CN110184298B - Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法 - Google Patents

Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110184298B
CN110184298B CN201910406942.2A CN201910406942A CN110184298B CN 110184298 B CN110184298 B CN 110184298B CN 201910406942 A CN201910406942 A CN 201910406942A CN 110184298 B CN110184298 B CN 110184298B
Authority
CN
China
Prior art keywords
surface glycoprotein
hiv
hiv mutant
thr
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910406942.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110184298A (zh
Inventor
彭贵青
王健斌
龚贻洲
周军
许俊峰
李强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Jinghong Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Jinghong Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Jinghong Technology Co ltd filed Critical Wuhan Jinghong Technology Co ltd
Priority to CN201910406942.2A priority Critical patent/CN110184298B/zh
Publication of CN110184298A publication Critical patent/CN110184298A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110184298B publication Critical patent/CN110184298B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供了HIV突变型表面糖蛋白、HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原及其制备方法。所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸；所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原；本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120蛋白进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。

Description

HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
技术领域
本发明涉及抗原制备技术领域，尤其涉及HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法。
背景技术
人类免疫缺陷综合征(AIDS)于1981年第一次在美国被确诊。自从造成AIDS的病原-人类免疫缺陷病毒(HIV)于1983年被正式确认，HIV已经在全球造成了至少6000万的感染者，其中至少2500万的感染者因病死亡。尽管从2000年以来感染HIV人数的比例总体趋于稳定，但是全球感染的总人数仍然在逐年增长。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的出现和使用大大减少了新发病例的出现，并且极大的延长了感染者的存活时间，使得人们似乎看到了根除治疗HIV的前景。但是到目前为止，仍然缺少可靠有效的根除HIV的药物以及预防其传播感染的疫苗。同时，欠发达地区还有较高的流行率和新发病例比例，加上当地医疗卫生条件的欠缺、关注度的匮乏，使得AIDS仍然是人类所面临的一个非常严峻的公共卫生问题。因此，诊断发现并知晓自身感染状况是一种公认的易于实施的防控策略，研发出一种效果好、价格合理的自检测试纸条将为我国艾滋病的防控做出巨大贡献，同时也具有广阔的市场前景。
HIV表面的糖蛋白Env三聚体由三个非共价连接的gp120和gp41三聚体组成，它们来自于gp160前体蛋白。Env蛋白通常在gp41的跨膜结构域之前被截断，从而产生可溶性Env免疫原。然而，未经修饰的gp120蛋白是不稳定的，不能有效地体外表达和纯化Env三聚体。目前，针对HIV-1的保护性疫苗应该能够诱导广泛中和抗体(bNAbs)，以防止HIV-1的入侵。目前，从HIV-1感染个体中分离出许多bnab，它们以HIV-1包膜糖蛋白(Env)三聚体为靶点，能够中和不同亚型的病毒，这为诱导此类抗体提供了证据。然而，与自然感染相比，目前还没有任何基于免疫球蛋白的疫苗能够诱导bNAbs，原因之一可能是这些疫苗不能再现天然的Env三聚体。
因此，如何稳定HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原，本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一，在于提供一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。其中，HIV-1野生型表面糖蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的目的之二，在于提供所述的杆状病毒的用途，即用于生产一种构象稳定的HIV突变型表面糖蛋白。
本发明的目的之三，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白，所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。
所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之四，在于提供一种DNA分子，它编码所述的HIV突变型表面糖蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之五，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、用所述的表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，在27±3℃培养；
S2、取感染后的P0代病毒液，将杆状病毒从P0代扩增至P3代；
S3、从病毒液中分离纯化获得HIV突变型表面糖蛋白。
本发明的目的之六，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量。
2、将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，成功组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原颗粒，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片表明组装效果好，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。
附图说明
图1为目的基因扩增结果；其中，M代表Marker，WT为未改造前的HIV-1野生型表面糖蛋白编码蛋白；mutant1为HIV突变型表面糖蛋白；Mock为空白对照组；
图2为HIV病毒表面糖蛋白(gp120和gp41)融合前的三聚体构象(PDB number：3J5M)；本发明的HIV突变型表面糖蛋白即是在gp120的氨基酸位点进行半胱氨酸突变；
图3为本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白SDS-PAGE检测结果；
图4为本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白的western-blot检测结果；
图5为HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原检测，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片。
具体实施方式
实施例1 HIV突变型表面糖蛋白的基因扩增和真核表达质粒构建
1、PCR扩增
(1)本实验采用重叠PCR进行扩增目的片段，首先利用引物F1和R2、F3和R4(如表1所示)分别进行目的基因扩增；最后用F1和R4引物扩增。由于引入两个半胱氨酸突变，因此分两次引入突变，最终形成双突变，PCR反应体系都是一样的，根据目的片段长短，其延伸时间分别为1-2min。
表1
(2)每一轮PCR反应的PCR反应体系均为50μL，如表2所示，反应条件为：95℃5min；32个循环，循环反应为：95℃1min，55℃1min，72℃1-3min(视片段长度而定)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用于后续进一步扩增。
表2
2、PCR产物或酶切产物的电泳检测
PCR或酶切反应结束后，将0.8％的琼脂糖凝胶放入装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液没过胶。取PCR或酶切产物5-10μL，加入1/10体积的10×loading buffer，混匀后点入胶孔中，同时加入相应的DNA Marker，120V电压电泳。待溴酚蓝电泳至适当位置后，停止电泳，将胶放入凝胶成像系统下观察拍照。
3、PCR产物或酶切产物的回收
用BioFlux公司的BioSpin Gel Extraction Kit试剂盒回收目的产物，收集管中即为回收的DNA片段。
4、DNA片段与质粒载体的连接反应
将回收的DNA片段与线性化载体pFast-bac1于16℃连接过夜得到连接产物，反应体系如表3所示(15μL)；
表3
5、大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
将-80℃冻存的DH5α菌种采用氯化钙法制成大肠杆菌感受态细胞。
6、连接产物转化DH5α
将所述DNA片段与质粒载体的连接得到的连接产物转化感受态DH5α，涂满整个平板。
7、质粒的提取与鉴定
于超净工作台中，从平板上挑取单菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中，于37℃振荡培养8-10h。用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取质粒；质粒提取完成后，用分光光度计ND-2000 Spectrophotometer测定DNA浓度。同时，将提取的质粒用作酶切鉴定，其体系(10μL)如表4所示。
表4
将体系混匀后，37℃恒温酶切2-3h，电泳检测酶切产物。其经过克隆基因的序列测定和分析比对表明载体构建成功：DNA测序证实了，DNA序列中HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。HIV突变型表面糖蛋白的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。
实施例2昆虫细胞表达系统纯化HIV病毒表面糖蛋白
1、杆粒(Bacmid)转染sf9细胞
转染前1-2h将sf9细胞铺于6孔细胞培养板，待其细胞密度长至80％。取Bacmid(约6-7μg)和6μL转染试剂cellfectinIireagent分别加入100μL昆虫细胞培养基(Sf-900 IISFM)，室温静置5min。将两者混匀，室温静置35min。在6孔细胞培养板每孔加入800μL培养基，再加入杆粒和转染试剂混合物，27℃恒温培养。转染后6h，吸出转染液，加入2mL含1％青霉素-链霉素的培养基，继续于27℃恒温培养。
2、目的蛋白表达与鉴定
转染后3-4d，吸取1mL病毒液置-80℃保存，于6孔细胞培养板中加入1mL Sf-900II SFM培养基继续培养3-4d。最后，将2mL病毒液置-80℃保存，记为P0代毒。同时，P0代毒进行Western blot试验，鉴定目的蛋白表达情况。
3、杆状病毒(P1-P3代)扩增
为大量表达重组蛋白，需要将病毒从P0代扩增至P3代，其扩增方法为：于125mL昆虫细胞培养瓶加入30mL sf9细胞(密度为1.5-2×106cell/mL)和1mL P0代毒，27℃摇床120r/min避光培养约5天至细胞死亡率达到80％以上，2000r/min离心10min收集上清，-80℃保存，记为P1代毒。按同样的细胞密度，于250mL三角瓶内加入100mL细胞和3mL P1代毒，约5天后同样方法收集上清，于-80℃保存，记为P2毒。最后，扩增用于纯化表达的P3代毒，约1L细胞和100mL P2代毒，避光培养约3-4天，进行蛋白表达与纯化。
4、HIV突变型表面糖蛋白大量表达与纯化
收集细胞培养液于500mL集菌瓶，6000r/min离心30min(4℃)。将获得细胞上清进行浓缩，并置换buffer(Tris buffer：20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)。然后，通过采用离子交换色谱法(HiLoad 16/10 Q Sepharose HP column，GE Healthcare)纯化。最后，通过分子筛层析(Superose 6 Increase 10/300 GL column，GE Healthcare)进一步纯化，并置换buffer为PBS(137mM NaCl，3mM KCl，10mM Na2HPO4-12H2O，and 2mM KH2PO4，pH 7.4)。获得单一聚集状态蛋白，5000r/min(4℃)离心，浓缩至10mg/mL，-80℃保存备用。
如图3所示，SDS-PAGE检测结果表明，HIV突变型表面糖蛋白可纯化至90％以上的纯度。
实施例3 HIV突变型表面糖蛋白Western Blot测定其表达量
1、BCA法测定样品总蛋白浓度：BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，用稀释标准品的溶液补到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，用稀释标准品的溶液补到20μL。各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min后测定OD562nm吸光值。得到数据后根据标准曲线计算出蛋白浓度，再计算出需要加的5×loading buffer量；
2、根据计算结果，将中样品加入5×loading buffer，沸水中煮10min后冰上2min，12000rpm离心5min，4℃保存。
3、SDS-PAGE
I、安装夹心式垂直电泳槽，制备12％分离胶，混匀后加入玻璃板中，并在分离胶上加入一层去离子水，置于通风橱中室温放置30min左右，待分离胶完全聚合后，将配置好的5％的浓缩胶加入分离胶之上，插入梳子，于通风橱中室温放置30min左右待胶凝固。
II、将配制好的聚丙烯酰胺凝胶置于垂直电泳槽中，往中间槽及外槽加入适量的1×SDS-PAGE电泳缓冲液，于点样孔中加入适量体积的处理好的蛋白样品和蛋白Marker。
III、插上电极电源线，稳定电压约80V，待样品进入分离胶后，换用120V电压继续电泳，根据目的蛋白的大小，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部合适的位置时停止电泳，准备转膜。
4、Western-blot
I、转膜：SDS-PAGE电泳结束后，根据目的蛋白的分子量，以蛋白Marker为对照进行切胶并裁剪合适大小的滤纸和PVDF膜。将切好的滤纸放入电转缓冲液中，将切好的PVDF膜放入甲醇中浸泡，然后分别放入纯水和电转缓冲液中浸泡。依次在转膜的夹子中放入滤纸、胶、PVDF膜、滤纸(负极到正极)，赶去气泡，夹紧夹子，放入转膜槽中以120V电压转膜，具体转膜时间视目的蛋白大小而定。
II、封闭：转膜完成后，将膜取出置于事先配好的封闭液中，于室温摇床上封闭2h或4℃摇床上封闭过夜。
III、一抗孵育：将膜用TBST涮洗一下，放入含事先稀释好一抗的平皿中，于室温摇床上孵育2.5h或4℃摇床上孵育过夜。
Ⅳ、二抗孵育：将膜用TBST洗3次，每次15min，然后将膜放入含事先稀释好二抗的平皿中，于室温摇床上孵育2h。孵育完后将膜用TBST洗3次，每次15min。
Ⅴ、化学发光显色：将ECL化学发光显色液中的A液和B液按1:1比例混合，然后加适量的显色液到膜上，避光反应1-2min，用化学发光成像系统成像看结果。
如图4所示，Western-blot结果表明此富集纯化的分子量为120kd的蛋白，产量是1L裂解液里面有10mg HIV突变型表面糖蛋白。而HIV野生型表面糖蛋白的表达量为1mg/L，该结果表明了本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，进而提高了其表达量。
实施例4 HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原的制备
HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒。制备步骤如下：
收集细胞培养液于500mL集菌瓶，6000r/min离心30min(4℃)。将获得细胞上清进行浓缩，并置换buffer(Tris buffer：20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)。加铁蛋白混匀，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒。然后，通过采用离子交换色谱法(HiLoad16/10 Q Sepharose HP column，GE Healthcare)纯化铁蛋白纳米粒。最后，HIV突变型表面糖蛋白-铁蛋白通过分子筛层析(Superose 6Increase 10/300 GL column，GEHealthcare)进一步纯化，并置换buffer为PBS(137mM NaCl，3mM KCl，10mM Na2HPO4-12H2O，and 2mM KH2PO4，pH 7.4)。获得单一聚集状态蛋白，5000r/min(4℃)离心，浓缩至10mg/mL，-80℃保存备用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司
<120> HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> HIV突变型表面糖蛋白的编码序列(HIV)
<400> 1
actgtctact acggtgtgcc agtctggaag gacgccgaga ccactctgtt ctgcgctagc 60
gacgctaagg cctacgagac cgaaaagcac aacgtctggg ccacccacgc ttgcgtgcct 120
actgacccaa accctcagga gatccacctg gaaaacgtga ccgaggaatt caacatgtgg 180
aagaacaaca tggtcgagca gatgcacact gacatcatct ccctgtggga ccagagcctg 240
aagccatgcg tcaagctgac ccctctgtgc gtgactctgc agtgcaccaa cgtcactaac 300
aacatcaccg acgacatgcg tggcgagctg aagaactgct ctttcaacat gaccactgaa 360
ctgagggaca agaagcagaa ggtgtactca ctgttctaca gactggacgt ggtccagatc 420
aacgaaaacc agggaaacag gtccaacaac agcaacaagg agtacagact gatcaactgc 480
aacacctccg ccatcactca ggcttgccct aaggtcagct tcgaacccat cccaatccac 540
tactgcgctc ccgccggttt cgctatcctg aagtgcaagg actgcaagtt caacggcacc 600
ggaccttgcc catccgtgag caccgtccag tgcactcacg gaatcaagcc tgtggtctct 660
actcagctgc tgctgaacgg ttcactggcc gaggaagagg tcatgatcag gagcgagaac 720
atcaccaaca acgctaagaa catcctggtc cagttcaaca ctcccgtgca gatcaactgc 780
accagaccaa acaacaacac tcgcaagtct atccgtatcg gacccggtca ggccttctac 840
gctaccggcg acatcatcgg agacatccgc caggcccact gcactgtctc aaaggctacc 900
tggaacgaaa ctctgggaaa ggtggtcaag cagctgcgca agcacttcgg taacaacacc 960
atcatccgtt tcgctaactc cagcggtggc gacctggagg tgaccactca ctccttcaac 1020
tgcggaggtg aattcttcta ctgcaacact tctggcctgt tcaactcaac ctggatctct 1080
aacacttcag tccagggatc taactcaacc ggttccaacg acagcatcac tctgccctgc 1140
aggatcaagc agatcatcaa catgtggcag agaatcggtc aggccatgta cgctcctccc 1200
atccagggcg tcatccgctg cgtgtccaac atcaccggac tgatcctgac tcgtgacggc 1260
ggatctacca actcaacctg cgaaactttc cgcccaggtg gcggagacat gagggacaac 1320
tggagaagcg agctgtacaa gtacaaggtg gtcaagatcg aacctctggg tgtggctcca 1380
actagggcta agaggagggt ggtgggaagg gagaagagg                        1419
<210> 2
<211> 473
<212> PRT
<213> HIV突变型表面糖蛋白(HIV)
<400> 2
Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu Lys His Asn Val
            20                  25                  30
Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile
        35                  40                  45
His Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met
    50                  55                  60
Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu Gln Cys Thr
                85                  90                  95
Asn Val Thr Asn Asn Ile Thr Asp Asp Met Arg Gly Glu Leu Lys Asn
            100                 105                 110
Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys Gln Lys Val
        115                 120                 125
Tyr Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Val Val Gln Ile Asn Glu Asn Gln
    130                 135                 140
Gly Asn Arg Ser Asn Asn Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Cys
145                 150                 155                 160
Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro
                165                 170                 175
Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys
            180                 185                 190
Lys Asp Cys Lys Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Pro Ser Val Ser Thr
        195                 200                 205
Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu
    210                 215                 220
Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Asn Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Gln Phe Asn Thr Pro Val
                245                 250                 255
Gln Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg
            260                 265                 270
Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp
        275                 280                 285
Ile Arg Gln Ala His Cys Thr Val Ser Lys Ala Thr Trp Asn Glu Thr
    290                 295                 300
Leu Gly Lys Val Val Lys Gln Leu Arg Lys His Phe Gly Asn Asn Thr
305                 310                 315                 320
Ile Ile Arg Phe Ala Asn Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Val Thr Thr
                325                 330                 335
His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly
            340                 345                 350
Leu Phe Asn Ser Thr Trp Ile Ser Asn Thr Ser Val Gln Gly Ser Asn
        355                 360                 365
Ser Thr Gly Ser Asn Asp Ser Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln
    370                 375                 380
Ile Ile Asn Met Trp Gln Arg Ile Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro
385                 390                 395                 400
Ile Gln Gly Val Ile Arg Cys Val Ser Asn Ile Thr Gly Leu Ile Leu
                405                 410                 415
Thr Arg Asp Gly Gly Ser Thr Asn Ser Thr Cys Glu Thr Phe Arg Pro
            420                 425                 430
Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr
        435                 440                 445
Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Arg Ala Lys
    450                 455                 460
Arg Arg Val Val Gly Arg Glu Lys Arg
465                 470
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> HIV野生型表面糖蛋白编码序列(HIV enV)
<400> 3
actgtctact acggtgtgcc agtctggaag gacgccgaga ccactctgtt ctgcgctagc 60
gacgctaagg cctacgagac cgaaaagcac aacgtctggg ccacccacgc ttgcgtgcct 120
actgacccaa accctcagga gatccacctg gaaaacgtga ccgaggaatt caacatgtgg 180
aagaacaaca tggtcgagca gatgcacact gacatcatct ccctgtggga ccagagcctg 240
aagccatgcg tcaagctgac ccctctgtgc gtgactctgc agtgcaccaa cgtcactaac 300
aacatcaccg acgacatgcg tggcgagctg aagaactgct ctttcaacat gaccactgaa 360
ctgagggaca agaagcagaa ggtgtactca ctgttctaca gactggacgt ggtccagatc 420
aacgaaaacc agggaaacag gtccaacaac agcaacaagg agtacagact gatcaactgc 480
aacacctccg ccatcactca ggcttgccct aaggtcagct tcgaacccat cccaatccac 540
tactgcgctc ccgccggttt cgctatcctg aagtgcaagg acaagaagtt caacggcacc 600
ggaccttgcc catccgtgag caccgtccag tgcactcacg gaatcaagcc tgtggtctct 660
actcagctgc tgctgaacgg ttcactggcc gaggaagagg tcatgatcag gagcgagaac 720
atcaccaaca acgctaagaa catcctggtc cagttcaaca ctcccgtgca gatcaactgc 780
accagaccaa acaacaacac tcgcaagtct atccgtatcg gacccggtca ggccttctac 840
gctaccggcg acatcatcgg agacatccgc caggcccact gcactgtctc aaaggctacc 900
tggaacgaaa ctctgggaaa ggtggtcaag cagctgcgca agcacttcgg taacaacacc 960
atcatccgtt tcgctaactc cagcggtggc gacctggagg tgaccactca ctccttcaac 1020
tgcggaggtg aattcttcta ctgcaacact tctggcctgt tcaactcaac ctggatctct 1080
aacacttcag tccagggatc taactcaacc ggttccaacg acagcatcac tctgccctgc 1140
aggatcaagc agatcatcaa catgtggcag agaatcggtc aggccatgta cgctcctccc 1200
atccagggcg tcatccgctg cgtgtccaac atcaccggac tgatcctgac tcgtgacggc 1260
ggatctacca actcaaccac tgaaactttc cgcccaggtg gcggagacat gagggacaac 1320
tggagaagcg agctgtacaa gtacaaggtg gtcaagatcg aacctctggg tgtggctcca 1380
actagggcta agaggagggt ggtgggaagg gagaagagg                        1419
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> HIV野生型表面糖蛋白(HIV enV)
<400> 4
Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu Lys His Asn Val
            20                  25                  30
Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile
        35                  40                  45
His Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met
    50                  55                  60
Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu Gln Cys Thr
                85                  90                  95
Asn Val Thr Asn Asn Ile Thr Asp Asp Met Arg Gly Glu Leu Lys Asn
            100                 105                 110
Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys Gln Lys Val
        115                 120                 125
Tyr Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Val Val Gln Ile Asn Glu Asn Gln
    130                 135                 140
Gly Asn Arg Ser Asn Asn Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Cys
145                 150                 155                 160
Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro
                165                 170                 175
Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys
            180                 185                 190
Lys Asp Lys Lys Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Pro Ser Val Ser Thr
        195                 200                 205
Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu
    210                 215                 220
Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Asn Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Gln Phe Asn Thr Pro Val
                245                 250                 255
Gln Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg
            260                 265                 270
Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp
        275                 280                 285
Ile Arg Gln Ala His Cys Thr Val Ser Lys Ala Thr Trp Asn Glu Thr
    290                 295                 300
Leu Gly Lys Val Val Lys Gln Leu Arg Lys His Phe Gly Asn Asn Thr
305                 310                 315                 320
Ile Ile Arg Phe Ala Asn Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Val Thr Thr
                325                 330                 335
His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly
            340                 345                 350
Leu Phe Asn Ser Thr Trp Ile Ser Asn Thr Ser Val Gln Gly Ser Asn
        355                 360                 365
Ser Thr Gly Ser Asn Asp Ser Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln
    370                 375                 380
Ile Ile Asn Met Trp Gln Arg Ile Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro
385                 390                 395                 400
Ile Gln Gly Val Ile Arg Cys Val Ser Asn Ile Thr Gly Leu Ile Leu
                405                 410                 415
Thr Arg Asp Gly Gly Ser Thr Asn Ser Thr Thr Glu Thr Phe Arg Pro
            420                 425                 430
Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr
        435                 440                 445
Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Arg Ala Lys
    450                 455                 460
Arg Arg Val Val Gly Arg Glu Lys Arg
465                 470
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccatcggg cgcggatcca tgaaattctt agtcaacgtt gcccttgttt ttatggtcgt 60
gtacatttct tacatctatg cgactgtcta ctacggtgtg 100
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccggtgccg ttgaacttgc agtccttgca cttcaggat 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcctgaagt gcaaggactg caagttcaac ggcaccgga 39
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcatgcgctt gatggtaccc ctcttctccc ttcccac 37

Claims (6)

1.一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，其特征在于，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV突变型表面糖蛋白编码序列，所述HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种HIV突变型表面糖蛋白，其特征在于，所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求2所述的HIV突变型表面糖蛋白，其DNA序列为如SEQ ID NO.1所示。
4.一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、用权利要求1所述的表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，在27±3℃培养；
S2、取感染后的P0代病毒液，将杆状病毒从P0代扩增至P3代；
S3、从病毒液中分离纯化获得HIV突变型表面糖蛋白；
所述HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S3中分离纯化包括以下步骤：
步骤1、收集细胞培养液离心获得上清液并使用浓缩系统浓缩得到浓缩液；
步骤2、所述步骤1所得的浓缩液通过上样泵上样，将目的蛋白结合到StrepTactinSepharose High Performance基质的固化柱中，使其结合浓缩液中的HIV突变型表面糖蛋白；
步骤3、将结合HIV突变型表面糖蛋白通过Bio-rad NGC蛋白层析系统从固化柱上洗脱下来，获得纯化的HIV突变型表面糖蛋白。
6.一种HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，其特征在于，将权利要求2所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。
CN201910406942.2A 2019-05-15 2019-05-15 Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法 Active CN110184298B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910406942.2A CN110184298B (zh) 2019-05-15 2019-05-15 Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910406942.2A CN110184298B (zh) 2019-05-15 2019-05-15 Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110184298A CN110184298A (zh) 2019-08-30
CN110184298B true CN110184298B (zh) 2023-05-16

Family

ID=67716541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910406942.2A Active CN110184298B (zh) 2019-05-15 2019-05-15 Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110184298B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115124628B (zh) * 2021-03-27 2023-03-31 中国科学院昆明植物研究所 一种白及多糖及其制备方法和应用、包含所述白及多糖的免疫佐剂和纳米疫苗

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869624A (en) * 1993-03-26 1999-02-09 Progenics Pharmaceuticals, Inc. HIV-1 vaccines, antibody compositions related thereto, and therapeutic and prophylactic uses thereof
WO1999016883A2 (en) * 1997-10-01 1999-04-08 Dana-Farber Cancer Institute STABILIZATION OF ENVELOPE GLYCOPROTEIN TRIMERS BY DISULFIDE BONDS INTRODUCED INTO A gp41 GLYCOPROTEIN ECTODOMAIN
CN1304580C (zh) * 2004-07-09 2007-03-14 楼伟 重组表达人获得性免疫缺陷病毒I型的表面糖蛋白gp160
CA2756206A1 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Academia Sinica Methods and compositions for immunization against virus
WO2017156272A1 (en) * 2016-03-09 2017-09-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
HUE052008T2 (hu) * 2016-09-15 2021-04-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Trimert stabilizáló HIV-burokfehérje-mutációk

Also Published As

Publication number Publication date
CN110184298A (zh) 2019-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112076315B (zh) 新冠病毒s蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用
WO2021184415A1 (zh) 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白单区域亚单位纳米疫苗
Jagu et al. Concatenated multitype L2 fusion proteins as candidate prophylactic pan-human papillomavirus vaccines
CN101293918B (zh) 截短的人乳头瘤病毒16型l1蛋白
CN102229660B (zh) 截短的人乳头瘤病毒33型l1蛋白
AU2017276698B2 (en) Improvement of HPV L2 peptide immunogenicity
CN113512096B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
US9034340B2 (en) Genes encoding major capsid protein L1 of human papilloma virus
US9738691B2 (en) Truncated L1 protein of human papillomavirus type 58
CN104211784B (zh) 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
JPH01500161A (ja) Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチン
CN110184298B (zh) Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
CN114127098A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒51型l1蛋白
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
WO2021013078A1 (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒52型l1蛋白
CN104211782B (zh) 截短的人乳头瘤病毒45型l1蛋白
JPH02203793A (ja) ヒト免疫不全ウイルスタイプ１のエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチドを含むワクチン
CN102643335B (zh) 重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备
CN115161344A (zh) 一种针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗的制备方法
CN112225781A (zh) 一种高效表达新型冠状病毒n蛋白的方法
CN114174320A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒18型l1蛋白
WO2006065166A1 (fr) Composition de traitement et de prevention de l&#39;infection de l&#39;humain par le papillomavirus sur la base de la proteine l1 et des peptides de la proteine e7
JP2002017370A (ja) 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン
CN107513536A (zh) 一种利用真核表达系统制备HIV‑1gp120的方法
CN116239658A (zh) 一种改良的融合前体新型冠状病毒s蛋白突变体及其核酸分子、载体、细胞及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 430074 No.18, East bio Garden Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province

Applicant after: Wuhan Jinghong Technology Co.,Ltd.

Address before: 430074, building 7-5, 6 Industrial Park, Kanto New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei, East Lake

Applicant before: WUHAN JINGHONG WANFANGTANG PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: HIV Mutant Surface Glycoprotein and Its Nanosized Antigen and Preparation Method

Effective date of registration: 20231106

Granted publication date: 20230516

Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: Wuhan Jinghong Technology Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980064113

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right