N、573F、589V、204I、588Q;
(c)204I、535N、556P、588E、589V、651F、655I;
(d)535N、556P、589V、651F、655I;及び
(e)535N、556P、588E、589V、651F、655I;
からなる群から選択されるアミノ酸の組み合わせを含む、実施形態1~48のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質である。
配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、並びに
(a)501位及び506位におけるCys並びに559位におけるPro、
(b)アミノ酸508~511を置換する配列番号10を有する(b)、並びに/又は
(c)少なくとも100、好ましくは少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基における少なくとも1つの矯正変異であって、矯正変異が、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、矯正変異の少なくとも(a)、(b)、又は(c)、好ましくは(a)、(b)、及び(c)のうちの少なくとも2つ、最も好ましくは、(a)、(b)、及び(c)をもたらす変異を有する野生型HIV Envタンパク質
からなる群から選択される、実施形態59又は60の方法である。
HIVエンベロープクレードCコンセンサス配列
HIVクレードCエンベロープ(Env)タンパク質コンセンサス配列は、HIV Envタンパク質の三量体形成に対する様々な変異の影響を調査するためのバックボーン配列として開発された。既知のHIVウイルス単離株由来の3,434個のエンベロープタンパク質配列の配列アラインメントを、Los Alamosデータベース(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)からダウンロードした。3,434個の配列から、クレードCのみの1,252個の配列を選択して、HIVクレードC Envタンパク質コンセンサス配列を生成した。アラインメントに基づいてコンセンサス残基を明確に同定することができなかった位置で、コンセンサス配列を使用して、BLAST検索によって最も近い野生型配列を同定した。続いて、これらの位置のコンセンサス残基を、BLAST検索から同定された最も近い野生型配列におけるアミノ酸として選択した。HIV EnvクレードCコンセンサス配列を配列番号2に示す。
HIV EnvクレードBコンセンサス配列は、HIV EnvクレードCコンセンサス配列を生成するための上記の手順と同様の手順を用いて生成された。クレードBコンセンサス配列は、既知のクレードBウイルス単離株由来の1,708個のクレードBエンベロープタンパク質配列を用いて生成された。HIV EnvクレードBコンセンサス配列を配列番号4に示す。
組換え体HIV Envタンパク質は可溶性gp140タンパク質として発現され、且つ精製された。単一変異(アミノ酸置換)及びその組み合わせ(例えば、二重及び三重変異)をConC_SOSIPバックボーンコンセンサス配列に導入して、一連の組換え体HIV Envタンパク質バリアントを生成した。
配列番号3に示すHIVクレードC Envコンセンサス配列ConC_SOSIPをコードするDNAを、GenScript(Piscataway,NJ 08854)又はGene Art(Life Technologies,Carlsbad,CA)で合成し、コドン最適化した。続いて、コドン最適化された配列をベクターpcDNA2004にクローン化して、HIVクレードC gp140 Envコンストラクトを生成し、これは更なる変異を導入するためのバックボーンHIVエンベロープ配列として使用された。pcDNA2004 HIVクレードC gp140 Envコンストラクト上で実施される部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、ConC_SOSIPバックボーン配列に変異を導入した。HEK-Expi293F細胞又はHEK293F細胞を、ConC_SOSIP配列又はそのバリアントをコードする90%のpcDNA2004ベクター、及びフューリンプロテアーゼをコードする10%のpcDNA2004ベクター(フューリン-pCDNA2004)により、製造業者の指示書に従って一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を37℃及び10%CO2で5日間培養した。培養上清を1250×gで10分間遠心させた。その後、0.22μmの真空フィルターを使用して、遠心上清を滅菌濾過し、更なる使用まで4℃で保存した。
pcDNA2004ベクターから発現されるHIV gp140 Envタンパク質を、初回の精製ではガランタス・ニバリス(Galantus nivalis)-レクチンカラム(Vectorlabs、AL-1243)、続く工程ではSuperdex200 Increaseカラム(GE)を使用する、2段階の精製プロトコルに従って精製して、残留している不純物を除去した。ガランタス・ニバリス(Galantus nivalis)-レクチンカラムを使用する初回の工程のために、培養上清を緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl pH7.5)で希釈し、4mL CVのTricorn 10-50レクチンアガロースカラムに毎分4mLの速度で通過させた。その後、カラムを4カラム容量の緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl pH7.5)で洗浄し、4カラム容量の40mM Tris、500mM NaCl及び1Mマンノピラノシド pH7.5を用いて1.6mL/分の上向流により溶出したが、これは、流れの方向を下向きから上向きに変えて、エンベロープタンパク質の溶出の速度を増大させ、且つ溶出容量を減少させたことを意味している。溶出液をスピンコンセントレータ(50K、Amicon Ultra、Millipore)を使用して濃縮した。
発現されたHIV gp140 Envタンパク質を含有する細胞培養上清及び精製したHIV gp140 Envタンパク質試料を、4~12%(w/v)Bis-Tris NuPAGEゲル、1×MOPS(Life Technologies)上で、還元条件下又は非還元条件下にて分析し、iBlot技術(Life Technologies)を使用してブロットした。すべての手順を、製造業者の指示に従って実施した。純度分析のために、ゲルをKrypton Infrared Protein Stain(Thermo Scientific)又はSYPRO Rubiタンパク質染料(Bio-Rad)で染色した。ウェスタンブロット分析のために、膜を抗6×ヒスチジンタグ抗体(抗His-HRP)で探索した。ゲル及びブロット膜をOdyssey装置(Li-Cor)でスキャンし、画像をOdyssey 3.0ソフトウェア(Li-Cor)を使用して分析した。
実施例2で生成された組換え体HIV Envタンパク質バリアントを三量体形成に関してスクリーニングして、ConC_SOSIPバックボーン配列と比較して、形成される三量体の割合を向上させ、且つ/又は三量体の収量を向上させたそれらの変異を同定した。三量体の割合及び三量体の収量のハイスループットなスクリーニングを、AlphaLISAアッセイを使用して行い、組換え体HIV Envタンパク質に対する一群の広域中和HIV抗体(bNAb)及び非bNAbの結合を評価した。AlphaLISAアッセイの結果を、サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱(SEC-MALS)によって確認した。
HIV gp140 Envタンパク質の総発現量及び実施例2に記載されるように生成されたConC_SOSIP配列に導入された単一アミノ酸置換を有する200を超えるHIV gp140バリアントの適切にフォールディングされた天然の三量体の総量を、細胞培養上清中でAlphaLISAアッセイによって測定した。二重変異及び三重変異を含有するHIV gp140バリアントもまた試験された。いずれの追加の変異も有しないConC_SOSIP配列を有するHIV Envタンパク質を、比較のために試験した。
ConC_SOSIPバックボーン配列中の上記の表1の(i)~(vii)のリストからのいくつかの単一、二重、及び三重アミノ酸置換に関するAlphaLISAアッセイによって決定された三量体形成の割合を図2Aに示す。試験された単一アミノ酸置換を含有する約200個のHIV gp140 Envバリアントの中で、任意の追加のアミノ酸置換を有しないConC_SOSIPバックボーン配列に対して形成された三量体の割合と比較して、形成された三量体の割合を少なくとも25%増加させた7つの置換位置が同定された。
更に、SEC-MALS分析を使用して、AlphaLISAアッセイを使用してスクリーニングされたHIV gp140バリアントに関する三量体の収量及び三量体形成の割合を検証した。HIV gp140バリアントを30mLスケールの培養液中で発現させ、Polyprep自然落下カラム(Biorad カタログ番号731-1550)中の200μlのガランサス・ニバリス(Galanthus nivalis)レクチンビーズ(Vectorlab カタログ番号AL-1243)上に無細胞上清を適用することによって精製した。ビーズを2mlの結合緩衝液(40mM Tris、500mM NaCl、pH7.4)で洗浄した。250~500μlの40mM Tris、500mM NaCl、1Mマンノピラノシド pH7.4を使用して、タンパク質を溶出した。SEC-MALS実験を実施するために、高速液体クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies)及びOptilab T-rEX屈折率検出器(Wyatt)と連結したMiniDAWN TREOS装置(Wyatt)を使用した。全体で100μlのレクチン溶出又は約30μgのタンパク質のいずれかを、ランニング緩衝液(150mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH7.0)中で1mL/分にて平衡化したTSK-Gel G3000SWxlカラム(Tosoh Bioscience)に適用した。データをAstra 6ソフトウェアパッケージを使用して分析し、分子量計算値を屈折率シグナルから導出した。
クレードBコンセンサス配列ConB_SOSIP(配列番号5)に導入される単一アミノ酸置換(I535N、D589V、N651F又はK655I)を含む組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載されるように生成され且つ精製された。三量体の収量及び三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
配列番号7に示される配列を有する合成HIVエンベロープタンパク質(「DS_sC4_SOSIP_E166R」と命名される)に導入されるアミノ酸置換を含む組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載されるように調製され且つ精製された。合成HIVエンベロープタンパク質DS_sC4_SOSIP_E166Rは、いわゆるSOSIP変異(残基501及び605におけるCys、並びに残基559におけるPro)、ジスルフィド(DS)結合の導入をもたらす残基201及び433におけるCys、並びに尖部を安定化する166位におけるArgを有する。加えて、このタンパク質は655位でトランケートされる。三量体形成の割合及び三量体の収量を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
ConC_SOSIP(配列番号3に示される配列を有する)に導入されるアミノ酸置換を含む組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載されるように調製され且つ精製された。三量体形成の割合を、実施例3に記載されるようにAlphaLISAアッセイによって測定した。その後、組み合わせのうちより少数の選択物(下記で斜字体で表されるもの、及び加えてK655I;I535N、D589V;I535N、K655I;D589V、K655I)を、実施例3に記載されるようにガランサス・ニバリス(Galanthus nivalis)レクチンを使用して精製し、三量体含量をSEC-MALSを使用して分析した。
K655I、N651F;
K655I、N651F、E647F;
K655I、N651F、E647F、I535N;
K655I、N651F、I535N;
K655I、I573F;
K655I、D589V、I573F;
K655I、D589V、I573F、N651F;
K655I、D589V、I573F、K588E;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、I535N;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、I535N、A204I;
K655I、D589V、I535N、L556P;
K655I、D589V、I573F、N651F、K588E、L556P;
K655I、D589V、A204I;
L556P、N651F;
L556P、N651F、K655I;
L556P、N651F、K655I、I535N;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、N651F、I535N;
L556P、N651F、I535N、I573F;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、K655I、I535N;
L556P、K655I、I535N、I573F;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q;
L556P、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F;
L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q。
(He et al,2016)の記載と同様の方法で安定化されたEnvタンパク質をディスプレイするフェリチン及びDPS自己組織化粒子を調製した。これを行うために、gp140タンパク質は、短いアミノ酸リンカー(例えば、GSG又はAAAGSであるが、他のリンカーも使用することができ、例えば、He et al,2016を参照のこと)を介してDNAレベルで粒子のN末端に融合され、Expi293F細胞において融合タンパク質を発現した。この方法で調製された粒子の一例は、ConC_SOSIP(配列番号3)HIV Envタンパク質に融合したフェリチンに基づき、I535N、A558P、D589V、K655Iの変異を有した。三量体形成を向上させると報告された(Kesavardhana et al,2014)追加のV570D変異を有するこのEnvタンパク質を有するフェリチン粒子も調製したが、この変異は、望ましくない非中和抗体(17b)の結合の著しい増加をもたらすことが観察された。これらの5つの変異を有するEnvはまた、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)及びマイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)に由来する2種類のDPS粒子に融合された(DPS粒子の調製については、例えば、国際公開第2011/082087号パンフレットを参照のこと)。これらの5つの変異及び加えてジスルフィド架橋を導入する二重変異I201C-A433Cを有するEnvもフェリチンに融合された。
658位(HIV-1単離株HXB2のgp160に従うナンバリング)で置換変異を有する組換え体HIV Envタンパク質をConC_SOSIP(配列番号3)バックボーン中で調製した。K658を、Val、Ile、Phe、Met、Ala、及びLeuに変異させた。加えて、いくつかの二重変異体が作られ、これらの変異は、上記の安定化変異の1つであるK655Iと組み合わせられた。三量体形成の割合を、実施例3に記載されるようにAlphaLISAアッセイによって決定した。
単一アミノ酸置換(I535N、D589V、N651F、K655I、I573F、A204I、又はE647F)を、実施例2に記載されるようにSOSIP改変(「BG505_SOSIP」と命名される)を含む野生型クレードAのHIVエンベロープタンパク質に導入した。HIVエンベロープタンパク質BG505_SOSIPは、いわゆるSOSIP変異(残基501及び605におけるCys、並びに残基559におけるPro)、並びにジスルフィド(DS)結合の導入をもたらす残基201及び433における更なるCys、並びに332位における潜在的N-グリコシル化部位(T332N変異)を有する。このタンパク質は664位でトランケートされる。BG505_SOSIPの配列を配列番号21に示す。
単一アミノ酸置換T651F、追加の置換L556P(C97ZA_SOSIP_L556P)を伴うWT C97ZA_SOSIP Env配列(配列番号23)に導入される二重アミノ酸置換T651F、M535Nを含む本発明の実施形態による組換え体HIV Envタンパク質が、実施例2に記載のように生成され、発現された。三量体の収量及び三量体形成の割合を、実施例3に記載のようにAlphaLISAアッセイによって測定した。
クレードC株Du422由来のEnvタンパク質中にSOSIP変異を導入し、2つのグリカンホールを295位及び386位においてK295N及びD386N変異によってふさいだ。加えて、いくつかの残基を実施例12及び図13に記載の概念的フレームワークに従って矯正し(V272I、W456R、G466E、及びF643Y)、安定化置換L556P、I535N、N651F及びD589Vを導入した。全ての追加の置換により、より高い三量体の収量及び三量体の割合を得た(例えば、図12)。
感染した患者から単離されたウイルス由来のwt配列は、適切なフォールディングを阻害する不安定化変異を獲得した可能性があるため、クレードC C97ZA、DU422、及びモザイクsC4のwt Env配列を最初に矯正した。
前の実施例で示すように、7つの変異(A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F、及びK655I)は、ConC_SOSIPにおける三量体の収量及び割合を向上させた(「ConC_base」又は「安定化されたConC_SOSIP」又は「ConC_SOSIP 7mut」をもたらす)(例えば、図14及び16)。
実施例2に記載の変異に更に加えて、ConC_SOSIP(配列番号3)バックボーンにおいて、589位、647位、651位及び655位をMet残基によって個別に置換し、三量体形成の割合及び収量について上記の方法を使用して試験した。実施例2に記載の変異のように、647位、651位又は655位におけるMetは、図17で見ることができるように、三量体の品質を向上させた(より高い三量体の割合及び収量、bNAb結合の向上)ことが示された。
ウサギ免疫化の研究を、実施例7に記載されるようにリポソームに結合したEnvタンパク質を用いて実施した。初回免疫(prime)を、Ni-NTAリポソーム上にディスプレイされた安定化したConC_SOSIP.v3(配列番号28)を用いて予備形成し、続いて4つの追加免疫(boosts)を、共有結合クリックリポソームを用いて予備形成し、それぞれが別のタンパク質、すなわち1)矯正及び安定化されたsC4_SOSIP.v4(配列番号32);2)矯正及び安定化されたC97ZA_SOSIP.v2(配列番号30);3)矯正及び安定化されたDu422_SOSIP.v1(配列番号31);及び4)安定化されたBG505_SOSIP.v2(配列番号29)を有した。
クレードC株ZM233M由来のEnvタンパク質中に、文献(Julien et al,2015(上記))から知られる最もフォールディングの劣るEnvであるSOSIP変異が導入された。更に、実施例12及び図13で説明される概念的フレームワークに基づいて多くの残基(S67N、I156N、V174A、V414I、M33N、T347K、H638Y、A394T、F274S、T471G、S316T、V323I、L410S、Y134V、A335E、I395Y、A65V、D130N、A612S、I111L、S195N、N477D、K152E、L181I、S463N)が矯正され、また安定化置換M535N、L556P、K588E、D589V、N651F、K655I、K658Vが導入された。このバリアント(安定化及び矯正されたZM233M Env(HIV172520))の配列は、配列番号35において提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図14に示され(その中の安定化及び矯正されたZM233Mを参照されたい)、これは元のwt ZM233M SOSIP Env分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に高い増加を示す。
ConB_SOSIP(配列番号5)中で、上記の実施例で説明されたクレードC Env及びクレードA Env中で観察された三量体の収量の向上の他に、Q658Vの置換によって、トランスフェクション後に細胞培養上清を用いる分析的SECにおいて三量体の収量が向上し(図18)、これは658VがクレードBの三量体の収量を向上させることを示す。
HEK293F細胞を、安定化アミノ酸置換A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F、及びK655Iを含むか又は含まないかのいずれかの、膜結合性全長(FL)コンセンサスC(ConC)SOSIP(配列番号44)を発現させるDNAコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクション後の2日間、細胞は、広域中和抗体及び非広域中和抗体(bNAb及び非bNAb)のパネルでインキュベートされ、蛍光活性化セルソータ(FACS)を用いて、Alexa Fluor647(AF647)とラベリングされた抗ヒト二次抗体によって検出された。統合平均蛍光強度(integrated median fluorescence intensity)(iMFI)を、AF647陽性細胞の頻度をMFIで乗算することによって計算して、応答の大きさ及び品質の両方を組み込む測定基準を提供した(例えば、Darrah PA,et al.Nat Med.2007,13(7):843-50)。データは、図20の安定化変異(ConC_SOSIP_FL)を有さないバックボーンコンストラクトに対する倍率変化として示される。全体的に、膜結合性の文脈におけるbNAb iMFIに対する安定化変異の効果は限定的であるように見え、バックボーンと比較して、10個のbNAbのうち1個はより高いシグナルを示し、10個のbNAbのうち2個はより低いシグナルを示す。しかしながら、8個の非bNAbの全ては、安定化変異の存在下でiMFIの低下を示し、これは、膜結合性の文脈においてこれらの置換の有益な効果を実証する。
配列番号1 HIV-1単離株HXB2のgp160(シグナル配列は斜体であり;表1の位置(i)~(vii)におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され;658位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である)
RRRRRR
MRVRGILRNWQQWWIWGILGFWMLMICNVVG(注記:最後のVGは、成熟タンパク質の開始、又はシグナル配列の終端になり得る)
NPDWLPDM
GSGSGSGS
DDVHPDWD
RDTFALMM
DEEKVMDF
DEDPHWDP
MRVKGIRKNYQHLWRWGTMLLGMLMICSA
AAALPETGGGSDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHHHHHH
MRVRGMLRNWQQWWIWSSLGFWMLMIYSV
MRVMGIQRNCQHLFRWGTMILGMIIICSA
MRVRGIMRNWQQWWIWGSLGFWMLIICNVnG
MRVTGIRKNYRHLWRWGTMLLGMLMISSA
MRVMGILRNCQQWWIWSILGFLMIYSVIG
MRVRGILRNYPQWWIWGILGFWMLMNCNG
MRVRGIPRNWPQWWMWGILGFWMIIICRVVG
[1]
658位におけるアミノ酸は、Val、Ile、Phe、Met、Ala、及びLeuからなる群から選択され、位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス(HIV)エンベロープ(Env)タンパク質。
[2]
前記658位におけるアミノ酸はValである、上記[1]に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[3]
前記658位におけるアミノ酸はIleである、上記[1]に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[4]
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、若しくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、若しくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsn若しくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、若しくはAla;
(v)573位におけるPhe若しくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;及び/又は
(vii)647位におけるPhe、Met、若しくはIle、好ましくはPheのアミノ酸残基のうちの1つ以上を更に含み、
前記位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160における前記ナンバリングに従う、上記[1]~[3]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[5]
658位にValを含み、655位にIleを含む、上記[4]に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[6]
658位にValを含み、651位にPheを含む、上記[4]又は[5]に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[7]
前記(i)~(vii)のアミノ酸残基のうち少なくとも2つを含む、上記[4]~[6]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[8]
前記HIV Envタンパク質は、クレードA、B、又はCのHIV Envタンパク質、好ましくはクレードCのHIV Envタンパク質である、上記[1]~[7]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[9]
前記指定アミノ酸は親HIV Envタンパク質内に存在し、前記親HIV Envタンパク質は、
(a)HIV Envコンセンサス配列を含むHIV Envタンパク質;
(b)合成HIV Env配列;及び
(c)少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基における少なくとも1つの矯正変異、好ましくは少なくとも3つの矯正変異を含む、好ましくはクレードCの野生型HIV Envタンパク質であって、前記矯正変異は、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、前記矯正変異は、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、野生型HIV Envタンパク質から選択される、上記[1]~[8]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[10]
501位及び605位においてCys、又は559位においてPro、好ましくは、501位及び605位においてCys、並びに559位においてProを更に含む、上記[1]~[9]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[11]
(viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、Trp、若しくはPhe、好ましくはGln若しくはGlu;
(ix)64位におけるLys、若しくは66位におけるArg、若しくは64位におけるLys及び66位におけるArg;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位及び433位の両方におけるCys;
(xii)556位若しくは558位におけるPro、若しくは556位及び558位の両方におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の、7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、若しくは569位におけるGly、若しくは636位におけるGly、若しくは568位及び636位の両方におけるGly、若しくは569位及び636位の両方におけるGly;並びに/又は
(xv)302位におけるTyr、若しくは519位におけるArg、若しくは520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位及び520位の両方におけるArg;
の1つ以上を更に含む、上記[1]~[10]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[12]
前記HIV Envタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、508~511位でのRRRRRR(配列番号10)による置換を更に含む、上記[1]~[11]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[13]
gp140又はgp160タンパク質である、上記[1]~[12]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質。
[14]
上記[1]~[13]のいずれかに記載の3つの同一の組換え体HIV Envタンパク質の非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体。
[15]
上記[1]~[13]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質又は上記[14]に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソーム又はナノ粒子。
[16]
上記[1]~[13]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質をコードする単離核酸分子。
[17]
プロモーターに作動可能に連結された上記[16]に記載の単離核酸分子を含むベクター。
[18]
アデノウイルスベクターである、上記[17]に記載のベクター。
[19]
上記[16]に記載の単離核酸分子又は上記[17]若しくは[18]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[20]
組換え体HIV Envタンパク質を産生する方法であって、前記組換え体HIV Envタンパク質の産生に好適な条件下で上記[19]に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、方法。
[21]
上記[1]~[13]のいずれかに記載の組換え体HIV Envタンパク質、上記[14]に記載の三量体複合体、上記[15]に記載の粒子、上記[16]に記載の単離核酸分子、又は上記[17]若しくは[18]に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
[22]
HIV Envタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法は、658位におけるLys又はGlnのVal、Ile、Phe、Met、Ala、又はLeu、好ましくはVal又はIle、最も好ましくはValによる置換を親HIV Envタンパク質に導入することを含み、前記位置のナンバリングは、HIV-1単離株HXB2のgp160における前記ナンバリングに従う、方法。
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Claims (18)
- 658位におけるアミノ酸は、Val、Ile、Phe、Met、Ala、及びLeuからなる群から選択され、位置のナンバリングは、配列番号1に示されるHIV-1単離株HXB2のgp160におけるナンバリングに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス(HIV)エンベロープ(Env)タンパク質。
(但し、以下のアミノ酸残基:
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe
の2つ以上を含むHIV Envタンパク質を除く。) - 前記658位におけるアミノ酸はValである、請求項1に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 前記658位におけるアミノ酸はIleである、請求項1に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 前記HIV Envタンパク質は、クレードA、B、又はCのHIV Envタンパク質、好ましくはクレードCのHIV Envタンパク質である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 前記アミノ酸は親HIV Envタンパク質内に存在し、前記親HIV Envタンパク質は、
(a)HIV Envコンセンサス配列を含むHIV Envタンパク質;
(b)合成HIV Env配列;及び
(c)少なくとも1000、好ましくは少なくとも10000の野生型HIV Env配列のコレクション中のHIV Env配列のうち7.5%未満、好ましくは2%未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基における少なくとも1つの矯正変異、好ましくは少なくとも3つの矯正変異を含む、好ましくはクレードCの、野生型HIV Envタンパク質であって、前記矯正変異は、前記コレクション中のHIV Env配列のうち少なくとも10%の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、前記矯正変異は、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、野生型HIV Envタンパク質
から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。 - 501位及び605位においてCys、又は559位においてPro、好ましくは、501位及び605位においてCys、並びに559位においてProを更に含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- (viii)588位におけるGln、Glu、Ile、Met、Val、Trp、若しくはPhe、好ましくはGln若しくはGlu;
(ix)64位におけるLys、若しくは66位におけるArg、若しくは64位におけるLys及び66位におけるArg;
(x)316位におけるTrp;
(xi)201位及び433位の両方におけるCys;
(xii)556位若しくは558位におけるPro、若しくは556位及び558位の両方におけるPro;
(xiii)548~568アミノ酸位におけるループ(HR1ループ)の、7~10アミノ酸を有するループ、好ましくは8アミノ酸のループ、例えば、(配列番号12~17)のいずれか1つから選択される配列を有するループによる置換;
(xiv)568位におけるGly、若しくは569位におけるGly、若しくは636位におけるGly、若しくは568位及び636位の両方におけるGly、若しくは569位及び636位の両方におけるGly;並びに/又は
(xv)302位におけるTyr、若しくは519位におけるArg、若しくは520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに520位におけるArg、若しくは302位におけるTyr並びに519位及び520位の両方におけるArg;
の1つ以上を更に含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。 - 前記HIV Envタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、508~511位でのRRRRRR(配列番号10)による置換を更に含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- gp140又はgp160タンパク質である、請求項1~8のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の3つの同一の組換え体HIV Envタンパク質の非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質又は請求項10に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソーム又はナノ粒子。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質をコードする単離核酸分子。
- プロモーターに作動可能に連結された請求項12に記載の単離核酸分子を含むベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項12に記載の単離核酸分子又は請求項13若しくは14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 組換え体HIV Envタンパク質を産生する方法であって、前記組換え体HIV Envタンパク質の産生に好適な条件下で請求項15に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、方法。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の組換え体HIV Envタンパク質、請求項10に記載の三量体複合体、請求項11に記載の粒子、請求項12に記載の単離核酸分子、又は請求項13若しくは14に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
- HIV Envタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法は、658位におけるLys又はGlnのVal、Ile、Phe、Met、Ala、又はLeu、好ましくはVal又はIle、最も好ましくはValによる置換を親HIV Envタンパク質に導入することを含み、前記位置のナンバリングは、配列番号1に示されるHIV-1単離株HXB2のgp160における前記ナンバリングに従う、方法。
(但し、以下の2つ以上による置換を前記親HIV Envタンパク質に導入することを除く。
(i)651位におけるPhe、Leu、Met、もしくはTrp、好ましくはPhe;
(ii)655位におけるPhe、Ile、Met、もしくはTrp、好ましくはIle;
(iii)535位におけるAsnもしくはGln、好ましくはAsn;
(iv)589位におけるVal、Ile、もしくはAla、好ましくはVal;
(v)573位におけるPheもしくはTrp、好ましくはPhe;
(vi)204位におけるIle;および/または
(vii)647位におけるPhe、Met、もしくはIle、好ましくはPhe。)
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