TWI742158B - 三聚體穩定性ｈｉｖ包膜蛋白突變 - Google Patents

三聚體穩定性ｈｉｖ包膜蛋白突變 Download PDF

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Abstract

提供了人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，其具有穩定該包膜蛋白的三聚體形式的突變。該等HIV包膜蛋白在包膜蛋白序列中的特定位置具有某些胺基酸取代。與不具有所指示胺基酸取代中的一個或多個的HIV包膜蛋白相比，此處所述的HIV包膜蛋白具有改進的三聚體形成百分比和/或改進的三聚體產量。還提供了編碼該等HIV包膜蛋白的核酸分子和載體，以及含有該等HIV包膜蛋白、核酸和載體的組成物。

Description

三聚體穩定性HIV包膜蛋白突變
三聚體穩定性HIV包膜蛋白突變
人類免疫缺陷病毒(HIV)影響全世界數百萬人，並且即使在廣泛的抗逆轉錄病毒治療的時代，藉由有效疫苗預防HIV仍然具有非常高的優先順序。HIV病毒不同毒株和進化枝之間的抗原多樣性使得難以開發具有廣泛功效的疫苗。HIV-1係該病毒中最常見的並且致病的毒株，其中超過90%的HIV/AIDS病例來源於HIV-1 M群的感染。M群進一步細分為進化枝或亞型，其中進化枝C最大。有效疫苗理想地能夠引發強大的細胞應答和廣泛中和性抗體兩者，該等廣泛中和性抗體能夠中和來自不同進化枝的HIV-1毒株。
HIV表面上的包膜蛋白刺突(Env)由糖蛋白gp120和gp41的異源二聚體的三聚體組成(圖1A)。先質蛋白gp160被弗林蛋白酶(furin)切割成gp120和gp41，gp120係刺突的頭部，並且包含CD4受體結合位點以及大的高變環(V1至V5)，gp41係包膜蛋白刺突的膜錨定莖。與其他I類促融合蛋白一樣，gp41含有N端融合肽(FP)、C端跨膜(TM)結構域和細胞質結構域。HIV和靶細胞膜之間的膜融合需要包膜蛋白的一系列構象變化。HIV疫苗可以基於包膜蛋白進行開發。
然而，各種因素使得基於包膜蛋白開發HIV疫苗具有挑戰性，包括HIV-1的高遺傳變異性、包膜蛋白的緻密碳水化合物外殼、以及包膜蛋白刺突結構的相對動態和不穩定的性質。野生型包膜蛋白由於其功能而不穩定。因此，有時將穩定修飾引入到包膜結構中用於產生候選疫苗。包膜蛋白係中和抗體的 靶標，並且高度糖基化，其藉由遮罩蛋白表位而降低免疫原性。所有已知的廣泛中和抗體(bNAb)確實適應該等聚糖。
對於疫苗開發，較佳的是使用可誘導bNAb的包膜蛋白。然而，大多數bNAb在其經歷任何構象變化之前僅識別天然包膜蛋白構象。因此，開發穩定的處於其天然樣緊密和封閉構象的包膜蛋白同時最小化非天然和(由此)非中和表位的呈遞，可以改進產生這種bNAb的效率。以前對生產HIV疫苗的做出的努力集中在開發含有三聚體HIV包膜蛋白gp140的融合前胞外結構域的疫苗。gp140不具有跨膜(TM)和細胞質結構域，但與gp120不同，它可以形成三聚體結構。此外，該等以前的努力主要集中在進化枝A上。然而，已經誘導的中和抗體應答的廣度仍然有限。因此，如果穩定的天然包膜三聚體針對多個HIV進化枝可用，也將是有益的。
二十多年來，已經嘗試開發穩定的處於其融合前三聚體構象的包膜蛋白，僅在產生能夠誘導廣泛中和抗體應答的包膜蛋白的可溶性穩定三聚體方面取得有限的成功。例如，已經將所謂的SOSIP突變(501C、605C和559P)引入包膜蛋白序列以改進可溶性gp140三聚體部分的形成(Sanders等人，(2002),J.Virol.[病毒學雜誌]76(17)：8875-89)。所謂的SOSIP突變包括根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號(這係本領域中使用的常規編號方案)的位置501和605處的半胱胺酸殘基和位置559處的脯胺酸殘基。在三維蛋白結構中彼此接近的位置501和605處的兩個半胱胺酸殘基的引入導致二硫橋。SOSIP突變體包膜蛋白，例如BG505_SOSIP和B41_SOSIP(來自具有SOSIP突變的HIV毒株BG505和B41(即9032-08.A1.4685)毒株的包膜蛋白)，已經用於疫苗研究中，並且顯示誘導2級自體中和Ab(Sanders等人，Science[科學](2015),349(6224)：139-140)。
然而，即使所謂的SOSIP突變能夠穩定包膜蛋白的三聚體形式，此類SOSIP突變體的三聚體部分通常低於10%，仍然產生大量的單體和聚集體。即使 SOSIP突變體BG505_SOSIP係迄今已知的在穩定三聚體形式的能力方面最有希望的SOSIP突變體包膜蛋白之一，它典型地僅產生多達25%的三聚體形式(Julien等人，Proc.Nat.Acad.Sci.[美國科學院院報](2015),112(38),11947-52)。此外，在此三聚體部分中三聚體在頂點浮動時並不完全穩定。因此，除了該等SOSIP突變之外，還已經設計了幾種額外的取代，例如E64K、A316W和201C-433C，以穩定頂點並防止其浮動(de Taeye等人，Cell[細胞](2015),163(7),1702-15；Kwon等人，(2015)Nat.Struct.Mol.Biol.[自然結構與分子生物學]22(7)522-31)。
因此，需要HIV包膜蛋白的穩定三聚體，其具有改進的三聚體形成百分比、改進的三聚體產量和/或改進的三聚體穩定性。較佳的是，HIV包膜蛋白的這種穩定三聚體也將展示與廣泛中和抗體(bNAb)的良好結合和與非廣泛中和Ab(非bNAb)的相對有限結合。本發明的目的是提供具有改進的三聚體百分比並且較佳的是也具有改進的三聚體產量的HIV Env蛋白。
本發明涉及來自不同進化枝的重組HIV包膜蛋白，其與先前描述的HIV包膜三聚體相比具有改進的三聚體形成百分比和/或改進的三聚體產量。Env折疊被優化，毒株特異性特徵被修復，並且對於融合過程重要的融合前閉合構象的區域被此處所述的突變穩定。這提供了一種通用的方法來優化融合前閉合的HIV-1包膜三聚體的折疊和穩定性。所得的穩定且良好折疊的HIV Env三聚體可用於免疫目的，例如，以改進在施用重組HIV Env三聚體時誘導廣泛中和抗體並且減少非中和抗體和弱中和抗體的誘導的機會。本發明還涉及分離的核酸分子和編碼重組HIV包膜蛋白的載體，包含該等的細胞，以及重組HIV包膜蛋白、核酸分子、載體和/或細胞的組成物。
在一個一般方面，本發明涉及在包膜蛋白序列的鑒定位置處具有特定胺基酸殘基的重組人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，該等胺基酸殘基穩定三聚體的形成。
在某些實施方式中，本發明的重組HIV包膜(Env)蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少兩個處具有指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala；(v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。在某些較佳的實施方式中，位置651處所指示的胺基酸殘基為Phe；位置655處所指示的胺基酸殘基為Ile；位置535處所指示的胺基酸殘基為Asn；和/或位置573處所指示的胺基酸殘基為Phe。
在某些實施方式中，本發明的重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala； (v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，其中該HIV Env蛋白選自由以下各項組成之群組：(1)HIV Env共有胺基酸序列，例如，來自進化枝C(例如包含SEQ ID NO：2或3的胺基酸序列)或進化枝B(例如包含SEQ ID NO：4或5的胺基酸序列)；(2)合成HIV Env蛋白，例如包含(a)：SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或(b)：在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6，或(c)：在位置501和605處的胺基酸突變為Cys殘基且位置559處的胺基酸突變為Pro殘基的(a)或(b)，或(d)：具有另外的弗林蛋白酶切割位點突變的(a)、(b)或(c)，例如由RRRRRR(SEQ ID NO：10)替換位置508-511處的胺基酸，或(e)SEQ ID NO：7，或(f)鑲嵌Env序列，如包含SEQ ID NO：8或9的胺基酸序列的Env；以及(3)親本HIV Env蛋白，較佳的是野生型HIV Env蛋白，較佳的是進化枝C的，包含以至少100個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率，發現於對應位置的胺基酸殘基處的至少一個修復突變，其中該修復突變係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由發現於對應位置的胺基酸殘基進行的取代，並且較佳的是，該修復突變係由發現於所述集合中最常見的對應位置處的胺基酸殘基進行的取代；並且位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。在某些較佳的實施方式中，位置651處所指示的胺基酸殘基為Phe；位置655處所指示的胺基酸殘基為Ile；位置535處所指示的胺基酸殘基為Asn；和/或位置573處所指示的胺基酸殘基為Phe。
在某些實施方式中，本發明的重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala；(v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，其中該HIV Env蛋白係包含至少一個突變的SOSIP突變體HIV Env蛋白，所述突變導致在選自下組的指示位置處的一個或多個指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(a)位置501和605處的Cys；(b)位置559處的Pro；以及(c)位置501和605處的Cys和位置559處的Pro；以及該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。在某些較佳的實施方式中，位置651處所指示的胺基酸殘基為Phe；位置655處所指示的胺基酸殘基為Ile；位置535處所指示的胺基酸殘基為Asn；並且位置573處所指示的胺基酸殘基為Phe。
在其他實施方式中，本發明的重組HIV Env蛋白還包含在選自下組的指示位置中的至少一個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(viii)位置588處的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，較佳的是Gln或Glu；(ix)位置64處的Lys、或位置66處的Arg、或位置64處的Lys和位置66處的Arg； (x)位置316處的Ttp；(xi)201和433兩個位置處的Cys；(xii)位置556處的Pro、或位置558處的Pro、或位置556和558處的Pro；(xiii)由具有7-10個胺基酸的環，較佳的是8個胺基酸的環，例如具有選自(SEQ ID NO：12-17)中任一個的序列的環，替換胺基酸位置548-568處的環(HR1環)；(xiv)位置568處的Gly、或位置569處的Gly、或位置636處的Gly、或568和636兩個位置處的Gly、或569和636兩個位置處的Gly；和/或(xv)位置302處的Tyr、或位置519處的Arg、或位置520處的Arg、或位置302處的Tyr和位置519處的Arg、或位置302處的Tyr和位置520處的Arg、或位置302處的Tyr以及519和520兩個位置處的Arg。
在某些實施方式中，本發明的重組HIV Env蛋白還包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突變，如位置508-511處由RRRRRR(SEQ ID NO：10)進行的替換。
在一個實施方式中，重組HIV Env蛋白係gp140蛋白。
在另一個實施方式中，重組HIV Env蛋白係gp160蛋白。
在某些實施方式中，重組HIV Env蛋白在細胞質區域被截短，例如，該細胞質區域的7個胺基酸後。
在另一個一般方面，本發明涉及三聚體複合物，其包含此處所述的任何重組HIV Env蛋白中的三種的非共價低聚物。
本發明的另一個一般方面係提供了一種改進親本HIV Env蛋白的折疊和穩定性(如增加的三聚體百分比和/或三聚體產量測量的)之方法，該方法包括藉由在親本HIV Env蛋白中引入至少一個修復突變，較佳的是至少3個修復突變，來修復親本HIV Env蛋白的胺基酸序列，其中修復突變係以至少100個、較佳的是至少500個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置的胺基酸殘基處的胺基酸取代，其中該取代係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由存在於對應位置的胺基酸殘基進行的，並且較佳的是，該取代係由存在於所述集合中最常見的對應位置處的胺基酸殘基進行的。本發明還提供了可藉由本發明的所述方法獲得的經修復的HIV Env蛋白，用於改進HIV Env蛋白的折疊和穩定性(作為三聚體百分比和/或三聚體產量測量的)。本發明還提供了包含所述經修復的HIV Env蛋白之藥物組成物。本發明還提供了一種用於產生HIV Env蛋白之方法，包括用於修復此處所述的HIV Env蛋白並且在重組宿主細胞中表現編碼經修復的穩定的HIV Env蛋白的核酸之方法。
在另一個一般方面，本發明涉及包含與SEQ ID NO：2至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的重組HIV Env蛋白，其中較佳的是位置204、535、573、589、647、651和655以及較佳的是另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、588、548-568和605在確定%一致性時不考慮，其中編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。在其某些實施方式中，重組HIV Env蛋白包含與SEQ ID NO：3至少98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中較佳的是位置204、535、573、589、647、651和655以及較佳的是另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在確定%一致性時不考慮，其中編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
在另一個一般方面，本發明涉及包含與SEQ ID NO：4至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的重組HIV Env蛋白，其中較佳的是位置204、535、573、589、647、651和655以及較佳的是另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、588、548-568和605在確定%一致性時不考慮，其中編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。在其某些實施 方式中，重組HIV Env蛋白包含與SEQ ID NO：5至少98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中較佳的是位置204、535、573、589、647、651和655以及較佳的是另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在確定%一致性時不考慮，其中編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
在該等方面和實施方式中，確定%一致性時未考慮的指示位置處的胺基酸中的一個或多個較佳的是選自此處較佳的指示胺基酸，例如位置204處的Ile；位置651處的Phe、Ala、Leu、或Trp等(參見下表1和表2)。
在另一個一般方面，本發明涉及重組HIV Env蛋白，其包含與SEQ ID NO：2、3、4、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一個至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：20、22、24、26、27、28、29、30、31或32係特別較佳的。在這方面，較佳的是位置204、535、573、589、647、651、655和658以及較佳的是另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在確定%一致性時不考慮，其中編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。也在這方面，確定%一致性時未考慮的指示位置處的胺基酸中的一個或多個較佳的是選自此處在表1的(i)-(vii)、表2的(viii)-(xv)和/或表1的(xvi)中較佳的指示胺基酸，例如位置204處的Ile；位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp等。
在另一個一般方面，本發明涉及一種粒子，較佳的是脂質體或奈米粒子，例如自組裝奈米粒子，在其表面上展示本發明的重組HIV Env蛋白。
在另一個一般方面，本發明涉及編碼本發明的重組HIV Env蛋白的分離的核酸分子和包含與啟動子可操作地連接的分離的核酸分子的載體。在一個實施方式中，該載體係病毒載體。在另一個實施方式中，該載體係表現載體。在一個較佳的實施方式中，該病毒載體係腺病毒載體。
另一個一般方面涉及包含編碼本發明的重組HIV Env蛋白的分離的核酸分子或載體的宿主細胞。該等宿主細胞可用於重組蛋白生產、重組蛋白表現或病毒粒子生產。
另一個一般方面涉及產生重組HIV Env蛋白之方法，該方法包括使包含編碼本發明的重組HIV Env蛋白的分離的核酸分子或載體的宿主細胞生長在適於產生該重組HIV Env蛋白的條件下。
又另一個一般方面涉及包含如此處所述的重組HIV Env蛋白、三聚體複合物、分離的核酸分子、載體或宿主細胞以及藥學上可接受的載劑的組成物。
當連同附圖一起閱讀時，會更好地理解先前概述以及以下本發明的詳述。應理解的是本發明不限於附圖中示出的準確實施方式。
在附圖中：圖1A和1B顯示了HIV包膜(Env)蛋白的結構之示意圖；圖1A顯示了全長HIV Env蛋白；並且圖1B顯示了根據HIV-1分離株HXB2(SOSIP.644序列)的gp160中的編號，含有所謂的SOSIP突變和C端截短(開始於殘基664)的可溶性HIV Env蛋白；圖2A和2B顯示了如實例3所述藉由AlphaLISA測定測量的根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的三聚體形成百分比(圖2A)和三聚體產量(圖2B)。測試的重組HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有進化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)的單、雙或三胺基酸取代；基於三聚體特異性單株抗體(mAb)PGT145與每種重組HIV Env蛋白的結合確定三聚體百分比和三聚體產量；將本發明的每種重組HIV Env蛋白的三聚體產量和三聚體形成百分比 與具有無此處所述的任何額外三聚體穩定突變的骨架ConC_SOSIP序列的包膜蛋白的情況進行比較；圖3顯示了根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻層析(SEC-MALS)分析之層析圖；測試的重組HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有進化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)的單胺基酸取代，並如實例2所述藉由凝集素親和層析純化；如實例3中所述進行了SEC-MALS分析；對應於三聚體形式的峰在層析圖的每個中指示出；圖4顯示了根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的熱穩定性，報導為熱處理後餘下的三聚體的百分比；測試的重組HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有進化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)的單、雙或三胺基酸取代；使重組HIV Env蛋白經受熱處理，並且熱處理後餘下的三聚體的百分比如實例4所述藉由AlphaLISA測定來確定；還顯示了具有無任何額外三聚體穩定突變的骨架ConC_SOSIP序列的包膜蛋白的熱穩定性；圖5A-5B顯示了與具有無如實例5所述的本發明的任何額外三聚體穩定突變的骨架ConB_SOSIP序列的包膜蛋白相比，根據本發明的實施方式的具有引入到骨架HIV Env共有進化枝B序列ConB_SOSIP(SEQ ID NO：5)中的單個胺基酸取代的重組HIV Env蛋白的三聚體形成百分比(圖5A)和三聚體產量(圖5B)；三聚體產量和三聚體形成百分比係藉由AlphaLISA測定來確定；圖6A-6B顯示了如實例6所述的根據本發明的實施方式的具有引入到骨架合成HIV包膜蛋白序列DS_sC4_SOSIP_E166R中的胺基酸取代的重組HIV Env蛋白的三聚體形成百分比和三聚體產量；藉由AlphaLISA測定來確定三聚體形成百分比和三聚體產量。
圖7顯示了根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻層析(SEC-MALS)分析之層析圖；測試的重組HIV Env蛋白 含有單個K655I突變，在每個貼近的變體中，在骨架HIV Env共有進化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)中引入一個額外突變，並如實例2所述藉由凝集素親和層析純化；如實例3中所述進行了SEC-MALS分析；表示ConC_SOSIP中gp140單體的峰由陰影框指示，在三聚體峰右側。下圖顯示了圖形下部的放大，從而可以看出，每個額外突變引起gp140單體峰的高度進一步下降。
圖8A-8B顯示了與具有無如實例9所述的本發明的任何額外三聚體穩定突變的骨架BG505_SOSIP序列的包膜蛋白相比，具有根據本發明的實施方式引入的單胺基酸取代和取代的組合的BG505_SOSIP(衍生自野生型進化枝A毒株)的三聚體形成百分比(圖8A)和三聚體產量(圖8B)。三聚體產量和三聚體形成百分比係藉由AlphaLISA測定來確定。
圖9顯示了根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻層析(SEC-MALS)分析之層析圖；對Env轉染細胞的培養上清液進行SEC-MALS分析。對應於三聚體形式的峰在7和7.5分鐘之間洗提。深灰色線為BG505_SOSIP(衍生自野生型進化枝A毒株)，並且淺灰色線為具有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E取代的BG505_SOSIP。
圖10A-10B顯示了實例10中所述的C97ZA_SOSIP變體的三聚體產量。具有三個穩定取代(L556P、T651F和M535N)的C97ZA的三聚體產量(圖10A和B)。在圖10B中，藉由添加來根據圖12中描述的概念框架修復C97ZA Env序列的額外突變(21個額外突變)並藉由引入額外的穩定取代(K655I、D589V、A204I和K588E)進一步優化Env序列。三聚體產量和三聚體形成百分比係藉由AlphaLISA測定來確定。將信號針對設置為1的ConC_SOSIP信號歸一化。PNGS係潛在的N-糖基化位點。
圖11.具有四個穩定取代(詳見實例11)的HIV-1 Env毒株DU422的三聚體產量。將所有數字針對設置為1的ConC_SOSIP(未顯示)歸一化。
圖12.用於修復針對毒株C97ZA所示的HIV-1 Env序列的通用概念。從C97ZA殘基位置的低至高百分比分選在總HIV-1資料庫(頂部條)和毒株C97ZA殘基(底部條)中發生頻率最高的殘基(此處稱為‘共有殘基’)。基於以下標準選擇要取代為共有殘基的C97ZA序列位置：在Env資料庫序列(黑色條)中具有C97ZA殘基的發生小於2%的位置。具有C97ZA殘基的在Env資料庫序列中發生在2%至7.5%之間並被埋入或部分埋入(深灰色條)的位置。在C97ZA和親水性共有殘基(兩個最淺的灰色條)中暴露和疏水的位置和潛在的N-糖基化位點(PNGS)共有殘基(S234N)的位置。
圖13.藉由序列修復和突變穩定而在融合前閉合的的HIV ENV_SOSIP三聚體。對於廣泛中和抗體，所有SOSIP變體的細胞培養上清液中的AlphaLISA信號均針對ConC_SOSIP歸一化。
圖14.在轉染後使用細胞培養上清液，對照Env_SOSIP變體(骨架SOSIP)、根據實例12和圖12中描述的概念的經修復的Env變體和具有根據表3的額外穩定取代的Env變體的分析SEC特徵曲線。從所有特徵曲線中減去細胞培養上清液的類比信號。三聚體峰用*指示。
圖15.無穩定SOSIP修飾的HIV-1 Env ConC變體之三聚體產量。
圖16.在位置589、647、651和655處突變為甲硫胺酸的ConC_SOSIP的三聚體產量(A)和三聚體百分比(B)。將所有數字針對設置為1的ConC_SOSIP(未顯示)歸一化。誤差條顯示在該等條的右端。
圖17A-17D顯示了藉由AlphaLISA測定來測量的具有如實例15所述的指示突變的重組HIV Env蛋白的三聚體形成百分比(針對不同實驗為圖17A、B)和三聚體產量(針對不同實驗為圖17C、D)。
圖18顯示了具有如實例15所述的指示突變的重組HIV Env蛋白之SEC-MALS層析圖。
在背景和整個說明書中引用或描述了各種出版物、文章和專利；該等參考文獻中的每一篇均藉由引用以其整體結合在此。包括在本說明書中的文件、活動、材料、裝置、物品或類似物的討論用於提供本發明的背景之目的。這種討論不承認任何或所有該等事項形成關於所揭露或要求保護的任何發明的先前技術的一部分。
除非另外定義，在此所使用的所有科學技術術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。否則，在此所使用的某些術語具有說明書中闡述的含義。此處引用的所有專利、公開專利申請案和出版物如同完全列出一樣藉由引用結合在此。必須注意，除非上下文另外明確規定，否則如在此和所附申請專利範圍中所使用，單數形式“一/一個/種(a/an)”和“該”包括複數指示物。
除非另有說明，任何數值，如此處所述的濃度或濃度範圍，應被理解為在所有情況下都被術語“約”修飾。因此，數值典型包括列舉值±10%。如在此所使用，數值範圍的使用明確地包括所有可能的子範圍，該範圍內的所有單個數值，包括值的該等範圍內的整數和分數，除非上下文另有明確指示。
在整個揭露中引用了胺基酸。有20種天然存在的胺基酸以及許多非天然存在的胺基酸。每種已知的胺基酸(包括天然和非天然胺基酸)都具有全名、一字母的縮寫代碼和三字母的縮寫代碼，所有該等都是熟習該項技術者所熟知的。例如，用於20種天然存在的胺基酸的三字母和一字母的縮寫代碼如下：丙胺酸(Ala；A)、精胺酸(Arg；R)、天冬胺酸(Asp；D)、天冬醯胺(Asn；N)、半胱胺酸(Cys；C)、甘胺酸(Gly；G)、穀胺酸(Glu；E)、穀胺醯胺(Gln；Q)、組胺酸(His；H)、異亮胺酸(Ile；I)、亮胺酸(Leu；L)、 賴胺酸(Lys；K)、甲硫胺酸(Met；M)、苯丙胺酸(Phe；F)、脯胺酸(Pro；P)、絲胺酸(Ser；S)、蘇胺酸(Thr；T)、色胺酸(Trp；W)、酪胺酸(Tyr；Y)以及纈胺酸(Val；V)。胺基酸可以藉由其全名、一字母的縮寫代碼或三字母的縮寫代碼來引用。
除非上下文有明確規定，否則在此所使用的HIV包膜蛋白的胺基酸序列中位置的編號根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號，例如以下中所列出的，Korber等人(Human Retroviruses and AIDS 1998：A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences[人類逆轉錄病毒與AIDS 1998：核苷酸和胺基酸序列的彙編與分析]，Korber等人編輯洛斯阿拉莫斯國家實驗室理論生物學和生物物理學組，新墨西哥州洛斯阿拉莫斯[Theoretical Biology and Biophysics Group,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,N.Mex.])，其藉由引用以其整體結合在此。根據HXB2的編號在HIV Env蛋白領域係常規的。HIV-1分離株HXB2的gp160具有SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列。可以使用感興趣的HIV Env序列與此序列的比對來找到感興趣的序列中對應的胺基酸編號。
短語“包含在選自下組的指示位置中的至少一個處具有指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白的胺基酸序列，該組由以下各項組成”和“包含以下(胺基酸殘基)中的一個或多個”在此處互換使用。
術語“百分比(%)序列一致性”或“%一致性”描述了兩個或更多個經比對的胺基酸序列與組成該等胺基酸序列的總長度的胺基酸殘基數相比而言一致的胺基酸的匹配(“命中”)數。換言之，使用比對，對於兩個或更多個序列，當將該等序列針對最大對應(如使用本領域已知的序列比較演算法測量的)進行比較和比對時，或者當手動比對和視覺檢查時，可以確定相同的胺基酸殘基的百分比(例如95%、97%或98%一致性)。因此，進行比較以確定序列一致性的序列可以藉由一個或多個胺基酸取代、添加或缺失來區分。用於比 對蛋白序列的適合程序係熟習該項技術者已知的。蛋白序列的百分比序列一致性可以例如用程序如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST來確定，例如使用NCBI BLAST演算法(Altschul SF等人(1997),Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402)。
如在此所使用，‘HIV Env序列的集合’係可以來自相同進化枝(例如進化枝C)或來自不同進化枝(例如進化枝A、B、C等)的野生型HIV Env蛋白的代表性數目(例如至少100、或500、或1000、或更多)的隨機序列的集合。這樣的序列的適合集合可在資料庫中獲得，或者子集合可以從其中提取，例如HIV序列資料庫(洛斯阿拉莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory))。這樣的集合較佳的是包含至少100個HIV Env蛋白序列、1000個HIV Env蛋白序列、至少10000個HIV Env蛋白序列、至少50000個HIV Env蛋白序列，並且可以含有超過90000個HIV Env蛋白序列。
HIV Env蛋白中的‘對應位置’係指當比對至少兩個HIV Env序列時胺基酸殘基的位置。除非另有指示，否則按照本領域慣例，用於該等目的的胺基酸位置編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
如在此所使用，‘穩定突變’係如表1中的條目(i)-(vii)或(xvi)，或表2的(viii)-(xv)中任一項所述的突變，與親本分子相比，當藉由在所述親本分子中取代對應的胺基酸而引入突變時，所述突變增加了HIV Env蛋白的三聚體百分比和/或三聚體產量(其可以例如根據此處所述的AlphaLISA或SEC-MALS測定來測量)。由這樣的穩定突變得到的胺基酸典型在野生型HIV分離株的Env蛋白中很少發現(如果會有的話)。
如在此所使用，‘修復突變’係親本HIV Env蛋白中的胺基酸殘基的取代，該胺基酸殘基以HIV Env蛋白序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%存在於對應位置，其中該取代係藉由更頻繁地在所述集合中存在於對應位置的 胺基酸進行，例如在所述集合中至少10%的HIV Env蛋白中，並且該取代較佳的是藉由以所述集合中至少20%的HIV Env蛋白存在於對應位置的胺基酸或者是所述集合中對應位置處最常發生的胺基酸進行。由這樣的修復突變得到的胺基酸典型以野生型HIV分離株的相對高百分比的Env蛋白發現，並且在幾種情況下可以與共有HIV Env序列中對應位置處的那些相同。
如在此所使用，與親本HIV Env序列相比，‘經修復的和穩定的’HIV Env序列典型含有至少一個修復突變和至少一個穩定突變，較佳的是多個修復突變和多個穩定突變。
當提及HIV毒株(或來自它的Env蛋白)時，術語‘天然’或‘野生型’可互換使用，並且指自然界中存在的HIV毒株(或來自它的Env蛋白)，例如，如感染HIV的患者中的。
本發明一般涉及在包膜蛋白序列中指示位置處包含穩定包膜蛋白的三聚體形式的某些胺基酸取代的重組HIV包膜(Env)蛋白。將本發明的一個或多個鑒定的胺基酸取代引入HIV包膜蛋白的序列中可以導致三聚體形成百分比增加和/或三聚體產量增加。這可以例如使用三聚體特異性抗體、融合溫度、尺寸排阻層析法和與結合到正確折疊的(穩定三聚體)Env蛋白的抗體的結合或可替代地結合到錯誤折疊的(非穩定或非三聚體)Env蛋白的抗體的結合來測量，並且增加的三聚體百分比和/或三聚體產量被認為指示穩定的、天然的、正確折疊的Env蛋白。
人類免疫缺陷病毒(HIV)係慢病毒屬(Lentivirinae)的成員，其係逆轉錄病毒科(Retroviridae)的一部分。兩種HIV感染人類：HIV-1和HIV-2。HIV-1係最常見的HIV病毒毒株，並且已知比HIV-2更致病。如在此所使用，術語“人類免疫缺陷病毒”和“HIV”係指但不限於HIV-1和HIV-2。在較佳的實施方式中，HIV係指HIV-1。
HIV被分類為具有高度遺傳趨異的多個進化枝。如在此所使用，術語“HIV進化枝”或“HIV亞型”係指根據它們的遺傳相似性程度進行分類的相關人類免疫缺陷病毒。最大的一組HIV-1分離株被稱為M組(主要毒株)，並且由至少從A至J的十個進化枝組成。
在一個一般方面，本發明涉及重組HIV包膜(Env)蛋白。當有關於蛋白使用時，術語“重組”係指藉由重組技術或藉由體外化學合成產生的蛋白。根據本發明的實施方式，“重組”蛋白具有人工胺基酸序列，因為其含有在對應的天然存在的序列中未發現的至少一個序列元件(例如，胺基酸取代、缺失、添加，序列替換等)。較佳的是，“重組”蛋白係非天然存在的HIV包膜蛋白，其針對一種或多種天然存在的HIV毒株誘導免疫應答或產生免疫。
術語“HIV包膜蛋白”、“HIV Env”和“HIV Env蛋白”係指蛋白或其片段或衍生物，其本質上在HIV病毒粒子的包膜上表現，並使HIV能夠靶向和附著於HIV感染細胞的質膜。在整個揭露中，術語“包膜”和“Env”可互換使用。該HIV env基因編碼先質蛋白gp160，該先質蛋白gp160被蛋白質水解性地切割成兩種成熟的包膜糖蛋白，即gp120和gp41。該切割反應由宿主細胞蛋白酶、弗林蛋白酶(或弗林蛋白酶樣蛋白酶)在逆轉錄病毒包膜糖蛋白先質中的高度保守的序列基序處介導。更具體地，gp160三聚化為(gp160)3，並且然後經歷切割成為兩個非共價締合的成熟糖蛋白gp120和gp41。病毒進入隨後由gp120/gp41異源二聚體的三聚體介導。Gp120係受體結合片段，並且結合到靶細胞上的CD4受體(和共受體)上，該靶細胞具有這樣的受體如，例如T-輔助細胞。非共價結合至gp120的Gp41係融合片段並且提供HIV進入細胞的第二步驟。Gp41最初埋在該病毒包膜內，但當gp120與CD4受體和共受體結合時，gp120改變其構象，從而導致gp41暴露，其中它可以幫助與宿主細胞融合。Gp140係gp160的胞外結構域。
根據本發明的實施方式，“HIV包膜(Env)蛋白”可以是gp160或gp140蛋白，或其組合、融合物、截短物或衍生物。例如，“HIV包膜蛋白”可以包括與gp41蛋白非共價締合的gp120蛋白。“HIV包膜蛋白”還可以是截短的HIV包膜蛋白，該截短的HIV包膜蛋白包括但不局限於包含在胞外結構域(即，延伸至細胞外空間的結構域)中的C端截短、在gp41中的截短物(如在gp41的胞外結構域的截短物，在gp41的跨膜結構域中的截短物，或在gp41的細胞質結構域中的截短物)的包膜蛋白。HIV包膜蛋白也可以是gp140，對應於gp160胞外結構域，或gp140的延伸或截短形式。已經在幾個公開(例如Zhang等人，2001；Sanders等人，2002；Harris等人，2011)中描述了gp140蛋白的表現，並且該蛋白也可以不同的變體例如基於不同的HIV毒株從服務提供者訂購。根據本發明的gp140蛋白可以具有切割位點突變，使得gp120結構域和gp41結構域不被切割和共價連接，或者可替代地gp120結構域和gp41胞外結構域可被切割和共價連接，例如，藉由二硫橋(例如比如在SOSIP變體中)。“HIV包膜蛋白”還可以是天然存在的HIV包膜蛋白的衍生物，該HIV包膜蛋白的衍生物具有例如在弗林蛋白酶切割位點中的序列突變、和/或所謂的SOSIP突變。根據本發明的HIV包膜蛋白也可以具有切割位點，使得gp120和gp41胞外結構域可以非共價連接。
在本發明的較佳的實施方式中，HIV Env蛋白係gp140蛋白或gp160蛋白，並且更較佳的是gp140蛋白。在其他較佳的實施方式中，Env蛋白被截短，例如，藉由與天然Env蛋白相比在細胞質區域的第7個殘基後的殘基的缺失。
根據本發明的實施方式，“HIV包膜蛋白”可以是三聚體或單體，並且較佳的是三聚體。三聚體可以是同源三聚體(例如，包含三個一致的多肽單元的三聚體)或異源三聚體(例如，包含不完全一致的三個多肽單元的三聚體)。較佳的是，三聚體係同源三聚體。在切割的gp140或gp160的情況下，它係 gp120-gp41二聚體的多肽單元的三聚體，並且在該等二聚體中所有三種都相同的情況下，這被認為係同源三聚體。
“HIV包膜蛋白”可以是可溶性蛋白或膜結合蛋白。膜結合包膜蛋白典型包含跨膜結構域，例如在包含如圖1A所示的跨膜結構域(TM)的全長HIV包膜蛋白中。膜結合蛋白可以具有細胞質結構域，但不需要細胞質結構域被膜結合。可溶性包膜蛋白包含跨膜結構域的至少部分或完全缺失。例如，可以截短全長HIV包膜蛋白的C端末端以缺失跨膜結構域，從而產生可溶性蛋白，如圖1B所示。然而，HIV包膜蛋白仍然可以是可溶性的，相對於圖1B所示的那些，具有較短截短和可替代的截短位置。可以在不同位置進行截短，並且非限制性實例係在胺基酸664、655、683等之後，該等都導致可溶性蛋白。與天然Env蛋白相比，根據本發明的膜結合Env蛋白可以包含完整或部分C端結構域(例如，藉由部分缺失C端細胞質結構域，例如在某些實施方式中，在細胞質區域的第7個殘基之後)。
信號肽在表現時典型存在於HIV Env蛋白的N末端，但被信號肽酶切除，並且因此不存在於成熟蛋白中。信號肽可以與其他信號序列互換，並且信號肽的一些非限制性實例在此處提供於SEQ ID NO：11、18、33和34中。
根據本發明的實施方式，HIV包膜蛋白例如gp160或gp140可以衍生自來自任何HIV進化枝(或‘亞型’)的HIV包膜蛋白序列，例如進化枝A、進化枝B、進化枝C、進化枝D、進化枝E、進化枝F、進化枝G、進化枝H等或其組合(例如，‘循環重組形式’或衍生自不同亞型病毒之間的重組的CRF，例如BC、AE、AG、BE、BF、ADG等)。HIV包膜蛋白序列可以是天然存在的序列、鑲嵌序列、共有序列、合成序列或其任何衍生物或片段。“鑲嵌序列”含有衍生自一個或多個HIV進化枝的至少三個HIV包膜序列的多個表位，並且可以藉由優化T細胞表位覆蓋的演算法來設計。鑲嵌HIV包膜蛋白的序列的實例包括例如 Barouch等人，Nat Med[自然方法]2010,16：319-323；和WO 2010/059732中所述的那些，例如SEQ ID NO：8和9所示的那些。如在此所使用，“共有序列”係指基於同源蛋白的胺基酸序列比對的人工胺基酸序列，例如，如藉由同源蛋白的胺基酸序列的比對(例如，使用Clustal Omega)所確定的。它係基於來自至少1000個天然HIV分離株的Env的序列，在序列比對中每個位置處發現的最常見的胺基酸殘基的計算順序。“合成序列”係非天然存在的HIV包膜蛋白，其針對超過一種天然存在的HIV毒株誘導免疫應答或產生免疫。鑲嵌HIV包膜蛋白係合成HIV包膜蛋白的非限制性實例。在本發明的較佳的實施方式中，HIV Env蛋白係具有根據本發明的指示位置(i)-(vii)處的指示胺基酸中至少一個的共有Env蛋白或合成Env蛋白。特別較佳的是具有根據本發明的指示位置(i)-(vii)處的指示胺基酸殘基中至少一個、較佳的是至少兩個的共有Env蛋白，較佳的是具有如下所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位點突變。
在本發明的某些實施方式中，HIV包膜蛋白(無論天然存在的序列、鑲嵌序列、共有序列、合成序列等)包含額外的序列突變，例如在弗林蛋白酶切割位點中，和/或所謂的SOSIP突變。
在本發明的一些實施方式中，HIV包膜蛋白係“SOSIP突變體HIV Env蛋白”。所謂的SOSIP突變係包括‘SOS突變’(位置501和605處的Cys殘基，其導致在新產生的半胱胺酸殘基之間引入可能的二硫橋)和‘IP突變’(位置559處的Pro殘基)的三聚體穩定突變。根據本發明的實施方式，SOSIP突變體Env蛋白包含選自下組的至少一種突變，該組由以下各項組成：位置501和605處的Cys；位置559處的Pro；並且較佳的是位置501和605處的Cys和位置559處的Pro。SOSIP突變體HIV Env蛋白還可包含其他序列突變，例如在弗林蛋白酶切割位點中。此外，在某些實施方式中，可以進一步添加突變，使得Env蛋白包含位置556或位置558或位置556和558處的Pro，其在此處被發現不僅可以充當SOSIP 變體中位置559處的Pro的替代物，還可充當額外的突變，所述突變可進一步改進已經具有位置559處的Pro的SOSIP變體的三聚體形成。
在本發明的某些較佳的實施方式中，SOSIP突變體HIV Env蛋白包含位置501和605處的Cys和位置559處的Pro。
在某些實施方式中，本發明的HIV包膜蛋白還包含弗林蛋白酶切割位點中的突變。弗林蛋白酶切割序列中的突變可以是胺基酸取代、缺失、插入或一個序列被另一個替換或接頭胺基酸序列進行的替換。較佳的是，在本發明中，使弗林蛋白酶切割位點突變可用於優化切割位點，使得弗林蛋白酶切割比野生型有所改進，例如藉由用RRRRRR(SEQ ID NO：10)替換殘基508-511處的序列)[即用四個精胺酸殘基替換位置509-510處的典型胺基酸序列(例如EK)(即兩個替換和兩個添加)，而在位置508和511處，大多數HIV Env蛋白中已經存在精胺酸殘基，因此該等典型不需要被替換，但是由於文獻中的最終結果常被稱為胺基酸序列RRRRRR，我們在此保留了這一命名]。改進弗林蛋白酶切割的其他突變係已知的，並且也可以使用。可替代地，可以用接頭替換弗林蛋白酶切割位點，使得弗林蛋白酶切割不再是必要的，但是蛋白將採用天然樣構象(例如描述於(Sharma等人，2015)和(Georgiev等人，2015)中)。
在本發明的具體實施方式中，本發明的HIV包膜蛋白還包含所謂的SOSIP突變(較佳的是位置501和605處的Cys和位置559處的Pro)和弗林蛋白酶切割位點中的序列突變，較佳的是用RRRRRR(SEQ ID NO：10)替換殘基508-511處的序列。在某些較佳的實施方式中，HIV Env包含指示SOSIP和弗林蛋白酶切割位點突變，並且此外還包含位置556或位置558、最較佳的是位置556和558處的Pro殘基。
在本發明的較佳的實施方式中，HIV包膜蛋白的胺基酸序列係共有序列，如HIV包膜進化枝C共有序列或HIV包膜進化枝B共有序列。在特別較佳的實施方式中，HIV包膜蛋白的胺基酸序列係HIV包膜進化枝C共有序列。
可用於本發明的示例性HIV包膜蛋白包括HIV包膜進化枝C共有序列(SEQ ID NO：2)和HIV包膜進化枝B共有序列(SEQ ID NO：4)。該等HIV包膜進化枝C和進化枝B共有序列可以包含例如增強穩定性和/或三聚體形成的額外突變，如例如所述的所謂SOSIP突變和/或如上所述的弗林蛋白酶切割位點中的序列突變，如例如SEQ ID NO：3所示的ConC_SOSIP序列和SEQ ID NO：5所示的ConB_SOSIP序列中。
可用於本發明的較佳的HIV包膜蛋白序列的其他非限制性實例(如‘背景’或‘親本’分子，其中然後引入本發明的一個或多個突變)包括合成HIV Env蛋白，例如包含SEQ ID NO：6或在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6的胺基酸序列，兩者之一視情況具有如上所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位點突變。另一個非限制性實例係SEQ ID NO：7。另外的非限制性實例係鑲嵌HIV包膜蛋白，例如具有SEQ ID NO：8或9的胺基酸序列的那些。
在某些實施方式中，親本分子係野生型HIV Env蛋白，其中根據此處所述的方法修復了一個或較佳的是多個胺基酸。這樣的親本分子包含以至少100個、較佳的是至少500個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個、較佳的是至少20000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置的胺基酸殘基處的至少一個修復突變，其中該修復突變係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由存在於對應位置的胺基酸殘基進行的取代。較佳的是，所述取代係以在所述集合中至少15%、至少20%、至少25%的HIV Env序列的頻率由存在於對應位置的胺基酸殘基進行的。較佳的是，所述取代係在所述集合中最常見的由存在於對應位置處的胺基 酸殘基進行的。在某些較佳的實施方式中，所述親本分子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20個這樣的修復突變。較佳的是，與野生型Env蛋白相比，在親本分子中以所述集合中小於2%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置處的胺基酸殘基的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或全部被修復。在某些實施方式中，與野生型Env蛋白相比，在親本分子中以所述集合中小於7.5%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置處的胺基酸殘基的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或全部被修復。在某些實施方式中，野生型HIV Env蛋白來自進化枝A、B或C毒株，較佳的是來自進化枝C毒株。作為這種修復突變的結果，親本分子將顯示比原始野生型毒株更相似於HIV Env共有序列，因此經修復的胺基酸殘基在此處有時被稱為‘共有胺基酸’或‘共有殘基’。這種修復活性的結果係所得親本分子的關於折疊、三聚化、表現和/或穩定性的大大增強的性質，並且所得分子在此處稱為‘經修復的Env蛋白’。向這樣的親本分子中添加本發明的穩定突變(例如(i)-(vii)(表1)和/或(xvi)(表1)和/或視情況(viii)-(xv)(表2)中的一個或多個)導致三聚體百分比、三聚體產量、穩定性、廣泛中和抗體結合、折疊中的一項或多項的進一步改進，並且衍生自野生型HIV Env蛋白的所得分子此處被稱為‘經修復的和穩定的Env蛋白’熟習該項技術者將清楚，引入穩定突變實際上將得到的序列從共有序列中轉移一點，因此經修復的和穩定的HIV Env分子的大大增強的性質的淨結果係基於兩個完全不同的概念。
導致根據本發明的位置(i)-(vii)處的指示胺基酸的突變也可用於其中不存在SOSIP突變(例如，在Env共有序列中或在來自野生型HIV分離株的Env蛋白中)的HIV Env蛋白，並且可能也改進其三聚化，因為本發明的突變獨立於SOSIP突變，並且此外還顯示在幾個不同的HIV Env蛋白骨架中起作用。確實， 此處顯示根據本發明的突變可以在不存在SOS突變的情況下以及在不存在IP突變的情況下起作用，以改進HIV Env三聚化性質。
根據本發明的實施方式的重組HIV包膜蛋白包含在HIV包膜蛋白的胺基酸序列中的特定位置處具有某一個或多個胺基酸殘基的HIV包膜蛋白。具體地，鑒定了包膜蛋白中的七個位置，以及在每個鑒定位置處理想的具體胺基酸殘基。包膜蛋白序列中的鑒定位置包括(i)位置651，(ii)位置655，(iii)位置535，(iv)位置589，(v)位置573，(vi)位置204和(vii)位置647，其中位置的編號根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。根據本發明的HIV Env蛋白在指示位置(i)-(vii)中的至少一個、較佳的是在指示位置(i)-(vii)中的至少兩個、更較佳的是在指示位置(i)-(vii)中的至少三個位置中具有一個或多個特定胺基酸殘基。根據本發明的實施方式，在每個鑒定位置處理想的具體胺基酸殘基示於表1中。該等選項的較佳的位置係(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和/或(vii)。該等選項的特別較佳的位置係(i)、(ii)、(iii)、(iv)、和/或(vii)。額外的較佳的選項係(xvi)，此處稍後將會更詳細一些地提及。
1根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號
其中在一個或多個指示位置處引入一個或多個更理想的胺基酸(或指示胺基酸)取代的HIV包膜蛋白的胺基酸序列被稱為“骨架HIV包膜序列”或“親本HIV包膜序列”。例如，如果SEQ ID NO：3的ConC_SOSIP序列中的位置651突變為Phe，則ConC_SOSIP序列被認為係“骨架”或“親本”序列。可以使用根據本發明的實施方式可以引入新穎的穩定突變的任何HIV包膜蛋白作為“骨架”或“親本”序列，單獨或與其他突變組合，例如所謂的SOSIP突變和/或弗林蛋白酶切割位點中的突變。可用作骨架的HIV Env蛋白的非限制性實例包 括來自天然HIV分離株的HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白，並且在某些非限制性實例中包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的那些。
根據本發明的實施方式，HIV包膜蛋白可以在選自下組的指示位置中的至少一個處具有指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：位置651、655、535、589、573、204和647，如在一個、二個、三個、四個、五個、六個或七個位置處的指示胺基酸殘基。較佳的是，HIV包膜蛋白在指示位置中的一個、兩個或三個處被取代，並且更較佳的是，HIV包膜蛋白在指示位置中的至少兩個處被取代。甚至更較佳的是，HIV Env蛋白在指示位置中的三個、指示位置中的四個、指示位置中的五個、指示位置中的六個、或指示位置中的所有七個處被取代。較佳的是，HIV包膜蛋白在指示位置中的至少兩個處含有指示胺基酸殘基。更較佳的是，HIV包膜蛋白在指示位置中的三個處含有指示胺基酸殘基。在其他較佳的實施方式中，HIV包膜蛋白在指示位置中的四、五、六或全部七處含有指示胺基酸殘基。
在多個位置處具有指示胺基酸的HIV Env蛋白的實施方式(根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號對位置進行編號，隨後是在該位置上存在的殘基的一字母胺基酸代碼，在一個HIV Env蛋白實施方式內的位置被逗號分開[例如具有位置651處的Phe和位置655處的Ile的Env蛋白的實施方式被描述為651F，655I]，而不同的實施方式(即不同的HIV Env蛋白)被分號分開)包括以下。
在兩個位置具有指示的胺基酸的Env蛋白：651F，655I；651F，655F；651F，655M；651F，655W；651F，535N；651F，535Q；651F，589V；651F，589I；651F，589A；651F，573F；651F，573W；651F，204I；651F，647F；651F， 647I；651F，647M；651L，655I；651L，655F；651L，655M；651L，655W；651L，535N；651L，535Q；651L，589V；651L，589I；651L，589A；651L，573F；651L，573W；651L，204I；651L，647F；651L，647I；651L，647M；651M，655I；651M，655F；651M，655A；651M，655L；651M，655W；651M，535N；651M，535Q；651M，589V；651M，589I；651M，589A；651M，573F；651M，573W；651M，204I；651M，647F；651M，647I；651M，647M；651W，655I；651W，655F；651W，655M；651W，655W；651W，535N；651W，535Q；651W，589V；651W，589I；651W，589A；651W，573F；651W，573W；651W，204I；651W，647F；651W，647I；651W，647M；655I，535N；655I，535Q；655I，589V；655I，589I；655I，589A；655I，573F；655I，573W；655I，204I；655I，647F；655I，647I；655I，647M；655F，535N；655F，535Q；655F，589V；655F，589I；655F，589A；655F，573F；655F，573W；655F，204I；655F，647F；655F，647I；655F，647M；655M，535N；655M，535Q；655M，589V；655M，589I；655M，589A；655M，573F；655M，573W；655M，204I；655M，647F；655M，647I；655M，647M；655W，535N；655W，535Q；655W，589V；655W，589I；655W，589A；655W，573F；655W，573W；655W，204I；655W，647F；655W，647I；655W，647M；535N，589V；535N，589I；535N，589A；535N，573F；535N，573W；535N，204I；535N，647F；535N，647I；535N，647M；535Q，589V；535Q，589I；535Q，589A；535Q，573F；535Q，573W；535Q，204I；535Q，647F；535Q，647I；535Q，647M；589V，573F；589V，573W；589V，204I；589V，647F；589V，647I；589V，647M；589I，573F；589I，573W；589I，204I；589I，647F；589I，647I；589I，647M；589A，573F；589A，573W；589A，204I；589A，647F；589A，647I；589A，647M；573F，204I；573F，647F；573F，647I；573F，647M；573W，204I；573W，647F；573W，647I； 573W，647M；204I，647F；204I，647I；201I，647M。根據本發明，那些實施方式中的每個可以存在於任何HIV Env序列中，例如野生型分離株或SOSIP突變體HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白或合成HIV Env蛋白。那些實施方式中的每個可以與來自根據本發明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第三位置處的根據本發明的較佳的胺基酸之一組合。在指示位置(i)-(vii)的三個位置處具有較佳的胺基酸殘基的該等實施方式可以與在來自根據本發明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第四位置處的較佳的胺基酸之一組合。在指示位置(i)-(vii)的四個位置處具有較佳的胺基酸殘基的該等實施方式可以與在來自根據本發明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第五位置處的較佳的胺基酸之一組合。在指示位置(i)-(vii)的五個位置處具有較佳的胺基酸殘基的該等實施方式可以與在來自根據本發明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第六位置處的較佳的胺基酸之一組合。在指示位置(i)-(vii)的六個位置處具有較佳的胺基酸殘基的該等實施方式可以與在來自根據本發明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第七位置處的較佳的胺基酸之一組合，使得Env蛋白在根據本發明的所有七個位置(i)-(vii)都具有根據本發明的較佳的胺基酸。在本發明的位置(v)-(vii)中的位置中的三、四、五、六或七個處具有本發明的較佳的胺基酸的該等另外的實施方式中的任一個可以存在於任何HIV Env蛋白中，如來自野生型分離株、SOSIP變體、共有HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白等。
根據本發明在兩個位置具有指示的胺基酸的較佳的Env蛋白係：651F，655I；651F，535N；651F，589V；651F，589I；651F，573F；651F，204I；651F，647F；655I，535N；655I，589V；655I，589I；655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，204I；535N，647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；573F，204I；573F，647F；204I，647F。根據本發明在至少兩個位置具 有較佳的胺基酸的特別較佳的Env蛋白包括：651F，655I；655I，535N；655I，589V；535N，589V；535N，647F。
在三個位置具有較佳的胺基酸殘基的一些較佳的HIV Env蛋白係：651F，655I，535N；651F，589V，535N；651F，589I，535N；651F，573F，535N；651F，204I，535N；651F，647F，535N；655I，589V，535N；6551，589I，535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，535N；589V，573F，535N；589V，204I，535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，535N；589I，647F，535N；573F，204I，535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，589V；651F，573F，589V；651F，204I，589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，589V；655I，647F，589V；573F，204I，589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，589I；651F，573F，589I；651F，204I，589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，589I；655I，647F，589I；573F，204I，589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，573F；651F，204I，573F；651F，647F，573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，573F；651F，655I，204I；651F，647F，204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，647F；655I，651F，535N；655I，589V，573F；655I，589V，204I。根據本發明在至少三個位置具有較佳的胺基酸的特別較佳的Env蛋白包括：651F，655I，535N；655I，589V，535N；655I，573F，589V；655I，204I，589V；651F，655I，647F。
在四個位置具有較佳的胺基酸殘基的一些較佳的HIV Env蛋白係651F，655I，535N，589V；651F，655I，535N，573F；651F，655I，589V，573F；651F，535N，589V，573F；655I，535N，589V，573F；651F，655I，535N，204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；655I，535N，589V，204I；651F，655I，573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F， 204I；651F，589V，573F，204I；655I，589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，647F；651F，655I，589V，647F；651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，655I，573F，647F；651F，535N，573F，647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；655I，589V，573F，647F；535N，589V，573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，647F；655I，535N，204I，647F；651F，589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，204I，647F；651F，573F，204I，647F；655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及589V，573F，204I，647F。
在至少四個位置具有較佳的胺基酸殘基的較佳的HIV Env蛋白的一些實例包括：651F，655I，647F，I535N；651F，655I，573F，589V。在至少四個位置處包含指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白的較佳的實例包括535N，589V，651F，655I。這種HIV Env蛋白的非限制性實例在SEQ ID NO：20、22、24、26,27、28、29、30、31和32中提供。較佳的是，這種HIV Env蛋白係進化枝C HIV Env蛋白或進化枝A HIV Env蛋白，最較佳的是進化枝C HIV Env蛋白。在某些實施方式中，所述HIV Env蛋白還包含588E，即它包含至少535N，588E，589V，651F，655I。該等HIV Env蛋白的非限制性實例在SEQ ID NO：20、24、26、27、28、29、30、31和32中提供。在某些實施方式中，所述HIV Env還包含556P，即它包含至少535N，556P，589V，651F，655I或至少535N，556P，588E，589V，651F，655I。該等HIV Env蛋白的非限制性實例在SEQ ID NO：22、24、26、27、29、30、31和32中提供。
在一個實施方式中，根據本發明的重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少兩個處具有指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp； (ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile、或Ala；(v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile。
例如，重組HIV Env蛋白可以具有位置651處的Phe、Leu、Met或Trp之一和位置535處的Asn或Gln，視情況在額外的指示位置處的額外的指示胺基酸殘基。較佳的是，藉由胺基酸取代將(i)-(vii)中的胺基酸中的至少一個引入重組HIV Env蛋白中。例如，重組HIV Env蛋白可以由HIV Env蛋白產生，所述HIV Env蛋白不含有以上的(i)-(vii)中的胺基酸殘基或僅含有其中一個，使得至少兩個指示胺基酸殘基中的全部或一個或多個藉由胺基酸取代被引入重組HIV Env蛋白中。
在某些實施方式中，本發明的重組HIV Env蛋白還包含(viii)位置588處的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，其中Gln或Glu係較佳的。
鑒於本揭露，引入上述取代的HIV Env蛋白的胺基酸序列可以是本領域已知的任何HIV Env蛋白，如例如來自HIV進化枝A、進化枝B、進化枝C等的天然存在的序列；鑲嵌序列；共有序列，例如進化枝B或進化枝C共有序列；合成序列；或其衍生物或片段。在本發明的某些實施方式中，HIV Env蛋白的胺基酸序列包含額外的突變，如例如所謂的SOSIP突變和/或弗林蛋白酶切割位點中的突變。
在一個具體實施方式中，HIV Env骨架蛋白係包含選自下組的至少一種突變的SOSIP突變體HIV Env蛋白，該組由以下各項組成：位置501和605處的Cys；位置559處的Pro。在較佳的實施方式中，SOSIP突變體HIV Env蛋白包含位 置501和605處的Cys和位置559處的Pro。根據此實施方式，重組HIV Env蛋白包含該SOSIP突變體HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile、或Ala；(v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile。
SOSIP突變體HIV Env蛋白還可包含弗林蛋白酶切割位點中的突變，如由SEQ ID NO：10進行的位置608-511處的替換。
在另一個實施方式中，根據本發明的重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp；(iii)位置535處的Asn或Gln；(iv)位置589處的Val、Ile、或Ala；(v)位置573處的Phe或Trp；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，其中該HIV Env蛋白選自由以下各項組成之群組： (1)HIV Env共有序列，如進化枝C或進化枝B共有序列，例如包含SEQ ID NO：2、3、4或5的胺基酸序列；(2)一種合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(b)在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6；(c)SEQ ID NO：7；(d)SEQ ID NO：8或9，視情況具有如上所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位點突變的(a)、(b)或(d)。
較佳的是，該重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少兩個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：以上的(i)-(vii)，如兩個位置或三個位置。然而，重組HIV Env蛋白可以包含在指示位置中的一個或多個處(如指示位置中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個處)由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代。
在一個具體實施方式中，HIV Env骨架蛋白係包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的HIV Env共有進化枝C。較佳的是，SEQ ID NO：2的HIV共有進化枝C序列還包含所謂的SOSIP突變，即位置501和605處的Cys和位置559處的Pro，並且更較佳的是還包含所謂的SOSIP突變和弗林蛋白酶切割位點中的突變，如例如在位置508-511處由SEQ ID NO：10進行的替換。在特別較佳的實施方式中，HIV Env骨架蛋白包含SEQ ID NO：3中所示的序列，或與其至少95%一致的序列，其中較佳的是如由SEQ ID NO：10替換的位置501、559、605和508-511處的胺基酸與SEQ ID NO：3相比未突變。
在另一個具體實施方式中，HIV Env骨架蛋白係包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的HIV Env共有進化枝B。較佳的是，SEQ ID NO：4的HIV共有進化枝B序列還包含所謂的SOSIP突變，即位置501和605處的Cys和位置559處的Pro，並且更較佳的是還 包含所謂的SOSIP突變和弗林蛋白酶切割位點中的突變，如例如在位置508-511處由SEQ ID NO：10進行的替換。在特別較佳的實施方式中，HIV Env骨架蛋白包含SEQ ID NO：5中所示的序列，或與其至少95%一致的序列，其中較佳的是如由SEQ ID NO：10替換的位置501、559、605和508-511處的胺基酸與SEQ ID NO：5相比未突變。
在又另一個具體實施方式中，HIV Env骨架蛋白係一合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(b)在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6；(c)SEQ ID NO：7；或(d)SEQ ID NO：8或9，視情況具有如上所述的另外的SOSIP(501C、605C、559P)和/或弗林蛋白酶切割位點突變(508-511RRRRRR)的(a)(b)或(d)。
在又其他具體實施方式中，HIV Env骨架蛋白係來自野生型進化枝A或進化枝C HIV病毒的HIV Env蛋白，視情況包含根據此處所述的方法來修復序列的突變。
HIV Env蛋白中可以同時取代的兩個位置的示例性組合包括殘基535，589；535，647；以及589，655；如例如在雙突變體I535N，D589V；I535N，E647F；和D589V，K655I中。其他雙突變體包括K655I，I535N；N651F，K655I；和K655I，I573F。HIV Env蛋白中可以同時取代的三個位置的示例性組合包括535，589，655，如例如在三突變體I535N，D589V，K655I中。其他三突變體包括K655I，D589V，I573F；和K655I，N651F，I535N。
在本發明的某些實施方式中，根據本發明的重組HIV Env蛋白還可以包含在選自下組的一個或多個額外的指示位置處的指示胺基酸殘基(例如藉由取代)，該組由以下各項組成：位置(viii)588，(ix)64或66，(x)316，(xi)201/433，(xii)556或558或556和558，(xiii)548-568，(xiv)568、569和636或(xv)302、519或520，如下表2所示。本發明人發現該等胺基酸取代(例如(viii))中某些與上 述根據本發明的突變(組合)(i)-(vii)非常好地組合。該等胺基酸取代中的其他以前在文獻中報導過。例如，De Taeye等人(Cell[細胞](2015)163(7),1702-15)報導了具有E64K和T316W雙突變的HIV包膜蛋白和具有66R突變的HIV Env蛋白；並且Kwon等人(Nat.Struct.Mol.Biol.[自然結構與分子生物學](2015)22(7)522-31)報導了具有I204C、A433C二硫化物取代的HIV包膜蛋白；並且Guenaga等人(Immunity[免疫力](2017)46,792-803)報導了具有L568G、T569G或N636G以及N302Y、F519R、L520R三重取代的HIV包膜蛋白。然而，就本發明人所知，該等先前描述的突變沒有結合此處所述的任何新穎的取代(例如，表1中所列的替換)來描述。該等胺基酸突變與本發明的胺基酸取代組合可以進一步增加三聚體產量和/或三聚體形成百分比。除了在如表1中所述的指示位置中的一個或多個處用指示胺基酸殘基進行的取代外，還可將那些胺基酸取代引入此處所述的任何重組HIV Env蛋白中。
1根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號
在本發明的指示位置[(i)-(vii)，參見例如表1]處鑒定的取代不以天然序列存在或很少以天然序列存在，在以前報導的HIV Env蛋白序列中未組合發現，並且以前沒有提出導致改進HIV Env蛋白的三聚化、改進三聚體產量和/或增加三聚體穩定性。表2中的突變(ix)-(xi)(以前由其他人報導)都在三聚體特異性抗體PGT145結合的gp120區域中。該等突變使三聚體在頂點(在分子頂部)保持封閉。取代(xii)和(xiii)都在gp41的HR1中。除了位置204外，表1中本發明的突變都在 gp41區域(分子的底部)中，但在HR1區域外。顯然，以前描述的突變沒有提供針對引入本發明的突變的任何建議，更不必說如藉由PGT145結合測量的其對具有封閉頂點的三聚體形成的驚人效果。除了表2中的點突變(viii)-(xii)外，還可以由以下替換Env蛋白的HR1環(野生型序列中的胺基酸殘基548-568，根據HXB2分離株的gp160的編號)：具有7-10個胺基酸的較短且少柔性的環，較佳的是8個胺基酸的環，例如具有選自(SEQ ID NO：12-17)中任一個的序列，參見，例如Kong等人(Nat Commun.[自然通訊]2016年6月28日；7：12040.doi：10.1038/ncomms12040)描述了這樣的較短的環替換HR1環。在根據本發明的指示位置(i)-(vii)中的至少一個且較佳的是至少兩個處另外具有指示胺基酸殘基的這樣的Env變體也是本發明的實施方式。在本發明的某些實施方式中，可將(viii)-(xiii)中列出的突變添加到本發明的HIV Env蛋白中，即在(i)-(vii)位置處具有一個或多個指示胺基酸。另外，可以進行組(viii)-(xiii)內的組合，非限制性實例係在(viii)和(xii)處的突變(除了(i)-(vii)的至少一個突變外)的組合(例如I535N、A556P、K588E)。在具有SOSIP突變和位置(i)-(vii)中至少一個和位置(viii)-(xiii)中至少一個處的組合突變的HIV Env背景下製備的雙突變體的一些非限制性實例包括：535，588；588，589；655，588；558，535；以及655，556；如例如I535N，K588E；588Q，D589V；K655I，K588E；A558P，I535N；以及K655I，L556P。這樣的三突變體的一些非限制性實例包括558，535，588；558，535，589；558，535，655；以及558，535，651，如例如A558P，I535N，K588E；A558P，I535，D589V；A558P，I535N，K655I；以及A558P，I535N，N651F。
根據本發明的組合的另外的非限制性實例包括655I，573F，589V，588E；651F，655I，573F，589V，588E；651F，655I，573F，589V，588E，535N；651F，655I，573F，589V，588E，535N，204I；651F，655I，556P；651F，535N，556P； 651F，589V，556P；651F，589I，556P；651F，573F，556P；651F，204I，556P；651F，647F，556P；655I，535N，556P；655I，589V，556P；655I，589I，556P；655I，573F，556P；655I，204I，556P；655I，647F，556P；535N，589V，556P；535N，589I，556P；535N，573F，556P；535N，204I，556P；535N，647F，556P；589V，573F，556P；589V，204I，556P；589V，647F，556P；589I，573F，556P；589I，204I，556P；589I，647F，556P；573F，204I，556P；573F，647F，556P；651F，655I，558P；651F，535N，558P；651F，589V，558P；651F，589I，558P；651F，573F，558P；651F，204I，558P；651F，647F，558P；655I，535N，558P；655I，589V，558P；655I，589I，558P；655I，573F，558P；655I，204I，558P；655I，647F，558P；535N，589V，558P；535N，589I，558P；535N，573F，558P；535N，204I，558P；535N，647F，558P；589V，573F，558P；589V，204I，558P；589V，647F，558P；589I，573F，558P；589I，204I，558P；589I，647F，558P；573F，204I，558P；573F，647F，558P；655I，589V，535N，556P；651F，655I，535N，556P；556P，651F；556P，651F，655I，535N；655I，589V，573F，651F，588E，556P；556P，651F，655I，535N，573F；556P，651F，655I，535N，573F，589V；556P，651F，655I，535N，573F，589V，204I；556P，651F，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，655I，535N，573F，589V，204I，588Q，647F；556P，651F，535N，573F；556P，651F，535N，573F，589V；556P，651F，535N，573F，589V，204I；556P，651F，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，535N，573F，589V，204I，588Q，647F；556P，655I，535N，573F；556P，655I，535N，573F，589V；556P，655I，535N，573F，589V，204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q，647F。再次，那些實施方式中任一個可以在任何HIV Env蛋白中，例如，野生型分離株、共有Env、合成Env蛋白、SOSIP突變體Env蛋白、 含有根據此處所述的概念的修復突變的野生型分離株等。根據本發明的一些較佳的組合包括655I，589V，573F，651F，588E，535N，204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；204I，535N，556P，588E，589V，651F，655I；535N，556P，589V，651F，655I；以及535N，556P，588E，589V，651F，655I。
在某些較佳的實施方式中，HIV Env蛋白包含與SEQ ID NO：20、22、24、26、27、28、29、30、31和32中任一個至少95%一致，較佳的是至少96%、97%、98%、99%一致，較佳的是100%一致的序列。為了測定%一致性，較佳的是不考慮表1和2的位置(i)-(xv)，並且較佳的是也不考慮位置501、559和605。較佳的是，該等位置處的胺基酸殘基分別是SEQ ID NO：20、22、24、26、27、28、29、30、31或32的序列中的胺基酸殘基。
在某些實施方式中，本發明的HIV Env蛋白還包含：(xvi)位置658處的選自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的胺基酸殘基。較佳的是，位置658處的胺基酸係Val或Ile，最較佳的是Val。發現了Env蛋白的三聚體百分比和三聚體產量的這種強烈增加，單獨地或與選自在此所述的表1的(i)-(vii)和/或表2的(viii)-(xv)的突變組合。
根據本發明的實施方式，與在如表1所示的位置651、655、535、589、573、204和647中一個或多個處不具有指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白相比，重組HIV Env蛋白具有(a)改進的三聚體形成百分比和(b)改進的三聚體產量中的至少一項。
如在此所使用，“改進的三聚體形成百分比”意指當HIV包膜蛋白的骨架序列含有本發明的胺基酸取代中的一個或多個時，與當HIV包膜序列的骨架序列不含有這種胺基酸取代時形成的三聚體的百分比相比，形成更大百分比的三聚體。如在此所使用，“改進的三聚體產量”意指當HIV包膜蛋白的骨架序列含有本發明的胺基酸取代中的一個或多個時，與當HIV包膜序列的骨架序列不含 有這種胺基酸取代時獲得的包膜蛋白的三聚體形式的總量相比，獲得包膜蛋白的三聚體形式的更大總量。
可以藉由使用與HIV Env蛋白的三聚體形式特異結合的抗體的抗體結合測定來測量三聚體形成。可用於檢測三聚體形式的三聚體特異性抗體的實例包括但不限於單株抗體(mAb)PGT145、PGDM1400、PG16和PGT151。較佳的是，三聚體特異性抗體係mAb PGT145。鑒於本揭露，可以使用本領域中已知的任何抗體結合測定來測量本發明的重組HIV Env蛋白的三聚體形成百分比，例如ELISA、AlphaLISA等。
在具體實施方式中，藉由AlphaLISA來測量三聚體形成。AlphaLISA係一基於珠的鄰近測定，其中藉由供體珠的高能輻射產生的單線態氧分子轉移到相對於供體珠粒大約200nm的距離內的受體珠粒。將單線態氧分子轉移到受體珠粒引發了遞增系列的化學反應，產生化學發光信號，該化學發光信號則可以檢測到(Eglen等人Curr.Chem.Genomics[當前化學基因組學]，2008,25(1)：2-10)。例如，用Flag-His標籤標記的重組HIV包膜蛋白可以用三聚體特異性mAb、同與三聚體特異性mAb結合的抗體綴合的供體珠粒、鎳綴合的供體珠粒、與抗His抗體綴合的受體珠粒、以及與抗Flag抗體綴合的受體珠粒進行孵育。可以藉由測量從同與三聚體特異性mAb結合的抗體綴合的一對供體珠粒和與抗Flag抗體綴合的受體珠粒生成的化學發光信號來測定形成的三聚體的量。可以藉由測量由一對鎳綴合的供體珠粒和抗Flag綴合的受體珠粒生成的化學發光信號來測定表現的HIV包膜蛋白的總量。例如，可以如實例3中詳細描述的藉由AlphaLISA測定來測量三聚體的量和表現的總包膜蛋白。可以藉由將形成的三聚體的量除以表現的包膜蛋白的總量來計算三聚體形成百分比。
也可以使用能夠將三聚體形式與其他形式的HIV包膜蛋白(例如單體形式)分離的層析技術來測定形成的三聚體的量和表現的包膜蛋白的總量。可 以使用的這種技術的實例包括但不限於具有多角度光散射的尺寸排阻層析(SEC-MALS)。根據某些實施方式，使用SEC-MALS測定三聚體形成百分比。根據某些實施方式，使用SEC-MALS測定三聚體產量。
核酸、載體和細胞
在另一個一般方面，本發明提供了編碼根據本發明的重組HIV Env蛋白的核酸分子和包含該核酸分子的載體。本發明的該等核酸分子可以處於RNA形式或處於藉由選殖獲得或合成產生的DNA形式。該DNA可以是雙股或單股的。該DNA可以例如包含cDNA、基因組DNA或其組合。該核酸分子和載體可用於產生重組蛋白、在宿主細胞中表現該蛋白或產生病毒粒子。
根據本發明的實施方式，編碼該重組HIV包膜蛋白的核酸可操作地連接至啟動子，這意味著該核酸在啟動子的控制下。該啟動子可以是同源啟動子(即，來源於相同的作為載體的遺傳來源)或異源啟動子(即，來源於不同載體或遺傳來源)。適合的啟動子的實例包括人類巨細胞病毒立即早期(hCMV IE，或簡稱“CMV”)啟動子和勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子。較佳的是，該啟動子位於表現盒內的核酸的上游。
根據本發明的實施方式，載體可以是表現載體。表現載體包括但不限於用於重組蛋白表現的載體和用於將核酸遞送至受試者中用於在該受試者的組織中表現的載體，例如病毒載體。適合用於本發明的病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、修飾的安卡拉牛痘(MVA)載體、腸系病毒載體、委內瑞拉馬腦炎病毒載體、塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒載體、菸草鑲崁病毒載體、慢病毒載體等。該載體還可以是非病毒載體。非病毒載體的實例包括但不限於質粒、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體等。
在本發明的某些實施方式中，該載體係腺病毒載體，例如重組腺病毒載體。重組腺病毒載體可以例如衍生自人類腺病毒(HAdV或AdHu)、或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh、或SAdV)或恒河猴腺病毒(rhAd)。較佳的是，腺病毒載體係重組人類腺病毒載體，例如重組人類腺病毒血清型26，或重組人類腺病毒血清型5、4、35、7、48等中的任一種。在其他實施方式中，腺病毒載體係rhAd載體，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。
重組腺病毒載體的製備在本領域中是熟知的。例如，重組腺病毒26載體的製備描述於例如，WO 2007/104792和Abbink等人，(2007)Virol.[病毒學]81(9)：4654-63。腺病毒26的示例性基因組序列發現於GenBank登錄號EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO：1中。US 2015/0291935中提供了rhAd51、rhAd52和rhAd53的示例性基因組序列。
根據本發明的實施方式，此處所述的任何重組HIV Env蛋白可由此處所述的任何載體表現和/或編碼。鑒於遺傳密碼的簡並性，技術人員將充分意識到可以根據本領域中完全常規的方法來設計編碼相同蛋白質的若干種核酸序列。編碼本發明的重組HIV Env蛋白的核酸可以視情況是密碼子優化的，以確保在宿主細胞(例如，細菌或哺乳動物細胞)中的適當表現。密碼子優化係廣泛應用於本領域中的技術。
本發明還提供了細胞，較佳的是包含此處所述的任何核酸分子和載體的分離的細胞。例如，該等細胞可以用於生產重組蛋白，或用於生產病毒粒子。
因此，本發明的實施方式還涉及製造重組HIV Env蛋白之方法。該方法包括用表現載體轉染宿主細胞，所述表現載體包含可操作地連接至啟動子的編碼根據本發明的重組HIV Env蛋白的核酸；在適合於表現該重組HIV Env蛋白的條件下培養該轉染的細胞，並視情況純化或分離在該細胞中表現的重組HIV Env蛋白。可以藉由本領域中已知的任何方法(包括親和層析、尺寸排阻層析等)從該細胞中分離或收集該重組HIV Env蛋白。鑒於本揭露，用於重組蛋白表現的技術將是熟習該項技術者所熟知的。也可以研究表現的重組HIV Env蛋白而不需要純化或分離該表現的蛋白，例如藉由分析用編碼該重組HIV Env蛋白的表現載體轉染的細胞的上清液，並使之在適合於表現該HIV Env蛋白的條件下生長。
在較佳的實施方式中，將表現的重組HIV Env蛋白在允許締合該蛋白以形成穩定的三聚體複合物的條件下純化。例如，可以在33℃-39℃(例如37℃)和2%-12%二氧化碳(例如8%二氧化碳)下培養用與啟動子(例如，CMV啟動子)可操作地連接的編碼該重組HIV Env蛋白的表現載體轉染的哺乳動物細胞。表現也可以在替代表現系統如昆蟲細胞或酵母細胞(都是本領域中常規的)中進行。然後可以例如藉由凝集素親和層析從細胞培養物中分離表現的HIV Env蛋白，其結合糖蛋白。結合到柱上的HIV Env蛋白可以用哌喃甘露糖苷(mannopyranoside)洗提。可以按需要使從柱上洗提的HIV Env蛋白經受進一步的純化步驟，例如尺寸排阻層析，以去除任何殘留的污染物，例如細胞污染物，還有Env聚集物，gp140單體和gp120單體。也可以使用可替代的純化方法，非限制性實例包括抗體親和層析、用非bNAb進行的陰性選擇、抗標籤純化或其他層析如離子交換層析等以及本領域已知的其他方法來分離表現的HIV Env蛋白。
鑒於本揭露，可以藉由本領域已知的任何方法製備編碼本發明的重組HIV Env蛋白的核酸分子和表現載體。例如，可以使用熟習該項技術者熟知的基因工程技術和分子生物學技術，例如定點誘變、聚合酶鏈式反應(PCR)等，藉由將指示位置處的胺基酸取代中的至少一個引入骨架HIV包膜序列來製備編碼該重組HIV Env蛋白的核酸。然後可以使用標準分子生物學技術將該核酸分子引入或“選殖”到表現載體中。然後可以在宿主細胞中從表現載體表現該重組 HIV包膜蛋白，並且鑒於本揭露，藉由本領域已知的任何方法從細胞培養物中純化表現的蛋白。
三聚體複合物
在另一個一般方面，本發明涉及三聚體複合物，其包含根據本發明的重組HIV Env蛋白中的三種的非共價低聚物。該三聚體複合物可以包含此處所述的任何重組HIV Env蛋白。較佳的是，該三聚體複合物包含根據本發明的重組HIV Env蛋白的三種一致的單體(或一致的異源二聚體，如果gp140被切割的話)。該三聚體複合物可以與其他形式(例如單體形式)的HIV包膜蛋白分離，或該三聚體複合物可與其他形式(例如單體形式)的HIV包膜蛋白一起存在。
組成物和方法
在另一個一般方面，本發明涉及包含重組HIV Env蛋白、三聚體複合物、分離的核酸、載體或宿主細胞以及藥學上可接受的載劑的組成物。該組成物可以包含此處所述的任何重組HIV Env蛋白、三聚體複合物、分離的核酸分子、載體或宿主細胞。
載劑可以包括一種或多種藥學上可接受的賦形劑，如黏合劑、崩散劑、蓬鬆劑、助懸劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、防腐劑、染料、增溶劑以及塗層。該載劑或其他物質的確切性質可以取決於給藥途徑，例如肌內、皮內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如，腸)、鼻內或腹膜內途徑。對於液體可注射製劑(例如，懸浮液和溶液)，適合的載劑和添加劑包括水、乙二醇、油、醇、防腐劑、著色劑等。對於固體口服製劑(例如散劑、膠囊、囊片、軟膠囊和片劑)，適合的載劑和添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、黏合劑、崩散劑等。對於鼻噴霧劑/吸入劑混合物，該水性溶液/懸浮液可以包括作為適合的載劑和添加劑的水、乙二醇、油、軟化劑、穩定劑、潤濕劑、防腐劑、芳香劑、調味劑等。
本發明的組成物可以配製成適合於給予受試者以便於給予並改進功效的任何物質，包括但不限於口服(腸內)給予和腸胃外注射。腸胃外注射包括靜脈注射或輸注、皮下注射、皮內注射和肌內注射。還可以配製本發明的組成物用於其他給藥途徑，包括經黏膜、眼、直腸、長效植入、舌下給藥、舌下、從口腔黏膜繞過門脈循環、吸入或鼻內。
本發明的實施方式還涉及製備該組成物之方法。根據本發明的實施方式，生產組成物的方法包括將本發明的重組HIV Env蛋白、三聚體複合物、分離的核酸、載體或宿主細胞與一種或多種藥學上可接受的載劑混合。熟習該項技術者將熟悉用於製備這樣的組成物的常規技術。
HIV抗原(例如，衍生自HIV gag、pol和/或env基因產物的蛋白或其片段)和表現該HIV抗原的載體(例如病毒載體)已經用於免疫原性組成物和疫苗中，用於針對HIV感染對受試者進行疫苗接種或在受試者中產生針對HIV感染的免疫反應。如在此所使用，“受試者”係指將向其給予或已經給予根據本發明的實施方式的免疫原性組成物的任何動物，較佳的是哺乳動物，最較佳的是人類。如在此所使用的術語“哺乳動物”涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人類等，較佳的是人類。本發明的重組HIV Env蛋白還可以用作抗原，以在有需要的受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答。免疫應答可以針對一個或多個HIV進化枝，例如進化枝A、進化枝B、進化枝C等。該組成物可以包含表現該重組HIV Env蛋白的載體，或該組成物可以包含根據本發明的實施方式的分離的重組HIV Env蛋白。
例如，可以將包含重組HIV蛋白或其三聚體複合物的組成物給予有需要的受試者以在受試者中誘導針對HIV感染的免疫應答。也可以將包含編碼本發明的重組HIV Env蛋白的載體(如腺病毒載體)的組成物給予有需要的受試者以在受試者中誘導針對HIV感染的免疫應答，其中該載體表現該重組HIV Env蛋 白。此處所述的方法還包括將本發明的組成物與較佳的是由一種或多種載體(例如腺病毒載體或MVA載體)表現的一種或多種額外的HIV抗原(例如，衍生自HIV gag、pol和/或env基因產物的蛋白或其片段)組合給予，包括引發和加強免疫應答的方法。
在某些實施方式中，該HIV Env蛋白可以展示在粒子如脂質體、病毒樣粒子(VLP)、奈米粒子、病毒體或外來體上，視情況與內源和/或外源性佐劑組合。當與其自身的可溶性或單體Env蛋白相比時，這樣的粒子典型在體內展示增強的抗原呈遞功效。
可以製備展示HIV Env蛋白的VLP的實例，例如藉由與自組裝病毒蛋白如HIV Gag核或其他逆轉錄病毒Gag蛋白共表現該HIV Env蛋白。VLP類似病毒，但不具有感染性，因為它們不含病毒遺傳物質。病毒結構蛋白(例如包膜或衣殼)的表現可導致VLP的自組裝。VLP係熟習該項技術者所熟知的，並且它們在疫苗中的用途例如描述於(Kushnir等人，2012)中。
在某些較佳的實施方式中，該粒子係脂質體。脂質體係具有至少一個脂質雙層的球形囊泡。HIV Env三聚體蛋白可以例如藉由靜電相互作用(例如藉由向HIV Env三聚體的C端添加His-標籤)和併入到脂質體中的衍生化脂質的頭部基團中的二價螯合原子(如Ni2+或Co2+)而非共價偶聯到該等脂質體上。在某些非限制性和示例性的實施方式中，該脂質體包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、膽固醇和1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-[(N-(5-胺基-1-羧戊基)亞胺基二乙酸)琥珀醯基]的鎳或鈷鹽(DGS-NTA(Ni2+)或DGS-NTA(Co2+))，莫耳比為60：36：4。在較佳的實施方式中，HIV Env三聚體蛋白共價偶聯到脂質體表面，例如藉由整合在脂質體表面的馬來醯亞胺官能團。在其某些非限制性示例性實施方式中，該脂質體包含DSPC、膽固醇和1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對馬來醯亞胺基甲基)環己烷-羧醯胺]脂質，莫耳比為54：30：16。HIV Env 蛋白可以與其偶聯，例如藉由HIV Env蛋白中添加的C端半胱胺酸。共價偶聯的變體更穩定，引起高抗原特異性IgG滴度，並且掩蔽了在抗原性上較不相關的‘Env三聚體’底部的表位。用於製備與脂質體偶聯的HIV Env三聚體和表徵它們的方法係已知的，並且已經在(Bale等人，2017)中描述，該文獻藉由引用結合在此。本發明還提供了融合到和/或展示在脂質體上的本發明的HIV Env蛋白。
在某些實施方式中，本發明的HIV Env蛋白與自組裝粒子融合或展示在奈米粒子上。抗原奈米粒子係呈遞多個拷貝的抗原(例如本發明的HIV Env蛋白)的多肽的組裝，其導致多結合位點(親合力)並且可以提供改進的抗原穩定性和免疫原性。製備自組裝蛋白奈米粒子和其用於疫苗中的用途係熟習該項技術者熟知的，參見例如(Zhao等人，2014)，(López-Sagaseta等人，2016)。作為非限制性實例，自組裝奈米粒子可以基於鐵蛋白、細菌鐵蛋白或DPS。在表面上展示蛋白的DPS奈米粒子例如描述於WO 2011/082087中。這種粒子上的三聚體HIV-1抗原的說明已經例如在(He等人，2016)中描述過。其他自組裝蛋白奈米粒子及其製備例如在WO 2014/124301和US 2016/0122392中揭露，它們藉由引用結合在此。本發明還提供了融合到和/或展示在自組裝奈米粒子上的本發明的HIV Env蛋白。本發明還提供了包含根據本發明的VLP、脂質體或自組裝奈米粒子的組成物。
在某些實施方式中，佐劑包括在本發明的組成物中或與本發明的組成物共同給予。佐劑的使用係視情況的，並且當組成物用於疫苗接種的目的時，可進一步增強免疫應答。適合於共同給予或包含在根據本發明的組成物中的佐劑較佳的是應該係在人體中潛在安全、良好耐受和有效的佐劑。這樣的佐劑係熟習該項技術者熟知的，並且非限制性實例包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TER醯胺、PSC97B、Adjumer、 PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、鋁鹽如磷酸鋁(例如AdjuPhos)或氫氧化鋁以及MF59。
本發明的其他方面涉及包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4(分別代表HIV包膜共有進化枝C和共有進化枝B序列)的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的重組HIV包膜蛋白。該等共有序列在任何天然存在的序列中都沒有發現，並且因此被認為係新穎的HIV包膜蛋白。包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列的重組HIV包膜蛋白可以視情況另外包含所謂的SOSIP突變和/或弗林蛋白酶切割位點中的突變，如例如在SEQ ID NO：3所示的那些序列或還包含位置558和/或位置556處的Pro的SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：5或還包含位置558和/或位置556處的Pro的SEQ ID NO：5中。當確定該等序列的%一致性時，較佳的是不考慮突變的弗林蛋白酶切割位點處和位置501、605、559、556和558處的胺基酸。驚人地發現，該等蛋白以高水平表現並且具有高水平的穩定性和三聚體形成。在某些實施方式中，該等HIV Env蛋白可以用作骨架蛋白，其中可以製備上述突變體以獲得本發明的分子。本發明也涵蓋了編碼該等序列的分離的核酸分子，包含與啟動子可操作地連接的該等序列的載體，以及包含該蛋白、分離的核酸分子或載體的組成物。
【實施方式】
實施方式1係重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少兩個處具有指示胺基酸殘基的HIV Env蛋白的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp，較佳的是Phe；(i)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp，較佳的是Ile； (iii)位置535處的Asn或Gln，較佳的是Asn；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala，較佳的是Val或Ile；(v)位置573處的Phe或Trp，較佳的是Phe；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，較佳的是Phe,其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
實施方式2係重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp，較佳的是Phe；(ii)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp，較佳的是Ile；(iii)位置535處的Asn或Gln，較佳的是Asn；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala，較佳的是Val或Ile；(v)位置573處的Phe或Trp，較佳的是Phe；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，較佳的是Phe,其中該HIV Env蛋白選自由以下各項組成之群組：(1)具有共有序列的HIV Env蛋白，例如來自進化枝C或進化枝B，例如包含(SEQ ID NO：2、3、4或5)的胺基酸序列；或(2)合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(b)在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6；(c)SEQ ID NO：7；或(d)SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)，其中(a)、(b)或(d)視情況可以具有另外的SOSIP(位置501和605處的Cys和位置559處的Pro)和/或弗林蛋白酶切割位點突變(例如SEQ ID NO：10替換胺基酸508-511)；或 (3)野生型HIV Env蛋白，較佳的是進化枝C的，包含以至少100個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置的胺基酸殘基處的至少一個修復突變，其中該修復突變係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由存在於對應位置的胺基酸殘基進行的取代，並且較佳的是，該修復突變係由存在於所述集合中最常見的對應位置處的胺基酸殘基進行的取代；以及其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
實施方式3係重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的胺基酸序列和在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(i)位置651處的Phe、Leu、Met、或Trp，較佳的是Phe；(i)位置655處的Phe、Ile、Met、或Trp，較佳的是Ile；(iii)位置535處的Asn或Gln，較佳的是Asn；(iv)位置589處的Val、Ile或Ala，較佳的是Val或Ile；(v)位置573處的Phe或Trp，較佳的是Phe；(vi)位置204處的Ile；以及(vii)位置647處的Phe、Met、或Ile，較佳的是Phe,其中該HIV Env蛋白係包含選自下組的至少一個突變的SOSIP突變體HIV Env蛋白，該組由以下各項組成：(a)位置501和605處的Cys；(b)位置559處的Pro；(c)位置501和605處的Cys和位置559處的Pro；以及該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
實施方式4係實施方式2所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少兩個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式5係實施方式3所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少兩個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式6係實施方式1、2和4中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白還包含位置501和605處的Cys或位置559處的Pro，較佳的是位置501和605處的Cys和位置559處的Pro。
實施方式7係實施方式1至6中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少三個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式8係實施方式1至6中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少四個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式9係實施方式1至6中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少五個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式10係實施方式1至6中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的至少六個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式11係實施方式1至6中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含在選自下組的指示位置中的七個處的指示胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)至(vii)。
實施方式12係實施方式1、4和5中任一項所述之重組HIV Env蛋白，其中該至少兩個指示位置和殘基係選自下群組的組合，該群組由以下各項組成：651F，655I；651F，535N；651F，589V；651F，589I；651F，573F；651F，204I；651F，647F；655I，535N；655I，589V；655I，589I；655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，204I；535N，647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；573F，204I；573F，647F；和204I，647F。
實施方式13係實施方式7所述之重組HIV Env蛋白，其中該至少三個指示位置和殘基係選自下群組的組合，該群組由以下各項組成：651F，655I，535N；651F，589V，535N；651F，589I，535N；651F，573F，535N；651F，204I，535N；651F，647F，535N；655I，589V，535N；655I，589I，535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，535N；589V，573F，535N；589V，204I，535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，535N；589I，647F，535N；573F，204I，535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，589V；651F，573F，589V；651F，204I，589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，589V；655I，647F，589V；573F，204I，589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，589I；651F，573F，589I；651F，204I，589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，589I；655I，647F，589I；573F，204I，589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，573F；651F，204I，573F；651F，647F，573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，573F；651F，655I，204I；651F，647F，204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，647F；655I，651F，535N；655I，589V，573F；和655I，589V，204I。
實施方式14係實施方式8所述之重組HIV Env蛋白，其中該至少四個指示位置和殘基係選自下群組的組合，該群組由以下各項組成：651F，655I，535N，589V；651F，655I，535N，573F；651F，655I，589V，573F；651F，535N，589V，573F；655I，535N，589V，573F；651F，655I，535N，204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；655I，535N，589V，204I；651F，655I，573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F，204I；651F，589V，573F，204I；655I，589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，647F；651F，655I，589V，647F；651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，655I，573F，647F；651F，535N，573F，647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；655I，589V，573F，647F；535N，589V，573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，647F；655I，535N，204I，647F；651F，589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，204I，647F；651F，573F，204I，647F；655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及589V，573F，204I，647F。
實施方式15係實施方式9所述之重組HIV Env蛋白，其中該至少五個指示位置和殘基係選自下群組的組合，該群組由以下各項組成：651F，655I，535N，589V，573F；651F，655I，535N，589V，204I；651F，655I，535N，573F，204I；651F，655I，589V，573F，204I；651F，535N，589V，573F，204I；655I，535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，589V，647F；651F，655I，535N，573F，647F；651F，655I，589V，573F，647F；651F，535N，589V，573F，647F；655I，535N，589V，573F，647F；651F，655I，535N，204I，647F；651F，655I，589V，204I，647F；651F，535N，589V，204I，647F；655I，535N，589V，204I，647F；651F，655I，573F，204I，647F；651F，535N，573F，204I，647F；655I， 535N，573F，204I，647F；651F，589V，573F，204I，647F；655I，589V，573F，204I，647F；以及535N，589V，573F，204I，647F。
實施方式16係實施方式10所述的重組HIV Env蛋白，其中該至少六個指示位置和殘基係選自下群組的組合，該群組由以下各項組成：651F，655I，535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，589V，573F，647F；651F，655I，535N，589V，204I，647F；651F，655I，535N，573F，204I，647F；651F，655I，589V，573F，204I，647F；651F，535N，589V，573F，204I，647F；以及655I，535N，589V，573F，204I，647F。
實施方式17係實施方式1至16中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白還包含在選自下組的指示位置中的至少一個處由指示胺基酸殘基進行的胺基酸取代，該組由以下各項組成：(viii)位置588處的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp、或Phe，較佳的是Gln或Glu；(ix)位置64處的Lys、或位置66處的Arg或位置64處的Lys和位置66處的Arg兩者；(x)位置316處的Trp；(xi)201和433兩個位置處的Cys；(xii)位置556或558處的或556和558兩個位置處的Pro；以及(xiii)由具有7-10個胺基酸的環，較佳的是8個胺基酸的環，例如具有選自(SEQ ID NO：12-17)中任一個的序列的環，替換胺基酸位置548-568處的環(HR1環)；(xiv)位置568處的Gly、或位置569處的Gly、或位置636處的Gly、或568和636兩個位置處的Gly、或569和636兩個位置處的Gly；和/或 (xv)位置302處的Tyr、或位置519處的Arg、或位置520處的Arg、或位置302處的Tyr和位置519處的Arg、或位置302處的Tyr和位置520處的Arg、或位置302處的Tyr和519和520兩個位置處的Arg，其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
實施方式18係實施方式1至17中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白還包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突變。
實施方式19係實施方式18所述之重組HIV Env蛋白，其中弗林蛋白酶切割位點中的突變係位置508-511處由RRRRRR(SEQ ID NO：10)進行的替換。
實施方式20係實施方式1至19中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白為gp140或gp160。
實施方式21係實施方式1至20中任一項所述之重組HIV Env蛋白，其中與在選自由(i)至(vii)組成的組的指示位置處不具有指示胺基酸殘基中的一個或多個的HIV Env蛋白相比，該重組HIV Env蛋白具有改進的三聚體形成百分比和改進的三聚體產量中的至少一項。
實施方式22係實施方式21所述之重組HIV Env蛋白，其中三聚體形成係藉由具有多角度光散射的尺寸排阻層析(SEC-MALS)測量。
實施方式23係實施方式1-22中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白還包含位置658處選自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的胺基酸殘基，較佳的是Val或Ile，最較佳的是Val。
實施方式24係實施方式1至23中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含選自下組的胺基酸的組合，該組由以下各項組成：(a)655I，589V，573F，651F，588E，535N，204I；(b)556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；(c)204I，535N，556P，588E，589V，651F，655I； (d)535N，556P，589V，651F，655I；以及(e)535N，556P，588E，589V，651F，655I。
實施方式25係實施方式1至24中任一項所述之重組HIV Env蛋白，該重組HIV Env蛋白包含與SEQ ID NO：3、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一項至少95%、96%、97%、98%、99%一致或100%一致的胺基酸序列，較佳的是與SEQ ID NO：20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一項至少98%一致的胺基酸序列。
實施方式26係一種三聚體複合物，該三聚體複合物包含實施方式1至25中任一項所述的重組HIV Env蛋白中的三種的非共價低聚物。
實施方式27係一種粒子，例如脂質體或奈米粒子，例如自組裝奈米粒子，其展示實施方式1-25中任一項所述的重組HIV Env蛋白或實施方式26所述的三聚體。
實施方式28係一種編碼實施方式1至25中任一項所述的重組HIV Env蛋白的分離的核酸分子。
實施方式29係一種載體，該載體包含與啟動子可操作地連接的實施方式28所述的分離的核酸分子。
實施方式30係實施方式29所述的載體，該載體係腺病毒載體。
實施方式31係一種包含實施方式28所述的分離的核酸分子或實施方式29或30所述之載體的宿主細胞。
實施方式32係一種生產重組HIV Env蛋白之方法，該方法包括使實施方式31所述的宿主細胞生長在適於產生重組HIV Env蛋白的條件下。
實施方式33係一種生產重組HIV Env蛋白之方法，該方法包括獲得包含與啟動子可操作地連接的實施方式28所述之分離的核酸的表現載體；用該表 現載體轉染細胞；使經轉染的細胞生長在適於表現該重組HIV Env蛋白的條件下；並在允許形成穩定的三聚體複合物的條件下純化該重組HIV Env蛋白。
實施方式34係一種產生根據實施方式1至25中任一項所述之重組HIV Env蛋白之方法，該方法包括向骨架HIV包膜蛋白序列引入至少一個指示胺基酸取代，導致在選自下組的位置處的胺基酸殘基，該組由以下各項組成：(i)-(vii)。
實施方式35係根據實施方式34所述之方法，其中編碼該胺基酸取代的核苷酸序列被引入編碼該骨架HIV包膜蛋白序列的核酸中。
實施方式36係實施方式34或35所述之方法，其中該骨架HIV包膜蛋白序列選自由以下各項組成之群組：SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；在位置166處Glu突變為Arg的SEQ ID NO：6；具有位置501和605處的Cys、位置559處的Pro和/或SEQ ID NO：10替換了胺基酸508-511的SEQ ID NO：6；在位置166處Glu突變為Arg的，還具有位置501和605處的Cys、位置559處的Pro和/或SEQ ID NO：10替換了胺基酸508-511的SEQ ID NO：6；具有位置501和605處的Cys、位置559處的Pro和/或SEQ ID NO：10替換了胺基酸508-511的SEQ ID NO：8；具有位置501和605處的Cys、位置559處的Pro和/或SEQ ID NO：10替換了胺基酸508-511的SEQ ID NO：9；和一種具有如下突變的野生型HIV Env蛋白，所述突變導致至少以下的(a)、(b)或(c)，較佳的是以下的(a)、(b)和(c)中至少兩項，最較佳的是以下的(a)、(b)和(c)：(a)位置501和506處的Cys和位置559處的Pro，(b)SEQ ID NO：10替換胺基酸508-511，和/或(c)以至少100個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率存在於對應位置的胺基酸殘基處的至少一個修復突變，其中該修復突變係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由存在於對應位置的胺基酸殘基進行的取代，並 且較佳的是，該修復突變係由存在於所述集合中最常見的對應位置處的胺基酸殘基進行的取代。
實施方式37係一種包含實施方式1至25中任一項所述之重組HIV Env蛋白、實施方式26所述之三聚體複合物、實施方式27所述之粒子、實施方式28所述之分離的核酸分子、實施方式29或30所述之載體、或實施方式31所述的宿主細胞以及藥學上可接受的載劑的組成物。
實施方式38係實施方式37所述之組成物，該組成物還包含佐劑。
實施方式39係一種產生實施方式37所述的組成物之方法，該方法包括將該重組HIV Env蛋白、三聚體複合物、粒子、分離的核酸、載體或宿主細胞與一種或多種藥學上可接受的載劑混合。
實施方式40係一種針對HIV感染對受試者進行疫苗接種之方法，該方法包括向受試者給予包含實施方式1至25中任一項所述之重組HIV包膜蛋白、實施方式26所述的三聚體複合物、實施方式27所述之粒子或實施方式29或30所述之載體的組成物。
實施方式41係在有需要的受試者中產生針對HIV感染的免疫應答之方法，該方法包括向受試者給予包含實施方式1至25中任一項所述的重組HIV包膜蛋白、實施方式26所述的三聚體複合物、實施方式27所述的粒子或實施方式29或30所述之載體的組成物。
實施方式42係包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與其至少95%一致的序列之重組HIV Env蛋白。
實施方式43係包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與其至少95%一致的序列之重組HIV Env蛋白。
實施方式44係包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與其至少95%一致的序列之重組HIV Env蛋白。
實施方式45係包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或與其至少95%一致的序列之重組HIV Env蛋白。
實施方式46係一種編碼實施方式42至45中任一項所述的重組HIV Env蛋白的分離的核酸分子。
實施方式47係一種載體，該載體包含與啟動子可操作地連接的實施方式46所述之分離的核酸分子。
實施方式48係實施方式47所述之載體，該載體係腺病毒載體。
實施方式49係一種包含實施方式46所述之分離的核酸分子或實施方式47或48所述之載體的宿主細胞。
實施方式50係一種包含實施方式42至45中任一項所述之重組HIV Env蛋白、實施方式46所述的分離之核酸分子、實施方式47或48所述之載體、或實施方式49所述之宿主細胞以及藥學上可接受的載劑之組成物。
實施方式51係一種改進親本HIV Env蛋白的三聚體百分比和/或三聚體產量(代表折疊和穩定性)之方法，該方法包括藉由在親本HIV Env蛋白中引入至少一個修復突變，較佳的是至少3個修復突變，來修復親本HIV Env蛋白的胺基酸序列，其中修復突變係以至少100個、較佳的是至少500個、較佳的是至少1000個、較佳的是至少10000個野生型HIV Env序列的集合中小於7.5%、較佳的是小於2%的HIV Env序列的頻率發現於對應位置的胺基酸殘基處的胺基酸取代，其中該取代係以在所述集合中至少10%的HIV Env序列的頻率由發現於對應位置的胺基酸殘基進行的，並且較佳的是，該取代係由發現於所述集合中最常見的對應位置處的胺基酸殘基進行的。
實施方式52係實施方式51所述之方法，其中親本HIV Env蛋白中的至少50%、較佳的是至少80%的胺基酸殘基被修復，該等殘基以在所述集合中小於7.5%的HIV Env序列的頻率被發現於對應位置處。
實施方式53係實施方式51所述之方法，其中親本HIV Env蛋白中的至少50%、較佳的是至少80%的胺基酸殘基被修復，該等殘基以在所述集合中小於2%的HIV Env序列的頻率被發現於對應位置處。
實施方式54係實施方式51至53中任一項所述之方法，其中該親本HIV Env蛋白來自進化枝C。
實施方式55係實施方式51至54中任一項所述之方法，其中該親本HIV Env蛋白係野生型型HIV Env蛋白。
實施方式56係實施方式51至54中任一項所述之方法，其中該親本HIV Env蛋白包含以下中的一項或多項：(a)位置501和506處的Cys和位置559處的Pro；(b)HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突變，例如，SEQ ID NO：10替換胺基酸508-511；(c)位置651處的Phe；(d)位置655處的Ile；(e)位置535處的Asn；(f)位置589處的Val；(g)位置573處的Phe；(h)位置204處的Ile；(i)位置647處的Phe；(j)位置658處的Val；(k)位置588處的Gln或Glu；和/或(l)位置556、558、或556和558處的Pro。
實施方式57係藉由實施方式51至56中任一項所述之方法可獲得的重組HIV Env蛋白。
【實例】
實例1：HIV包膜進化枝C和進化枝B共有序列的生成
HIV包膜進化枝C共有序列
以骨架序列開發HIV進化枝C包膜(Env)蛋白共有序列用於研究各種突變對HIV Env蛋白三聚體形成的影響。從Los Alamos資料庫(http：//www.hiv.lanl.gov/content/index)下載來自已知HIV病毒分離株的3,434個包膜蛋白序列的序列比對。從3,434個序列中，僅選擇進化枝C的1,252個序列以生成HIV進化枝C Env蛋白共有序列。在基於比對不能明確鑒定共有殘基的位置，藉由BLAST搜索使用共有序列來鑒定最接近的野生型序列。然後選擇該等位置上的共有殘基作為從BLAST搜索鑒定的最接近的野生型序列中的胺基酸。HIV Env進化枝C共有序列顯示於SEQ ID NO：2中。使用BLAST，與SEQ ID NO：2具有最高同源性的兩個序列係具有Genbank編號ADM30337.1和ADM30340.1的序列，兩者都與SEQ ID NO：2具有90%序列一致性。
藉由引入包括位置501和605處的半胱胺酸殘基和位置559處的脯胺酸殘基的所謂SOSIP突變以及藉由用6個精胺酸殘基替換殘基508-511處的弗林蛋白酶位點來優化弗林蛋白酶切割位點，進一步修飾HIV Env進化枝C共有序列。另外，位置295的Val突變為Asn(V295N)，以產生存在於大多數HIV毒株中的N-連接的糖基化位點，並且可以改進與在一些實驗中使用的某些抗體的結合。此外，C端在殘基664處被截短，導致編碼可溶性HIV gp140蛋白的序列。上述所有取代/修飾位置均相對於HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。所得的HIV gp140序列，稱為“ConC_SOSIP”，示於(SEQ ID NO：3)中。將ConC_SOSIP序列用作骨架或親本HIV包膜序列，其中引入了額外的突變，例如單和雙胺基酸取代，以產生根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白。
HIV包膜進化枝B共有序列
使用與上述用於生成HIV Env進化枝C共有序列的類似程序生成HIV Env進化枝B共有序列。使用來自已知進化枝B病毒分離株的1,708個進化枝B包膜蛋白序列來生成進化枝B共有序列。HIV Env進化枝B共有序列顯示於SEQ ID NO：4中。
藉由引入所謂的SOSIP突變，藉由用6個精胺酸殘基替換弗林蛋白酶位點來優化弗林蛋白酶切割位點，並如上所述在殘基664處截短C端，來進一步修飾HIV Env進化枝B共有序列，得到編碼可溶性HIV gp140進化枝B共有序列的序列。所得的HIV gp140 Env蛋白序列，稱為“ConB_SOSIP”，示於(SEQ ID NO：5)中。
出人意料地發現，基於共有序列的分子與基於天然分離株的分子相比具有改進的表現水平，並且此外已經具有改進的三聚化水平。因此，具有SEQ ID NO：2-5的分子已經具有出人意料的有利性質。
實例2：重組HIV Env蛋白的表現和純化
重組HIV Env蛋白以可溶gp140蛋白表現和純化。將單突變(胺基酸取代)及其組合(即雙突變和三突變)引入ConC_SOSIP骨架共有序列，以生成一系列重組HIV Env蛋白變體。
HIV gp140 Env構建體和變體的生成和表現
合成SEQ ID NO：3所示的編碼HIV進化枝C Env共有序列ConC_SOSIP的DNA，並在GenScript(皮斯卡塔韋，新澤西州08854)或Gene Art(生命技術公司(Life Technologies)，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)中進行密碼子優化。然後將密碼子優化的序列選殖到載體pcDNA2004中，以生成HIV進化枝C gp140 Env構建體，將其用作骨架HIV包膜序列以引入另外的突變。藉由在 pcDNA2004 HIV進化枝C gp140 Env構建體上進行定點誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)，向ConC_SOSIP骨架序列中引入突變。根據製造商的說明書，用90%的編碼ConC_SOSIP序列的pcDNA2004載體或其變體和10%的編碼弗林蛋白酶的pcDNA2004載體(弗林蛋白酶-pCDNA2004)暫態轉染HEK-Expi293F細胞或HEK293F細胞。將轉染的細胞在37℃和10% CO2下培養5天。將培養上清液在1250 x g旋轉10分鐘。隨後使用0.22μm真空過濾器無菌過濾旋轉過的上清液，並在4℃下儲存直至進一步使用。
為了在96孔規格中表現，將細胞在37℃和10% CO2下培養3天。將4uL Optimem(培養基)與4uL 100ng/uL DNA和8uL Expi293F混合物(54uL/mL Optimem)混合並孵育20分鐘。隨後以2.5 x 10E6個細胞/mL添加200uL/孔Expi293F細胞。收集培養物上清液並在300g旋轉5分鐘以去除細胞和細胞碎片。隨後使用0.22μm真空過濾器無菌過濾旋轉過的上清液，並在4℃下儲存直至進一步使用。
HIV gp140 Env蛋白的純化
根據兩步純化方案將從pcDNA2004載體表現的HIV gp140 Env蛋白進行純化，使用雪花蓮(Galantus nivalis)凝集素柱(維克特實驗室(Vectorlabs)，AL-1243)進行初步純化，並在隨後的步驟中用Superdex200 Increase柱(通用電氣公司(GE))去除殘留污染物。對於使用雪花蓮凝集素柱的初始步驟，將培養上清液用緩衝液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.5)稀釋，並以每分鐘4mL的速率藉由4mL CV Tricorn 10-50凝集素瓊脂糖柱。隨後，用四個柱體積的緩衝液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.5)洗滌柱，並用四個柱體積的40mM Tris、500mM NaCl和1M哌喃甘露糖苷pH 7.5洗提，上升流量為1.6mL/min，這意味著流動方向從下降變為上升，以增加包膜蛋白洗提速率並減少洗提體積。使用旋轉濃縮器(50K，Amicon Ultra，密理博公司(Millipore))對洗提液進行濃縮。
將HIV gp140 Env在Superdex200柱上進一步純化，使用50mM Tris、150mM NaCl pH 7.4作為運行緩衝液。從柱洗提的第二峰含有HIV gp140 Env蛋白。合併含有此峰的級分，並使用西方墨點法和SDS-PAGE和/或SEC-MALS分析確認該峰的身份為HIV gp140 Env蛋白。藉由測量280nm處的光密度來確定經純化的HIV gp140 Env蛋白的濃度，並將經純化的HIV gp140 Env蛋白在4℃下儲存，直至進一步使用。
SDS-PAGE和西方墨點法分析
在還原或非還原條件下，在4%-12%(w/v)Bis-Tris NuPAGE凝膠，1X MOPS(生命技術公司)上分析含有所表現的HIV gp140 Env蛋白和經純化的HIV gp140 Env蛋白樣品的細胞培養上清液，並使用iBlot技術(生命技術公司)進行印跡。所有程序均根據製造商的說明書進行。對於純度分析，將凝膠用Krypton Infrared蛋白質染色(賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))或SYPRO Rubi蛋白質染色(伯樂公司(Bio-Rad))進行染色。對於西方墨點法分析，用抗6x-組胺酸-標籤抗體(抗His-HRP)探測膜。在Odyssey儀器(Li-Cor)上掃描凝膠和印跡膜，並使用Odyssey 3.0軟體(Li-Cor)分析圖像。
藉由陰性染色電子顯微鏡對HIV Env三聚體形成進行成像
使用陰性染色電子顯微鏡(NS-EM)對具有ConC_SOSIP骨架序列的包膜蛋白的三聚體進行成像，該三聚體使用雪花蓮(Galanthus nivalis)凝集素、隨後尺寸排阻層析進行純化，並且如Julien等人2015(Proc.Natl.Acad.Sci.[美國科學院院報](2015)112(38)11947-52)描述進行。將三聚體樣品在Tris緩衝鹽水(TBS)pH 7.4中稀釋至0.01-0.5mg/mL之間，並附著於帶有碳塗層的200Cu網柵(EMS CF200-Cu)上，該Cu網柵在使用前剛在空氣中2*10-1毫巴，25mA，30秒輝光放電。隨後，將一滴3μL的經稀釋的三聚體樣品施加於網柵上1min，隨後用濾紙(沃特曼(Whatman)1號或4號)吸乾。將網柵乾燥1分鐘，然後用3μL的2.3% 乙酸鈾醯(UAc)染色60秒。使用在120keV下操作的FEI Tecnai F20電子顯微鏡採集數據，放大倍數為25,000倍，得到樣品平面上的像素尺寸為4.68Å。用Gatan BM ultrascan獲取圖像。
幾乎(這種富含三聚體的材料)圖像中所有粒子都是結構良好的封閉三聚體(數據未顯示)。
實例3：針對三聚體產量和三聚體形成百分比篩選重組HIV gp140 Env變體
針對三聚體形成篩選實例2中生成的重組HIV Env蛋白變體，以鑒定相對於ConC_SOSIP骨架序列改進三聚體形成百分比和/或改進三聚體產量的那些突變。使用AlphaLISA測定進行三聚體百分比和三聚體產量的高通量(throughput)篩選，以評價一組廣泛中和HIV抗體(bNAb)和非bNAb與重組HIV Env蛋白的結合。藉由尺寸排阻層析與多角度光散射(SEC-MALS)證實了AlphaLISA測定的結果。
AlphaLISA®測定分析
藉由AlphaLISA測定，在細胞培養上清液中測量HIV gp140 Env蛋白的總表現和具有引入到如實例2所述生成的ConC_SOSIP序列中的單胺基酸取代的超過200種HIV gp140變體的正確折疊的天然三聚體的總量。還測試了含有雙突變和三突變的HIV gp140變體。測試具有無任何額外突變的ConC_SOSIP序列的HIV Env蛋白以進行比較。
特別使用以下單株抗體(mAb)用於分析：mAb PGT145、mAb PGDM1400、mAb PG16、mAb PGT151、mAb 35O22、mAb PGT128、mAb PG9、mAb F105、mAb B6、mAb 447-52d、mAb 14e和mAb 17b。MAb 447-52D(AB014)、PG9(AB015)和PG16(AB016)購自Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH(克洛斯特新堡，奧地利)。非中和抗體b6獲得自Dennis R.Burton(斯克裡普斯研究所(The Scripps Research Institue)，加利福尼亞州拉荷亞)，並且非中和抗體14e得自James E.Robinson(杜蘭大學(Tulane University)，路易斯安那州新奧爾良)。對於mAb PGT145(PDB：3U1S)、PGDM1400(PDB：4RQQ)、PGT151(PDB：4NUG)、35022(PDB：4TVP)、F105(PDB：1U6A)、PGT128(PDB：3TYG)和17b(PDB：4RQS)，編碼該等公開序列的核酸被選殖到表現載體中並生產以用於HIV Env蛋白的評價。除了mAb F105、B6、447-52d、14e和17b之外，用於分析的抗體係廣泛中和抗體(bNAb)。bNAb能夠中和多種HIV病毒株。在bNAb中，PGT145、PGDM1400和PG16係頂端黏合劑(apex binder)，並且是三聚體特異性的。PGT151也是三聚體特異性的，但是在gp120和gp41的兩個原聚體的介面處結合，並且是切割依賴性的。非bNAb的結合指示不正確的折疊或開放的三聚體構象。
還藉由測量可溶性HIV gp140Env蛋白變體與已知結合該HIV包膜蛋白的共受體結合位點的抗體(mAb 17b)的結合來測試蛋白折疊，該HIV包膜蛋白僅在結合CD4後暴露(數據未顯示)。具體地，可溶性受體CD4(sCD4)與mAb 17組合使用以評價CD4誘導的構象變化。在沒有預先的CD4結合到該包膜蛋白的情況下，mAb 17b與HIV gp140 Env蛋白變體的結合係部分解折疊的或預先觸發的包膜蛋白(即，在不存在CD4結合時採取“開放”構象的不穩定Env)的指示。
對於AlphaLISA測定，製備含有接頭，隨後是分選酶A標籤，隨後是Flag標籤，隨後是柔性(G4S)7接頭並以His標籤結束(位於HIV Env蛋白的C端的標籤的序列在SEQ ID NO：19中提供)的pcDNA2004載體中的HIV gp140Env構建體。HIV gp140 Env構建體在HEK-Expi293細胞中表現，將其在96孔板(200μL/孔)中培養3天。在AlphaLISA緩衝液(PBS+0.05% Tween-20+0.5mg/mL BSA) 中將粗上清液稀釋120倍。對於基於mAb 17b的測定，將上清液稀釋12倍。然後將10μL的每種稀釋液轉移到96孔板中，並與40μL受體珠粒、供體珠粒和一種以上列出的mAb混合。將供體珠粒與ProtA(目錄號：AS102M，批號1831829，珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))綴合，其結合至mAb。將受體珠粒與結合至構建體的His標籤的抗His抗體(目錄號：AL128M，珀金埃爾默公司)綴合。為了定量包括所有形式的包膜蛋白的總蛋白產量，使用了用於檢測His標籤的鎳綴合供體珠粒(目錄號：AS101M，珀金埃爾默公司)連同用於檢測Flag標籤的抗Flag抗體綴合受體珠粒(目錄號：AL112R，珀金埃爾默公司)的組合。對於與sCD4-His組合使用mAb 17b的測試，使用了ProtA供體珠粒和抗Flag受體珠粒的組合(數據未顯示)。將一個樣品與供體珠粒和受體珠粒混合以檢測三聚體形成，並將相同Env變體的第二個樣品與鎳綴合供體珠粒和抗Flag綴合受體珠粒混合以測量表現的蛋白的總量(即，總蛋白產量)。
將含有表現的HIV gp140Env蛋白、mAb、供體珠粒和受體珠粒的上清液的混合物在室溫下孵育2小時而不搖動。隨後，用Synergy NEO讀板機儀器(伯騰公司(BioTek))測量化學發光信號。從針對每種HIV gp140 Env變體測量的AlphaLISA計數中減去歸因於類比轉染細胞的平均背景信號。然後，將整個數據集除以針對具有ConC_SOSIP骨架序列信號的HIV Env蛋白測量的信號，以將針對測試的每種HIV gp140 Env變體的信號歸一化為骨架。使用每種HIV gp140 Env變體與三聚體特異性mAb PGT145的結合數據來確定每種變體的三聚體形成百分比和三聚體產量。使用與其他mAb的結合來評價HIV Env變體與bNAb和非bNAb(未顯示)的一般結合模式。
藉由將從HIV Env變體、mAb PGT145、ProtA綴合供體珠粒和抗His綴合受體珠粒的樣品混合物獲得的歸一化化學發光信號除以從HIV Env變體、抗 His綴合供體珠粒和抗Flag綴合受體珠粒的樣品混合物獲得的歸一化化學發光信號來計算每種HIV Env變體的三聚體形成百分比。
相對於具有無任何額外突變的ConC_SOSIP骨架序列的HIV Env蛋白的三聚體產量測定每種HIV Env變體的三聚體產量。將從mAb PGT145與ConC_SOSIP包膜蛋白的結合獲得的歸一化化學發光信號設定為1，並且將從mAb PGT145與每種HIV gp140蛋白的結合獲得的歸一化化學發光信號歸一化為此值。
AlphaLISA測定分析的結果-三聚體百分比和三聚體產量
在ConC_SOSIP骨架序列中，如藉由AlphaLISA測定針對來自上表1中的(i)-(vii)列表的幾個單、雙和三胺基酸取代確定的三聚體形成百分比顯示在圖2A中。在測試的含有單胺基酸取代的約200種HIV gp140 Env變體中，鑒定了七個取代位置，其中三聚體形成百分比相對於無任何額外胺基酸取代的ConC_SOSIP骨架序列的三聚體形成百分比增加至少25%。
圖2A中所示的結果證明，根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號，觀察到三聚體形成百分比顯著增加的七個較佳的是取代位置包括N651、K655、I535、D589、I573、A204和E647。具體地，導致三聚體形成百分比最大改進的單胺基酸取代包括N651F、K655I(F/W)(儘管還有一個實驗，其中K655F似乎沒有導致改進)、I535N、D589V(/A)、I573F、A204I、E647F。與該等突變中的幾種組合測試的一些突變包括K588Q/E、I556P和A558P，並且在本實驗中，該等進一步改進在本發明的位置(表1中的(i)-(vii))處具有較佳的是胺基酸的突變體的三聚體百分比。
在本實驗中測試的所有雙取代具有比對應的單取代更高的三聚體形成百分比，並且測試的所有三取代具有比對應的單和雙突變更高的三聚體形成 百分比(圖2A)。該等不可預測和出人意料的結果指示，該等突變可能在該等實驗中針對包膜蛋白的三聚化展示出協同作用的形式。
除了改進三聚體形成百分比之外，增加三聚體產量也是理想的。因此，藉由AlphaLISA測定也確定了ConC_SOSIP骨架序列中含有單、雙和三突變的HIV gp140變體的三聚體產量。結果示於圖2B中。含有單突變的大多數HIV gp140變體(例外係I535N、D589A和D589I)具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的三聚體產量。然而，如下所述，I535N突變體的更準確的SEC-MALS分析顯示三聚體產量增加。此外，與I535N組合的額外突變，如D589V，導致在不存在I535N突變的情況下，針對具有特定額外取代的包膜蛋白觀察到相同的三聚體產量。具有雙突變的變體的三聚體產量也增加，其中每種單突變變體具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的三聚體產量(圖2B)。
還測試了先前在文獻中描述的在ConC_SOSIP骨架中具有雙突變的HIV gp140變體的三聚體形成百分比，所述雙取代包括由(De Taeye等人，同上)描述的E64K、T316W雙取代和(Kwon等人，同上)描述的二硫雙取代I204C、A433C。E64K、T316W雙取代導致三聚體形成百分比低於ConC_SOSIP包膜蛋白，即15%(數據未顯示)。儘管二硫雙取代I204C，A433C將三聚體百分比增加至43%(數據未顯示)，但在AlphaLISA實驗中，此處所述的新穎雙取代如I535N/K588E、K588Q/D589V、K655I/K588E、I535N/D589V、I535N/E647F、D589V/K655I和I535N/K655I(圖2A)導致甚至更大的三聚體形成百分比。
也向ConC_SOSIP骨架中引入了額外突變(殘基558和/或556處的脯胺酸)，並測量了該等HIV gp140Env蛋白的三聚體形成百分比和三聚體產量。除了已經含在ConC_SOSIP骨架中的SOSIP突變(即，位置501和605處的Cys以及位置559處的Pro)之外，在位置558或556處的Pro的單取代以及在位置556和558處的脯胺酸的雙取代增加三聚體形成百分比和三聚體產量(數據未顯示)。實 際上，在另外包含位置558和/或556處的Pro殘基的ConC_SOSIP骨架中引入本發明的一個或多個新穎胺基酸穩定取代進一步改進了三聚體形成百分比和/或三聚體產量(例如圖2A，例如A558P/I535N、K655I/L556P和幾種包括A558P突變的三突變體)。
HIV gp140 Env變體與其他bNAb和非bNAb的結合數據證明，測試的增加了三聚體產量和三聚體形成百分比的大多數單、雙和三突變(如圖2A和2B中列出的那些)還具有增加的與bNAb的結合和相對於針對具有ConC_SOSIP骨架序列的HIV包膜蛋白觀察到的與bNAb和非bNAb的結合量相同或減少的與非bNAb的結合(數據未顯示)。對於疫苗開發，較佳的是增加與bNAb的結合和減少與非bNAb的結合。因此，數據證明，在上述表1中所示的(i)-(vii)位置處包含胺基酸取代的HIV包膜蛋白關於廣泛中和抗體和非廣泛中和抗體的結合模式具有理想的性質。
SEC-MALS分析
也使用SEC-MALS分析來驗證使用AlphaLISA測定篩選的HIV gp140變體的三聚體產量和三聚體形成百分比。將HIV gp140變體在30mL標準培養基中表現，並藉由在Polyprep重力流動柱(伯樂公司(Biorad)目錄號731-1550)中200μ雪花蓮凝集素珠粒(維克特實驗室目錄號AL-1243)上施加無細胞上清液進行純化。將珠粒用2ml結合緩衝液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.4)洗滌。將蛋白使用250-500μl 40mM Tris、500mM NaCl、1M哌喃甘露糖苷pH 7.4洗提。使用偶聯到Optilab T-rEX折射率檢測器(懷亞特公司(Wyatt))的高效液相層析系統(安捷倫技術公司(Agilent Technologies))和MiniDAWN TREOS儀器(懷亞特公司)進行SEC-MALS實驗。總體來說，將100μl凝集素洗提物或大約30μg蛋白以1mL/min施加到在運行緩衝液(150mM磷酸鈉，50mM NaCl， pH 7.0)中平衡的TSK-Gel G3000SWxl柱(東曹生物科學公司(Tosoh Bioscience))上。使用Astra 6套裝軟體分析數據，並從折射率信號推導分子量計算。
ConC_SOSIP包膜蛋白和含有單突變的HIV gp140變體的SEC-MALS層析圖示於圖3中。一般來說，從SEC-MALS分析得到的結果與從AlphaLISA分析得到的結果係可比較的和一致的。ConC_SOSIP包膜蛋白的層析圖具有四個主峰，在約7.3分鐘洗提出的第二個峰係三聚體峰。ConC_SOSIP包膜蛋白被確定係約27%三聚的。聚集體和單體的形成指示與具有ConC_SOSIP共有序列的HIV gp140 Env蛋白相關的一些錯誤折疊和不穩定性。如圖3所示的層析圖所證明的，與ConC_SOSIP包膜蛋白的三聚體峰相比，所有單取代都導致相對較高的三聚體峰，指示每種HIV gp140變體的三聚體產量增加。
總之，結果證明，此處表1的(i)-(vii)中鑒定的胺基酸取代提供了具有改進的三聚體形成百分比和/或改進的三聚體產量的重組HIV Env蛋白。具體地，在表1的(i)-(vii)的鑒定位置處具有多個取代(如所鑒定的突變中兩個或更多個的組合)的HIV Env蛋白變體典型展現出比僅具有單突變的HIV Env蛋白變體甚至更加改進的三聚體產量和/或三聚體形成百分比，其顯示了表1的組合突變(i)-(vii)的可能的協同作用。就本發明人所知，該等胺基酸取代的組合都沒有在天然發生的HIV包膜蛋白序列中報導過，並且因此所有組合((i)-(vii)之間)都被認為係三聚體穩定突變的新穎組合。具有增加的三聚體形成百分比的HIV包膜蛋白(如本發明的重組HIV包膜蛋白)從製造的角度來說是有利的，如用於疫苗，因為將需要更少純化和除去製劑中存在的不希望的非天然構象的包膜蛋白。另外，增加的總三聚體表現產量對於製造疫苗產品係有利的。
實例4：三聚體HIV包膜蛋白的穩定性
藉由AlphaLISA和差示掃描量熱法(DSC)測試根目錄據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白的熱穩定性。
使用AlphaLISA進行熱穩定性測量
藉由基於與三聚體特異性mAb PGT145的結合測量熱處理時的完整三聚體的損失來測試熱穩定性。在60℃下，將粗上清液(20μl)加熱1小時。然後將樣品以最大速度離心5分鐘以除去聚集體。如上述在實例3中所述進行AlphaLISA測定。
結果示於圖4中，並且數據包告為熱處理後三聚體保持不變的百分比。從結果可以看出，測試的本發明的單突變體重組HIV gp140 Env蛋白的大多數具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的熱穩定性。還發現所測試的具有此處鑒定的三聚體穩定雙和三取代的HIV包膜蛋白具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的熱穩定性。
使用DSC進行熱穩定性測量
藉由DSC使用MicroCal毛細管DSC系統測定HIV gp140 Env變體的解鏈溫度(Tm)。以100℃/小時的掃描速度進行每次測量，起始溫度為20℃，並且最終溫度為110℃。每次測量使用濃度為0.5mg/mL(400μL)的蛋白樣品。使用Origin J.軟體(MicroCal VP-分析工具)分析數據。
使用DSC測量的ConC_SOSIP包膜蛋白的解鏈溫度(Tm)被確定為69.8℃，並且解鏈起始溫度為60.1℃。針對ConC_SOSIP包膜蛋白測量的Tm高於BG505_SOSIP包膜蛋白(具有所謂的SOSIP突變的BG505病毒分離株的HIV包膜蛋白)，據報導其Tm為67.0℃(Kwon等人，2015)。這指示具有ConC_SOSIP骨架序列的HIV包膜蛋白關於熱穩定性比具有三聚體穩定突變的另一已知HIV包膜序列具有更有利的性質。
ConC_SOSIP的K655I突變體的Tm被測量為72.3℃，並且解鏈起始溫度為63.7℃，甚至高於ConC_SOSIP包膜蛋白的Tm。ConC_SOSIP的A558P、N651F、I535N突變體的Tm被測量為77.29℃，起始溫度為74.87℃。DSC結果因此證實了藉由AlphaLISA測定確定的熱穩定性結果。
總之，結果證明，包含此處所述的至少一個胺基取代的HIV Env蛋白典型比缺少這種突變的包膜蛋白具有更高的熱穩定性。結果還證明，所有雙取代HIV Env蛋白變體都具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的熱穩定性。三取代HIV Env蛋白變體也比ConC_SOSIP包膜蛋白更穩定。
實例5：基於進化枝B包膜蛋白共有序列的重組HIV包膜蛋白變體
如實例2所述生成和純化根據本發明的實施方式的包含引入進化枝B共有序列ConB_SOSIP(SEQ ID NO：5)的單胺基酸取代(I535N、D589V、N651F或K655I)的重組HIV Env蛋白。如實例3所述藉由AlphaLISA測定來測量三聚體產量和三聚體形成百分比。
結果示於圖5A(三聚體形成百分比)和圖5B(三聚體產量)。報告的值係相對於針對ConB_SOSIP包膜蛋白測量的值(對於三聚體形成百分比和三聚體產量都設置為1)。結果顯示，所有測試的突變都增加了三聚體形成百分比。對於所有測試的突變，相對於ConB_SOSIP包膜蛋白，三聚體產量大致相同或被改進。
該等結果證明，當引入一個不同的骨架HIV包膜蛋白序列(在本情形下是進化枝B衍生的共有序列)時，該等突變也對包膜蛋白具有穩定作用，例如改進三聚體產量、改進三聚體形成百分比等。
實例6：基於合成包膜蛋白序列的重組HIV包膜蛋白變體
如實例2所述製備和純化根據本發明的實施方式的包含引入合成HIV包膜蛋白(命名為‘DS_sC4_SOSIP_E166R’，具有SEQ ID NO：7所示的序列)的胺基酸取代的重組HIV Env蛋白。合成HIV包膜蛋白DS_sC4_SOSIP_E166R具有所謂的SOSIP突變(殘基501和605處的Cys以及殘基559處的Pro)、導致引入二硫(DS)鍵的殘基201和433處的Cys和位置166處的Arg以穩定頂點。此外，該蛋白在位置655處被截短。如實例3所述，藉由AlphaLISA測定來測量三聚體形成百分比和三聚體產量。
結果示於圖6，其比較了針對所測試的每種變體的三聚體形成百分比與針對DS_sC4_SOSIP_E166R骨架的三聚體形成百分比(圖6A)和三聚體產量(圖6B)。與該骨架序列相比，針對所測試的每種變體觀察到更大的三聚體形成百分比。
除了E166R外，其他一些很少天然發生的胺基酸在野生型HIV Env蛋白的集合中的對應位置處變成更盛行的胺基酸(A114Q、E117K、T375S和I434M)，以根據以下實例12和圖12中更詳細解釋的框架‘修復’該蛋白。在這種‘經修復的’蛋白中，穩定突變A204I和K655I甚至進一步改進了sC4_SOSIP(圖13)。
本實例的結果與實例5的結果一致，證明了此處所述的突變也對包膜蛋白具有穩定作用，例如，當引入不同的骨架HIV包膜蛋白序列(在這種情形下是非共有的合成Env序列)時，改進三聚體形成百分比和/或改進三聚體產量等。
實例7：HIV Env突變的另外的組合
如實例2所述製備和純化根據本發明的實施方式的包含引入ConC_SOSIP(具有SEQ ID NO：3所示的序列)的胺基酸取代的重組HIV Env蛋白。如實例3所述，藉由AlphaLISA測定來測量三聚體形成百分比。隨後，使用 雪花蓮凝集素純化組合的較小選擇(以下以斜體描繪的那些和此外的K655I；I535N，D589V；I535N，K655I；D589V，K655I)，並且如實例3所述使用SEC-MALS分析三聚體含量。如實例4所述測量穩定性。
針對本實驗製備以下突變體：K655I，N651F；K655I，N651F，E647F；K655I，N651F，E647F，I535N；K655I，N651F，I535N；K655I，I573F；K655I，D589V，I573F；K655I，D589V，I573F，N651F；K655I，D589V，I573F，K588E；K655I，D589V，I573F，N651F，K588E；K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，I535N；K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，I535N，A204I；K655I，D589V，I535N，L556P；K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，L556P；K655I，D589V，A204I；L556P，N651F；L556P，N651F，K655I；L556P，N651F，K655I，I535N；L556P，N651F，K655I，I535N，I573F：L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V；L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I； L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588O，E647F；L556P，N651F，I535N；L556P，N651F，I535N，I573F：L556P，N651F，I535N，I573F，D589V；L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I；L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，E647F；L556P，K655I，I535N；L556P，K655I，I535N，I573F；L556P，K655I，I535N，I573F，D589V；L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I；L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，E647F；L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，其中SOS突變被去除。
在AlphaLISA中，與骨架相比，ConC_SOSIP骨架中測試的所有取代組合都顯示更高的三聚體百分比、更高的三聚體產量和在60℃更高的三聚體穩定性(數據未顯示)。針對骨架中測試的所有突變，SEC_MALS證實改進的三聚體百分比(數據未顯示)。
對於包含一個接一個突變一直到九個突變的組，SEC-MALS顯示，藉由每個貼近的突變的引入，三聚體/單體比率隨著單體峰的高度降低而增加，而三聚體峰的高度在SEC圖中保持相同(圖7)。在SEC-MALS中測試的所有變體中，具有L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、 E647F取代的變體顯示出最高的三聚體百分比(最少的gp140單體和最少的gp120單體)、最高的總蛋白產量和一較高的溫度穩定性。這意味著與骨架相比，該等突變可以組合而不損失三聚體。此外，這表明，一般而言，添加表1的(i)-(vii)中所述的突變，視情況與表2中所述的突變組合，導致進一步改進的三聚化。
也測試了具有L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q突變的構建體，其中除去了‘SOS突變’(即，位置501和605處的兩個半胱胺酸殘基恢復成原本存在於共有進化枝C序列中的胺基酸殘基)。儘管其溫度穩定性較低，但該突變體具有與其包含SOS突變的對應突變體相當的三聚體百分比和產量。其中除去SOS突變的突變體甚至具有比其對應的含有SOS的對應物(具有L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q突變)結合較少非bNAb的優點。這證明本發明的有利性質(如高三聚化百分比)也可以在不具有所有SOSIP突變的HIV Env蛋白中獲得。
基於表現水平、三聚體形成和與廣泛中和抗體PGT151的結合的有利性質的組合，一種突變體(在ConC_SOSIP骨架中測試的)具有以下突變：L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q。
在ConC_SOSIP背景中，9個最成功的取代係gp41中的L556P、E647F、N651F、K655I、I535N、D589V、I573F和K588E以及gp120中的A204I。所有這9個取代的組合導致增加的穩定性、三聚體含量和三聚體產量。由於在具有9個取代的此變體中添加L556P對改進的三聚體百分比的影響相對有限，並且在此上下文中E647F取代顯現阻礙PGT151結合，所以這兩個突變並不總是用於其他變體，而具有7個取代的變體(命名為ConC_SOSIP_7mut，有時在此處也被稱為‘穩定的ConC_SOSIP’或‘ConC_base’；包括N651F、K655I、I535N、D589V、I573F、K588E、和A204I)被發現比具有以上所示的9個取代的變體稍 微更穩定(增加的解鏈溫度)。此變體(穩定的ConC_SOSIP Env，HIV 160544)的完整序列在SEQ ID NO：20中提供。
此時，基於表現水平、三聚體形成和與廣泛中和抗體結合的有利性質的組合，特別較佳的突變體[在ConC_SOSIP骨架中測試的，具有以下額外突變：(a)D279N，A281V，A362Q(增加與傳播的創始(founder)病毒的相似性，如其他人所述)；(b)Del139-152(缺失可變環以減少誘導針對該環的抗體的幾率)；以及(c)V295N(引入存在於大多數HIV毒株中的聚糖位點)]具有本發明的以下穩定突變：N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588E。此變體(穩定的ConC_SOSIP.v3Env(HIV170654，ConC_SOSIP.v3))的完整序列在SEQ ID NO：28中提供。
在另一變體中，向此構建體添加K658V突變(也參見以下的實例15)，這進一步改進了結果。
實例8：展示穩定的HIV Env蛋白的自組裝粒子
製備鐵蛋白和DPS自組裝粒子，其以與(He等人，2016)中所述相似的方式展示穩定的Env蛋白。為了做到這一點，gp140蛋白藉由短胺基酸接頭(例如GSG或AAAGS，但也可以使用其他接頭，參見例如He等人，2016)在DNA水平融合到粒子的N端並在Expi293F細胞中表現該融合蛋白。以這種方式製備的粒子的一個實例係基於如下的鐵蛋白，所述鐵蛋白與具有以下突變：I535N、A558P、D589V、K655I的ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)HIV Env蛋白融合。還製備了帶有具有額外的V570D突變的Env蛋白的鐵蛋白粒子，其已被報導改進三聚化(Kesavardhana等人，2014)，但是觀察到這種突變導致與非中和抗體(17b)的結合強烈增加，這係不希望的。具有這五個突變的Env也與來自幽門螺桿菌和恥垢分枝桿菌的兩種類型的DPS粒子融合(參見例如WO 2011/082087，針對DPS 粒子的製備)。帶有這五個突變和此外引入雙突變I201C-A433C的二硫橋的Env也與鐵蛋白融合。
用PGDM140親和珠粒從無細胞上清液中純化粒子，並使用SEC-MALS(用TSKgel G6000PWCL層析柱)分析該等粒子。SEC-MALS以及Native PAGE(3%-12%)證實形成了具有大約預期尺寸的粒子。
以類似的方式，還製備了展示具有以下突變：(L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q)的組合的ConC_SOSIP序列的HIV Env的鐵蛋白和DPS自組裝奈米粒子。
還製備了另外的脂質體和/或自組裝奈米粒子，其展示此處所述的其他HIV Env變體，例如具有SEQ ID NO：20、22、24、26、27、28、29、30、31或32的HIV Env。
實例9：基於進化枝A包膜蛋白序列的重組HIV包膜蛋白變體
如實例2所述將根據本發明的實施方式的包含單胺基酸取代(I535N、D589V、N651F、K655I、I573F、A204I或E647F)的重組HIV Env蛋白引入具有SOSIP修飾(命名為‘BG505_SOSIP’)的野生型進化枝HIV包膜蛋白中。HIV包膜蛋白BG505_SOSIP具有所謂的SOSIP突變(殘基501和605處的Cys以及殘基559處的Pro)，連同導致引入二硫(DS)鍵的殘基201和433處的另外的Cys，以及位置332上潛在的N-糖基化位點(T332N突變)。蛋白在位置664處被截短。BG505_SOSIP的序列示於SEQ ID NO：21中。
如實例3所述，藉由AlphaLISA測定來測量三聚體形成百分比和三聚體產量。將針對所測試的每種變體的三聚體形成百分比和三聚體產量與BG505_SOSIP進行比較。與骨架序列相比，針對M535N、D589V、N651F或K655I取代觀察到更高的三聚體形成百分比(例如圖8A)。例如L556P、K655I和M535N 的組合顯示出甚至增加更多的三聚體產量和百分比(例如圖8A和8B)。N651F和D589V的組合甚至更多地改進了三聚體產量和百分比(數據未顯示)。本實例對於進化枝A病毒的結果與下面實例10和11(進化枝C)和實例5(進化枝B)的結果一致，其中突變I535N、D589V、N651F和K655I還顯示出對衍生自野生型毒株的包膜蛋白的穩定作用，例如改進三聚體形成百分比和/或改進三聚體產量。顯然，本發明的該等突變也改進了衍生自野生型進化枝A毒株的HIV Env的三聚化。
此時，特別較佳的突變體(在BG505_SOSIP骨架中測試的，基於表現水平、三聚體形成和與廣泛中和抗體的結合的有利性質的組合)係具有以下突變的突變體：L556P、K655I、M535N、N651F、D589V(參見例如圖9，顯示了在SEC-MALS分析中這種突變體的三聚體形成的強烈改進，以及圖13，顯示了這種突變體的明顯改進的與廣泛中和抗體的結合)。這種穩定的BG505_SOSIP Env(HIV170863)的序列示於SEQ ID NO：22中。
添加突變Q658V提供了小的進一步改進。
進一步較佳的構建體含有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V突變，連同‘DS’突變(位置201和433處的Cys，導致二硫鍵的引入)，R588E和Q658V。該變體(BG505_SOSIP.v2Env，HIV171814)的序列在SEQ ID NO：29中提供。
實例10：基於進化枝C野生型包膜蛋白序列的重組HIV包膜蛋白變體
如實例2所述生成和表現根據本發明的實施方式的重組HIV Env蛋白，其包含引入WT C97ZA_SOSIP Env序列(SEQ ID NO：23)中的單胺基酸取代T651F，雙胺基酸取代T651F、M535N，以及額外取代L556P (C97ZA_SOSIP_L556P)。如實例3所述藉由AlphaLISA測定來測量三聚體產量和三聚體形成百分比。
結果示於圖10A和B。C97ZA_SOSIP_L556P_T651F_M535N的三聚體產量比C97ZA_SOSIP骨架的高五倍。
因此，L556P、T651F和M535N取代給出了C97ZA_SOSIP的大大改進，但是針對這種進化枝C野生型衍生變體的與bNAb的結合和三聚體百分比仍然遠低於針對ConC_SOSIP骨架的。由於wt Env可以適應於其宿主(可能降低其一般適合性)，並且從而折疊可能被破壞，根據下面在實例12和圖12中描述的概念框架Env序列被‘修復’。總共21個殘基被改變以修復序列，並且添加了三個潛在的N-糖基化位點(PNGS)以填充所謂的“聚糖孔”(在至少50%的野生型HIV毒株Env蛋白中存在潛在的N-糖基化位點的位置)。針對C97ZA_SOSIP，藉由遵循此框架引入的突變在表3‘修復突變’欄中示出。此處揭露的穩定突變K655I的添加與D589V，A204I和K588E一樣增加了三聚體百分比和產量。
該等結果證明，當引入C97ZA_SOSIP(衍生自進化枝C野生型毒株Env蛋白)及其變體中時，此處所述的T651F、M535N和K655I、D589V、A204I和K588E突變也對包膜蛋白具有穩定作用，例如，改進三聚體產量，改進三聚體形成百分比。
此時，基於表現水平、三聚體形成和與廣泛中和抗體的結合的有利性質的組合，特別較佳的變體(在C97ZA_SOSIP骨架中測試的)係具有以下突變的變體：Q567K(以前由其他人描述)；A198T、S243N、K236T、V295N(以填充聚糖孔)；M34L、T46K、T58A、Q171K、G172V、P179L、L183Q、I192R、N209T、M307I、Q350R、N352H、Y353F、D412N、G429E、V455T、I489V、L491I、G500K、S547G、T578A、T651N(以修復該序列)；V505N、E507T、T663N(在分子底部添加的潛在N-糖基化位點)；和A204I、M535N、L556P、 K588E、D589V、T651F、K655I(本發明的穩定突變)。針對此變體的數據例如在圖13中示出(具體參見其中的‘穩定的和經修復的C97ZA’)，與原始wt C97ZA Env分子相比，顯示廣泛中和抗體結合的巨大增加。此變體(穩定的和經修復的C97ZA_SOSIP Env(HIV170690))的序列在SEQ ID NO：24中提供。
添加突變K658V甚至進一步穩定了此蛋白。
另外的較佳的變體包括‘DS’突變和K658V，並且此變體(C97ZA_SOSIP.v2Env，HIV171810)的序列在SEQ ID NO：30中提供。
實例11：基於另一個進化枝C野生型包膜蛋白序列的重組HIV包膜蛋白變體
在來自進化枝C毒株Du422的Env蛋白中引入SOSIP突變，並藉由K295N和D386N突變在位置295和位置386處填充兩個聚糖孔。此外，根據實例12和圖12(V272I、W456R、G466E和F643Y)中描述的概念框架修復了一些殘基，並引入了穩定取代L556P、I535N、N651F和D589V。所有額外的取代導致更高的三聚體產量和三聚體百分比(例如圖11)。
在具有這四種穩定突變(SEQ ID NO：25)的特定測試變體中，額外的K655I取代進一步將三聚體產量和三聚體百分比分別增加了1.3和1.4倍(數據未顯示)。
此時，基於表現水平、三聚體形成和與廣泛中和抗體的結合的有利性質的組合，特別較佳的Du422_SOSIP Env變體係具有以下突變的變體：L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E、I201C、A433C、V272I、W456R、G466E、F643Y、D386N、和K295N。此變體(穩定的和經修復的Du422_SOSIP Env(HIV170859))的序列在SEQ ID NO：26中提供。針對此變體的數據例如在圖13中示出(參見其中的穩定的和經修復的Du422)，與原始wt Du422 Env分子相比，顯示廣泛中和抗體結合的巨大增加。
另外的較佳的變體此外包含‘DS’突變和K658V，並且此變體(Du422_SOSIP.v1 Env，HIV171812)的序列在SEQ ID NO：31中提供。
實例12：修復和穩定不同HIV-1 Env序列
由於從被感染患者分離的病毒的wt序列可能具有阻礙正確折疊的獲得性不穩定突變，因此首先修復了進化枝C C97ZA、DU422和鑲嵌sC4的wt Env序列。
為了在野生型序列中搜索非最佳突變，在UniProt資料庫和洛斯阿拉莫斯HIV資料庫(約90.000個序列)中比對所有HIV-1 Env序列，並計算每種胺基酸的胺基酸分佈。通常，根據圖12中描述的概念框架，將wt Env序列中的多個相對較少存在的胺基酸取代為更常見的胺基酸(基於資料庫中對應位置處的頻率)。
此外，引入C97ZA_SOSIP的頂點處的兩個額外的取代Y353F和Q171K可改進頂點靶向抗體的結合，並且藉由D411N、K236T和V295N的取代引入了額外多聚糖位點，因為該等潛在的N-糖基化位點(PNGS)>50%係保守的。接下來，將前述實例中描述的穩定取代轉移到經修復的序列。
穩定的ConC_SOSIP含有取代A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F和K655I(穩定的ConC_SOSIP)。穩定的ConC_SOSIP的完整序列在SEQ ID NO：20中提供。
表3中提供了一些變體Env蛋白及其突變的概述。
表3.此處描述的幾種HIV Env蛋白變體。‘來自文獻的突變’欄描述了在該等構建體中使用並且以前由其他人描述的突變。‘添加的PNGS’欄描述了添加潛在的N-糖基化位點(在許多野生型Env蛋白包含這樣的位點的位置)的突變。‘前導序列’列描述了如果不是原始(天然)前導序列則使用哪個前導序列用於表現。‘修復突變’欄描述了如實例12和圖12所述的改進一些野生型Env蛋白的折疊和穩定性(作為三聚體產量和百分比測量，基於與bNAb的結合)的突變。‘穩定突變’欄描述了如此處所揭露的本發明的穩定該蛋白並改進三聚化的突變。‘另外的突變’欄描述了針對一些構建體制定的額外突變。‘端’欄描述了最後一個胺基酸的位置(整個表中的編號係相對於HXB2 Env序列)。
針對與幾種指向頂點的三聚體特異性廣泛中和抗體的結合測試了用野生型(wt)經修復的和穩定的Env變體暫態轉染的細胞的上清液。用AlphaLISA(圖13)和SEC-MALS(圖14)測定，修復取代並且尤其是穩定取代對三聚體含量具有顯著的影響(圖13和14)。
經修復和穩定的DS_sC4Env蛋白(經修復的和穩定的DS_sC4_SOSIP Env(HIV170686))的較佳的變體的序列在SEQ ID NO：27中提供。
其另一種較佳的變體在SEQ ID NO：32中提供(經修復的和穩定的sC4_SOSIP.v4 Env)。
實例13：在不存在SOSIP突變的情況下本發明的穩定突變起作用
如前述實例所示，7個突變(A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F和K655I)改進了ConC_SOSIP中的三聚體產量和百分比(導致‘ConC_base’或‘穩定的ConC_SOSIP’或‘ConC_SOSIP 7mut’)(例如圖13和15)
本實例證明不同的SOSIP突變(即‘SOS’突變：在位置501和605處由Cys殘基進行的2個取代；和‘IP突變’：在位置559處由Pro殘基進行的取代)有助於進一步穩定，但是對於從本發明的突變獲得益處而言不是必需的。
顯示了7個突變也改進不包含穩定的I559P突變(‘IP’突變)的所謂的ConC_SOS中的三聚體產量，如圖15所示(比較ConC_SOS與ConC_SOS,7mut)。因此，‘IP’突變對於從此處所述的突變獲得益處不是必需的。添加I559P突變導致大的增加，顯示除了本發明的7個突變之外，‘IP’突變在此構建體中是有益的。穩定IP突變(I559P)也可以被A558P或L556P替換，這兩者也都導致比缺少I559P突變的變體大大增加。
另外，含有本發明的上述的7個突變但缺少‘SOS’突變的ConC_IP,7mut仍然顯示出非常高的三聚體產量，證明‘SOS’突變對於從此處所述的突變獲得益處也不是必需的(例如比較ConC_SOSIP與ConC_IP,7 mut)，符合實例7中的觀察。添加‘SOS’突變進一步增加了三聚體產量。
因此，儘管含有此處所述的穩定突變的Env三聚體可受益於SOSIP突變帶來的進一步穩定，但是3種SOSIP突變對於從此處所述的穩定突變獲得益處(例如改進的三聚體產量)而言都不是必需的。
實例14：位置647、651或655處的甲硫胺酸取代改進三聚體質量
又及實例2中所述的突變，在ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)骨架中位置589、647、651和655被Met殘基分別取代，並使用如上所述的方法測試三聚化百分比和產量。顯示了如實例2所述的突變，位置647、651或655處的Met改進了三聚體的質量(更高的三聚體百分比和產量，增加的bNAb結合)，如可以在圖16中看到的。
因此，除了在位置651處由Phe、Ala或Trp進行的取代之外，在位置651處由Met進行的取代還改進三聚體形成；除了在位置655處由Phe、Ile或Trp進行的取代之外，在位置655處由Met進行的取代還改進三聚體形成；並且除了在位置647處由Phe或Ile進行的取代之外，在位置647處由Met進行的取代還改進三聚體形成。
實例15：在位置658處具有三聚體穩定突變的HIV Env蛋白。
製備在ConC_SOSIP(SEQ ID NO：3)骨架中在位置658(根據HIV-1分離株HXB2的gp160進行編號)處具有取代突變的重組HIV Env蛋白。K658突變為Val、Ile、Phe、Leu、Met或Ala。此外，製備了一些雙突變體，其中該等突變與上述穩定突變之一K655I組合。如實例3所述，藉由AlphaLISA測定來確定三聚體形成百分比。
結果示於圖17A和B(三聚體百分比，在不同實驗中測量，因此是兩個圖)以及圖17C和D(三聚體產量，在不同的實驗中測量，因此是兩個圖)。該等結果證明，在位置658處由Ile、Phe、Met、Leu、Ala或Val進行的取代導致三聚體形成百分比的改進和三聚體產量的改進。在位置658處Ile進行的取代導致與K655I突變大致相同的範圍的增加(圖17A、C)，K655I突變係上述表1中的突變(i)-(vii)中表現最好的單突變體(參見例如圖2A)。在658位置處Val進行的取代導致甚至更高的改進(圖17A、C)。
結果還證明，在位置658處Ile或Val進行的取代可以與上述突變K655I組合，並且這導致超過每種對應的單突變體的進一步改進(圖17A、C)。
也使用SEC-MALS測試K658V突變體。使96孔培養物生長三天，如對於AlphaLISA所做的那樣。將上清液直接載入在SEC-MALS柱上。從具有Env蛋白的上清液的層析圖中減去針對模擬上清液(具有弗林蛋白酶表現)獲得的層析圖。在7至8分鐘之間從柱中洗提三聚蛋白。結果在圖18中顯示，並證實K658V突變體顯示超過背景Env蛋白以及超過K655I突變體Env蛋白的改進的三聚化。
本實例證明，在HIV Env蛋白中位置658處由Val、Ile、Phe、Met、Leu或Ala進行的胺基酸取代導致改進的三聚體百分比和三聚體產量。
在其中K658V突變與來自此處所述的表1和/或2的其他突變組合存在的HIV Env變體中以及來自進化枝A和B的HIV毒株中，使用AlphaLISA和/或SEC-MALS進行測量變體的三聚體形成的另外的實驗。例如，已經顯示658V突變改進了如上所述的ConC_SOSIP,7mut(實例7)，以及具有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E的BG505_SOSIP(實例9)以及經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP(實例10)。
基於上述結果，預期了在不同背景HIV Env蛋白中，位置658處的胺基酸突變成纈胺酸、異亮胺酸、苯丙胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸或丙胺酸(較佳的是纈胺酸)殘基將改進三聚體形成和/或三聚體產量。
實例16.用穩定的HIV Env蛋白進行免疫
用可溶性Env蛋白和與脂質體偶聯的Env蛋白進行兔免疫研究。用穩定的ConC_SOSIP.v3(SEQ ID NO：28)進行引發，並且隨後進行四次加強，各用另一種蛋白，即1)經修復的和穩定的sC4_SOSIP.v4(SEQ ID NO：32)；2) 經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP.v2(SEQ ID NO：30)；3)經修復的和穩定的Du422_SOSIP.v1(SEQ ID NO：31)；和4)穩定的BG505_SOSIP.v2(SEQ ID NO：29)。
在連續免疫後分離血清，並針對特異性結合穩定的封閉的融合前構象的Env的誘導抗體(使用ELISA)以及針對誘導bNAb(使用病毒中和測定)進行分析。
上述實例證明，本發明提供了提供了一種通用的方法來優化融合前閉合HIV包膜三聚體蛋白的折疊和穩定性。
應當理解，此處描述的實例和實施方式僅用於說明的目的，並且可以在不脫離其廣泛的發明構思的情況下對上述實施方式進行改變。因此，應當理解，本發明不限於所揭露的具體實施方式，而是旨在覆蓋由所附申請專利範圍限定的本發明的精神和範圍內的修改。
【序列表】
SEQ ID NO：1 HIV-1分離株HXB2的gp160(信號序列為斜體；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0092-9
SEQ ID NO：2HIV Env共有進化枝C(僅共有序列，不包括任何信號序列、跨膜結構域(664係最後一個胺基酸)、SOSIP突變和/或弗林蛋白酶切割位點突變；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0092-10
SEQ ID NO：3 ConC_SOSIP(具有SOSIP突變和弗林蛋白酶切割位點(斜體)和C端截短的成熟進化枝C共有序列；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0093-11
SEQ ID NO：4 HIV Env共有進化枝B(僅共有序列，不包括任何信號序列、跨膜結構域(664係最後一個胺基酸)、SOSIP突變和/或弗林蛋白酶切割位點突變；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0093-12
SEQ ID NO：5 ConB_SOSIP(具有SOSIP突變和弗林蛋白酶切割位點(斜體)和C端截短的成熟進化枝B共有序列；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0093-13
Figure 106131855-A0202-12-0094-14
SEQ ID NO：6合成HIV包膜蛋白Mos2S Env C4片段；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0094-15
SEQ ID NO：7(DS_sC4_SOSIP_E166R序列；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0094-16
SEQ ID NO：8(Mos1.Env，鑲嵌HIV包膜蛋白序列；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0094-17
Figure 106131855-A0202-12-0095-19
SEQ ID NO：9(Mos2.Env，鑲嵌HIV包膜蛋白序列；在針對根據本發明的突變的位置(i)-(vii)處的胺基酸由灰色陰影指示)
Figure 106131855-A0202-12-0095-18
SEQ ID NO：10(弗林蛋白酶切割位點突變體序列)RRRRRR
SEQ ID NO：11(信號序列的實例(例如用於ConC_SOSIP，以及一些野生型衍生的變體))
MRVRGILRNWQQWWIWGILGFWMLMICNVVG(注解：最後的VG可以是成熟蛋白的開始或信號序列的結束)
SEQ ID NO：12(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)NPDWLPDM
SEQ ID NO：13(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)GSGSGSGS
SEQ ID NO：14(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)DDVHPDWD
SEQ ID NO：15(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)RDTFALMM
SEQ ID NO：16(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)DEEKVMDF
SEQ ID NO：17(可替換HR1環的8胺基酸序列之實例)DEDPHWDP
SEQ ID NO：18(信號序列的實例(例如用於ConB_SOSIP)MRVKGIRKNYQHLWRWGTMLLGMLMICSA
SEQ ID NO：19(在AlphaLISA測定中用於HIV gp140構建體的標籤)
Figure 106131855-A0202-12-0096-27
SEQ ID NO：20(穩定的ConC_SOSIP，‘ConC_SOSIP_7mut’(HIV160544))
Figure 106131855-A0202-12-0096-20
SEQ ID NO：21(BG505_SOSIP Env蛋白(HIV150673))
Figure 106131855-A0202-12-0096-21
SEQ ID NO：22(穩定的BG505_SOSIP Env蛋白(HIV170863))
Figure 106131855-A0202-12-0097-22
SEQ ID NO：23(具有L535M和Q567K的wt C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV150673))
Figure 106131855-A0202-12-0097-23
SEQ ID NO：24(經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV170690))
Figure 106131855-A0202-12-0097-25
SEQ ID NO：25(經修復的和穩定的Du422構建體的變體(HIV161818))
Figure 106131855-A0202-12-0098-28
SEQ ID NO：26(經修復的和穩定的Du422_SOSIP(HIV170859))
Figure 106131855-A0202-12-0098-29
SEQ ID NO：27(經修復的和穩定的DS_sC4_SOSIP(HIV170686))
Figure 106131855-A0202-12-0098-30
SEQ ID NO：28(穩定的ConC_SOSIP.v3(HIV170654))
Figure 106131855-A0202-12-0098-31
Figure 106131855-A0202-12-0099-36
SEQ ID NO：29(穩定的BG505_SOSIP.v2(HIV171814))
Figure 106131855-A0202-12-0099-37
SEQ ID NO：30(經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP.v2(HIV171810))
Figure 106131855-A0202-12-0099-34
SEQ ID NO：31(經修復的和穩定的Du422_SOSIP.v1 (HIV171812))
Figure 106131855-A0202-12-0099-33
Figure 106131855-A0202-12-0100-38
SEQ ID NO：32(穩定的和經修復的sC4_SOSIP.v4)
Figure 106131855-A0202-12-0100-39
SEQ ID NO：33(信號序列之實例(例如用於DS_sC4_SOSIP變體)MRVRGMLRNWQQWWIWSSLGFWMLMIYSV
SEQ ID NO：34(信號序列之實例(例如用於BG505_SOSIP變體)MRVMGIQRNCQHLFRWGTMILGMIIICSA
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Figure 106131855-A0305-02-0105-1
Figure 106131855-A0202-12-0104-49
Figure 106131855-A0202-12-0105-48
Figure 106131855-A0202-12-0106-47
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Figure 106131855-A0202-12-0107-46
Figure 106131855-A0202-12-0108-50
Figure 106131855-A0202-12-0109-51
Figure 106131855-A0202-12-0110-52
<210> 3
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ConC_SOSIP序列
<400> 3
Figure 106131855-A0202-12-0110-53
Figure 106131855-A0202-12-0111-54
Figure 106131855-A0202-12-0112-55
Figure 106131855-A0202-12-0113-56
<210> 4
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV Env共有進化枝B序列
<400> 4
Figure 106131855-A0202-12-0113-57
Figure 106131855-A0202-12-0114-58
Figure 106131855-A0202-12-0115-59
Figure 106131855-A0202-12-0116-60
<210> 5
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ConB_SOSIP序列
<400> 5
Figure 106131855-A0202-12-0116-61
Figure 106131855-A0202-12-0117-62
Figure 106131855-A0202-12-0118-63
Figure 106131855-A0202-12-0119-64
<210> 6
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成HIV包膜蛋白Mos2S Env C4片段
<400> 6
Figure 106131855-A0202-12-0119-65
Figure 106131855-A0202-12-0120-66
Figure 106131855-A0202-12-0121-67
Figure 106131855-A0202-12-0122-68
<210> 7
<211> 627
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DS_sC4_SOSIP_E166R序列
<400> 7
Figure 106131855-A0202-12-0122-69
Figure 106131855-A0202-12-0123-70
Figure 106131855-A0202-12-0124-71
Figure 106131855-A0202-12-0125-72
<210> 8
<211> 631
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mos1.Env序列
<400> 8
Figure 106131855-A0202-12-0125-73
Figure 106131855-A0202-12-0126-74
Figure 106131855-A0202-12-0127-75
Figure 106131855-A0202-12-0128-76
<210> 9
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mos2.Env序列
<400> 9
Figure 106131855-A0202-12-0128-77
Figure 106131855-A0202-12-0129-78
Figure 106131855-A0202-12-0130-79
Figure 106131855-A0202-12-0131-80
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點突變體序列
<400> 10
Figure 106131855-A0202-12-0131-81
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 11
Figure 106131855-A0202-12-0131-82
Figure 106131855-A0202-12-0132-86
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 12
Figure 106131855-A0202-12-0132-85
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 13
Figure 106131855-A0202-12-0132-84
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 14
Figure 106131855-A0202-12-0132-83
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 15
Figure 106131855-A0202-12-0133-87
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 16
Figure 106131855-A0202-12-0133-88
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替換HR1環的8胺基酸序列的實例
<400> 17
Figure 106131855-A0202-12-0133-89
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 18
Figure 106131855-A0202-12-0133-90
<210> 19
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 標籤序列
<400> 19
Figure 106131855-A0202-12-0134-92
<210> 20
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定的ConC_SOSIP Env蛋白(HIV160544)
<400> 20
Figure 106131855-A0202-12-0134-91
Figure 106131855-A0202-12-0135-93
Figure 106131855-A0202-12-0136-94
Figure 106131855-A0202-12-0137-95
<210> 21
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BG505_SOSIP Env蛋白(HIV150673)
<400> 21
Figure 106131855-A0202-12-0137-96
Figure 106131855-A0202-12-0138-97
Figure 106131855-A0202-12-0139-98
Figure 106131855-A0202-12-0140-99
<210> 22
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定的BG505_SOSIP Env蛋白(HIV170863)
<400> 22
Figure 106131855-A0202-12-0140-100
Figure 106131855-A0202-12-0141-101
Figure 106131855-A0202-12-0142-102
Figure 106131855-A0202-12-0143-103
<210> 23
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L535M和Q567K的wt C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV150673)
<400> 23
Figure 106131855-A0202-12-0143-104
Figure 106131855-A0202-12-0144-105
Figure 106131855-A0202-12-0145-106
Figure 106131855-A0202-12-0146-107
<210> 24
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV170690)
<400> 24
Figure 106131855-A0202-12-0146-108
Figure 106131855-A0202-12-0147-109
Figure 106131855-A0202-12-0148-110
Figure 106131855-A0202-12-0149-111
<210> 25
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的Du422構建體的變體(HIV161818)
<400> 25
Figure 106131855-A0202-12-0149-112
Figure 106131855-A0202-12-0150-113
Figure 106131855-A0202-12-0151-114
Figure 106131855-A0202-12-0152-115
<210> 26
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的Du422_SOSIP Env蛋白(HIV170859)
<400> 26
Figure 106131855-A0202-12-0152-116
Figure 106131855-A0202-12-0153-117
Figure 106131855-A0202-12-0154-118
Figure 106131855-A0202-12-0155-119
<210> 27
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的DS_sC4_SOSIP Env蛋白(HIV170686)
<400> 27
Figure 106131855-A0202-12-0155-120
Figure 106131855-A0202-12-0156-121
Figure 106131855-A0202-12-0157-122
Figure 106131855-A0202-12-0158-123
<210> 28
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定的ConC_SOSIP.v3 Env蛋白(HIV170654)
<400> 28
Figure 106131855-A0202-12-0158-124
Figure 106131855-A0202-12-0159-125
Figure 106131855-A0202-12-0160-126
Figure 106131855-A0202-12-0161-127
<210> 29
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定的BG505_SOSIP.v2 Env蛋白(HIV171814)
<400> 29
Figure 106131855-A0202-12-0161-128
Figure 106131855-A0202-12-0162-129
Figure 106131855-A0202-12-0163-130
Figure 106131855-A0202-12-0164-131
<210> 30
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的C97ZA_SOSIP.v2 Env蛋白(HIV171810)
<400> 30
Figure 106131855-A0202-12-0164-132
Figure 106131855-A0202-12-0165-133
Figure 106131855-A0202-12-0166-134
Figure 106131855-A0202-12-0167-135
<210> 31
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修復的和穩定的Du422_SOSIP.v1 Env蛋白(HIV171812)
<400> 31
Figure 106131855-A0202-12-0167-136
Figure 106131855-A0202-12-0168-137
Figure 106131855-A0202-12-0169-138
Figure 106131855-A0202-12-0170-139
<210> 32
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定的和經修復的sC4_SOSIP.v4 Env蛋白
<400> 32
Figure 106131855-A0202-12-0170-140
Figure 106131855-A0202-12-0171-141
Figure 106131855-A0202-12-0172-142
Figure 106131855-A0202-12-0173-143
<210> 33
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 33
Figure 106131855-A0202-12-0173-144
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 34
Figure 106131855-A0202-12-0173-145

Claims (24)

  1. 一種重組人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白，其包含以下胺基酸殘基中的兩個或更多個：(i)位置651處為Phe、Leu、Met或Trp；(ii)位置655處為Phe、Ile、Met或Trp；(iii)位置535處為Asn或Gln；(iv)位置589處為Val、Ile或Ala；(v)位置573處為Phe或Trp；(vi)位置204處為Ile；和/或(vii)位置647處為Phe、Met或Ile，其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
  2. 一種重組HIV Env蛋白，其包含以下胺基酸殘基中的一個或多個：(i)位置651處為Phe、Leu、Met或Trp；(ii)位置655處為Phe、Ile、Met或Trp；(iii)位置535處為Asn或Gln；(iv)位置589處為Val、Ile或Ala；(v)位置573處為Phe或Trp；(vi)位置204處為Ile；和/或(vii)位置647處為Phe、Met或Ile，其中該HIV Env蛋白選自由以下組成之群組：(1)HIV Env蛋白質，其包含SEQ ID NO：2、3、4或5之共有序列；(2)合成HIV Env蛋白；以及 (3)親本HIV Env蛋白，包含在胺基酸殘基之至少1個修復突變，該胺基酸殘基位於在至少1000個的野生型HIV Env序列集合中，頻率少於7.5%的對應位置；其中該修復突變為胺基酸殘基取代，該胺基酸殘基位於該集合中HIV Env序列之至少10%頻率的對應位置；且其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
  3. 一種重組HIV Env蛋白，其包含以下胺基酸殘基中的一個或多個：(i)位置651處為Phe、Leu、Met或Trp；(ii)位置655處為Phe、Ile、Met或Trp；(iii)位置535處為Asn或Gln；(iv)位置589處為Val、Ile或Ala；(v)位置573處為Phe或Trp；(vi)位置204處為Ile；和/或(vii)位置647處為Phe、Met或Ile，其中該HIV Env蛋白係包含以下中至少一個的HIV Env蛋白：(a)位置501和605處為Cys；(b)位置559處為Pro；(c)位置501和605處為Cys和位置559處為Pro；以及該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
  4. 如請求項2或3之重組HIV Env蛋白，其包含(i)至(vii)中所指示的胺基酸殘基中的兩個或更多個。
  5. 如請求項1或2之重組HIV Env蛋白，其包含位置501和605處為Cys或位置559處為Pro。
  6. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其包含(i)至(vii)中所指示的胺基酸殘基中的三個或更多個。
  7. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其包含(i)至(vii)中所指示的胺基酸殘基中的四個或更多個。
  8. 如請求項1至3中任一項之重組HIv Env蛋白，其包含位置651處為Phe、位置655處為Ile、位置535處為Asn和位置589處為Val。
  9. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其包含(i)至(vii)中所指示的胺基酸殘基中的五個或更多個。
  10. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其進一步包含以下中的一個或多個：(viii)位置588處為Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe；(ix)位置64處為Lys或位置66處為Arg或位置64處為Lys和位置66處為Arg；(x)位置316處為Trp；(xi)位置201和433兩處為Cys；(xii)位置556或558處或位置556和558兩處為Pro；(xiii)由具有7-10個胺基酸的環替換胺基酸位置548-568處的環(HR1環)； (xiv)位置568處為Gly、或位置569處為Gly、或位置636處為Gly、或位置568和636兩處為Gly、或位置569和636兩處為Gly；和/或(xv)位置302處為Tyr、或位置519處為Arg、或位置520處為Arg、或位置302處為Tyr和位置519處為Arg、或位置302處為Tyr和位置520處為Arg、或位置302處為Tyr以及位置519和520兩處為Arg。
  11. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其進一步包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突變。
  12. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其包含與SEQ ID NO：3、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一者至少95%一致的胺基酸序列。
  13. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其進一步包含：(xvi)位置658處的選自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的胺基酸殘基。
  14. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其係gp140或gp160蛋白。
  15. 如請求項1至3中任一項之重組HIV Env蛋白，其來自進化枝C或進化枝A。
  16. 一種三聚體複合物，其包含如請求項1至15中任一項之重組HIV Env蛋白中的三種的非共價低聚物。
  17. 一種粒子，在其表面上展示如請求項1至15中任一項之重組HIV Env蛋白或如請求項16之三聚體複合物。
  18. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至15中任一項之重組HIV Env蛋白。
  19. 一種載體，其包含與啟動子可操作地連接的如請求項18之分離的核酸分子。
  20. 如請求項19之載體，其係腺病毒載體。
  21. 一種宿主細胞，其包含如請求項18之分離的核酸分子或如請求項19或20之載體。
  22. 一種生產重組HIV Env蛋白之方法，其包括使如請求項21之宿主細胞生長在適於產生該重組HIV Env蛋白的條件下。
  23. 一種組成物，其包含如請求項1至15中任一項之重組HIV Env蛋白、如請求項16之三聚體複合物、如請求項17之粒子、如請求項18之分離的核酸分子或如請求項19或20之載體以及藥學上可接受的載劑。
  24. 一種改進HIV Env蛋白的三聚體形成之方法，該方法包括取代親本HIV Env蛋白中的一個或多個胺基酸殘基，其中該一個或多個取代導致以下胺基酸中的一個或多個：(i)位置651處為Phe、Leu、Met或Trp；(ii)位置655處為Phe、Ile、Met或Trp；(iii)位置535處為Asn或Gln；(iv)位置589處為Val、Ile或Ala；(v)位置573處為Phe或Trp；(vi)位置204處為Ile；和/或 (vii)位置647處為Phe、Met或Ile，其中該等位置的編號係根據HIV-1分離株HXB2的gp160中的編號。
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