CN110184298A - Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了HIV突变型表面糖蛋白、HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原及其制备方法。所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸；所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原；本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120蛋白进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。

Description

HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
技术领域
本发明涉及抗原制备技术领域，尤其涉及HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法。
背景技术
人类免疫缺陷综合征(AIDS)于1981年第一次在美国被确诊。自从造成 AIDS的病原-人类免疫缺陷病毒(HIV)于1983年被正式确认，HIV已经在全球造成了至少6000万的感染者，其中至少2500万的感染者因病死亡。尽管从 2000年以来感染HIV人数的比例总体趋于稳定，但是全球感染的总人数仍然在逐年增长。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的出现和使用大大减少了新发病例的出现，并且极大的延长了感染者的存活时间，使得人们似乎看到了根除治疗HIV的前景。但是到目前为止，仍然缺少可靠有效的根除HIV的药物以及预防其传播感染的疫苗。同时，欠发达地区还有较高的流行率和新发病例比例，加上当地医疗卫生条件的欠缺、关注度的匮乏，使得AIDS仍然是人类所面临的一个非常严峻的公共卫生问题。因此，诊断发现并知晓自身感染状况是一种公认的易于实施的防控策略，研发出一种效果好、价格合理的自检测试纸条将为我国艾滋病的防控做出巨大贡献，同时也具有广阔的市场前景。
HIV表面的糖蛋白Env三聚体由三个非共价连接的gp120和gp41三聚体组成，它们来自于gp160前体蛋白。Env蛋白通常在gp41的跨膜结构域之前被截断，从而产生可溶性Env免疫原。然而，未经修饰的gp120蛋白是不稳定的，不能有效地体外表达和纯化Env三聚体。目前，针对HIV-1的保护性疫苗应该能够诱导广泛中和抗体(bNAbs)，以防止HIV-1的入侵。目前，从HIV-1感染个体中分离出许多bnab，它们以HIV-1包膜糖蛋白(Env)三聚体为靶点，能够中和不同亚型的病毒，这为诱导此类抗体提供了证据。然而，与自然感染相比，目前还没有任何基于免疫球蛋白的疫苗能够诱导bNAbs，原因之一可能是这些疫苗不能再现天然的Env三聚体。
因此，如何稳定HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原，本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV 病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一，在于提供一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述 HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。其中，HIV-1野生型表面糖蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的目的之二，在于提供所述的杆状病毒的用途，即用于生产一种构象稳定的HIV突变型表面糖蛋白。
本发明的目的之三，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白，所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。
所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之四，在于提供一种DNA分子，它编码所述的HIV突变型表面糖蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之五，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、用所述的表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，在 27±3℃培养；
S2、取感染后的P0代病毒液，将杆状病毒从P0代扩增至P3代；
S3、从病毒液中分离纯化获得HIV突变型表面糖蛋白。
本发明的目的之六，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量。
2、将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，成功组装形成 HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原颗粒，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片表明组装效果好，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。
附图说明
图1为目的基因扩增结果；其中，M代表Marker，WT为未改造前的HIV-1 野生型表面糖蛋白编码蛋白；mutant1为HIV突变型表面糖蛋白；Mock为空白对照组；
图2为HIV病毒表面糖蛋白(gp120和gp41)融合前的三聚体构象(PDB number：3J5M)；本发明的HIV突变型表面糖蛋白即是在gp120的氨基酸位点进行半胱氨酸突变；
图3为本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白SDS-PAGE检测结果；
图4为本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白的western-blot检测结果；
图5为HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原检测，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片。
具体实施方式
实施例1 HIV突变型表面糖蛋白的基因扩增和真核表达质粒构建
1、PCR扩增
(1)本实验采用重叠PCR进行扩增目的片段，首先利用引物F1和R2、F3和R4(如表1所示)分别进行目的基因扩增；最后用F1和R4引物扩增。由于引入两个半胱氨酸突变，因此分两次引入突变，最终形成双突变，PCR反应体系都是一样的，根据目的片段长短，其延伸时间分别为1-2min。
表1
(2)每一轮PCR反应的PCR反应体系均为50μL，如表2所示，反应条件为：95℃5min；32个循环，循环反应为：95℃1min，55℃1min，72℃1-3 min(视片段长度而定)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用于后续进一步扩增。
表2
2、PCR产物或酶切产物的电泳检测
PCR或酶切反应结束后，将0.8％的琼脂糖凝胶放入装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液没过胶。取PCR或酶切产物5-10μL，加入1/10体积的 10×loading buffer，混匀后点入胶孔中，同时加入相应的DNA Marker，120V 电压电泳。待溴酚蓝电泳至适当位置后，停止电泳，将胶放入凝胶成像系统下观察拍照。
3、PCR产物或酶切产物的回收
用BioFlux公司的BioSpin Gel Extraction Kit试剂盒回收目的产物，收集管中即为回收的DNA片段。
4、DNA片段与质粒载体的连接反应
将回收的DNA片段与线性化载体pFast-bac1于16℃连接过夜得到连接产物，反应体系如表3所示(15μL)；
表3
5、大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
将-80℃冻存的DH5α菌种采用氯化钙法制成大肠杆菌感受态细胞。
6、连接产物转化DH5α
将所述DNA片段与质粒载体的连接得到的连接产物转化感受态DH5α，涂满整个平板。
7、质粒的提取与鉴定
于超净工作台中，从平板上挑取单菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中，于37℃振荡培养8-10h。用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取质粒；质粒提取完成后，用分光光度计ND-2000 Spectrophotometer测定DNA浓度。同时，将提取的质粒用作酶切鉴定，其体系(10μL)如表4所示。
表4
将体系混匀后，37℃恒温酶切2-3h，电泳检测酶切产物。其经过克隆基因的序列测定和分析比对表明载体构建成功：DNA测序证实了，DNA序列中HIV 野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。HIV突变型表面糖蛋白的DNA序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO：1和2所示。
实施例2昆虫细胞表达系统纯化HIV病毒表面糖蛋白
1、杆粒(Bacmid)转染sf9细胞
转染前1-2h将sf9细胞铺于6孔细胞培养板，待其细胞密度长至80％。取 Bacmid(约6-7μg)和6μL转染试剂cellfectinIireagent分别加入100μL昆虫细胞培养基(Sf-900II SFM)，室温静置5min。将两者混匀，室温静置35min。在6孔细胞培养板每孔加入800μL培养基，再加入杆粒和转染试剂混合物，27℃恒温培养。转染后6h，吸出转染液，加入2mL含1％青霉素-链霉素的培养基，继续于27℃恒温培养。
2、目的蛋白表达与鉴定
转染后3-4d，吸取1mL病毒液置-80℃保存，于6孔细胞培养板中加入1mL Sf-900II SFM培养基继续培养3-4d。最后，将2mL病毒液置-80℃保存，记为 P0代毒。同时，P0代毒进行Western blot试验，鉴定目的蛋白表达情况。
3、杆状病毒(P1-P3代)扩增
为大量表达重组蛋白，需要将病毒从P0代扩增至P3代，其扩增方法为：于125mL昆虫细胞培养瓶加入30mL sf9细胞(密度为1.5-2×106cell/mL)和 1mL P0代毒，27℃摇床120r/min避光培养约5天至细胞死亡率达到80％以上， 2000r/min离心10min收集上清，-80℃保存，记为P1代毒。按同样的细胞密度，于250mL三角瓶内加入100mL细胞和3mL P1代毒，约5天后同样方法收集上清，于-80℃保存，记为P2毒。最后，扩增用于纯化表达的P3代毒，约1L细胞和100mL P2代毒，避光培养约3-4天，进行蛋白表达与纯化。
4、HIV突变型表面糖蛋白大量表达与纯化
收集细胞培养液于500mL集菌瓶，6000r/min离心30min(4℃)。将获得细胞上清进行浓缩，并置换buffer(Tris buffer：20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)。然后，通过采用离子交换色谱法(HiLoad 16/10 Q Sepharose HP column， GE Healthcare)纯化。最后，通过分子筛层析(Superose 6 Increase 10/300 GL column，GE Healthcare)进一步纯化，并置换buffer为PBS(137mM NaCl，3mM KCl，10mM Na2HPO4-12H2O，and 2mM KH2PO4，pH 7.4)。获得单一聚集状态蛋白，5000r/min(4℃)离心，浓缩至10mg/mL，-80℃保存备用。
如图3所示，SDS-PAGE检测结果表明，HIV突变型表面糖蛋白可纯化至 90％以上的纯度。
实施例3 HIV突变型表面糖蛋白Western Blot测定其表达量
1、BCA法测定样品总蛋白浓度：BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，用稀释标准品的溶液补到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，用稀释标准品的溶液补到20μL。各孔加入200μL BCA工作液， 37℃放置30min后测定OD562nm吸光值。得到数据后根据标准曲线计算出蛋白浓度，再计算出需要加的5×loading buffer量；
2、根据计算结果，将中样品加入5×loading buffer，沸水中煮10min后冰上2min，12000rpm离心5min，4℃保存。
3、SDS-PAGE
I、安装夹心式垂直电泳槽，制备12％分离胶，混匀后加入玻璃板中，并在分离胶上加入一层去离子水，置于通风橱中室温放置30min左右，待分离胶完全聚合后，将配置好的5％的浓缩胶加入分离胶之上，插入梳子，于通风橱中室温放置30min左右待胶凝固。
II、将配制好的聚丙烯酰胺凝胶置于垂直电泳槽中，往中间槽及外槽加入适量的1×SDS-PAGE电泳缓冲液，于点样孔中加入适量体积的处理好的蛋白样品和蛋白Marker。
III、插上电极电源线，稳定电压约80V，待样品进入分离胶后，换用120V 电压继续电泳，根据目的蛋白的大小，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部合适的位置时停止电泳，准备转膜。
4、Western-blot
I、转膜：SDS-PAGE电泳结束后，根据目的蛋白的分子量，以蛋白Marker 为对照进行切胶并裁剪合适大小的滤纸和PVDF膜。将切好的滤纸放入电转缓冲液中，将切好的PVDF膜放入甲醇中浸泡，然后分别放入纯水和电转缓冲液中浸泡。依次在转膜的夹子中放入滤纸、胶、PVDF膜、滤纸(负极到正极)，赶去气泡，夹紧夹子，放入转膜槽中以120V电压转膜，具体转膜时间视目的蛋白大小而定。
II、封闭：转膜完成后，将膜取出置于事先配好的封闭液中，于室温摇床上封闭2h或4℃摇床上封闭过夜。
III、一抗孵育：将膜用TBST涮洗一下，放入含事先稀释好一抗的平皿中，于室温摇床上孵育2.5h或4℃摇床上孵育过夜。
Ⅳ、二抗孵育：将膜用TBST洗3次，每次15min，然后将膜放入含事先稀释好二抗的平皿中，于室温摇床上孵育2h。孵育完后将膜用TBST洗3次，每次15min。
Ⅴ、化学发光显色：将ECL化学发光显色液中的A液和B液按1:1比例混合，然后加适量的显色液到膜上，避光反应1-2min，用化学发光成像系统成像看结果。
如图4所示，Western-blot结果表明此富集纯化的分子量为120kd的蛋白，产量是1L裂解液里面有10mg HIV突变型表面糖蛋白。而HIV野生型表面糖蛋白的表达量为1mg/L，该结果表明了本发明提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，进而提高了其表达量。
实施例4 HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原的制备
HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒。制备步骤如下：
收集细胞培养液于500mL集菌瓶，6000r/min离心30min(4℃)。将获得细胞上清进行浓缩，并置换buffer(Tris buffer：20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)。加铁蛋白混匀，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒。然后，通过采用离子交换色谱法(HiLoad16/10 Q Sepharose HP column，GE Healthcare)纯化铁蛋白纳米粒。最后，HIV突变型表面糖蛋白-铁蛋白通过分子筛层析(Superose 6Increase 10/300 GL column，GEHealthcare)进一步纯化，并置换buffer为PBS(137mM NaCl，3mM KCl，10mM Na2HPO4-12H2O，and 2mM KH2PO4，pH 7.4)。获得单一聚集状态蛋白，5000r/min(4℃)离心，浓缩至 10mg/mL，-80℃保存备用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司
<120> HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> HIV突变型表面糖蛋白的编码序列(HIV)
<400> 1
actgtctact acggtgtgcc agtctggaag gacgccgaga ccactctgtt ctgcgctagc 60
gacgctaagg cctacgagac cgaaaagcac aacgtctggg ccacccacgc ttgcgtgcct 120
actgacccaa accctcagga gatccacctg gaaaacgtga ccgaggaatt caacatgtgg 180
aagaacaaca tggtcgagca gatgcacact gacatcatct ccctgtggga ccagagcctg 240
aagccatgcg tcaagctgac ccctctgtgc gtgactctgc agtgcaccaa cgtcactaac 300
aacatcaccg acgacatgcg tggcgagctg aagaactgct ctttcaacat gaccactgaa 360
ctgagggaca agaagcagaa ggtgtactca ctgttctaca gactggacgt ggtccagatc 420
aacgaaaacc agggaaacag gtccaacaac agcaacaagg agtacagact gatcaactgc 480
aacacctccg ccatcactca ggcttgccct aaggtcagct tcgaacccat cccaatccac 540
tactgcgctc ccgccggttt cgctatcctg aagtgcaagg actgcaagtt caacggcacc 600
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actcagctgc tgctgaacgg ttcactggcc gaggaagagg tcatgatcag gagcgagaac 720
atcaccaaca acgctaagaa catcctggtc cagttcaaca ctcccgtgca gatcaactgc 780
accagaccaa acaacaacac tcgcaagtct atccgtatcg gacccggtca ggccttctac 840
gctaccggcg acatcatcgg agacatccgc caggcccact gcactgtctc aaaggctacc 900
tggaacgaaa ctctgggaaa ggtggtcaag cagctgcgca agcacttcgg taacaacacc 960
atcatccgtt tcgctaactc cagcggtggc gacctggagg tgaccactca ctccttcaac 1020
tgcggaggtg aattcttcta ctgcaacact tctggcctgt tcaactcaac ctggatctct 1080
aacacttcag tccagggatc taactcaacc ggttccaacg acagcatcac tctgccctgc 1140
aggatcaagc agatcatcaa catgtggcag agaatcggtc aggccatgta cgctcctccc 1200
atccagggcg tcatccgctg cgtgtccaac atcaccggac tgatcctgac tcgtgacggc 1260
ggatctacca actcaacctg cgaaactttc cgcccaggtg gcggagacat gagggacaac 1320
tggagaagcg agctgtacaa gtacaaggtg gtcaagatcg aacctctggg tgtggctcca 1380
actagggcta agaggagggt ggtgggaagg gagaagagg 1419
<210> 2
<211> 473
<212> PRT
<213> HIV突变型表面糖蛋白(HIV)
<400> 2
Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu Thr Thr Leu
1 5 10 15
Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu Lys His Asn Val
20 25 30
Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile
35 40 45
His Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met
50 55 60
Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu Gln Cys Thr
85 90 95
Asn Val Thr Asn Asn Ile Thr Asp Asp Met Arg Gly Glu Leu Lys Asn
100 105 110
Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys Gln Lys Val
115 120 125
Tyr Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Val Val Gln Ile Asn Glu Asn Gln
130 135 140
Gly Asn Arg Ser Asn Asn Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Cys
145 150 155 160
Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro
165 170 175
Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys
180 185 190
Lys Asp Cys Lys Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Pro Ser Val Ser Thr
195 200 205
Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu
210 215 220
Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Gln Phe Asn Thr Pro Val
245 250 255
Gln Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg
260 265 270
Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp
275 280 285
Ile Arg Gln Ala His Cys Thr Val Ser Lys Ala Thr Trp Asn Glu Thr
290 295 300
Leu Gly Lys Val Val Lys Gln Leu Arg Lys His Phe Gly Asn Asn Thr
305 310 315 320
Ile Ile Arg Phe Ala Asn Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Val Thr Thr
325 330 335
His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly
340 345 350
Leu Phe Asn Ser Thr Trp Ile Ser Asn Thr Ser Val Gln Gly Ser Asn
355 360 365
Ser Thr Gly Ser Asn Asp Ser Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln
370 375 380
Ile Ile Asn Met Trp Gln Arg Ile Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro
385 390 395 400
Ile Gln Gly Val Ile Arg Cys Val Ser Asn Ile Thr Gly Leu Ile Leu
405 410 415
Thr Arg Asp Gly Gly Ser Thr Asn Ser Thr Cys Glu Thr Phe Arg Pro
420 425 430
Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr
435 440 445
Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Arg Ala Lys
450 455 460
Arg Arg Val Val Gly Arg Glu Lys Arg
465 470
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> HIV野生型表面糖蛋白编码序列(HIV enV)
<400> 3
actgtctact acggtgtgcc agtctggaag gacgccgaga ccactctgtt ctgcgctagc 60
gacgctaagg cctacgagac cgaaaagcac aacgtctggg ccacccacgc ttgcgtgcct 120
actgacccaa accctcagga gatccacctg gaaaacgtga ccgaggaatt caacatgtgg 180
aagaacaaca tggtcgagca gatgcacact gacatcatct ccctgtggga ccagagcctg 240
aagccatgcg tcaagctgac ccctctgtgc gtgactctgc agtgcaccaa cgtcactaac 300
aacatcaccg acgacatgcg tggcgagctg aagaactgct ctttcaacat gaccactgaa 360
ctgagggaca agaagcagaa ggtgtactca ctgttctaca gactggacgt ggtccagatc 420
aacgaaaacc agggaaacag gtccaacaac agcaacaagg agtacagact gatcaactgc 480
aacacctccg ccatcactca ggcttgccct aaggtcagct tcgaacccat cccaatccac 540
tactgcgctc ccgccggttt cgctatcctg aagtgcaagg acaagaagtt caacggcacc 600
ggaccttgcc catccgtgag caccgtccag tgcactcacg gaatcaagcc tgtggtctct 660
actcagctgc tgctgaacgg ttcactggcc gaggaagagg tcatgatcag gagcgagaac 720
atcaccaaca acgctaagaa catcctggtc cagttcaaca ctcccgtgca gatcaactgc 780
accagaccaa acaacaacac tcgcaagtct atccgtatcg gacccggtca ggccttctac 840
gctaccggcg acatcatcgg agacatccgc caggcccact gcactgtctc aaaggctacc 900
tggaacgaaa ctctgggaaa ggtggtcaag cagctgcgca agcacttcgg taacaacacc 960
atcatccgtt tcgctaactc cagcggtggc gacctggagg tgaccactca ctccttcaac 1020
tgcggaggtg aattcttcta ctgcaacact tctggcctgt tcaactcaac ctggatctct 1080
aacacttcag tccagggatc taactcaacc ggttccaacg acagcatcac tctgccctgc 1140
aggatcaagc agatcatcaa catgtggcag agaatcggtc aggccatgta cgctcctccc 1200
atccagggcg tcatccgctg cgtgtccaac atcaccggac tgatcctgac tcgtgacggc 1260
ggatctacca actcaaccac tgaaactttc cgcccaggtg gcggagacat gagggacaac 1320
tggagaagcg agctgtacaa gtacaaggtg gtcaagatcg aacctctggg tgtggctcca 1380
actagggcta agaggagggt ggtgggaagg gagaagagg 1419
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> HIV野生型表面糖蛋白(HIV enV)
<400> 4
Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu Thr Thr Leu
1 5 10 15
Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu Lys His Asn Val
20 25 30
Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile
35 40 45
His Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met
50 55 60
Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu Gln Cys Thr
85 90 95
Asn Val Thr Asn Asn Ile Thr Asp Asp Met Arg Gly Glu Leu Lys Asn
100 105 110
Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys Gln Lys Val
115 120 125
Tyr Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Val Val Gln Ile Asn Glu Asn Gln
130 135 140
Gly Asn Arg Ser Asn Asn Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Cys
145 150 155 160
Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro
165 170 175
Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys
180 185 190
Lys Asp Lys Lys Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Pro Ser Val Ser Thr
195 200 205
Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu
210 215 220
Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Gln Phe Asn Thr Pro Val
245 250 255
Gln Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg
260 265 270
Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp
275 280 285
Ile Arg Gln Ala His Cys Thr Val Ser Lys Ala Thr Trp Asn Glu Thr
290 295 300
Leu Gly Lys Val Val Lys Gln Leu Arg Lys His Phe Gly Asn Asn Thr
305 310 315 320
Ile Ile Arg Phe Ala Asn Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Val Thr Thr
325 330 335
His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly
340 345 350
Leu Phe Asn Ser Thr Trp Ile Ser Asn Thr Ser Val Gln Gly Ser Asn
355 360 365
Ser Thr Gly Ser Asn Asp Ser Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln
370 375 380
Ile Ile Asn Met Trp Gln Arg Ile Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro
385 390 395 400
Ile Gln Gly Val Ile Arg Cys Val Ser Asn Ile Thr Gly Leu Ile Leu
405 410 415
Thr Arg Asp Gly Gly Ser Thr Asn Ser Thr Thr Glu Thr Phe Arg Pro
420 425 430
Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr
435 440 445
Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Arg Ala Lys
450 455 460
Arg Arg Val Val Gly Arg Glu Lys Arg
465 470
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccatcggg cgcggatcca tgaaattctt agtcaacgtt gcccttgttt ttatggtcgt 60
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<400> 6
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<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcatgcgctt gatggtaccc ctcttctccc ttcccac 37

Claims (9)

1.一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，其特征在于，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。
2.如权利要求1所述的杆状病毒的用途，其特征在于，用于生产一种构象稳定的HIV突变型表面糖蛋白。
3.一种HIV突变型表面糖蛋白，其特征在于，所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。
4.如权利要求3所述的HIV突变型表面糖蛋白，其特征在于，所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求3-4所述的HIV突变型表面糖蛋白。
6.如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其DNA序列为如SEQ ID NO.1所示。
7.一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、用权利要求1所述的表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，在27±3℃培养；
S2、取感染后的P0代病毒液，将杆状病毒从P0代扩增至P3代；
S3、从病毒液中分离纯化获得HIV突变型表面糖蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S3中分离纯化包括以下步骤：
步骤1、收集细胞培养液离心获得上清液并使用浓缩系统浓缩得到浓缩液；
步骤2、所述步骤1所得的浓缩液通过上样泵上样，将目的蛋白结合到StrepTactinSepharose High Performance基质的固化柱中，使其结合浓缩液中的HIV突变型表面糖蛋白；
步骤3、将结合HIV突变型表面糖蛋白通过Bio-rad NGC蛋白层析系统从固化柱上洗脱下来，获得纯化的HIV突变型表面糖蛋白。
9.一种HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，其特征在于，将权利要求3-4所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。
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Denomination of invention: HIV Mutant Surface Glycoprotein and Its Nanosized Antigen and Preparation Method

Effective date of registration: 20231106

Granted publication date: 20230516

Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: Wuhan Jinghong Technology Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980064113